CN117897164A - 源自马奶酒的外泌体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够抑制与各种炎症性疾病的发病相关的TARC、例如对特应性皮炎的治疗等有用的新型材料。一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物，其含有从马奶酒获得并富集源自所述马奶酒的外泌体而成的外泌体富集组分。另外，一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物的制造方法，其特征在于，具有以下步骤：将马奶酒分为多个组分；以及从所述多个组分中回收富集有外泌体的组分。该源自马奶酒的外泌体具有抑制TARC产生的作用效果，作为配合于皮肤处理用组合物、抗炎用组合物的材料是有用的。另外，作为针对特应性皮炎等TARC介导性疾病的处理剂也是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及一种源自马奶酒的外泌体及其用途。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的直径30～200nm(纳米)的细胞外囊泡，嵌入有作为细胞所具备的信息分子的膜蛋白质、细胞内蛋白质、核酸(Micro RNA、信使RNA、DNA等)等，被认为负责与其他细胞之间的信息传递(非专利文献1)。近年来，应用该外泌体作为医药品、化妆品、功能性食品等的尝试也十分活跃。
关于外泌体在医药品、化妆品等中的应用，例如，专利文献1公开了一种涉及包含源自间充质干细胞的外泌体的医药组合物、以及其在治疗免疫介导性炎症性疾病的方法中的用途的发明。另外，专利文献2公开了一种涉及以含有源自牛奶的外泌体为有效成分的抗炎剂的发明。另外，专利文献3公开了一种涉及从日本清酒的酒母或醪、或味噌中提取的外泌体的发明，并记载了以下内容：源自酵母(酒母、醪、味噌)的外泌体会增加由NK细胞分泌的细胞杀伤因子即顆粒酶的表达量，另外，通过添加酒母外泌体能够提高老化的成纤维细胞中的胶原蛋白和弹性蛋白的基因表达量(专利文献3的段落0055)。
另一方面，作为相对于白细胞显示出趋化性等的趋化因子之一，已知TARC(Thymusand activation-regulated chemokine)。例如，认为在特应性皮炎中，由病变部的表皮角化细胞产生的TRAC使淋巴细胞(表达CC R4的Th2细胞)在局部迁移，通过Th2主导的免疫反应，引起IgE产生、嗜酸性粒细胞的浸润·活化而出现过敏症状(非专利文献2)。
另外，例如，专利文献4公开了一种涉及人CCL17抗体的发明，并记载了以下内容：CCL17(“CCL17”为“TARC”的别名)与溃疡性结肠炎、特应性皮炎、特发性肺纤维化和哮喘等会对各种脏器造成影响的人类疾病相关，因此人CCL17抗体对治疗这样的CCL17介导性炎症性疾病有用(专利文献4的段落0004、0144)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kosaka N,Yoshioka Y,Fujita Y,Ochiya T.「Versatil e rolesof extracellular vesicles in cancer.」J Clin Invest.2016Apr 1；126(4),pp1163-72.
非专利文献2：常深佑一郎“血清TARC值在特应性皮炎诊疗中的利用”，日本皮肤过敏·接触性皮炎学会杂志，11(3)；2017年，第220～226页。
专利文献
专利文献1：日本特表2018-531979号公报
专利文献2：国际公开WO2016/039356号
专利文献3：国际公开WO2020/158930号
专利文献4：日本特表2016-537024号公报
发明内容
发明要解决的课题
如果能够抑制与各种炎症性疾病的发病相关的TARC，则认为有望作为这些疾病的治疗药等。然而，例如在专利文献4记载的抗体技术中，很难说在对患者的给药方式、效果表现性等实用方面具有通用性。
因此，本发明的目的在于提供一种能够抑制与各种炎症性疾病的发病相关的TARC、例如对特应性皮炎的治疗等有用的新型材料。
用于解决课题的手段
为了实现上述目的，本发明人们进行了各种研究，结果发现，源自马奶酒的外泌体具有抑制正常人表皮角化细胞产生引起炎症反应的TARC的作用效果，从而完成了本发明。
即，第一，本发明提供一种皮肤处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
另外，第二，本发明提供一种抗炎用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
另外，第三，本发明提供一种TARC产生抑制用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
