KR20080100942A - 간 기능 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 오리나무, 갈화, 헛개나무 열매, 인진쑥, 헛개나무 가지, 헛개나무 잎, 진피, 숙지황, 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 억제 기능을 갖는 간 기능 개선용 조성물 및 상기 조성물로 제조된 식품이 제공된다.
본 발명에 따른 천연 추출물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물은 독성과 같은 부작용을 나타내지 않으며 우수한 간 섬유화 억제 기능을 가지므로, 간 기능 회복용 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 유용하다.
간 섬유화, 간 기능, 천연 추출물, 헛개나무, 오리나무
Description
도 1은 간 조직에서의 콜라겐 양을 측정함으로써 간 섬유화의 진행 상태를 조사하기 위해 사용된 콜라겐 1형과 3형에 대한 프라이머 디자인을 나타낸 것이다.
도 2는 MTT 에세이에 의한 본 발명의 간 기능 개선용 조성물의 농도에 따른 세포독성 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 SRB 에세이에 의한 본 발명의 간 기능 개선용 조성물의 농도에 따른 세포증식 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 간 기능 개선용 조성물과 CCl4를 병행 투여할 때 본 발명의 간 기능 개선용 조성물이 간 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 간 손상 평가 지표로 이용되고 있는 혈청 AST 및 ALT의 활성 변동을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 간 기능 개선용 조성물과 CCl4를 병행 투여할 때 본 발명의 간 기능 개선용 조성물이 간 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 간 손상 평가 지표로 이용되고 있는 혈청 비포합 빌리루빈(total bilirubin) 및 포합 빌리루빈(direct bilirubin)의 활성 변동을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 간 기능 개선용 조성물 투여 후 간 조직에서 콜라겐 유형 I 및 III의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 CCl4 투여 그룹에서 간 섬유화 평가를 위한 간의 매이슨 트리크롬 염색의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 FHD 투여 그룹에서 간 섬유화 평가를 위한 간의 매이슨 트리크롬 염색의 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CCl4와 FDH를 함께 투여한 그룹에서 간 섬유화 평가를 위한 간의 매이슨 트리크롬 염색의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정의 여러 가지 천연 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 억제 기능을 갖는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
지금까지 간 경변은 불치병으로 인식되어 왔으나 최근 10여년 동안 과도한 섬유생성이 특징인 간 경변의 병태 생리가 밝혀짐에 따라 간경변증은 불가역적인 질환이 아닌, 간 섬유생성의 억제 또는 용해촉진 등에 의해 가역적인 질환으로 개 념이 변하고 있다. 간 경변 중 가역적인 초기의 병변을 간 섬유화(liver fibrosis)로 불가역적인 병변을 간 경변(liver cirrhosis)으로 구분하고 있다. 간 섬유화는 간 질환의 가장 초기적이고 기본적인 질환으로 그 원인과 발생기전 및 형태가 다양하고 복잡하다. 간단하게 섬유화는 생화학적으로 빠른 두 과정인 결합조직 단백의 합성(fibrogenesis)과 결합조직의 퇴행(fibrolysis)의 진행에 의해서 나타나며, 두 과정의 균형이 깨어질 때 간 조직 중 결합조직의 축적이 일어나고 과도하게 되면 간 섬유화에 이어서 간 경화가 일어나게 된다.
간 섬유화를 조직학적 연구를 통해 보면 간 섬유화의 결합조직 축적에 관여하는 단백질로는 콜라겐, 세포외부 당단백질, 프로테오글리칸, 엘라스틴 등이 있다. 인체에 가장 많이 존재하는 단백질(전체 단백질의 1/3)중 하나인 콜라겐은 1500개의 잔기로 구성된 특유의 α-체인을 가지며 아미노산 배열은 (Gly-Xaa-Yaa)n으로 표시되고, Yaa 위치에 프롤린 또는 라이신을 함유한다. 세포내부 공간에서의 삼중 나선 형성과 세포외부에서의 교차결합(cross linking)형성으로 콜라겐 구조가 인정화 되는데 경화된 간에는 이렇게 안정화 된 불용성의 콜라겐 섬유의 광범위한 침착이 일어난다. 간 경화는 만성적인 간 손상에 의해 간 조직 중 결합조직이 과다 축척 되면서 정상적인 간 소엽의 육각형 구조가 파괴된 상태이며 반면에 간 섬유화는 간 소엽의 육각형 구조는 유지한 상태로 간 조직 중 결합조직만 과다 축척된 상태를 의미한다. 간 섬유화 및 경화는 간 조직 중 염증 반응이 지속되어 쿠퍼세포 및 지방 세포(lipocyte)가 활성화 되면서 간 조직 중 결합조직으로 대치되는데 이 과정을 스트로말 리페어(stromal repair)라 한다. 이에 의해 간 조직 중 결합조직 의 양이 정상에 비해 10배정도 증가하게 되어 동양혈관(sinusoid)에 결합조직이 축적됨으로써 동양혈관 내의 통로가 좁아져 혈액과 간세포간의 물질교환이 원활하지 못하게 되는 카필라리제이션이 초래된다.
