WO2018227384A1 - 一种鉴定茶叶品质的方法 - Google Patents

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谢子建
王茵
李大详
宛晓春
黄敏祺
曹文华
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浙江海正甦力康生物科技有限公司
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying the quality of tea leaves, in particular to a method for identifying the quality of tea leaves by the active ingredients in tea leaves and their biological effects.
  • Tea is a natural and healthy green drink. From the beginning of the "Shen Nong tastes the herb, the seventy-two poisons in the day, and the tea (the tea)), the drinking and spreading of tea is made for people's health and happiness index. A significant contribution.
  • the method for identifying tea quality of the present invention comprises:
  • the content of ECG in the tea leaves is at least 2.0% (w/w) based on the total weight of the tea leaves, preferably at least 4.0% (w/w); after treatment of the cells with 1 ⁇ g/mL tea water extract for 10 min, pERK in the cells Levels increased by at least 1 fold compared to untreated cells, treated with 5 ⁇ g/mL tea water extract After 10 min, the level of pERK in the cells was increased at least 2-fold compared to untreated cells.
  • the tea leaves are green tea; further preferably, the tea leaves are green tea that has not been fermented or oxidized.
  • the tea leaf water extract is obtained by pulverizing the tea leaves and leaching with pure water of 70 ° C or higher, and extracting the extracts to a viscous state under reduced pressure at 40 to 60 ° C, and placing them at -15 ° C. It is frozen at -25 ° C for 4 to 12 hours, then placed in a -60 to -80 ° C freeze dryer, and dried under vacuum for 24 to 48 hours to obtain a lyophilized powder of tea water extract.
  • the step of pulverizing the tea leaves with a pure water above 70 ° C further comprises extracting with ultrasound.
  • the ECG content of the tea leaf water extract is 2.5% (w/w) or more based on the weight of the tea water extract; preferably, the ECG content of the tea water extract is 5% (w/ w) above.
  • the cell is a cell expressing a Na + /K + -ATPase; more preferably, the cell is an LLC-PK1 cell.
  • the method provided by the invention detects the active ingredient ECG in the tea, further detects the activation effect of the active ingredient on the extracellular signal-regulated kinase (ERK), thereby identifying the quality of the tea based on the two, and provides a new standard for the identification of the tea.
  • ENK extracellular signal-regulated kinase
  • Figure 1 Effect of aqueous extract of green tea 26 on the activation of ERK phosphorylation in LLC-PK1 cells.
  • A time effect: the effect of 5 ⁇ g/ml tea aqueous extract on the effect of pERK on different time;
  • B concentration effect: the effect of tea aqueous extract on pERK after treatment of cells at different concentrations for 10 min;
  • Con control; 26#, No. 26 green tea sample; catechin 26#, and catechin No. 26 green tea sample.
  • FIG. 2 Correlation analysis of ECG (A) and EGCG (B) levels in tea aqueous extracts with pERK activation.
  • FIG. 3 Comparison of the effects of different tea aqueous extracts on phosphorylated ERK (pERK) activation in LLC-PK1 cells;
  • Con control; GTE 1, green tea water extract 1; GTE 2, green tea water extract 2; GTE 3, green tea water extract 3; pERK, phosphorylated ERK; tERK, total ERK.
  • Epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG, epigallocatechin-3-gallate, Mw: 458.4) and epicatechin-3-O-gallate (ECG, epicatechin-3-gallate, Mw: 442.4) is the main component of the biological activity of tea polyphenols in tea.
  • CN200310111367.2 discloses that ECG and EGCG are useful in the treatment of chronic renal failure, uremia in animal models.
  • Na + /K + -ATPase also known as sodium potassium pump or sodium pump
  • NKA sodium potassium pump
  • Sodium-potassium-ATPase can be functionally divided into receptor-type sodium-potassium-ATPase (or sodium-potassium-ATPase receptor) and ion-pump-type sodium-potassium-ATPase, the former involved in related signaling, and the latter in intracellular Ion balance.
  • Japanese scholar Hideo Ochiai et al., Journal Biochemical Pharmacology 2009, 78: 1069-1074 disclose that ECG and EGCG can bind to Na + /K + -ATPase purified from porcine kidney.