另外，第四，本发明提供一种特应性皮炎处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
另外，第五，本发明提供一种TARC产生抑制剂，其以源自马奶酒的外泌体为有效成分。
另外，第六，本发明提供一种疾病处理用组合物，其含有上述TARC产生抑制剂。
在上述疾病处理用组合物中，所述疾病优选为TARC介导性疾病。另外，所述疾病优选为特应性皮炎。
另外，第七，本发明提供一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物的制造方法，其特征在于，具有以下步骤：将马奶酒分为多个组分；以及从所述多个组分中回收富集有外泌体的组分。
另外，第八，本发明提供一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物，其含有从马奶酒获得并富集源自所述马奶酒的外泌体而成的外泌体富集组分。
发明效果
根据由本发明提供的源自马奶酒的外泌体，能够抑制与各种炎症性疾病的发病相关的TARC，例如对特应性皮炎的治疗等有用。另外，可以合适地用作对人或动物给药的处理用组合物的配合成分。
附图的简单说明
图1是示出利用纳米颗粒跟踪分析系统对制备例1中制备的源自马奶酒的外泌体进行测定的结果的图表，图1(a)示出粒径分布的曲线图，图1(b)示出观察视野图像的一例。
图2是示出在试验例1中对源自马奶酒的外泌体对使IL-10/TNF-α/IF N-γ作用于正常人表皮角化细胞而引起炎症性时产生的TARC的表达量(相对值)造成的影响进行调查的结果的图表。
图3是示出在试验例1中对源自马奶酒的外泌体对使IL-10/TNF-α/IF N-γ作用于正常人表皮角化细胞而引起炎症性时产生的TSLP的表达量(相对值)造成的影响进行调查的结果的图表。
图4是示出在试验例1中对源自马奶酒的外泌体对使IL-10/TNF-α/IF N-γ作用于正常人表皮角化细胞而引起炎症性时产生的MDC的表达量(相对值)造成的影响进行调查的结果的图表。
具体实施方式
在本说明书中，“马奶酒”与本领域技术人员通常理解的意义相同，具体而言，是使马奶自然发酵而得到的酒精含量为1～3％且包含源自马奶的矿物质·维生素等营养素的饮料。可以通过将制备好的剩余马奶酒加入刚挤出的马奶中并进行搅拌等而获得。优选使用以蒙古国为原产国的马奶酒。
在本说明书中，“外泌体”与本领域技术人员通常理解的意义相同，具体而言，是由细胞分泌的直径30～200nm(纳米)的细胞外囊泡，包含作为细胞所具备的信息分子的膜蛋白质、细胞内蛋白质、核酸(MicroRNA、信使RNA、DNA等)等。
关于来自马奶酒的外泌体的制备，例如为了去除马奶酒中富含的蛋白质成分，用醋酸对马奶酒进行处理而使蛋白质沉淀，通过超离心分离其上清液部分，由此能够获得高度纯化的外泌体。
以下，对具体实施方式进行更详细的说明。
1.源自马奶酒的外泌体
源自马奶酒的外泌体例如能够经由以下步骤获得。
(a)将作为原料的马奶酒供于离心或过滤器过滤的处理来去除杂质
(b)将经过上述步骤(a)而去除了杂质的试样供于超离心处理
(c)对通过上述步骤(b)的处理而获得的沉淀物进行回收
作为上述步骤(a)中的离心力条件，只要能够不使外泌体沉淀地将外泌体以外的杂质作为沉淀物去除即可，例如，可以为10000～20000×g，可以为10000～17000×g，可以为12000～17000×g，或者可以为12000～15000×g。另外，作为上述步骤(a)中的离心时间，例如，可以为5～60分钟，可以为10～45分钟，或者可以为15～30分钟。另外，作为上述步骤(a)中的离心温度，能够在4℃～室温下进行。根据需要对通过上述步骤(a)获得的上清液进行过滤器过滤(例如，利用0.65μm过滤器的过滤)，由此能够进一步去除杂质。离心或过滤器过滤的处理也可以根据需要分两个阶段进行。另外，可以改变离心处理和过滤器过滤处理的顺序，也可以交替地进行这些处理。
作为上述步骤(b)中的离心力条件，只要能够在沉淀物中回收外泌体即可，例如，可以为50000～210000×g，可以为70000～200000×g，可以为70000～200000×g，或者可以为100000～180000×g。另外，作为上述步骤(b)中的离心时间，例如，可以为50分钟～4小时，可以为60分钟～4小时，或者可以为70分钟～4小时。另外，作为上述步骤(b)中的离心温度，能够在4℃～室温下进行。
在上述步骤(c)中，去除通过上述步骤(b)的超离心处理而获得的上清液，在通过上述步骤(b)的超离心处理而获得的沉淀物中加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)等适当的溶剂使其悬浮，回收该沉淀物。回收的外泌体能够根据需要用PBS等洗涤。洗涤能够通过使沉淀物悬浮在PBS中后，重复上述步骤(b)的条件下的超离心处理来进行。
