KR101344054B1 - 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물 - Google Patents
헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물 및 간 기능 개선용 건강식품을 제공한다.
Description
본 발명은 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물 및 간 기능 개선용 건강식품에 관한 것이다.
최근 한국인의 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.4명으로 세계 1위이고 만성 간질환의 경우도 28.8명으로 3번째로 조사되었다. 또한 최근 통계청에서 우리나라 40대의 경우 인구 10만 명당 56.1명이 간질환을 앓고 있고, 이는 가장 높은 사망원인으로 발표하였다. 과음으로 인한 알코올성 간질환은 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증 등이 있으며, 정신적 스트레스와 흡연은 간 손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다. 이러한 간 관련 질병에 의한 폐해가 커짐에 따라서 간 관련 치료제 시장뿐만 아니라 건강기능성 식품시장에도 간 기능성 개선 제품에 대한 관심과 소비자의 요구도가 높아지고 있는 실정이다.
헛개나무(Hovenia dulis Thunb)는 갈매 나무과(Rhamnaceae)로 민간 요법에서는 숙취에 사용되고 있다. 중국 명나라 때 이시진이 쓴 본초강목(本草綱目)에 "헛개나무는 가을이 되면 열매 대궁이 비대해지면서 산호 모양으로 되는데, 이것을 약으로 쓰며 맛이 달아서 사람들이 먹는다. 열매에는 숙취를 덜게 하고 간을 보호해 주는 약효가 있다"고 기록되어 있다. 산림청 산하 임업연구원에서 이루어진 과학적인 조사에 따르면 헛개나무는 열매와 잎,목재 중에 열매를 포함한 열매자루에 약효성분이 가장 많다고 한다. 열매 자루에서 추출한 물질을 분석해본 결과, 고분자의 친수성(親水性)이며, 산 분해에도 강한 분자량 114,500 정도이고 물에 잘 녹는 구조를 갖는 다당류(polysaccharide)로 규명되었다. 이러한 물질에 간 독성 해소 및 숙취 해소 활성을 갖는 물질이 포함되어 있다는 것이다. 또한 헛개나무는 글루타메이트(glutamate)로 유도한 뇌 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고되었다. 헛개나무는 사염화탄소로 유도한 간 손상을 억제하는 효과를 가지며(Hase K et al., Biol. Pharm.Bull. 20(4):381-385, 1997), 헛개나무 열매에서 분리한 디하이드로플라보논(dihydroflavonols), 호베니틴(hovenitins) I, II 및 III가 알코올로 인한 간 손상을 억제하는 효과가 있다고 보고되었다(Yoshikawa M et al., Yakugaku Zasshi 117(2):108-118, 1997). 헛개나무 열매는 급성 알코올 투여시 알코올 분해를 촉진시키는 효과가 있음이 보고되었다(Ji Y. et al., Zhong Yao Cai 24(2):126-128, 2001).
최근 생약초와 같은 한방제제를 발효하여 유용성분을 증진시키고 약효 및 흡수율을 상승시켜 기능성 식품소재로 활용하는 연구가 진행되고 있다.
따라서 본 발명자들은 락토바실러스(Lactobacillus)의 일종인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 이용해 헛개 추출물의 발효물을 아세트아미노펜에 의해 손상된 간세포에 처리하여 간 기능 개선 여부를 조사하였다. 아세트아미노펜은 진통제나 해열제로 널리 알려진 약으로, 만성 알코올 환자에게 사용하였을 경우나 과다복용시 전격성 간염이나 간 부전을 야기하는 약이다(Gyamlani G.G., 2002 Crit. Care).
한국공개특허 제2012-0048801호에는 간 기능 보호 및 개선용 미나리 발효액 및 그 제조 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0808130호에는 홍조류 김으로부터 분리한 단백질을 포함하는 아세트아미노펜 유발성 간질환 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 간 기능을 개선시킬 수 있는 기능성 소재의 개발이 요망되고 있으나, 부작용 등 안전성의 문제 때문에 많은 제약을 받고 있는 요즘, 비교적 안전성이 높은 천연물인 헛개 추출물을 젖산균으로 발효시킨 간기능 개선용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 헛개 추출물의 발효물을 함유하는 간 기능 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명에 따르면, 헛개 추출물을 젖산균으로 발효시킨 조성물은 간 기능 개선에 효과적이며, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않으며, 안전성을 확보할 수 있어, 간 기능 개선을 위한 기능성 식품 산업상 매우 유용한 발명이 될 것이다.
도 1은 헛개 추출물의 젖산발효기간에 따른 pH 변화를 나타낸다.
