KR101449379B1 - 녹차로부터 루테인의 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차로부터 루테인을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 녹차로부터 분리된 루테인의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 녹차로부터 카로티노이드계 색소인 루테인을 정제된 형태로 분리시키고, 분리된 카로티노이드계 색소인 루테인에 대한 항산화 활성 및 항암활성을 검정하여 항산화 및 항암 활성을 가짐을 확인한 발명에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 녹차의 새로운 생리활성 기능을 밝히면서 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 가능성 및 녹차의 항암 조성물로서의 새로운 기능을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Description

녹차로부터 루테인의 추출 방법{Extraction method of lutein from green tea}

본 발명은 녹차로부터 분리된 색소성분인 루테인이 높은 항산화 활성 및 항암 활성을 나타냄을 확인하고 이를 추출하는 발명이다.

최근 작물에 함유된 식이 피토케미칼(phytochemical)의 섭취가 강력한 항산화 활성을 나타내어 다양한 질병예방 및 치료에서 중요한 역할을 수행하고 있다는 것이 증명되고 있다. 다양한 항발암제와 항돌연변이제가 in vivo 상에서 종양(tumor), 암(cancer)의 중간매개 바이오마커(biomarker)의 증식과 빈도를 감소시키는 것이 확인되었으며, in vitro 상에서 단기간의 유전독성 검정을 통해 항암효능을 나타내는 것이 확인되고 있다.

다양한 동물 실험을 통해 피토케미칼이 인체에 섭취되어지는 수준 또는 그 이상의 농도에서 항암효능이 검증되고 있으나, 작물의 잎이나 과일과 같은 영양체로부터 발견되어지는 클로로필(chlorophyll)이나 카로티노이드와 같은 색소화합물에 대한 고찰은 극히 미흡한 실정이다. 또한 작물의 활성성분 중 항산화활성에 기인하여 질병치료와 건강증진에 기여하는 것이 비타민 C나 E, 폴리페놀(polyphenol) 등과 같은 피토케미칼에 의해서 인지 혹은 클로로필이나 카로티노이드(carotenoid)와 같은 색소화합물에 의한 것인지에 대해서는 불분명하며, 대부분의 연구가 이러한 색소화합물을 제외한 플라보노이드나 사포닌과 같은 피토케미칼에 국한되어 있는 실정이다.

카로티노이드는 일반적으로 인간의 식 재료가 되고 있는 식물체의 열매 및 잎에 많이 포함되어 있으며, 노란색과 적색의 색상을 나타내는 화합물의 한 종류로서 자연 상태에서 수백 개의 성분들을 포함하고 있으나 체내에 섭취되어 인간의 혈장과 조직에서 검출되거나 기능을 수행하는 것이 밝혀진 것은 단지 몇 가지에 지나지 않고 있다(Khachik et al., 1992). 몇몇의 카로티노이드는 인체 내에서 생물학적 기능을 수행하고 있으며, 인간의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 수행하고 있다. 또한 많은 질병 역학적 연구에서 이들 카로티노이드의 섭취와 혈장에서의 수준이 암이나 심혈관계질환과 부의 상관관계를 가지고 있는 것이 보고되어지고 있다(Cooper et al., 1999). 반면 카로티노이드가 인간의 다양한 질병에 대한 보호효과를 가지고 있다는 이러한 보고들은 아직 충분한 근거와 과학적인 설명이 부족한 상태이다.

카로티노이드 계열의 하나인 루테인(lutein)은 녹색 채소에 존재하는 다중의 지용성 항산화제 중 하나이며, 천연의 소재에서 분리된 약 700개의 카로티노이드 중에서 유리기(free radical)를 소거할 수 있는 가장 효율적이며 중요한 하이드록시 카로티노이드(hydroxyl carotenoid) 이다(Southon, 2000). 또한 루테인은 인간이 섭취하는 음식과 체내 혈장, 조직에서 쉽게 발견되어지며, 혈장에서 가장 높은 비율로 존재하는 카로티노이드이고, 다른 카로티노이드와 유사하게 임상적으로 체내 섭취가 암이나 백내장과 같은 임상적 질환에 도움이 되는 것으로 알려져 있으나(Zhang et al., 1999; Enger et al., 1996; Rumi et al., 1999; Slattery et al., 2000) 역시 아직까지 충분한 근거와 과학적인 설명이 부족한 상태이다.

