KR102643533B1 - 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법 - Google Patents
발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 복합소재는, 활성산소종을 증가시키지 않고, 사이토카인(TNF-α, IL-6 , IL-1β) 분비능과 산화질소 분비능을 향상시키고, MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현과 세포 표면 활성 인자 발현을 유도하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다음과 같은 연구과제를 통해 도출된 결과물이다.
[부처명 : 충청남도 서천군 / 과제관리전문기관명 : 충남테크노파크
연구사업명 : 2020년 해양바이오 전략소재 및 상품화 공정개발 지원사업
연구과제명 : 다당체 성분이 증진된 해삼복합소재(SJBG-F)를 이용한 면역조절능 증진 소재제조, 응용제품 개발 및 산업화
연구기간 : 2020.5.11~2021.4.10]
인삼의 주요 생리활성 물질들은 진세노사이드(ginsenoside)와, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 다당체(polysaccharide), 인삼 단백질 및 페놀성 물질 등이 알려져 왔다.
진세노사이드는 면역 및 염증 반응 조절에 관여한다고 알려져 있다. 또한 다당체들은 면역조절(immunostimulatory), 항암(antitumor), 항산화(antioxidant)등의 효능이 있는 것으로 발표되고 있다.
해삼(Stichopus japonicus)은 ‘바다의 인삼’이란 뜻으로 실제로 해삼에는 사포닌 성분이 포함되어 있으며, 해삼의 사포닌 성분이 고지방 사료로 유도된 마우스에서 비만 및 간 지방증과 glucose 과민증에 효과가 있다는 보고도 있다.
해삼의 일반 성분은 단백질 함량이 2~5%이며 지방은 0~0.4%로 그 함량이 매우 낮으며, 미네랄은 칼슘과 나트륨이 굴, 가리비 등에 비해 10배 이상 많으며, 칼륨, 아연, 구리, 철분은 미량 함유하고 있으며 동물 등의 세포간 조직, 신경조직 및 연골조직에서 발견되는 당단백질인 황산 콘드로이친 (Chondroitin sulfate, Chs)을 2.6~3.2%를 함유하고 있다.
해삼의 기능성에 관한 연구로 해삼의 사포닌 성분은 고지방식이를 먹인 mice에서 비만과 간지방증에 대한 보호 효과가 보고되었고, 해삼 당단백질과 황산콘드로이친은 항돌연변이 유발 실험과 사람의 위암세포와 결장암세포의 성장을 82~95%까지 크게 억제하는 것으로 알려져 있으며, 해삼에서 추출한 frondanol-A5는 췌장암 세포의 cell cycle arrest와 apoptosis를 일으켜 성장을 억제한다는 보고 등이 있다. 우리나라에서는 해삼을 오래 전부터 식용하고 있으나 그 이용성 등에 관한 연구는 많이 이루어지고 있지 않다.
따라서 본 출원인은 산성다당체의 기능성을 이용한 식품으로 해삼과 흑삼을 이용한 면역관련건강 식품을 개발하기 위해 해삼과 흑삼을 백국균(white-koji mould)으로 발효시켜 그 생리활성의 변화를 실험하여 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌을 보면, 대한민국 등록특허공보 10-1712565에 '증숙건해삼의 제조방법 및 상기 증숙건해삼을 사용한 해삼성분이 함유된 건강식품 제조방법'이 기재되어 있고, 대한민국 공개특허공보 10-2013-0081009에 '건해삼 혼합 홍삼환의 제조방법 및 그 제조방법에 따라 제조된 건해삼 혼합 홍삼'이 기재되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 10-1708167에 '홍삼과 해삼의 가수분해 원료를 포함한 식품조성물 및 그 제조방법'이 기재되어 있다. 그러나 상기 문헌들은 발효흑삼과 발효해삼에 대해서 기재되어 있지 않다.
해결과제는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물를 복합하여 면역력 활성을 증진시킨 소재를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
해결수단은,
해삼을 백국균으로 발효하여 발효해삼을 제조하는 1단계;
상기 발효해삼을 멸균수로 추출하여 발효해삼 추출물을 제조하는 2단계;
인삼을 복수 회 증숙 및 건조를 반복하여 흑삼을 제조하는 3단계;
상기 흑삼을 백국균으로 발효하여 발효흑삼을 제조하는 4단계;
상기 발효흑삼을 에탄올로 추출하여 발효흑삼 추출물을 제조하는 5단계; 및
상기 발효해삼 추출물과 상기 발효흑삼 추출물을 혼합하여 복합소재를 제조하는 6단계;를 포함하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법이다.