在上述步骤(a)中，对成为原料的马奶酒进行不去除外泌体的程度的离心或过滤器过滤的处理来去除杂质，从而防止该杂质混入后段的步骤中富集的外泌体组分中。
在上述步骤(b)中，能够通过超离心处理使悬浮在马奶酒中的外泌体沉淀，与在马奶酒中悬浮、分散或溶解等的外泌体以外的成分分离。
在上述步骤(c)中，能够使沉淀的外泌体悬浮在PBS等适当的溶剂中来回收。
因此，通过经由步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)，能够选择性地回收并富集马奶酒中所含的外泌体。
在此，“富集”是指，制备的含有源自马奶酒的外泌体的组合物中的浓度(例如，可以是以个数为基准，也可以是以特定的蛋白质、核酸、脂质等外泌体成分的含量为基准)相对于作为原料的马奶酒中所含的外泌体浓度，优选提高了2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、或1000倍以上。
关于获得的外泌体富集组分中是否含有目标外泌体，例如可以通过对外泌体特有的粒径范围内的粒子进行测定、或者进行使用特异性识别外泌体的抗体的ELISA测定等来确认。确认手段不限于此，外泌体特有的粒径范围内的粒子例如可以使用纳米颗粒跟踪分析系统来测定，该纳米粒子跟踪分析系统基于各个粒子的布朗运动速度的差异来分析粒径。具体而言，可以利用市售的分析系统(商品名“Nanosight”、Malvern Panalytical公司制造)等。另外，可以使用与马、牛等动物种具有交叉性的抗外泌体抗体进行ELISA测定。具体而言，例如，可以利用市售的测定试剂盒“牛奶外泌体ELISA试剂盒”(COSMO BIO公司制造)等。
作为由本发明提供的源自马奶酒的外泌体的平均粒径，例如，可以为80～200nm，可以为100～180nm，或者可以为110～160nm。另外，作为峰值径，优选地，可以为70～140nm，可以为80～130nm，或者可以为90～120nm。
此外，本发明并不限于上述实施方式，在本发明的主旨范围内，能够进行各种变形实施方式，这样的实施方式也包含在本发明的范围内。另外，如上所述，由马奶酒制备外泌体富集组分，并利用该组分，因此，作为一个观点，本发明提供一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物，该组合物含有富集源自马奶酒的外泌体而成的外泌体富集组分。另外，作为另一观点，提供一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物的制造方法，该方法具有以下步骤：将马奶酒分为多个组分；以及从该多个组分中回收富集有外泌体的组分。
2.含有源自马奶酒的外泌体的组合物(剂)
如后述的试验例所示，根据源自马奶酒的外泌体，具有抑制正常人表皮角化细胞所产生的引起炎症反应的TARC的产生的作用效果。
因此，在某方式中，本发明提供一种用于将源自马奶酒的外泌体配合于各种组合物并应用于人或动物而利用的该组合物。例如，可以列举出以下组合物。
(a)一种皮肤处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体
(b)一种抗炎用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体
(c)一种TARC产生抑制用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体
(d)一种特应性皮炎处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体
(e)一种TARC产生抑制剂，其以源自马奶酒的外泌体为有效成分
(f)一种疾病处理用组合物，其含有以源自马奶酒的外泌体为有效成分的TARC产生抑制剂
作为皮肤处理用组合物，除了源自马奶酒的外泌体以外，还可以根据需要添加药学上可接受的基材、载体，并通过通常的制剂方法，形成例如乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、敷剂、贴附剂、棒剂、擦剂等形态，形成以将其应用于皮肤进行处理为目的而使用的组合物的形态。
作为抗炎用组合物，可以是以预防、改善或治疗炎症的症状等为目的而使用的组合物。给药方式、给药剂型没有特别限制，可以与上述皮肤处理用组合物一样，或者可以为经口、静脉、腹腔、经皮、经肺、经鼻、口腔、经肠等任一给药方式。在该情况下，为了适于其各种给药方式，可以通过通常的制剂手段，适当地形成制备为含有适当的制剂性基材等和源自马奶酒的外泌体的形态。例如，可以为片剂、散剂、液剂、粉末、颗粒、软胶囊、硬胶囊、胶状剂、锭剂、口腔崩解剂、注射剂、吸入剂、栓剂、涂布剂等形态。
作为TARC产生抑制用组合物，可以是以抑制所需细胞中产生TARC等为目的而使用的组合物。给药方式、给药剂型没有特别限制，可以与上述皮肤处理用组合物、抗炎用组合物一样。