한편, 면역학적 수준의 연구를 보면 여러 가지 원인에 의해 간세포가 손상을 받으면 여러 세포들의 상호작용에 의해 각종 시토킨(cytokine) 및 산소 자유 라디칼 등이 생성되고 정상 세포외기질(ECM)이 손상을 받게 되면, 세포외기질의 이상 증식이 유발되어 간 섬유증으로 진행된다. 일반적으로 간 섬유증은 간 경변과는 달리 가역적이고, 얇은 섬유원으로 구성되며, 결절 형성이 없는 것으로 알려져 있고 간 손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있으나, 이러한 간 섬유증 과정이 반복적으로 계속되면서 세포외기질 간의 교환결합이 증가하여 두꺼운 섬유원을 형성하고 결절이 있는 비가역적인 간 경변으로 진행된다. 세포외기질은 콜라겐, 당단백질, 및 프로테오글리칸 등으로 구성된다. 간 섬유화시 세포외기질의 과다생성은 간 내 포식세포(macrophage)인 쿠퍼세포가 활성화됨으로써 분비되는 여러 시토킨에 의해 지방세포(Ito cell, hepatic stellate cell)의 활성화가 촉진됨으로써 결합조직의 합성이 증가되는 것으로 알려져 있다. 쿠퍼 세포는 손상된 간세포의 포식세포(phagocytosis)에 의해 활성화되거나 여러 간 독성물질에 의해 직접 활성화되어 TGF-베타, TGF-알파, TNF-알파, PDGF, IL 등을 분비하며 이 시토킨에 의해 쿠퍼 세포 자신이 다시 활성화 되는 자가 활성화(autocrine) 작용을 받는다. 또한 측 분비(paracrine) 작용으로 쿠퍼세포가 분비한 시토킨들에 의해 지방세포가 활성화 되며 이와 같은 시토킨을 지방 세포가 직접 분비하여 자신이 분비한 시토킨에 의해 다시 자기자신이 활성화되는 자가 활성화 작용을 받는다. 이와 같은 일련의 반응으로 활성화된 지방 세포는 세포외 기질의 생성이 왕성해지면서 반면에 금속단백분해효소(metalloproteinase)와 콜라겐 분해효소(collagenase) 등의 세포외기질 분해효소으ㅢ 생성을 억제합으로써 간 조직 중 결합조직이 과다 축적되는 것이다. 시토킨은 호르몬과 유사한 당단백질로 분자량은 대부분 80 kD 이하이며 대부분 혈액세포(blood cell), 간질세포(stromal cell), 상피세포(epithelial cell)에서 합성되고 염증 반응시 서로 다른 종류의 세포간의 신호전달 목적으로 사용된다. 시토킨은 피코몰 농도로 세포표면의 수용체를 통해 측 분비 및 자가 활성화 작용으로 주변의 세포에 신호를 전달한다. TGF-베타는 지금까지 알려진 시토킨 중에서 결합조직생성을 가장 많이 촉진하는 섬유조직 발생 시토킨으로 알려졌다. TGF-베타는 현재까지 5 종류(포유류에서는 3가지)가 발견되어 보고되오 있으나 TGF-베타 1은 쿠퍼세포와 지방세포에 합성되며 다음과 같은 역할을 수행한다. 지방세포를 활성화시켜 콜라겐 등의 세포외기질 생산을 유도하며 세포외기질을 분해하는 단백질 분해 효소의 합성을 저해하고 지방세포 내 레티노이드의 저장량을 감소시키며 간세포(hepatocyte)의 DNA합성을 저해한다. 그 외 섬유화에 중요한 시토카인 PDGF는 지방세포의 증식을 촉진하는 것으로 보고되고 있다.