상기 1단계에서, 백국균은 해삼 무게의 1~3%로 첨가하여 24~72시간 발효하는 것을 특징으로 한다.
상기 6단계에서, 발효해삼 추출물과 발효흑삼 추출물은 3:7 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 한다.
상기 발효흑삼 추출물에는 21-25%로 증가된 산성다당체와 진세노사이드인 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가되어 포함되고, 상기 발효해삼 추출물에는 26.14-74.21%로 증가된 산성다당체가 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 복합소재는,
활성산소종을 증가시키지 않고, 사이토카인(TNF-α, IL-6 , IL-1β) 분비능과 산화질소 분비능을 향상시키고, MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현과 세포 표면 활성 인자 발현을 유도하는 것을 특징으로 한다.
해결수단은, 상기 방법으로 제조된 복합소재이다.
본 발명에 따른 방법은, 21-25%로 산성다당체가 증가되고, 흑삼 특유의 진세노사이드인 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가된 발효흑삼 추출물을 제조할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 방법은, 균 접종량과 발효시간에 따라 26.14-74.21%로 산성다당체가 증가된 발효해삼 추출물을 제조할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 방법은, 활성산소종을 증가시키지 않고, 사이토카인(TNF-α, IL-6 , IL-1β) 분비능을 향상시키며, 산화질소 분비능을 향상시키고, MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현을 유도하며, 세포 표면 활성 인자 발현을 유도함으로써, 면역활성을 증진시키는 복합소재를 제조할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
도 1은 발효흑삼 추출물의 산성다당체 함량 분석 결과 그래프이다.
도 2는 발효해삼 추출물의 산성다당체 함량 분석 결과 그래프이다.
도 3은 발효흑삼 추출물의 진세노사이드 함량 변화 분석 결과 표이고, 도 4는 크로마토그램이다.
도 5는 세포생존율 분석 결과 그래프이다.
도 6은 세표사멸 분석 결과 그래프이다.
도 7은 활성산소종 평가 결과 그래프이다.
도 8은 사이토카인 분비능 분석 결과 그래프이다.
도 9는 산화질소 분비능 분석 결과 그래프이다.
도 10은 MAPKs 인산화 및 NF-κB 발현 분석 결과 그래프이다.
도 2는 발효해삼 추출물의 산성다당체 함량 분석 결과 그래프이다.
도 3은 발효흑삼 추출물의 진세노사이드 함량 변화 분석 결과 표이고, 도 4는 크로마토그램이다.
도 5는 세포생존율 분석 결과 그래프이다.
도 6은 세표사멸 분석 결과 그래프이다.
도 7은 활성산소종 평가 결과 그래프이다.
도 8은 사이토카인 분비능 분석 결과 그래프이다.
도 9는 산화질소 분비능 분석 결과 그래프이다.
도 10은 MAPKs 인산화 및 NF-κB 발현 분석 결과 그래프이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.
실험예 1. 재료 및 방법
1. 발효흑삼 제조
충남 금산 금산수삼시장에서 금산에서 재배된 5년근 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 구입하여 사용하였다. 인삼을 스크류 세척기 (Cleaning Machines, Sambo, Pocheon, Korea)에 넣고 10분간 총 3회 반복해서 세척하였으며 세척 과정 중에 껍질이 손상되지 않도록 세척하였다. 세척한 후 무게, 수분함량, 총당 및 조단백질 등을 분석 한 후, 평균 규격에 맞는 인삼을 선별한 후 흑삼의 가공 원료삼으로 사용하였다.
세척된 인삼은 건조기 (KL-290, WooSung Election Company,Andong, Korea)를 이용하여 50℃에서 24시간 건조하여 표면이 건조된 삼을 제조하였으며 건조삼은 증숙기 (Mach Steamer 10-KM, Daechang ENG, Eumseong, Korea)를 사용하여 95℃에 서 6시간 증숙 후, 60℃에서 수분 함량 15%까지 건조하였다.
건조된 삼에 수분과 백국균(Aspergillus awamori var.kawachii : white-koji mould)을 접종하여 발효삼을 제조하였으며 다시 증숙 및 건조 과정을 5회 반복하여 최종적으로 수분함량이 13% - 15% 이내가 되도록 건조하여 발효 흑삼을 제조 하였다.