  • Extracellular signal-regulated kinase is the first mitogen-activated protein kinase (MAPK) discovered, including ERK1 and ERK2, which are involved in the regulation of important biological processes in a variety of cells, including cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Wait.
  • the total expression level of ERK protein (tERK) remains stable in cells, and after activation by upstream signals, ERK protein is phosphorylated and activates kinase activity, which is involved in biological reactions, and thus can be determined by detecting the level of phosphorylated ERK (pERK). The degree of activation of the ERK protein.
  • the content of the present application will be described in detail by the following examples, but the content of the present invention is not limited thereto.
  • the reagents and instruments used are conventional reagents and instruments in the art, and can be obtained from common commercial sources; the method used is a conventional method, and those skilled in the art can have no problem. The method is implemented according to the content and the corresponding result is obtained.
  • aqueous extract solution The tea aqueous extract was dissolved in distilled water to a concentration of 5 mg/ml, and then diluted to 20, 100 and 500 ⁇ g/ml with serum-free DMEM medium for use.
  • LLC-PK1 cells purchased from ATCC, Cat. No. CL-101
  • LLC-PK1 was selected as a cell model for ERK activation evaluation of tea samples. In the process of cell passage, the cell morphology and biological characteristics will change slowly due to the increase of algebra, so the LLC-PK1 cell algebra used for tea-like activation of ERK evaluation is limited to 12 generations.
  • LLC-PK1 frozen cells were inoculated into a 60 mm culture dish at a seeding density of 10 6 cells/dish.
  • DMEM medium Sigma containing 10% fetal bovine serum (FBS, Atlanta Biologicals, Cat. No. S11550) and 1% penicillin/streptomycin (P/S, Fisher, Cat. No. MT-30-002-CL)
  • FBS fetal bovine serum
  • P/S penicillin/streptomycin
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • the cell culture medium is replaced with fresh serum-free DMEM medium for 30 minutes; the cells at this time It can be used in the evaluation experiment of tea-activated ERK.
  • PBS ice-cold phosphate buffer
  • RIPA cell lysate (containing 1 mM EDTA, 150 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 2 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 , 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 ⁇ g/ml enzyme Inhibitor (Sigma, Cat. No. P8340, pH 7.4)), cell lysates were collected.
  • the protein was transferred to the NC membrane by electrophoresis at 95 V for 1.5 h in a Western blotting system.
  • NC membrane was taken out, and the membrane was sealed with TBST buffer (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20) containing 1% milk and 1% bovine serum albumin, and blocked on a shaker for 1 h.
  • TBST buffer (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20) containing 1% milk and 1% bovine serum albumin, and blocked on a shaker for 1 h.
  • Example 6 Western blotting (IB) method for detecting total ERK
  • Example 8 Detection and analysis of the activation of ERK by aqueous extracts of tea leaves
  • tea-like pERK levels there were 48 tea-like pERK levels and no statistically significant difference between the blank control group and the blank control group, accounting for 41.0% of the total tea sample; 69 tea samples could be activated compared with the blank control group (ie, the pERK level was increased by 1 time) or Significant activation (ie, more than 1 fold increase in pERK levels) ERK, of which 43 tea-like pERK levels increased by a factor of 1 and 26 tea-like pERK levels increased by 1 to 2 times. It can be seen that the activation effects of different tea leaves on ERK vary greatly.
  • Table 2 pERK levels in different tea aqueous extracts at 1 ⁇ g/ml versus blank control
  • the tea aqueous extract obtained in Example 7 was used to treat LLC-PK1 cells and to detect the activation of ERK.
  • the No. 26 tea water extract (26#-GTE) was selected to analyze the time and concentration effect of activation of ERK phosphorylation reaction.
  • the time effect after treatment of cells with 5 ⁇ g/ml tea water extract for 4h, the pERK level still increased by 2 times compared with the control (Fig. 1-A), showing the uniqueness of tea water extract. It is different from the transientity of the general drug to activate ERK through the growth factor receptor.
  • 0.2 ⁇ g/ml of 26#-GTE significantly activated ERK phosphorylation and reached the maximum effect of activation at 10 ⁇ g/ml (Fig. 1-B).