콜라겐의 증가는 간 섬유증의 중요한 원인이 되고 콜라겐은 여러 가지 원인에 의해 활성화된 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)에서 주로 생성이 된다. 콜라겐은 현재 1형부터 19형까지 알려져 있고 1, 2, 3, 5 및 11형과 같은 띠 또는 섬유 형성 타입과 4, 6, 7, 8, 9, 10 형 등과 같은 띠 또는 섬유를 형성하지 않는 타입으로 구분되고 간 섬유화에서는 주로 섬유원 형태의 콜라겐이 증가한다. 간과 연관이 있는 것은 1, 3, 4, 5 및 6형으로 알려져 있다. 정상 간에서는 1형과 3형이 각각 전체 콜라겐의 40~45%로 대부분을 차지하고 간 경변에서는 6-10배 이상으로 증가하고 1형과 3형의 비율이 약 4:1로 주로 1형이 많이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 간 조직에서의 콜라겐 양을 측정함으로써 간 섬유화의 진행 상태를 알 수 있다.
바이러스 감염(30%), 알코올성 간질환(30%), 담즙정체성 질환(10%), 기타 등으로 간 섬유화의 대부분이 과다한 음주에 의한 알코올성인데 비하여, B형 감염바이러스성 간질환의 발병률이 높은 우리나라에서는 70% 이상이 B형 간염바이러스에 의한 괴사후성 간 섬유증이고 알코올성은 상대적으로 적어서 7% 내외에 불과하다고 보고되어 있다. 간 섬유화의 기전에 대한 연구가 진행되고 이해가 높아짐에 따라 특이적이고 효과적인 항 섬유화 치료방법과 진단법에 대한 여러가지 방법들이 시도되고 있다. 그러나 간 섬유화에 관한 유전자적인 메커니즘에 관한 연구는 잘 알려져 있지 않다. 또한 간 질환은 특별한 치료방법도 없고, 원인 제거 및 병 진행 완화 또한 제한되어 있다. 따라서 간 지질대사 개선 및 간섬유화 억제제의 개발이 필요하다. 특히, 우리나라에는 예전부터 내려오는 민간요법을 이용한 간 질환 치료제 개발에 더욱 중점을 두고 있다. 이는 민간요법을 사용했을 시에 어느 정도 임상적 인 효력이 확보되어 있고, 부작용에 대한 우려가 상대적으로 낮기 때문이다. 그러나 현재까지는 효과적인 치료제 및 진단방법이 없는 실정이다. 이에 간 질환에 대한 치료와 예방을 할 수 있는 물질의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명의 목적은 독성과 같은 부작용이 없는 천연 추출물을 포함하는 간 섬유화 억제 기능을 갖는 간 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 간 기능 개선용 조성물을 함유하여 간 기능 개선에 도움이 되는 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 오리나무, 갈화, 헛개나무 열매, 인진쑥, 헛개나무 가지, 헛개나무 잎, 진피, 숙지황, 및 감초로 이루어진 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 억제 기능을 갖는 간 기능 개선용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기 간 기능 개선용 조성물을 함유하여 간 기능 개선에 도움이 되는 식품이 제공된다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 특정 천연 추출물들을 포함하여 이루어진 조성물은 간 섬유화 억제 기능을 가져 간 기능 개선 효과를 나타냄을 실험을 통해 확인할 수 있었다.
본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미하며, 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
상기 혼합 추출물은 조성물에 대하여 건조 중량 기준으로 0.001 내지 10중량% 함유되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 혼합 추출물은, 혼합물의 총 중량을 기준으로 오리나무 1-2중량%, 갈화 1-2중량%, 인진쑥 0.5-1중량%, 헛개나무 가지 0.2-0.6중량%, 헛개나무 잎 0.2-0.6중량%, 진피 0.2-0.6중량%, 숙지황 0.1-0.15중량%, 감초 0.05-0.1중량% 및 나머지 량의 용매를 혼합한 다음, 상기 혼합물을 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 또는 환류 추출에 의해 추출하고, 추출 여액을 여과한 후 감압 증류하여 농축시키고, 농축된 여액을 동결 건조하여 분말화하여 얻어질 수 있다. 이때 상기 용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
헛개나무는 열매가 익을 무렵이면 과경이 굵어져서 울퉁불퉁하게 된다. 은은한 향기가 있고, 단맛이 있어 먹을 수 있으며 음식 맛을 한결 돋운다. 약학서 본초강목에는 헛개나무가 맛이 달고 평온하며 독성이 없으며, 오장을 부드럽게 하고 윤활하게 하며 대변, 소변을 잘 보게 하며 가슴에 번열을 없애주고 갈증을 풀어주며 술독을 풀고, 구토증을 제거한다고 되어있다. 본 발명에서 추출시 상기 헛개나무 가지 및 잎의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 헛개나무 가지 및 잎은 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 각각 0.2-0.6중량%씩 혼합되는 것이 바람직하다.