도 2는 헛개 추출물의 젖산발효기간에 따른 산도 변화를 나타낸다.
도 3은 아세트아미노펜(acetaminophen)의 양에 따른 쥐의 간세포 활력을 나타낸다.
도 4는 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 세포생존율(cell viability)로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존율은 MTT 분석을 통해 측정하였다.
도 5는 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 LDH(lactate dehydrogenase) 농도로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 간 보호 작용 효과는 LDH 분석으로 측정하였다.
도 6은 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 ALT(Alanine aminotransferase) 농도로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 간 보호 작용 효과 효과는 ALT 분석으로 측정하였다.
도 2는 헛개 추출물의 젖산발효기간에 따른 산도 변화를 나타낸다.
도 3은 아세트아미노펜(acetaminophen)의 양에 따른 쥐의 간세포 활력을 나타낸다.
도 4는 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 세포생존율(cell viability)로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 세포생존율은 MTT 분석을 통해 측정하였다.
도 5는 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 LDH(lactate dehydrogenase) 농도로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 간 보호 작용 효과는 LDH 분석으로 측정하였다.
도 6은 쥐의 간세포에 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포독성에 대해 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물의 간 보호 작용 효과를 ALT(Alanine aminotransferase) 농도로 조사한 결과이다. 쥐의 간세포에 헛개 추출물 또는 이들 추출물을 젖산균으로 발효한 후 얻은 발효물 10ug/mL를 처리하고, 10mM 아세트아미노펜을 24시간 동안 처리하였다. 간 보호 작용 효과 효과는 ALT 분석으로 측정하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 헛개 추출물의 발효물은 헛개 추출물에 젖산균을 첨가 후 발효시켜 제조될 수 있고, 상기 젖산균은 바람직하게는 락토바실러스 속 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 헛개 추출물은 헛개 열수 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올,에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르,클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드 (DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 헛개 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.
상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 헛개 추출물의 발효물은 바람직하게는
(a) 헛개 열수 추출물에 글루코스 및 탈지분유를 첨가하여 120~122℃에서 13~17분 동안 멸균하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 멸균한 첨가물을 식힌 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 접종하여 35~39℃에서 12~16일간 발효시켜 제조할 수 있고,
더욱 바람직하게는
(a) 헛개 열수 추출물에 글루코스 0.8~1.2% 및 탈지분유 0.8~1.2%를 첨가하여 120~122℃에서 13~17분 동안 멸균하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 멸균한 첨가물을 식힌 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 접종하여 35~39℃에서 12~16일간 발효시켜 제조할 수 있고,
가장 바람직하게는
(a) 헛개 열수 추출물에 글루코스 1% 및 탈지분유 1%를 첨가하여 121℃에서 15분 동안 멸균하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 멸균한 첨가물을 식힌 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 접종하여 37℃에서 14일간 발효시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 헛개 추출물의 젖산균 발효에 의한 발효물을 함유하는 간 기능 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 헛개 추출물의 젖산균 발효에 의한 발효물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 헛개 추출물의 젖산균 발효에 의한 발효물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 발효물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 구체적인 예로, 상기 발효물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주,양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예를 들어, 참치, 고등어, 공치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파인애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지, 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
또한, 상기 발효물을 이용하여 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미하고, 본 발명의 발효물은 간 기능 회복 및 보호 효과를 가지는 상기 여러 가지의 특정 천연 추출물을 유효 성분으로 포함하므로 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1) 원료
헛개는 ㈜PNK와 동부생약조합법인에서 구입하여 사용하였다.
2) 젖산균
젖산균 발효에는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 사용하였다.
3) 시료 제조방법
헛개 추출물과 젖산균 발효물에 대한 제조 방법은 다음과 같다. 즉, 시료 1kg에 정제수 4L를 넣고 100℃에서 3시간 동안 추출하여 57 브릭스(brix)로 농축한 것을 사용하였다. 추출물의 농도가 각각 1%, 3%, 5%가 포함되도록 최종 부피 1L가 되도록 증류수로 조정한 후 글루코스(glucose) 1%, 탈지분유 1%를 첨가하여 121℃에서 15분 동안 멸균시켰다. 상온에서 식힌 상기 멸균된 추출물에 젖산균 배양액 10㎖를 접종 후 37℃에서 14일간 발효시킨 것을 사용하였다. 대조구는 젖산균 발효 처리를 수행하지 않는 멸균된 추출물을 그대로 사용하였다.