  • ERK when the water extract of tea leaves at 1 ⁇ g/ml, ERK can be activated to make the pERK levels 1.44, 1.40, and 0.89 times of the blank control group, respectively, which is 0.44, 0.4, and -0.11 times, respectively, and when 5 ⁇ g/ When ml is used, the level of pERK after activation can be increased by more than 1.5 times, and the highest can be increased by 5 times. Therefore, these three tea samples are unqualified.
  • the ECG concentration in the water extract of 1 ⁇ g/ml is closer to the physiological concentration after drinking the tea, and the level of pERK that activates ERK at 5 ⁇ g/ml will reach the highest value.
  • the aqueous extracts of the tea samples were selected to have test concentrations of 1 ⁇ g/ml and 5 ⁇ g/ml.
  • An excellent tea sample with the effect of activating ERK should have a significant (p ⁇ 0.05) activation of ERK to more than double the expression of pERK at 1 ⁇ g/ml, while at 5 ⁇ g/ml Its activation of ERK increased the expression level of pERK by more than 2 fold.

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Abstract

一种茶叶品质的鉴定方法。通过检测茶叶中表儿茶素没食子酸酯(ECG)含量水平筛选出的特定茶叶，并测定该特定茶叶的水浸提物对细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)产生的磷酸化蛋白pERK表达增加水平的作用，从而作为一种具有特定生物学活性的茶叶品质好坏的判断依据。该方法科学、准确、易操作，可以基于特定生物学活性有效鉴定茶叶品质，有利于茶叶市场实现以生物学活性为判别标准的茶叶品质管理的规范化。

Description

一种鉴定茶叶品质的方法 技术领域
本发明涉及茶叶品质的鉴定方法，具体地，涉及通过茶叶中的活性成分及其生物学功效来鉴定茶叶品质的方法。
背景技术
茶是一种天然的、健康的绿色饮料，从“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼(茶)而解之”开始，茶叶的饮用与传播为人们的健康和幸福指数做出了显著的贡献。
中药及植物提取物在过去几十年间得到迅速发展。2013年美国草药类膳食补充剂市场的总销售额为60.32亿美元。2014年美国草药茶销售额达到17.5亿美元，比2013年上升了5.9％。伴随着中药及植物药、以及相应的膳食补充剂市场的不断扩大，如何控制植物提取物的质量，这一问题显得越发迫切。由于茶叶等原料中的药效成分受到茶树品种、茶树的生长年限、茶叶的产地、茶叶的生长季节、茶园的栽培管理措施、茶叶的加工方法等多种因素影响，导致茶叶原材料的质量不稳定，进而导致相关茶叶产品的质量、品质，特别是具有特定生物学活性的茶叶品质难以控制。因此，迫切需要找到一种用于鉴定具有特殊生物学活性效应的茶叶产品的方法，这对于茶叶健康产品的开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过分析茶叶中的活性成分及其生物学活性鉴定茶叶品质的方法，从而解决现有技术存在的问题。
本发明的鉴定茶叶品质的方法，包括：