오리나무는 자작나무과에 딸린 낙엽큰키나무다. 유리목(楡里木) 또는 적양(赤楊)이라고도 하며 중국에서는 다조(茶條)라고 한다. 우리나라, 중국, 일본 등에 흔히 자라고 있으며 뿌리에서 공기 중에 있는 질소를 흡수할 수 있으므로 메마른 땅에서도 잘 자라고 또 땅을 기름지게 하므로 사방목으로 매우 중요하게 여겼다. 본 발명에서 추출시 상기 오리나무의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 오리나무는 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 1-2중량%로 혼합되는 것이 바람직하다.
갈화는 칡의 꽃을 의미하며, 풀 냄새가 조금 있고 약성은 달다. 과음으로 인한 두통, 발열 및 가슴 속이 답답하고 편안치 않아서 팔다리를 가만히 두지 못하는 증상, 갈증, 식욕부진, 복부팽만, 구토증을 다스리는데 사용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 갈화는 완전히 개화하지 않은 봉오리를 사용하며 색깔은 엷은 남자색(藍紫色)을 띠고 꽃대나 그 밖의 이물이 없는 것이 좋다고 알려져 있다. 본 발명에서 추출시 상기 갈화의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 갈화는 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 1-2중량%로 혼합되는 것이 바람직하다.
인진쑥은 국화과의 여러해살이풀로서, 높이는 30~ 100cm이며, 잎은 어긋나고 꽃이 피지 않는 가지 끝에서는 뭉쳐난다. 초가을에 노란 꽃이 원추(圓錐) 꽃차례로 피며, 어린잎은 식용하고 약재로도 사용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 추출시 상기 인진쑥의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 인진쑥은 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 0.5-1중량%로 혼합되는 것이 바람직하다.
진피란 감귤의 껍질을 말린 한방약으로 진귤피라고도 불린다. 집에서 감귤을 먹기전에 깨끗이 씻은 후 껍질을 벗겨 말리면 충분히 재료로 사용할 수 있다. 본 발명에서 추출시 상기 진피의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 진피는 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 0.2-0.6중량%로 혼합되는 것이 바람직하다.
숙지황은 지황(地黃)의 뿌리를 쪄서 말린 한약재이다. 숙지황은 사물탕(四物湯)의 주요 약재이며 각종 만성병 중 몸이 허약하여 나타나는 내열(內熱), 인후건조(咽喉乾燥), 갈증 등의 증상에 쓰이는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 추출시 상기 숙지황의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 0.1-0.15중량%로 혼합되는 것이 바람직하다.
감초는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 여러해살이풀로서 약용식물이다. 감초는 쓴 약을 달게 하여 먹기 좋게 하는 것뿐만 아니라 그 독특한 약성이 있다. 모든 약의 독성을 풀어 주고 기침과 담을 삭이며 모든 약을 중화하는 작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 추출시 상기 감초의 첨가량은 이에 한정하는 것은 아니나, 추출시 혼합물의 총 중량을 기준으로 0.05-0.10중량%로 혼합되는 것이 바람직 하다.
본 발명에서 상기 각 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조된다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.
유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올,에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다.
상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추출액을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 혼합 추출물은 오리나무 1.00-2.00g, 갈화 1.00-2.00g, 인진쑥 0.50-1.00g, 헛개나무 가지 0.20-0.60g, 헛개나무 잎 0.20-0.60g, 진피 0.20-0.60g, 숙지황 0.10-0.15g, 및 감초 0.05-0.10g을 추출포에 각각 넣은 후에 94g의 정재수를 넣은 후 12시간이상 85℃ ~ 95℃에서 추출액을 순환시키면서 추출한다. 이렇게 하여 얻어진 추출물은 여과하는 것이 바람직하다. 100㎛의 포어크기를 갖는 여과지로 여과하는 것이 효과면에서 우수하므로 바람직하다.