4) 일반성분 분석
일반성분은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists) 방법에 따라 분석하였다. 즉 수분은 시료 5g을 각각 칭량병에 담고 105℃ 드라이 오븐에서 항량이 될 때까지 건조시켜 무게를 측정하여 함량을 구하고, 조회분은 시료 약 2g을 250℃에서 예비 회화한 후 600℃에서 회화하여 직접 회화법으로, 조단백질의 함량은 캘달(Kjeldahl)법으로 측정된 질소량에 질소계수 6.25를 곱하여 산출하였으며 조지방의 함량은 시료를 건조시킨 후 속슬레(Soxhlet) 추출법으로 측정하였다. 또한, 조섬유는 헨너베르크스토만(Henneberg Stohmann) 개량한 AOAC법으로 분석하고, 가용성 무질소물의 함량은 총량에서 수분, 조회분, 조단백질, 조지방, 조섬유의 함량을 뺀 값으로 산출하였다.
5) 유리당 분석
유리당 성분은 윌슨(Wilson) 등의 방법에 따라 분석하였다. 즉, 시료 20g에 증류수를 가해 균질기로 마쇄하고 교반 후 침출시켜 100 mL로 정용한 다음 원심분리(3,000 분당회전수, 30분)하여 상등액을 취해 여과(Whatman No.2)하였다. 여과한 여액은 Sep-pak C18으로 정제시킨 다음 0.45㎛ 막 필터(Millipore Co., 미국)로 여과하여 HPLC용 분석 시료로 사용하였으며, 함량은 외부표준법으로 계산하고 HPLC 조건은 표 1과 같다.
6) 유기산 분석
유기산 분석은 유리당 분석의 전처리 과정과 동일하게 처리하여 추출된 여액을 HPLC를 이용하여 표 2의 조건으로 분석하였다.
7) 아미노산 분석
가) 구성 아미노산 분석
시료 1g을 시험관에 넣고 6N-HCl 용액 10mL를 가한 후 110℃에서 24시간 가수분해시켜서 얻은 여액을 원심분리하고, 상등액을 50℃에서 농축하여 염산과 물을 완전히 증발시킨 후, 20mM HCl(pH 2.2)을 사용하여 5mL로 정용한 다음 0.45㎛ 막 필터로 여과한 다음 여액을 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화 시킨 후 HPLC용 분석 시료로 사용하였다. 분석조건은 표 3과 같고, 아미노산 함량은 적분기(integrator)에 의한 외부표준법으로 계산하였다.
나) 유리 아미노산 분석
시료의 유리 아미노산 분석은 유리당 정량과 같은 방법으로 전처리하여 얻은 여액을 Ohara와 Ariyosh의 방법에 준해 분석하였다. 여액 10ml에 설포살리실산(sulfosalicylic acid) 25 mg을 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 방치시킨 후 원심분리(50000 분당회전수, 30분)하여 단백질 등을 제거하고, 상등액을 0.45㎛ 막 필터로 여과하여 얻은 여액을 AccQ-Tag 시약으로 유도체화시킨 후 HPLC로 분석하였으며 분석조건은 표 3과 같다.
8) pH 측정
시료의 발효기간 중 pH의 변화는 시료 20 mL를 취하여 pH 미터(Orion 940. 미국)를 사용하여 측정하였다.
9) 산도 측정
시료의 발효기간 중 총산 함량은 시료를 원심분리하여 상징액 10mL를 취해 1% 페놀프탈레인(phenolphthalein)을 지시약으로 하고, 01 N NaOH 용액으로 적정한 후 젖산계수 0.009를 곱하여 젖산(lactic acid)으로 환산하였다.
10) 간 보호 및 간기능개선 실험
가) 콜라게나제 관류(Collagenase perfusion)
스프레이그-다우레이(Sprague-Dawley; SD) 쥐(rat)의 간세포는 Berry와 Friend의 방법을 수정한 2단계 콜라게나제 관류 방법으로 분리하였다. 간세포를 얻기 위해 SD 쥐는 에테르(ether)로 흡입 마취시키고 70% 에탄올로 복부를 소독한 후, 개복하여 우심방을 절개하여 혈액이 제거될 수 있도록 하고 좌심실에 21 게이지 주사기로 한의평형염액(hank's balanced salt solution; HBSS) 150 ml을 혈관 내로 주입하였다. 혈액을 제거한 후, 콜라게나제(100 U/ml)가 포함된 한의평형염액을 100 ml 재순환시켜 간세포가 유리되게 하였다. 간조직을 떼어내어 100 mm 배양접시에서 한의평형염액 60 ml를 첨가하고 No. 11 블레이드(blade)로 잘라 하나의 세포들을 얻을 수 있었다. 이 세포 현탁액에 콜라게나제를 제거하기 위해 3회 웨이머스(Waymouth)의 MB 752/1 배지(5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 2.0 mg/ml 소혈청 알부민(bovine serum albumin), 10-6 M 덱사메사손(dexamethasone), 10-7 M 인슐린, 5.32 x 10-2 M L-세린, 4.09 x 10-2 M L-알라닌, 2.67 x 10-2 M NaHCO3, 100 IU/ml 페니실린, 100 IU/ml 스트레토마이신(streptomycin), 50 /ml 젠타마이신설페이트(gentamicin sulfate))으로 헹궈주었다. 이렇게 얻은 간세포는 5 x 105 cell/ml로 희석하여 콜라겐(collagen)으로 코팅되어 있는 96웰 플레이트(96- well plate) 에 4시간 동안 부착시킨 후, 각 시료를 처리하였다.