(1)检测茶叶中的表儿茶素-3-O-没食子酸酯(ECG)含量；优选地，利用HPLC法，按照GB/T 8313-2008的方法检测；
(2)以茶叶水浸提物处理细胞，检测细胞中磷酸化的胞外信号调节激酶(pERK)的水平。
优选地，茶叶中ECG的含量基于茶叶总重量至少为2.0％(w/w)，优选至少为4.0％(w/w)；以1μg/mL茶叶水浸提物处理细胞10min后，细胞中pERK的水平与未处理的细胞相比增加至少1倍，以5μg/mL茶叶水浸提物处理细胞 10min后，细胞中pERK的水平与未处理的细胞相比增加至少2倍。
优选地，所述茶叶为绿茶；进一步优选地，所述茶叶为未经发酵或氧化加工的绿茶。
优选地，所述茶叶水浸提物的获得方法为：将茶叶粉碎后用70℃以上纯水浸提，浸提物经40～60℃减压浓缩至粘稠状，置于-15℃～-25℃冷冻4～12小时，然后置于-60～-80℃冷冻干燥机中，真空干燥24～48小时后得到茶叶水浸提物的冻干粉。优选地，将茶叶粉碎后用70℃以上纯水浸提步骤还包括利用超声提取。
进一步优选地，所述茶叶水浸提物中ECG含量基于茶叶水浸提物重量为2.5％(w/w)以上；优选地，所述茶叶水浸提物中ECG含量为5％(w/w)以上。
优选地，所述细胞为表达Na+/K+-ATP酶的细胞；更优选地，所述细胞为LLC-PK1细胞。
本发明提供的方法检测茶叶中的活性成分ECG，进一步检测该活性成分对胞外信号调节激酶(ERK)的激活作用，从而基于这两项来鉴定茶叶品质，为茶叶的鉴定提供了新的标准和方法，科学准确、容易实施，标准清楚，有效控制了茶叶原材料的质量和品质，便于快速筛选出有健康功效的茶叶，有利于实现基于茶叶健康功效的一种茶叶品质规范化的管理。
附图说明
图1：LLC-PK1细胞中，26号绿茶水浸提物激活ERK磷酸化的效应。A，时间效应：5μg/ml的茶叶水浸提物处理细胞不同时间后对pERK的影响结果；B，浓度效应：茶叶水浸提物以不同浓度处理细胞10min后对pERK的影响结果；C，茶叶水浸提物脱儿茶素后(1μg/ml)对pERK的影响结果；
其中，Con，对照；26#，26号绿茶样品；脱除儿茶素26#，脱除儿茶素后的26号绿茶样品。
图2：茶叶水浸提物中ECG(A)和EGCG(B)含量与pERK激活的相关性分析。
图3：LLC-PK1细胞中，不同的茶叶水浸提物对磷酸化ERK(pERK)激活的影响对比；
其中，Con，对照；GTE 1，绿茶水浸提物1号；GTE 2，绿茶水浸提物2号；GTE 3，绿茶水浸提物3号；pERK，磷酸化ERK；tERK，总ERK。
具体实施方式
表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG，epigallocatechin-3-gallate，Mw:458.4)和表儿茶素-3-O-没食子酸酯(ECG，epicatechin-3-gallate，Mw:442.4)是茶叶中茶多酚生物活性的主要成分。CN200310111367.2公开了ECG和EGCG在动物模型中可用于治疗慢性肾功能衰竭、尿毒症。
Na+/K+-ATP酶(简写为NKA)又称钠钾泵或钠泵，最早由JC.Skou(1957)发现。钠钾-ATP酶从功能上可分为受体型钠钾-ATP酶(或钠钾-ATP酶受体)和离子泵型钠钾-ATP酶，前者参与相关信号传递，后者维持细胞内离子平衡。日本学者Hideo Ochiai等在期刊Biochemical Pharmacology 2009，78:1069-1074上公开了ECG和EGCG可以与从猪肾脏中纯化得到的Na+/K+-ATP酶结合。
胞外信号调节激酶(ERK)是发现的第一个丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，包括ERK1和ERK2，它参与调控了多种细胞的重要生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等。在细胞中ERK蛋白总表达水平(tERK)保持稳定，在被上游信号激活后，ERK蛋白被磷酸化并激活激酶活性，参与生物学反应，因此可通过检测磷酸化ERK(pERK)的水平来测定ERK蛋白的活化程度。
本申请的内容将通过以下实施例详细说明，但本发明的内容不限于此。在以下实施例中，如无具体说明，所使用的试剂和仪器均为本领域常规试剂和仪器，可以从普通商购途径获得；所使用的方法为常规方法，本领域技术人员可以毫无问题地根据所述内容实现该方法并得到相应的结果。
实施例一：茶叶中ECG含量的检测
按GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》检测茶叶中的ECG含量，所使用的方法和仪器等完全按照该标准执行。
实施例二：茶叶水浸提物的制备
1、取5g粉碎茶叶，100ml沸水冲泡，超声提取15min，过滤后收集滤液。向提取后的茶渣中再次加入100ml沸水，超声提取15min，过滤后合并滤液，40～60℃减压浓缩至粘稠状，置于-15℃～-25℃冷冻4～12小时，然后置于-60～80℃冷冻干燥机中，真空24～48小时后得到茶叶水浸提物冻干粉。
2、水浸提物溶液配制：将茶叶水浸提物溶解至蒸馏水中，配制浓度为5mg/ml，然后用无血清DMEM培养液分别稀释至20、100和500μg/ml备用。
实施例三：LLC-PK1细胞的培养
猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1细胞(购自ATCC公司，货号：CL-101)源自猪肾小管上皮，富含NKA，是研究ECG通过作用细胞膜受体NKA激活ERK的最佳细胞，因此选用LLC-PK1作为细胞模型用于茶样的ERK激活评价。在细胞传代过程中，由于代数的增加，细胞形态和生物学特性会发生缓慢的改变，因而用于茶样激活ERK评价的LLC-PK1细胞代数限制在12代以内。
LLC-PK1冷冻细胞经复苏后，接种到60mm培养皿中，接种密度为106个细胞/皿。用含10％胎牛血清(FBS，Atlanta Biologicals公司，货号：S11550)和1％青霉素/链霉素(P/S，Fisher公司，货号：MT-30-002-CL)的DMEM培养基(Sigma公司，货号：D1152)，在37℃、5％CO2培养箱中进行细胞培养。
当细胞生长至85％-90％密度时，用Hank's平衡盐溶液(HBSS，Sigma公司，货号：H9269)洗涤细胞2～3次后，将培养液换成无血清的DMEM，继续培养过夜。
次日，在细胞密度约达100％(注：细胞过密或过疏均会影响ERK的激活评价)时，将细胞培养液更换为新鲜的无血清DMEM培养液继续培养30min；此时的细胞可用于茶叶激活ERK的评价实验。
实施例四：LLC-PK1细胞的处理和蛋白质收集
1、将配制好的茶叶水浸提物溶液在37℃下预热数分钟，将预热后的溶液(以无血清培养基作为空白对照)加至DMEM细胞培养液中(30μl加至3ml中)，茶样水浸提物的终浓度为0.2、1和5μg/ml。
2、将加入步骤1的茶叶水浸提物的细胞(按实施例三培养得到的细胞)在37℃、5％CO2下继续培养10min后，将培养皿取出并置于冰块上，去除培养基并且用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS，1L diH2O中含0.27g KH2PO4,、1.42gNa2HPO4、8g NaCl、0.2g KCl，pH＝7.4)洗涤3次，加入180μl RIPA细胞裂解液(内含1mM EDTA、150mM Tris、150mM NaCl、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、2mM NaF、2mM Na3VO4、1mM苯甲基磺酰氟、1μg/ml酶抑制剂(Sigma，货号P8340，pH 7.4))，收集细胞裂解物。
3、将细胞裂解物转移至1.5ml试管中，4℃摇床继续裂解15min后，在14000g、4℃下离心15min，收集上清液，测定其中的蛋白质浓度，并用于后续的蛋白质免疫印迹。
实施例五：处理后的细胞中的pERK的检测
1、从实施例四的上清液取含40μg蛋白质的溶液，补充RIPA裂解液至40μl总体积，再按照4:1的体积比，加入10μl的5倍浓度的上样缓冲液(2％(质量百分比，下同)SDS、10％甘油、5％β-巯基乙醇、0.01％溴苯酚和62mMTris-HCl，pH6.8)，沸水浴煮5min后，上样，进行10％SDS-PAGE凝胶电泳，直至分离出约44kDa的蛋白条带，停止电泳。
2、将胶取出后，在蛋白质印迹系统中，在95V条件下电泳1.5h，将蛋白转移至NC膜。
3、转印完毕后，取出NC膜，加入含1％牛奶和1％牛血清蛋白的TBST缓冲液(20mM Tris、137mM NaCl、0.1％Tween-20)进行膜的封闭，在摇床上封闭1h。
4、封闭完毕后，加入1％牛奶+1％牛血清蛋白TBST的缓冲液，并加入内含1:1000的一抗ERK磷酸化抗体pERK 42/44抗体(Cell Signal公司，货号：9101L)，在4℃条件下，摇床孵育过夜。