다른 구현예로, 상기 혼합 추출물은 오리나무 1.00-2.00g, 갈화 1.00-2.00g, 인진쑥0.50-1.00g, 헛개나무 가지 0.20-0.60g, 헛개나무 잎 0.20-0.60g, 진피 0.20-0.60g, 숙지황 0.10-0.15g, 및 감초 0.05-0.10g을 추출포에 각각 넣은 후 상기 재료의 총 중량의 10-20배, 바람직하게는 14-16배의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 물과 에틸 알코올의 혼합용매로, 50℃, 바람직하게는 45-55℃ 추출온도에서 10시간 내지 12시간, 바람직하게는 12시간, 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 바람직하게는 열수환류추출 방법으로 수득한다. 또한, 상기 추출물을 여지로 여과하고 여액을 회전진공농축기로 70℃, 바람직하게는 65-75℃에서 감압농축 할 수 있다.
상기 특정 천연 추출물을 함유하는 본 발명의 간 기능 개선용 조성물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80중량%로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각종 비타민이나 미네랄, 구연산, 구연산나트륨, 사과산, 레시틴, 젖산, 아미노산, 설탕, 벌꿀, 과당, 천연향료, 천연색소 등이 함유될 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 이용하여 간 기능 개선 효과를 나타내는 다양한 종류의 식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예를 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예를 들어, 참치, 고등어, 공치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파인애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육 류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지, 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물을 이용하여 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품을 제조할 수 있다. 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품은 영양 기능 외에도 생리활성 성분을 포함하여 생체조절 기능을 제공하는 식품을 의미하고, 본 발명의 조성물은 간 기능 회복 효과를 가지는 상기 여러 가지의 특정 천연 추출물을 유효 성분으로 포함하므로 기능성식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
상기 식품은 간 기능 개선 및 회복에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
각종 천연물의 재료 및 추출
(주)참선진으로부터 헛개나무 열매를 포함하는 각종 천연물 재료를 함유하는 추출물을 제공받았다. 추출은 오리나무 1.51중량%, 갈화 1.51중량%, 헛개나무 열매 0.75중량%, 인진쑥 0.75중량%, 헛개나무 가지 0.43중량%, 헛개나무 잎 0.43중량%, 진피 0.43중량%, 숙지황 0.11중량%, 감소 0.08중량% 및 정제수 94중량%를 혼합한 후 100℃의 끓는 물에서 16시간 추출하였다. 추출된 추출물은 2.5brix의 농도를 가졌으며, 이를 85℃에서 진공농축하여 12brix로 농축하였다.
<실시예 1> 세포증식 및 독성 분석
1.1 MTT 분석
메틸(Methyl)-티아졸(thiazol)-디페닐(diphenyl)-테트라졸륨(tetrazolium) (MTT)분석은 MTT 세포 증식 에세이 키트(cell proliferation assay kit)(invitrogen)를 사용하였다. 5x103cells/100㎕를 96웰 플레이트에 시딩하고 헛개나무 열매 추출물을 농도별로 처리하여 CO2 배양기에서 24 내지 48시간동안 배양한다. MTT 저장 용액(5mg/ml) 10㎕를 웰에 넣어주고 4시간 동안 CO2 배양기에 넣어 배양한다. 그런 후 SDS-HCl 용액 100㎕를 각 웰에 넣어주고 4 내지 18시간 동안 CO2 배양기에 넣어 배양한 후 ELISA(Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) 판독기로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.
1.2 SRB 에세이
5x103cells/well의 세포를 플레이트에 시딩한다. 4시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 후 세포가 부착된 것을 확인 후에 0.1% FBS가 포함된 DMEM을 100㎕씩 각 웰에 넣어주고 얼음 위 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후 최종 TCA 농도가 10%가 될 만큼 TCA를 웰에 넣어준다. 그리고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 후 멸균 증류수로 5번 세척해주고 다 마를 때까지 공기 중에서 말린다. 0.4%의 SRB를 100 ㎕/well로 넣어준 후 30분 동안 실온에서 배양하고 SRB를 버린 후 1% 아세트산으로 4번 세척해주고 공기 중에서 다 마를 때까지 방치한 후 10mM 트리스-베이스(Tris-base)를 100 ㎕/well로 넣어준 후 5분 동안 쉐이크 테이블(shake table)에 올려놓는다. 그런 후 96 웰 플레이트를 ELISA 판독기를 사용하여 550nm에서 측정하였다.