제조된 흑삼을 70％(V/V) ethanol에 1 : 10의 비율로 넣어 80℃에서 8시간 씩 2회 추출하였으며, 추출한 후 5㎛ 정성여과지 (No.1, Advantec MFS Inc., Dubiln, CA, USA)를 사용하여 여과하였다. 여과된 추출액을 감압농축기를 이용하여 농축 후 소재로 사용하였다.
2. 발효해삼 제조
해삼(Stichopus japonicus)은 충남 보령시 및 태안군등 서해안 자생 해삼을 구입하여 건조, 자숙 및 발효과정을 거쳐 발효해삼을 제조하여 추출 및 농축하여 사용하였다. 건조해삼(DS)은 재수화하였으며, 생해삼은 찌기(SS)와 자숙(BS)하여 3 가지 시료를 본 실험에 사용하였다.
해삼은 백국균(white-koji mould)을 이용하여 발효하였다. 원료의 수분함량을 60%로 조정 후 멸균기에서 멸균 후 원료 무게의 1, 2, 3%의 백국균(white-koji mould)을 각각 첨가하여 30℃에서 0, 24, 36, 48, 60, 72 시간 발효하여 산성다당체 함량을 측정하여 발효조건을 결정하였다.
해삼 발효물은 10배수의 멸균수를 넣어 60℃에서 추출하여 추출액을 감압농축하여 발효 농축액을 제조하여 실험에 사용하였다.
3. 산성다당체 측정
발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)의 산성다당체 함량은 3-phenylphenol법(Choi et al., 2014)으로 측정하였다. 추출물 0.1 g에 10 mL의 증류수를 첨가한 다음 초고속 원심분리기를 이용하여 7,000 rpm에서 15분 동안 원심분리를 한 후 여과지(Whatman No 1.)로 여과한 다음 사용하였다. 추출물 1 g에 5 mL의 0.0125 M sodium tetraborate/H2SO4를 첨가한 후 항온수조에서 100°C, 5분 동안 가열하고 15분 동안 냉각시켰다. 1 mL의 0.15% 3-phenyl-phenol/0.5% NaOH를 첨가한 후 분광광도계를 이용하여 520 nm에서 측정하였다. 표준곡선은 galacturonic acid를 이용하여 0~100 μg/g으로 측정하였다.
4. 진세노사이드 분석
시료 1.0 g을 농축용 플라스크에 평량해 넣고 70% 메탄올 50 mL을 첨가하고 80℃ 환류냉각추출기에서 1시간 추출하였으며, 10분간 방냉 후 추출액을 여과하고, 잔사에 다시 동량의 용매를 넣어 2회 반복 추출하였다. 추출물을 농축플라스크에 모아 45℃ 수조에서 rotary evaporator를 이용하여 진공 농축하였다. 농축 후 플라스크 내 잔류물을 10 mL 증류수에 녹여 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하였다. Ginsenoside 함량 측정은 HPLC (Agilent 1260, Agilent Technologies, USA)를 이용하여 측정하였다. HPLC 분석은 Agilent poroshell 120EC-C18 (3.0 mm × 50 mm, 2.7 ㎛) column을 사용하여 표와 같이 이동상의 유속과 컬럼 온도는 각각 0.8 ㎖/min, 35℃로 하고, UV 검출기의 검출 파장은 203 nm로 하여 분석하였다. (하기의 표 1 : HPLC 이동상 조건)
| Time (min) | Acetonitrile (%) | Water (%) |
| 0 | 5 | 95 |
| 2 | 5 | 95 |
| 4 | 11 | 89 |
| 9 | 13 | 57 |
| 19 | 21 | 79 |
| 26 | 28 | 72 |
| 28 | 28 | 72 |
| 32 | 32 | 68 |
| 34 | 32 | 68 |
| 40 | 45 | 55 |
| 42 | 45 | 55 |
| 50 | 55 | 45 |
| 55 | 55 | 45 |
| 62 | 5 | 95 |
5. 대식세포 배양
마우스 유래의 대식세포주인 Raw264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용했으며, 세포배양을 위해 100 unit/mL penicillin 및 100 unit/mL streptomycin과 10% fetal bovine serum을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Lonza, Walkersville, MD, USA)을 사용했고, 세포는 37°C, 5% CO2 incubator(Thermo, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
6. 대식세포 생존율 평가
해삼복합소재(SJBG-F)의 처리가 대식세포 생존율에 미치는 영향을 측정하기 위하여 대식세포를 96-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 15시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시킨 후, 해삼, 흑삼 및 해삼복합소재를 각각 희석배율에 따라 처리한 뒤 37℃로 유지되는 5% CO2 세포 배양기에서 24시간 배양한 후, 대식세포 생존율을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 방법에 의하여 측정하였다. MTT 시약을 PBS에 5 mg/mL의 농도로 용해하여 well당 30 μL씩 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후, 배양 상등액를 제거하고 세포 내 생성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich Co.)에 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 대식세포 세포 독성 평가
해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 세포사멸을 분석하기 위해 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용해 측정하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 Annexin V binding buffer를 이용하여 5×105 cells/mL 농도로 현탁시켰다. 이 용액으로부터 100 μL(1×105 cells)의 세포를 채취하여 5 mL culture tube에 분주하고, Annexin V-FITC(5 μL)와 PI-PE(5 μL)를 첨가하여 20분 동안 상온에서 염색을 실시한다. 염색된 혼합액에 Annexin V binding buffer(400 μL)를 첨가한 후 flow cytometer(BD FACSVerseTM; BD Biosciences) 분석을 실시하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software(V10, Tree Star, Ashland, OR, USA)를 사용해 평가하였다.