作为特应性皮炎处理用组合物，可以是以预防、改善或治疗特应性皮炎的症状等为目的而使用的组合物。给药方式、给药剂型没有特别限制，可以与上述皮肤处理用组合物、抗炎用组合物一样。特别地，优选以应用于特应性皮炎的患部的皮肤进行处理为目的而使用的形态。
另一方面，由本发明提供的源自马奶酒的外泌体可以是作为以抑制所需细胞中产生TARC为目的而使用的原药的TARC产生抑制剂。即，可以是以源自马奶酒的外泌体为有效成分的TARC产生抑制剂。
因此，例如，以上述源自马奶酒的外泌体为有效成分的TARC产生抑制剂可以是以预防、改善或治疗TARC介导性疾病的症状等为目的而使用的组合物。给药方式、给药剂型没有特别限制，可以与上述皮肤处理用组合物、抗炎用组合物一样。
在此，“TARC介导性疾病”是指TARC参与疾病的该疾病，例如，可以列举出特应性皮炎作为代表，但除此以外，还可以列举出接触性皮炎、钱币状湿疹、淤积性皮炎、汗疹、接触过敏性皮炎、毛囊炎、银屑病、皮肤干燥瘙痒、荨麻疹、皮脂性湿疹、脂溢性湿疹、出汗不良性湿疹、钱币状湿疹、斑秃、花粉症、哮喘、动物过敏等。另外，针对狗、猫等动物，可以列举出蜱和跳蚤介导性皮肤疾病等。
在形成为上述各种组合物而利用的情况下，作为该组合物中含有的外泌体的含量，如果以制备的外泌体富集组分的质量换算计，例如，可以为1～100质量％、2～100质量％、3～100质量％、4～100质量％、5～100质量％、10～100质量％、20～100质量％、30～100质量％、40～100质量％或50～100质量％。另外，如果以外泌体的个数换算计，例如，可以为4×108～1×1014个/mL、5×108～1×1014个/mL、1×109～1×1014个/mL、1×1010～1×1014个/mL、1×1011～1×1014个/mL或1×1012～1×1014个/mL。此外，在以外泌体的个数换算计为4×108个的情况下，通常以其质量换算计相当于约20μg。
在将由本发明提供的源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的情况下，作为该外泌体的给药量，可以根据用于利用其的上述组合物的形态、目的适当地设定。例如，在作为经口摄取用摄取的情况下，成人每日数次，如果以制备的外泌体富集组分的质量换算计，例如每次可以摄取0.001mg～10g。另外，如果以外泌体的个数换算计，例如可以摄取2×107～2×1012个。另外，在作为皮肤处理用而涂覆于皮肤的情况下，如果以制备的外泌体富集组分的质量换算计，例如可以涂覆0.0001mg～0.1g/cm2。如果以外泌体的个数换算计，例如可以涂覆2×106～2×1010个/cm2。
由本发明提供的含有源自马奶酒的外泌体的组合物可以以预防、改善、治疗特定症状等为目的而使用，或者可以应用于健康的人或动物。例如，可以用于维持该健康的人或动物的健康。
由本发明提供的含有源自马奶酒的外泌体的组合物典型地可以以例如医药品、准药品、功能性食品、营养补充食品、补充剂、保健食品、动物用医药品、动物用准药品、动物用功能性食品、动物用营养补充食品、动物用补充剂、动物用保健食品、饲料、饲料添加物等各种产品形态使用。或者，可以与这些产品组合使用。另外，也可以与各种饮食品组合使用。
此外，在一个方式中，本发明提供一种将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药而进行处理的方法。例如，可以列举出以下方法。
(a1)将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的皮肤处理方法
(b1)将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的炎症处理方法
(c1)将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的TARC产生抑制、TSLP产生抑制或MDC产生抑制用处理方法
(d1)将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的特应性皮炎处理方法(e1)将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药的TARC介导性疾病处理方法
另外，在某方式中，本发明提供一种用于将源自马奶酒的外泌体对人或动物给药而进行处理的用途。例如，可以列举出以下用途。
(a2)源自马奶酒的外泌体用于处理皮肤的用途
(b2)源自马奶酒的外泌体用于处理炎症的用途
(c2)源自马奶酒的外泌体用于TARC产生抑制、TSLP产生抑制或MDC产生抑制的用途
(d2)源自马奶酒的外泌体用于处理特应性皮炎的用途
(e2)源自马奶酒的外泌体用于处理TARC介导性疾病的用途
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更具体的说明。这些实施例并不限定本发明的范围。