1.3 천연물의 간 섬유화 억제 효과 탐색
(주)참선진으로부터 헛개나무 열매를 포함하는 각종 천연물 재료를 함유하는 추출물을 제공받았다. 추출은 오리나무 1.51중량%, 갈화 1.51중량%, 헛개나무 열매 0.75중량%, 인진쑥 0.75중량%, 헛개나무 가지 0.43중량%, 헛개나무 잎 0.43중량%, 진피 0.43중량%, 숙지황 0.11중량%, 감소 0.08중량% 및 정제수 94중량%를 혼합한 후 100℃의 끓는 물에서 16시간 추출하였다. 추출된 추출물은 2.5brix의 농도를 가졌으며, 이를 85℃에서 진공농축하여 12brix로 농축하였다. 이렇게 하여 얻어진 추출물을 본 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 간 성상 세포는 CFSC이다. CFSC는 독일 베를린 대학에 위치한 UKBF의료병원I 간 연구센터(UKBF medical hospital I Liver Research center)에서 제공받았다. CFSC의 표현형은 간 성상세포가 이미 활성화된 것으로 간 섬유화가 이미 진행된 쥐에서 일차세포(primary cell) 배양을 통해 획득한 것이다. CFSC는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, gibco)을 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(glico)를 사용하여 5%, CO2, 37℃에서 배양하였으며 세포 증식 분석에 사용하였다.
추출물 시료의 세포 독성을 알아보기 위하여 MTT 에세이를 수행한 후 세포독성을 안 미치는 정도의 농도를 최고 농도로 잡고 SRB 에세이를 수행하였다. 여기서는 헛개나무 열매 추출물의 MTT 에세이 결과만을 나타내었다(도 2, 표 1). MTT 에세이의 결과를 보았을 때 헛개나무 열매 추출물은 세포 독성을 갖지 않는 것을 확인하였다. 헛개나무 열매 추출물은 18mg/ml의 농도로 추출되었으며, 예비 실험을 통하여 1%의 농도에서부터 세포 독성에 미치는 영향이 없다는 것이 확인되었다. SRB 에세이 결과, 각 천연물 중에서 헛개나무 열매 추출물은 농도에 따른 유의차를 보였다(도 3, 표 2). 180㎍/ml의 농도에서 22.80%의 증식을 보였으며, 90㎍/ml에서는 49.45%의 증식을 보였다. 그 이하의 농도에서는 높은 증식을 보였다. 이로써 180~90㎍/ml에서 CFSC의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다.
[표 1]
[표 2]
<실시예 2> 간 섬유화 동물 모델
동물은 생후 5주령 된 체중 200±10g의 외견상 건강한 실험용(Sprague dawley 종) 숫 흰 쥐를 (주)오리엔트바이오에서 구입 후 사육실에서 일정한 사육 조건에서 일주일 동안 적응시켜 실험에 사용하였다. 총 36마리의 흰 쥐를 무작위로 각 군마다 4마리씩 넣었다. 각 실험군은 대조군(Normal, Normal + FDH), CCl4 처리군(CCl4, CCl4 + FHD(Fruit of Houenia Dulcis ))으로 모두 4 그룹으로 나누었다. 대조군은 콘 오일(corn oil)을 피하 주사하였으며, CCl4 처리군은 콘 오일 주사 2주 후부터 콘 오일로 희석한 50% CCl4를 1ml/kg으로 10주간 일주일에 2번 피하 주사하였다. 정상에 FHD를 투여한 군과 CCl4와 FDH를 함께 투여한 군은 CCl4 주사 2주 후부터 헛개나무 열매 추출물을 증류수로 20% 희석하여 57.6mg/kg으로 일주일에 5회 경구 투여하였다.
<실시예 3> 혈청 내 효소 활성 측정
3.1 ALT(Alanine aminotransferase)와 AST(aspartate amino-transferase) 활성도 측정
혈청 중 ALT 및 AST의 활성도는 L-알라닌(L-alanine) 및 L-아스파르트(L-aspartate)와 α-케토글루타릭산(α-ketoglutaric acid)를 기질로 하여 생성되는 피브르산 및 옥살로 아세테이트가 염기성에서 2,4-디니트로페닐히드라진과 작용하여 발색되는 하이드로존의 색조를 비색정량 하는 라이트만(Reitman)과 프랑켈(Frankel)의 방법에 준해 제조된 키트 시액(아산제약 ㈜)을 사용하였다. 활성도 단위는 혈청 ml 당 카르멘 유닛(Karmen unit)으로 표시한다.