8. 대식세포 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 측정
세포 내 활성산소종은 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 세포를 염색하여 확인하였다. H2DCFDA가 세포 안으로 침투할 때 가수분해에 의해 dichlorofluorescein diacetate로 전환되고 활성산소종과 반응하여 dichlorofluorescein으로 산화되어 녹색의 형광을 발하게 된다. 세포에 H2DCFDA 10 μM을 37°C에서 30분간 염색한 후 PBS로 세척한 다음 flow cytometer(BD FACSVerseTM; BD Biosciences) 분석을 실시하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software를 사용하여 평가하였다.
9. 대식세포 사이토카인(cytokine) 분비능 측정
해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 대식세포 사이토카인 분비능을 측정하기 위하여 대식세포를 24 well plate에 well당 1×105 개로 분주하고 15시간 동안 배양한 다음, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 희석배율에 따라 처리한 뒤, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후, 배양 상등액에 포함되어 있는 사이토 카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β)의 함량을 측정하였다. 사이토카인의 측정은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit (BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다.
10. 대식세포 산화질소(nitric oxide; NO) 분비능 측정
분리된 배양 상층액 100 μL에 동량의 Griess(Sigma-Aldrich) 시약을 처리하여 10분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소의 농도는 아질산소듐(NaNO2, Sigma-Aldrich)을 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.
11. Western blot analysis
대식세포 Raw264.7를 6-well plate에 1×106 cell/well의 농도로 분주하여 15시간 동안 완전히 부착시키고 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS로 3회 세척한 후 NP40 cell lysis buffer(Biosource, Seoul, Korea)를 첨가한 뒤 13,000 rpm에서 15분간 원심분리해서 cell lysis를 분리하였다. 핵 내의 단백질을 분리하기 위하여, 상기 수집된 세포에 저장성 완충용액(10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM magnesium chloride(MgCl2), 10 mM potassium chloride(KCl), 0.5 mM dithiothreitol(DTT), 1 μM leupeptin 및 0.2 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF))을 20분간 처리한 후 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 세포질과 핵을 분리하였으며, 분리된 핵을 고장성 완충액(20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glycerol, 420 mM ethylene diaminetetraacetic acid(EDTA), 0.5 mM DTT, 1 μM leupeptin, 0.2 mM PMSF)을 처리하여 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 핵 단백질을 추출하였다. 분리된 cell lysate는 BCA protein detection kit(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질 정향을 실시하였고, well 당 10 μg의 cell lysate를 폴리아크릴아마이드 젤에 각각 loading하여 SDS-PAGE로 변성분리하였다. 그 다음, polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane(Millipore Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 transfer하였고, membrane은 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 blocking solution(5% skim milk solution)에서 1시간 방치하였다. 이후 TBST(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5)로 10분씩 3회 세척한 후, Cox-2, iNOS, p-ERK1/2, p-p38, p-IκBα 및 NF-κB의 발현량을 측정하기 위해 1차 항체(Cell signaling, Danvers, MN, USA)를 1:2,000으로 희석하여 4°C에서 15시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 10분씩 3∼5회 세척한 뒤, 2차 항체(goat-anti rabbit IgG; Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 1:5,000으로 희석하여 1시간 반응시켰다. 그 다음 TBST로 10분씩 3∼5회 세척한 뒤, 현상을 위하여 electrochemiluminescence(ECL; Millipore Merck KGaA) reagent를 사용하여 인화하였다.