5、一抗孵育完毕后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。完毕后，在室温下加入内含3％牛奶的TBST溶液，并加入1:1000的二抗羊抗兔IgG-HRP(Santa Cruz公司，货号：sc-12314)，摇床孵育1h。
6、二抗孵育完毕后，用TBST洗涤3次，每次5min。完毕后，将NC膜取出，在暗室中，加上ECL增强型发光试剂盒(Thermo公司，货号：34080)激发膜发出光信号，在暗室中用X片压片显影后获得pERK蛋白的印迹条带。
7、每个实验重复三次，用Image J软件扫描并定量检测印迹条带的密度，并用Graphpad作图软件对量化后的数据进行统计分析。结果用平均值±标准误表示。
实施例六、蛋白质免疫印迹(IB)法检测总ERK
将上述实施例五的步骤6中压片后的NC膜放在TBST缓冲液中洗涤数分钟后，加入10ml膜再生液1(29.2g/L NaCl，2.86％HAc(乙酸))，摇床孵育5min，之后，取出NC膜接着在10ml膜再生液2(4g/L NaOH)中摇床孵育2min终止反应，使膜上已有的pERK一抗二抗和抗原解离，然后重新进行封闭、加入总ERK的一抗(Santa Cruz公司，货号：sc-153)和二抗(Santa Cruz公司，货号：sc-12314)，操作步骤同上述实施例五中的步骤3-7。获得的总 ERK条带密度值作为内对照。
实施例七：不同茶叶中ECG含量分析
从中国不同茶区收集了不同季节、不同方法和不同嫩度的茶叶样品共129个，根据实施例一的方法检测它们的ECG含量，其中有122种检测到ECG含量大于2％(w/w)，有68种ECG含量大于4％(w/w)。利用实施例二的方法提取茶叶水浸提物，并对122种茶样及茶叶水浸提物中的ECG、EGCG等主要成分进行了HPLC定量(GB/T 8313-2008)检测。如表1所示，不同茶叶样品中ECG含量差异显著，正说明不同茶叶的品质差异显著。其中，茶叶水浸提物ECG含量大于2.5％(w/w)的茶样有117个，大于5％(w/w)的茶样有53个。
表1：122种茶样中的主要儿茶素成分含量(％，w/w)
Figure PCTCN2017088079-appb-000001
实施例八：茶叶水浸提物对ERK的激活作用的检测和分析
1、不同茶叶的水浸体物对ERK的激活作用
将实施七筛选到的117个茶样，制备它们的茶叶水浸提物，并调节其浓度为1μg/ml。根据实施例四的方法处理LLC-PK1细胞10分钟，并根据实施例五的方法检测茶叶水浸提物对ERK的激活作用。结果如表2所示。其中，有48个茶样pERK的水平与空白对照组无统计学显著差异，占茶样总数的41.0％；有69个茶样对比空白对照组可以激活(即，pERK水平增加1倍以内)或显著激活(即，pERK水平增加1倍以上)ERK，其中43个茶样pERK水平增加1倍以内，有26个茶样pERK水平增加1～2倍之间。由此可见，不同茶叶对ERK的激活效应有巨大差别。
表2：不同茶叶水浸提物在1μg/ml时相对空白对照组的pERK水平
Figure PCTCN2017088079-appb-000002
Figure PCTCN2017088079-appb-000003
取筛选出的pERK水平增加1～2倍之间的26个茶样，调节其水浸提物的浓度为5μg/ml，同样依据上述方法处理细胞并检测茶叶水浸提物对ERK的激活作用。结果显示，处理10分钟后，这26个样品中，有17个使细胞中pERK的水平增加了至少2倍。
因此，根据上述实验结果，在129种茶样中，有17种茶叶的品质优良，具有健康功效。
2、茶叶水浸提物激活ERK的时间效应和浓度效应
以同样的方法使用实施例七得到的茶叶水浸提物对LLC-PK1细胞进行处理并检测ERK的激活情况。其中，选取第26号茶叶水浸提物(26#-GTE)分析激活ERK磷酸化反应的时间与浓度效应。在时间效应中，5μg/ml的茶叶水浸出物处理细胞4h后，pERK水平与对照相比仍有2倍的增加(如图1-A)，表现出了茶叶水浸出物的独特性，有异于一般药物通过生长因子受体激活ERK的瞬时性。在浓度效应中，0.2μg/ml的26#-GTE就可显著性激活ERK磷酸化，并且在10μg/ml时达到激活效应的最大值(如图1-B)。
3、茶叶水浸提物中与ERK有关的活性成分分析