3.2 빌리루빈 활성도 측정
혈청 내 빌리루빈의 성분의 디아조 반응에 의한 아조 빌리루빈 정색을 비색 정량하는 에블린-말로이(Evelyn-malloy) 변법을 이용하여 비포합 빌리루빈(total bilirubin-TB)과 포합 빌리루빈(direct bilirubin-DT)을 측정하는 키트 시액(아산제약(주))를 사용하였다.
3.3 간 조직 및 혈청 중 간 손상 지표
헛개나무 열매 추출물과 CCl4를 병행 투여할 때 헛개나무 열매 추출물이 간섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 간 손상 평가 지표로 이용되고 있는 혈청 AST, ALT와 비포합 빌리루빈(total bilirubin), 포합 빌리루빈(direct bilirubin)의 활성 변동을 측정하였다. 혈청 중 ALT 및 AST의 활성도는 L-알라닌 및 L-아스파라이트와 α-케토글루타르산을 기질로 하여 생성되는 피브르산 및 옥살로아세테이트가 염기성에서 2,4-디트로페닐하이드라존과 작용하여 발색되는 하이드라존의 색조를 비정량하여 나타낸다. AST, ALT의 활성은 정상군에서보다 CCl4를 투여한 군에서 액 3~5 배 정도 높게 측정되었으며(도 4, 표 3), CCl4와 FHD를 함께 투여한 군은 CCl4 투여군 보다 약 2배 정도 낮게 측정되었다. 비포합 빌리루빈, 포합 빌리루빈은 정상군보다 CCl4 투여군에서 증가하였으며, AST, ALT와 마찬가지로 CCl4와 FDH를 함께 투여한 군은 CCl4 투여군 보다 낮게 측정되었다(도 5, 표 4). 이와 같은 결과로 미루어 보아 헛개나무 열매 추출물은 간 섬유화에 대한 억제 작용을 나타내었다고 사료되었다.
[표 3]
[표 4]
3.4 헛개나무 열매 추출물 투여 후 콜라겐 I, III의 발현 정도
간 경변에서는 6~10 배 이상으로 증가하고 1형과 3형의 비율이 약 4:1로 주로 1형이 많이 증가하는 것으로 알려져 있다. 간 섬유증은 결국 간 내의 콜라겐의 증가로 유발되는데 여러 가지 인자로 인한 콜라겐 유전자의 자극으로 콜라겐의 생성이 증가하거나 콜라겐을 분해시키는 콜라겐 분해 효소의 감소로 유발된다. 따라서 정상 간 조직과 CCl4 투여에 의해 간 섬유화가 일어난 조직에서 콜라겐 양을 측정하여 비교해 봄으로써 간 섬유화의 진행 상태를 알 수 있는 의의를 가지고 있는 것이다. RT-PCR 수행 결과 콜라겐 I, III의 발현량은 정상군에서 보다 CCl4 투여 군에서 훨씬 증가하는 것을 볼 수 있다. 그리고 CCl4 투여 군에서 보다 CCl4와 FHD를 함께 투여한 군에서의 발현은 감소하였다(도 6). 이는 헛개나무 추출물이 간 섬유화 억제에 영향이 있음을 시사한다.
<실시예 4> 토탈 RNA의 분리
토탈 RNA는 안정화 용액인 RNA 레이터(later)(QIAGEN)에 보관되어 있던 얼어있는 간 조직을 30mg 취하여 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit, QIAGEN)를 사용하여 키트에 제시된 실험법에 따라 시행하였으며, 토탈 RNA의 농도와 순도는 나도드랍을 이용하여 측정하였다. 추출한 RNA는 1.2% 아가로스 젤을 이용하여 전기 영동을 하고 리보소말 RNA 18S과 28S밴드로 확인하였다.
<실시예 5> 역전사 연쇄 중합 반응(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR)
토탈 RNA는 1μg/μl의 농도에 맞추어 수퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 합성 시스템(Superscript III First-Strand Synthesis system)(Invitrogen) 키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 간 섬유화의 지표로 알려져 있는 콜라겐 1형과 3형에 대한 RT-PCR을 수행하여 간 섬유화의 진행 정도를 유전자 레벨로 관찰하였다. PCR생성물은 아가로스 젤을 이용한 전기영동을 통해 에티디움 브로마이드 염색하여 확인할 수 있었다. CDNA 샘플의 완전성(integrity)는 특정한 랫트 GAPDH 프라이머를 사용하여 확인하였다. 콜라겐 1형과 3형에 대한 프라이머(도 1)는 문헌상에서 참고하여 PCR(초기 변성(denaturation) 온도 94℃ 5분, 35 증폭 사이클: 변성 94℃ 45초, 어닐링(annealing) 59℃ 1분 30초, 확장(extention) 72℃ 2분, 최종 확장 72℃ 10분)을 수행하였다.