12. 세포 표면 활성 인자(cell surface marker) 발현 확인
해삼복합소재(SJBG-F)의 처리가 대식세포의 세포 표면 활성 인자 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 대식세포를 12-well plate에 well당 2×105개로 분주한 후, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 후 24시간 동안 반응시키고 각각의 세포를 회수하였다. 항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 회수된 각각의 세포에 1μg/mL의 Fcγ Ⅰ/Ⅲ (BD Biosciences)을 처리하여 4°C에서 20분간 반응시킨 후, 세포 표면 활성 인자 분석을 위하여 anti-CD80-PE, anti-CD86-APC, anti-MHC-Ⅰ-PE 및 anti-MHC-Ⅱ-PE (BD Biosciences)와 같은 세포 표면 항체를 각각 1,000배 희석하여 각각의 세포에 처리하여 30분 동안 반응시키고 flow cytometer(BD FACSVerseTM; BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software를 사용하여 평가하였다.
13. 통계처리
이상의 실험에서 얻어진 결과는 통계학적 소프트웨어(GraphPad Prism Software, version 4.03; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 Tukey’s multiple comparison test에 이어 one-way ANOVA test로 분석하였으며, 시료 간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 수준에서 비교하였다.
실험예 2. 실험결과 및 분석
1. 발효흑삼(BGF)의 산성다당체 함량
인삼의 면역증진의 기능성은 인삼 성분 중 사포닌 및 다당체에 의한 효능 연구도 많이 보고되어 있다. 동물실험결과 홍삼에서 분리한 홍삼산성다당체는 생체의 면역력을 증진 시킨다고 알려져 있다.
실험결과, 발효 전 백삼(W.G), 홍삼(R.G), 흑삼(B.G)의 추출물의 산성다당체 함량은 백삼 15.0%, 홍삼 15.2%, 흑삼 17.3%에서 발효를 통해 백삼(F.W.G) 18.2%, 홍삼(F.R.G) 19.2%, 흑삼(F.B.G) 21.3%로 증가되는 것으로 분석되었다.
발효를 통해 흑삼에서 최고 21-25%의 산성다당체 추출율 증가 효과를 볼 수 있었으며 환원당 역시 발효 전 백삼 11.9%, 홍삼 14.8%, 흑삼 13.2%의 수율에서 발효를 통해 백삼 22.3%, 홍삼 26.8%, 흑삼 28.1%의 증가를 보였으며, 흑삼에서 최고 80-110%의 환원당 증가 효과를 볼 수 있었다(도 1 참조)
2. 발효해삼(SJF)의 산성다당체 함량
해삼의 산성다당체는 균 접종량과 발효시간에 따라 26.14-74.21%의 범위로 측정되었다(도 2 참조). 백국균(white-koji mould) 발효에서 산성다당체 함량이 높게 측정되었으며, 균 접종량과 발효시간에 따라서는 증가와 감소의 패턴이 나타났다.
본 실험에서는 건조해삼에 대하여 백국균(white-koji mould) 1% 첨가군에서 60시간 발효하였을 때 가장 높은 산성다당체 함량을 나타내었으며 발효에 의해 산성다당체 함량이 증가하는 것으로 나타났다.
3. 발효흑삼의 진세노사이드 함량 변화
백국균(white-koji mould)을 이용한 발효 흑삼에서는 흑삼 특유 진세노사이드인 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가 되는 것을 볼 수 있었다.
백국균(white-koji mould) 발효를 통해, 백삼에서 지표물질 Rg3, Rg5, Rk1의 함량이 0 mg/g, 홍삼에서는 1.3 mg/g, 흑삼에서는 1.9 mg/g 그리고 발효흑삼에서는 4.13 mg/g으로 증가하는 결과를 볼 수 있었다. (도 3 및 도 4 참조)
4. 세포 생존율 평가
발효해삼(SJF, 발효해삼 추출물, 건조해삼에 백국균 1% 첨가 60시간 발효 후60℃ 멸균수 추출), 발효흑삼(BGF, 발효흑삼 추출물, 백군균 발효 70%(V/V) 에탄올 추출) 및 해삼복합소재(SJBG-F, 발효해삼 추출물:발효흑삼 추출물 = 3:7 중량비로 혼합)의 세포독성 여부를 확인하기 위하여 대식세포 Raw264.7 cell에 각각 희석배수별(200X, 400X, 800X, 1600X, 3200X, 6400X)로 처리하여 세포 생존율을 MTT 방법을 통하여 평가하였다.