[制备例1]＜源自马奶酒的外泌体的制备＞
准备马奶酒(原产国：蒙古国)，将其50mL施加于低速离心(2000×g、5分钟)来去除细胞破碎物等杂质。接着，保温于37℃，同时添加500μL的醋酸溶液并进行颠倒混合后，置于离心机(12000×g、10分钟、4℃)，将其上清液回收到新管中。将其置于超离心装置(BECKMAN公司制造、100000×g、70分钟、4℃)，回收其沉降组分。沉渣分散于PBS(-)，重复同样的超离心，进行洗涤，去除夹杂蛋白质。最终使其悬浮于PBS(-)，用于以下的试验。
关于最终产物，为了确认外泌体颗粒，通过纳米颗粒跟踪分析系统(商品名“Nanosight”、Malvern Panalytical公司制造)进行评价。结果，如图1所示，马奶酒外泌体的平均粒径约为107nm。另外，换算成原料的马奶酒中所含的浓度时的浓度约为4.0×108个/mL。即，可知马奶酒中每1cc含有4亿个外泌体。
(试验例1)＜炎症模型系统的效果＞
按照常规方法，使用角质形成细胞专用培养基(商品名“角化细胞增殖培养基2试剂盒：Keratinocyte Growth Medium 2Kit”，PromoCell公司制造)，在5％CO2、37℃下，在75cm2的平底板培养容器中将正常人表皮角化细胞(商品名“正常人表皮角化细胞(成人、单一供体)：Normal Human Epidermal Keratinocytes(NHEK)，adult donor，singledonor”，PromoCell公司制造)培养至亚汇合。为了传代，在新的培养容器中以成为40％汇合的细胞浓度的方式接种后，进一步培养48小时后，在6-孔板中以80％汇合的细胞浓度接种。培养24小时后，分别添加IL-10使最终浓度为10ng/mL、TNF-α使最终浓度为10ng/mL、IFN-γ使最终浓度为10ng/mL，进一步培养24小时。然后，在该培养24小时后的培养液中添加源自马奶酒的外泌体，使最终浓度为2μg/mL或10μg/mL。
培养48小时后，利用刮板采集细胞，使用总RNA回收试剂盒(商品名“NucleoSpinRNA”、TAKARA BIO公司制造)回收RNA，制备mRN A定量用DNA试样。对于该试样，按照常规方法，利用特异性引物进行定量PCR，测定TARC(Thymus and activation-regulatedchemokine)、T SLP(Thymic Stromal lymphopoietin)和MDC(Macropage Derived Chemokine)的mRNA量。需要说明的是，TARC作为相对于白细胞系细胞显示出趋化性等的趋化因子之一是公知的，并且已知与特应性皮炎的发病密切相关，同样已知TSLP是通过参与Th2细胞(2型辅助T细胞)的选择性分化诱导及其功能维持而与过敏性炎症的全部成立相关的主分子。另外，MDC(别名：CCL22)也与TARC一样，已知是相对于白细胞系细胞显示出趋化性等的趋化因子之一，是出现在特应性皮炎患者的血清中来良好地反映其重症度的分子。
结果，如图2、3、4所示，通过用IL-10/TNF-α/IFN-γ处理正常人表皮角化细胞，能够诱导在特应性皮炎患者中观察到上升的TARC、TSLP和MDC的表达。相对于此，通过添加源自马奶酒的外泌体，能够显著抑制这些TARC、TSLP、MDC的表达。
Claims (10)
1.一种皮肤处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
2.一种抗炎用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
3.一种TARC产生抑制用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
4.一种特应性皮炎处理用组合物，其含有源自马奶酒的外泌体。
5.一种TARC产生抑制剂，其以源自马奶酒的外泌体为有效成分。
6.一种疾病处理用组合物，其含有权利要求5所述的TARC产生抑制剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述疾病为TARC介导性疾病。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述疾病为特应性皮炎。
9.一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物的制造方法，其特征在于，具有以下步骤：将马奶酒分为多个组分；以及从所述多个组分中回收富集有外泌体的组分。
10.一种含有源自马奶酒的外泌体的组合物，其含有从马奶酒获得并富集源自所述马奶酒的外泌体而成的外泌体富集组分。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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