<실시예 6> 메이슨 트리크롬 염색
6.1
각각의 도살된 쥐에서 간 조직을 얻은 후 10% 중성 포르말린 고정액에 24시간 고정하였다. 고정된 간 조직을 적당한 크기로 잘라 계열 에탄올에 탈수한 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 마이크로톰을 사용하여 5μm 두께의 박절편을 광학현미경 검경용 유리 슬라이드에 부착한 후 탈 파라핀 고정 및 함수 과정을 거쳐 매이슨 트 리크롬 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.
6.2 매이슨 트리크롬 염색의 결과
현재 트리크롬 염색의 일반적으로 인정되는 이론은 교원섬유가 강산성 용액 하에서 산성 염료를 선택적으로 흡수함으로써 이루어진다고 여겨진다. 근육, 콜라겐은 산성 염료인 비브리히 스칼렛(biebrich scarlet), 산성 훅신(acid fuchsin)에 의해 적색으로 염색이 되고, 포스포몰리브딕-포스포텅스트산(phosphomolybdic-phosphotungstic acid)는 콜라겐을 탈색시키고, 염기성 염료인 아닐린 블루와 콜라겐의 기본 그룹을 결합시켜 파란색으로 염색시킨다. 이러한 매이슨 트리크롬 염색법을 이용하여 간 섬유화의 정도를 관찰하였다. CCl4 투여군 0주차에서 10주차까지의 간 섬유화 정도를 관찰할 수 있었는데, 시간이 흐를수록 간 섬유화의 정도는 더욱 진행되는 것을 볼 수 있다(도 7). 또한, CCl4와 FHD를 함께 투여한 군 2주차에서 6주차까지의 간 섬유화 정도를 관찰할 수 있었는데, 헛개나무 열매 추출물은 간 섬유화 억제 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 8, 9).
본 발명에 따른 천연 추출물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물은 독성과 같은 부작용을 나타내지 않으며 우수한 간 섬유화 억제 기능을 가지므로, 간 기능 회복용 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품 등의 제조에 유용하다.
Claims (8)
- 오리나무, 갈화, 헛개나무 열매, 인진쑥, 헛개나무 가지, 헛개나무 잎, 진피, 숙지황, 및 감초로 이루어진 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 억제 기능을 갖는 간 기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 조성물에 대하여 건조 중량 기준으로 0.001 내지 10중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은, 혼합물의 총 중량을 기준으로 오리나무 1-2중량%, 갈화 1-2중량%, 인진쑥 0.5-1중량%, 헛개나무 가지 0.2-0.6중량%, 헛개나무 잎 0.2-0.6중량%, 진피 0.2-0.6중량%, 숙지황 0.1-0.15중량%, 감초 0.05-0.1중량% 및 나머지 량의 용매를 혼합한 다음, 상기 혼합물을 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 또는 환류 추출에 의해 추출하고, 추출 여액을 여과한 후 감압 증류하여 농축시키고, 농축된 여액을 동결 건조하여 분말화하여 얻어진 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 엑기스 형태인 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 하여 제조된 식품.
- 제 6항에 있어서, 식품은 기능성 식품, 건강식품 또는 건강보조식품인 것을 특징으로 하는 식품.
- 제 6항에 있어서, 식품은 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육류가공식품 또는 국수인 것을 특징으로 하는 식품.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101140325B1 (ko) * | 2009-11-23 | 2012-05-02 | 주식회사 티제이네츄럴 | 인진쑥, 헛개열매, 오리나무, 감초, 갈근 및 구기자로 이루어진 한방 혼합 침출차 조성물 및 그 제조방법 |
KR20160070872A (ko) | 2014-12-10 | 2016-06-21 | 원광대학교산학협력단 | 산사 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
KR20180076883A (ko) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 남부대학교산학협력단 | 헛개와 갈화 추출액을 이용한 기능성 치킨 및 그 제조 방법 |
CN113559141A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-29 | 内蒙古民族大学 | 茵陈蒿用于制备治疗肺纤维化药物的用途 |
-
2007
- 2007-05-15 KR KR1020070047014A patent/KR20080100942A/ko not_active Application Discontinuation
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