나) 세포독성분석
쥐의 일차(primary) 간 세포는 96웰 플레이트에 5 x 105 cell/ml의 농도로 배양하여 시료를 처리하였다. 24시간 처리 후, 0.5 μg/ml tetrazolium-based colorimetric(MTT)를 첨가하여 4시간 동안 포르마잔(formazan)을 형성시켰다. 반응이 끝나면 배지를 제거하고 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 포르마잔을 용해시켜 마이크로플레이트 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 세포 생존률은 무처리군이 컨트롤을 100%로 하여 계산하였다.
다) 간기능 검사
간기능 검사를 하기 위해 BlueGene Co.(상하이, 중국)에서 구매한 쥐 알라닌 트랜스아미나아제(alanine transaminase; ALT), 쥐 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH) ELISA 키트를 사용하여 효소를 정량적으로 측정하였다.
실시예
1. 헛개의 일반성분, 유리당, 유기산 및 아미노산 함량 분석
1) 일반성분 함량
본 발명에 사용된 헛개의 일반성분 함량은 표 4와 같다. 수분 함량은 13.23%로 나타났으며, 회분 함량은 4.22%로 나타났다. 조단백질 함량은 5.62%로 높게 나타났다. 조지방 함량은 2.67%로 나타났으며, 조섬유 함량은 7.11%로 나타났다.
2) 유리당 함량
본 발명에 사용된 헛개 추출물의 유리당 함량은 표 5와 같다. 주요 당으로는 포도당과 과당으로 나타났다. 포도당과 과당의 함량은 각각 18.81%와 16.41%로 나타났다.
맥아당은 건조 시료구에서 1.40%로 나타났으나, 추출물을 이용한 시료구에서는 검출되지 않았다.
헛개 추출물 함량을 달리하여 제조한 젖산발효액의 유리당 함량은 젖산균 발효전에 비하여 총 유리당 함량을 비롯하여 모든 유리당의 함량이 낮아졌다.
3) 유기산 함량
본 발명에 사용된 시료의 유기산 함량은 표 6과 같다. 검출된 주요 유기산은 사과산, 젖산, 초산이었다. 추출물 함량에 따른 총유기산 함량변화는 젖산균을 접종하지 않은 시험구들에서 추출물들의 첨가량에 비례하여 총 유기산 함량이 높아졌다. 최종산물인 젖산균 발효물들은 헛개 추출물 첨가량이 증가할수록 총 유기산 함량이 높아짐을 확인하였다.
4) 아미노산 함량
가) 구성 아미노산 함량
본 발명에 사용된 시료의 구성 아미노산 분석 결과는 표 7과 같다. 시료의 구성 아미노산은 총 16종의 아미노산이 검출되었으며, 총 함량은 헛개 3,735.65 mg%, 헛개 추출물 1,753.29 mg%로 나타났다. 헛개와 헛개 추출물에서는 프롤린 (proline), 발린, 글루탐산, 아르기닌 등으로 나타났다.
나) 유리 아미노산 함량
본 발명에 사용된 시료의 유리 아미노산 분석 결과는 표 8과 같다. 시료의 유리 아미노산도 구성 아미노산과 같이 총 16종의 아미노산이 검출되었으며, 총 유리 아미노산 함량은 헛개 1,045.89 mg%, 헛개 추출물 308.54 mg% 로 나타났다. 헛개와 헛개 추출물의 주요 유리 아미노산으로는 아르기닌, 트레오닌, 아르파스트산(aspartic acid) 등으로 나타났으며, 트레오닌과 글리신(glycine)은 추출물들에서 검출되지 않았다.
실시예
2.