在上述实验基础上，当用乙酸乙酯萃取除去26#-GTE中的ECG等儿茶素后，剩下的物质则没有ERK的激活作用(如图1-C)。这些结果表明，茶叶水浸提物中，以ECG为主要成分的儿茶素类物质是激活ERK的主要功效成分。由于茶叶水浸出物中的儿茶素类物质除ECG外，还含有大量的其它儿茶素如EGCG，因此统计了1μg/ml茶叶水浸提取物对LLC-PK1细胞处理十分钟后对ERK的激活效应与不同儿茶素含量的相关性。结果显示其激活ERK活性的能力与ECG含量显著正相关(p<0.0001)(图2-A)，但与EGCG含量无显著相关性(图2-B)。
上述这些结果说明，茶叶的特定生物学活性与ECG含量呈正相关，但仅 仅化学成分检测不足以完全评价茶叶或茶叶水浸提物的生物学活性，还必须直接检测其激活细胞特定信号蛋白的能力。因此，一个优异茶叶，其水浸提物在1μg/ml浓度处理LLC-PK1细胞10分钟，对比未处理的空白对照组应当可显著激活ERK活性(得到的pERK水平增加1倍以上)，同时在5μg/ml浓度处理时，其激活的pERK水平应当为空白对照组的2倍以上。
实施例九：
取三个茶叶样品，按照上述实施例一检测ECG的含量，分别为：GTE19.96％、GTE2 8.02％、GTE3 8.35％。按照上述实施例二～六的方法处理细胞并检测pERK。茶样激活ERK的免疫印迹条带如图3所示。总体而言，茶叶水浸提物在1μg/ml时，可激活ERK使pERK水平分别为空白对照组的1.44、1.40、0.89倍，即分别增加0.44、0.4和-0.11倍，而当在5μg/ml时，可使激活后的pERK水平增加在1.5倍以上，最高的可增加5倍。因而，这三个茶样都不合格。其中1μg/ml的水浸提物中的ECG浓度更加接近人体饮茶后的生理浓度，而在5μg/ml时激活ERK的pERK水平将达到最高值。因此，在评价ERK激活作用时，茶样的水浸提物选用的测试浓度为1μg/ml和5μg/ml。一个具有激活ERK作用的优异茶样，应当具备其水浸提物在1μg/ml时，具有可显著(p<0.05)激活ERK使pERK表达水平增加一倍以上的作用，而在5μg/ml时，其激活ERK使pERK表达水平增加在2倍以上。

Claims (10)

  1. 一种鉴定茶叶品质的方法，包括：
    (1)检测茶叶中的表儿茶素-3-O-没食子酸酯(ECG)含量；
    (2)以茶叶水浸提物处理细胞，检测细胞中磷酸化的胞外信号调节激酶(pERK)的水平。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其中，茶叶中ECG的含量基于茶叶总重量至少为2.0％(w/w)；以1μg/mL茶叶水浸提物处理细胞10min后，细胞中pERK的水平与未处理的细胞相比增加至少1倍，以5μg/mL茶叶水浸提物处理细胞10min后，细胞中pERK的水平与未处理的细胞相比增加至少2倍。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其中，茶叶中ECG的含量基于茶叶总重量至少为4.0％(w/w)。
  4. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述茶叶为绿茶。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述茶叶为未经发酵或氧化加工的绿茶。
  6. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述茶叶水浸提物的获得方法为：将茶叶粉碎后用70℃以上纯水浸提，浸提物经40～60℃减压浓缩至粘稠状，置于-15℃～-25℃冷冻4～12小时，然后置于-60～-80℃冷冻干燥机中，真空干燥24～48小时后得到茶叶水浸提物的冻干粉。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述茶叶水浸提物中ECG含量基于茶叶水浸提物重量为2.5％(w/w)以上。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述茶叶水浸提物中ECG含量基于茶叶水浸提物重量为5％(w/w)以上。
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，所述细胞为表达Na+/K+-ATP酶的细胞；优选地，所述细胞为LLC-PK1细胞。
  10. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，按照GB/T 8313-2008的方法检测茶叶中的表儿茶素-3-O-没食子酸酯(ECG)含量。
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