그 결과 발효해삼은 희석배수 200X 및 400X에서 세포독성이 나타났지만 800X부터는 세포독성이 나타나지 않았으며(도 5A), 흑삼 및 해삼복합소재의 경우 희석배수 1600X까지 세포독성이 나타났지만 3200X부터는 세포독성이 나타나지 않았다(도 5B, C).
따라서 추후 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)의 면역활성 비교 평가를 위해서 세포독성이 나타나지 않는 희석배수 3200X으로 고정하여 실험하였다.
5. 세포사멸(apoptosis) 평가
고정된 희석배수 3200X의 발효해삼, 발효흑삼 및 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 세포사멸(apoptosis) 여부를 확인하기 위하여 대식세포 Raw264.7 cell에 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 뒤 Annexin V/PI staining analysis를 통하여 평가하였다(도 6 참조).
그 결과 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 세포사멸을 일으키지 않았으며, 이는 희석배수 3200X에서는 세포독성이 나타나지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
6. 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 평가
활성산소종은 생체 내에 산화 생성을 합성하며 이렇게 생성된 산화물질은 생체에 치명적인 독성을 일으킨다고 알려져 있기(Rao & Balachandran, 2002)에 본 실험에서는 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 활성산소종의 생성 여부를 확인하기 위하여 대식세포 Raw264.7 cell에 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 뒤 H2DCFDA를 세포에 염색하여 측정하였다(도 7 참조).
그 결과, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 활성산소종이 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
7. 사이토카인(cytokine) 분비능 비교
사이토카인은 면역세포 간 상호작용을 매개하여 신호전달을 위한 중요한 면역조절인자(Byun & Byun, 2015)이며 대식세포의 대표적인 사이토카인은 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등이 있다.
본 실험에서는 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 대식세포 면역활성에 미치는 영향을 비교 평가하기 위하여 대식세포 Raw264.7 cell에 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 뒤 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비능을 측정해보았다(도 8 참조).
그 결과 전반적으로 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비능이 증가하였으며, 특히 해삼복합소재(SJBG-F)의 사이토카인 분비능이 월등히 높게 증가하였다. 따라서 해삼복합소재(SJBG-F)의 면역활성으로 인한 사이토카인 분비능이 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높다는 것을 확인할 수 있었다.
8. Cox-2 및 iNOS 관련 산화질소(nitric oxide; NO) 분비능 비교
산화질소는 대식세포의 활성화에 중요한 바이오마커로 사용(Flurkey, 1991; Gao et al., 2000; Jung & Park, 2005)되므로 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 산화질소 분비능 및 산화질소 관련 단백질(Cox-2 및 iNOS)의 발현을 확인하였다.
그 결과, 이전 사이토카인 결과와 유사하게 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 산화질소의 분비능이 증가하였으며, 특히 해삼복합소재(SJBG-F)의 산화질소 분비능이 월등히 높게 증가하였다(도 9 A 참조).
또한, 산화질소 관련 단백질 Cox-2 및 iNOS의 발현도 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 확인하였으며, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)에서 Cox-2 및 iNOS의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다(도 9 B 참조).
이로 인해 해삼복합소재(SJBG-F)는 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 면역활성이 높아 산화질소 분비능도 높다는 것을 확인할 수 있었다.
9. MAPKs 인산화 및 NF-κB 발현 비교
Mitogen-activated protein kinases(MAPKs)와 nuclear factor(NF)-κB는 대식세포에서 면역활성을 매개하는 대표적인 신호전달 체계로서, 외부 자극에 의해 면역반응이 매개되면 대식세포 내부의 신호전달 체계가 활성화되면서 면역매개물질인 사이토카인과 산화질소 등의 분비가 촉진된다(Brewer et al., 1992).
대표적인 MAPKs의 단백질에는 세포 밖 조절 단백질 인산화효소(extracellular regulated protein kinase; ERK)와 세린/트레오닌 단백질 인산화효소(serine/threonine protein kinase; p38) 등이 있으며, 각 단백질의 인산화 유무에 따라 활성을 판단한다(Cobb & Goldsmith, 2000).