헛개
추출물의 젖산균 발효에 따른
pH
변화 및 젖산균 발효
물의
산도 변화
1) 젖산균 발효에 따른 pH 변화
헛개 추출물을 첨가한 시료들의 발효 기간에 따른 pH 변화는 도 1과 같다. 헛개 추출물에서 pH는 1일과 3일 사이에 가장 크게 낮아졌으며, 그 후로는 큰 변화 없이 일정 pH를 유지하였다. 초기 산도는 1% 헛개 추출물이 다른 첨가 비율에 비해서 높게 나타났으며, 최종 산도는 1% 헛개 추출물이 낮게 나타났다. 1% 헛개 추출물은 발효 1일에서 3일 사이에 가장 크게 낮아졌으며, 그 후로는 일정 pH를 유지하였다. 3% 추출물과 5% 추출물은 7일까지 천천히 낮아지다가 그 후로 일정 pH를 유지하였다.
2) 젖산균 발효물의 산도 변화
헛개 추출물을 첨가한 시료들의 발효기간에 따른 산도 변화는 도 2와 같다. 헛개 추출물에서는 농도에 따라 큰 변화가 없었으며, 헛개 추출물 1% 첨가구를 제외한 3%와 5% 첨가구에서 발효기간 11일까지 산도가 증가하다가 13일째 감소하였으며, 그 후 다시 증가하는 모습을 보였다. 헛개 추출물 1% 첨가 젖산균 발효물에서는 발효기간 9일부터 11일까지 감소하였다가 그 후 다시 증가하는 모습을 보였다.
실시예
3.
헛개
추출물의 젖산균
발효물의
간 보호 및 간기능개선 효과
가) 아세트아미노펜(Acetaminophen)의 세포독성에 대한 헛개 추출물의 젖산균 발효물의 효과
쥐 일차 간세포에 아세트아미노펜을 0, 0.5, 2.5, 10, 50 mM의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 각 웰(well)에 MTT 실험한 결과, 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다. 간독성을 유발하기 위해 10 mM 아세트아미노펜을 처리하였을 때, 간세포 독성이 일어나 10 mM 아세트아미노펜으로 간독성을 유발하여 간세포 보호효과 및 간기능 개선효과 실험을 실시하였다(도 3).
헛개 추출물 및 젖산균으로 발효한 헛개 추출물의 간세포 보호효과를 확인하기 위해 10 mM 아세트아미노펜과 각 시료 10 ㎍/mL을 처리하여 간 독성으로 인한 간세포 보호효과를 확인하였다(도 4). 그 결과 헛개 추출물의 세포생존도가 98.6%로 측정되었으며 젖산균으로 발효한 헛개 추출물은 134.6%로 측정되었다. 이는 추출물들이 간세포 보호를 하였지만, 젖산균으로 발효한 헛개 추출물은 36.0% 정도 간세포 보호효과가 높아졌음을 확인할 수 있었다. 이런 결과에 따라 추출물보다 젖산균으로 발효를 하였을 경우 간세포 보호효과를 강화하였다고 판단된다.
나) 추출물의 간기능 개선효과 검사(LDH)
10 mM 아세트아미노펜으로 간세포에 독성을 일으켰을 때, 분비되는 젖산탈수소효소(LDH)를 측정한 결과, 대조구보다 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 헛개 추출물들은 52.5 ng/mL로 측정되었지만 젖산균으로 발효한 헛개 추출물은 33.4 ng/mL로 측정되어 젖산균으로 발효하였을 때 간기능 개선효과가 19.1 ng/mL 만큼 젖산탈수소효소의 분비량이 낮아져 추출물보다 젖산균으로 발효한 추출물이 간기능 개선효과가 좋아졌음을 확인할 수 있었다.
다) 추출물의 간기능 개선효과 검사(ALT)
10 mM의 아세트아미노펜에 의해 간 독성을 유발시킨 일차 쥐 간세포의 ALT가 증가하였다(도 6). 헛개 추출물들은 젖산균으로 발효시킬 경우 4.9 ng/mL 만큼 ALT의 분비량이 줄어들었음을 확인하였으며, 이러한 결과는 추출물보다 젖산균으로 발효한 추출물이 간기능 개선에 보다 탁월함을 확인하였다.
Claims (6)
- 헛개 열수 추출물에 글루코스 및 탈지분유를 첨가하여 120~122℃에서 13~17분 동안 멸균한 첨가물을 식힌 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 접종하여 35~39℃에서 12~16일간 발효시켜 제조한 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물.
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- 헛개 열수 추출물에 글루코스 및 탈지분유를 첨가하여 120~122℃에서 13~17분 동안 멸균한 첨가물을 식힌 후, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 접종하여 35~39℃에서 12~16일간 발효시켜 제조한 헛개 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강식품.
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