본 실험에서는 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 면역반응 메커니즘에 관하여 비교 분석하기 위하여, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 각각 처리된 세포 내 MAPKs(ERK1/2와 p38) 인산화와 NF-κB의 활성화에 관하여 확인하였다.
대식세포 Raw264.7 cell에 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 뒤 대식세포 내의 MAPKs의 인산화와 핵 내 NF-κB 발현을 관찰한 결과, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 ERK1/2와 p38의 인산화가 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었으며, 특히 해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 ERK1/2와 p38의 인산화가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높은 것이 관찰되었다(도 10 A 참조).
또한, 핵 내 NF-κB 발현이 MAPKs 결과와 유사하게 증가되는 것이 관찰되었으며, NF-κB 발현도 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높은 것이 관찰되었다(도 10 B 참조).
따라서 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)는 MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현으로 인해 면역활성을 유도하며, 그 중 해삼복합소재(SJBG-F)가 가장 높은 면역활성을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
10. 세포 표면 활성 인자(cell surface marker) 발현 비교
세포 표면 활성 인자(CD80, CD86, MHC class I과 II)의 발현은 대식세포의 활성화와 매우 밀접한 관련이 있으므로(Mo et al., 2017), 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)가 대식세포의 세포 표면 활성 인자의 발현량에 미치는 영향을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다.
대식세포 Raw264.7 cell에 희석배수 3200X의 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)를 각각 처리한 뒤 대식세포의 세포 표면 활성 인자(CD80, CD86, MHC class I과 II)의 발현을 관찰한 결과(도 11 참조), 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 CD80, CD86, MHC class I과 II의 발현이 증가하는 것이 관찰되었으며, 이전 결과와 유사하게 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높게 발현되는 것이 관찰되었다.
이러한 결과로 보아 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 세포 표면 활성 인자 발현이 높아서 면역활성이 높은 것을 확인할 수 있었다.`
11. 총괄분석
발효 전 백삼, 홍삼, 흑삼의 추출물에서 산성다당체 함량은 백삼 15.0%, 홍삼 15.2%, 흑삼 17.3%로 분석되었으며 발효공정을 통해서 백삼 18.2%, 홍삼 19.2%, 흑삼 21.3%로 증가하는 것으로 분석되었다. 따라서 발효를 통해 발효흑삼(BGF)에서 최고 21-25%의 산성다당체 증가 효과를 볼 수 있었다.
해삼의 산성다당체는 균 접종량과 발효시간에 따라 26.14-74.21%의 범위로 측정되었으며 백국균(white-koji mould) 1% 첨가군에서 60시간 발효하였을 때 가장 높은 산성다당체 함량을 나타내었다.
백국균(white-koji mould)을 이용한 발효 흑삼에서는 흑삼 특유의 진세노사이드인 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가 되는 것을 볼 수 있었다.
대식세포를 이용한 활성산소종 측정에서 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 활성산소종이 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었으며 해삼복합소재(SJBG-F)의 면역활성으로 인한 사이토카인(TNF-α, IL-6 , IL-1β) 분비능이 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 산화질소 관련 단백질 Cox-2 및 iNOS의 발현도 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 확인하였으며, 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)에서 Cox-2 및 iNOS의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다. 이로 인해 해삼복합소재(SJBG-F)는 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 면역활성이 높아 산화질소 분비능도 높다는 것을 확인할 수 있었다.
해삼복합소재(SJBG-F)로 인한 ERK1/2와 p38의 인산화가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높은 것이 관찰되었고 핵 내 NF-κB 발현이 MAPKs 결과와 유사하게 증가되는 것이 관찰되었으며, NF-κB 발현도 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높은 것이 관찰되었다. 따라서 발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F)는 MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현으로 인해 면역활성을 유도하며, 그 중 해삼복합소재(SJBG-F)가 가장 높은 면역활성을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
발효해삼(SJF), 발효흑삼(BGF) 및 해삼복합소재(SJBG-F) 모두 CD80, CD86, MHC class I과 II의 발현이 증가하는 것이 관찰되었으며, 이전 결과와 유사하게 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 높게 발현되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과로 보아 해삼복합소재(SJBG-F)가 발효해삼(SJF) 및 발효흑삼(BGF)보다 세포 표면 활성 인자 발현이 높아서 면역활성이 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1. 발효해삼 추출물 및 발효흑심 추출물의 복합소재를 제조하는 방법 및 이 방법으로 생산된 복합소재
상기 실험예 1 및 2를 기반으로, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법을 실시할 수 있다.
실험예 1 및 2를 통해 알 수 있듯이, 흑삼과 해삼을 발효시킴으로써 각 물질의 산성다당체가 증진되고, 흑삼은 특유의 진세노사이드가 증가되며, 발효흑삼 추출물과 발효해삼 추출물 각각이 모두 면역활성을 지니고 있기 때문이다. 또한, 발효해삼 추출물과 발효흑삼 추출물을 3:7 중량비 혼합한 혼합물 역시 면역활성을 지니고 있기 때문이다.
방법은 다음의 단계들을 포함한다.
해삼을 백국균으로 발효하여 발효해삼을 제조하는 1단계;
상기 발효해삼을 멸균수로 추출하여 발효해삼 추출물을 제조하는 2단계;
인삼을 복수 회 증숙 및 건조를 반복하여 흑삼을 제조하는 3단계;
상기 흑삼을 백국균으로 발효하여 발효흑삼을 제조하는 4단계;
상기 발효흑삼을 에탄올로 추출하여 발효흑삼 추출물을 제조하는 5단계; 및
상기 발효해삼 추출물과 상기 발효흑삼 추출물을 혼합하여 복합소재를 제조하는 6단계;
바람직하게, 상기 1단계에서, 백국균은 해삼 무게의 1~3%로 첨가하여 24~72시간 발효한다. 상기 6단계에서, 발효해삼 추출물과 발효흑삼 추출물은 3:7 중량비로 혼합된다.
상기 방법으로 제조된, 발효흑삼 추출물에는 21-25%로 증가된 산성다당체와 진세노사이드인 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가되어 포함되고, 상기 발효해삼 추출물에는 26.14-74.21%로 증가된 산성다당체가 포함된다.
상기 방법으로 제조된 복합소재는,
활성산소종을 증가시키지 않고, 사이토카인(TNF-α, IL-6 , IL-1β) 분비능과 산화질소 분비능을 향상시키고, MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현과 세포 표면 활성 인자 발현을 유도하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 방법으로 제조된 복합소재를 실시할 수 있다.
본 실시예에 따른 복합소재에는 약제학적으로 허용가능한 첨가제 또는 식품학적으로 허용가능한 첨가제가 추가로 포함될 수 있다. 또한, 다양한 제형을 위한 제제가 추가로 포함되어 환, 태블릿, 산제, 주사제, 파우더 등의 형태로 실시될 수 있다.
지금까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다.
본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 하나의 실시예에 관련된 것이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형된 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
따라서 본 발명은 제시되는 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 특허청구범위에 기재된 기술사상의 균등한 범위 내에서 다양한 수정 및 변경이 가능한 실시예가 있을 수 있다.
Claims (6)
- 해삼을 백국균으로 발효하여 발효해삼을 제조하는 1단계;
상기 발효해삼을 멸균수로 추출하여 발효해삼 추출물을 제조하는 2단계;
인삼을 복수 회 증숙 및 건조를 반복하여 흑삼을 제조하는 3단계;
상기 흑삼을 백국균으로 발효하여 발효흑삼을 제조하는 4단계;
상기 발효흑삼을 에탄올로 추출하여 발효흑삼 추출물을 제조하는 5단계; 및
상기 발효해삼 추출물과 상기 발효흑삼 추출물을 혼합하여 복합소재를 제조하는 6단계;를 포함하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 1단계에서,
백국균은 해삼 무게의 1~3%로 첨가하여 24~72시간 발효하는 것을 특징으로 하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 6단계에서,
발효해삼 추출물과 발효흑삼 추출물은 3:7 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 발효흑삼 추출물에는,
산성다당체가 함량 21-25%로 포함되고, 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1 함량이 증가되어 포함되며,
상기 발효해삼 추출물에는 산성다당체가 함량 26.14-74.21%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 복합소재는,
활성산소종을 증가시키지 않고, 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비능과 산화질소 분비능을 향상시키고, MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 발현과 세포 표면 활성 인자 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, 발효해삼 추출물 및 발효흑삼 추출물의 복합소재를 제조하는 방법.
- 청구항 1의 방법으로 제조된 복합소재.
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