루테인과 연관된 화합물인 지아잔틴(zeaxanthin)은 디하이드록시 잔토필(dihydroxy xanthophyll) 계열의 카로티노이드로서 두 개의 하이드록시(hydroxy)기를 보유하고 있는 반면, β-카로틴이나 라이코펜(lycopene)과 같은 하이드로카본 카로티노이드(hydrocarbon carotenoid)는 산소원자를 가지고 있지 않다. 루테인과 지아잔틴이 가지는 하이드록시기는 이것을 포함하고 있지 않는 카로티노이드인 하이드카본 카로티노이드보다 더 큰 극성을 나타내게 되며, 인체의 시각조직에서 유익한 효능을 나타내는데 기여한다.

루테인은 유일하게 높은 에너지의 청색광에 대한 필터로 작용하거나 광촉매 기(radical)나 활성산소종을 제거하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Krinsky, 1989). 질병과 관련되어 루테인의 섭취는 노인성황반변성(Age-related macular degeneration)이나 백내장 (cataract)과 같은 안질환에 효율적으로 작용하는 것으로 알려져 있으나, 루테인의 항산화 활성과 항발암활성 (anticarcinogenecity)에 대한 보고는 거의 전무한 실정이다.

본 발명의 발명자들은 루테인의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 녹차로부터 카로티노이드 계열의 색소인 루테인을 정제된 형태로 획득하였고, 분리된 카로티노이드 계열의 색소인 루테인의 항산화 활성 및 항암활성을 검정한 결과, 루테인이 높은 항산화 활성 및 항암 활성을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 상기 녹차로부터 분리된 루테인을 포함하는 항암 조성물 및 건강 보조식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명에 따른 녹차로부터 항암활성을 가지는 루테인의 추출하는 방법은 cyclinD1의 발현 억제를 통한 암세포 증식 억제 활성을 가지는 루테인을 추출하는 것을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명의 암 개선 및 예방용 건강 보조식품은, 상기 녹차로부터 분리된 루테인을 유효성분으로 하는 항암 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 녹차로부터 아세톤을 사용하여 루테인을 수득하는 방법의 일례를 위주로 하여 구체적으로 설명한다.

먼저, 녹차 잎을 건조시키고 분쇄하여 건조 분말을 만들고, 이를 아세톤에 침지하고 여과하여 얻은 여액을 저온에서 정치하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 상기 불용성 침전물이 제거된 아세톤 추출물에 포화식염수, 증류수 및 헥산을 첨가하여 진탕 후 헥산 분획을 취하고, 이를 감압 농축하여 헥산을 제거하는 과정에 의하여 녹차 아세톤 추출물을 얻는다.

루테인은 탄소가 40개, 수소가 56개가 결합되어 있으나, 소수의 하이드록실기(OH)만 포함되어 있는 구조적 특징에 의하여 지용성을 나타낸다. 따라서, 물과 같은 완전극성 용제에는 전혀 용해되지 않는다. 이와 같이 지용성인 루테인은 알콜 혹은 아세토니트릴과 같이 극성이 5 내지 6 수준의 극성 유기용제에는 비교적 잘 용해되는 특성을 나타내지만, 이들 용제의 경우 당을 포함한 다양한 극성물질에 대한 용해도가 워낙 뛰어나므로 상기한 극성 유기용제를 사용하는 경우에는 루테인 외에 당, 플라보노이드, 배당체 및 단백질을 포함한 다른 극성물질까지 포괄적으로 추출된다. 따라서, 상기한 알콜 계열의 극성 유기용제는 상대적 극성 물질의 혼입에 의해 순도 및 효율면에서 루테인을 추출하기에 부적합하다.

또한 상대적으로 중간극성 혹은 비극성의 특성을 나타내는 에칠아세테이트, 클로로포름, 부탄올, 프로판올, 디클로로메탄, 에칠에테르, 크실렌 및 헥산과 같은 유기용제를 사용할 경우 지용성의 특성을 나타내는 루테인도 잘 추출할 수 있지만, 루테인보다 더 낮은 극성을 나타내는 클로로필 화합물, 페오피틴 유도체, 알파 및 베타카로틴을 포함한 카로틴 화합물, 지질 등과 같이 루테인 보다 더 낮은 극성을 나타내는 물질의 용해도가 극히 증가되어 비극성 물질의 혼입이 커지게 되므로 상대적으로 순도 및 효율면에서 아세톤보다 루테인을 추출하기에 부적합함을 확인하였다.

그러나, 본 발명에서 녹차로부터 루테인을 추출하기 위하여 사용한 아세톤은 극성의 측면에서 알콜류와 유사한 5.1 수준을 나타내지만, 식물체 내에 다량으로 존재하는 당, 배당체 및 단백질 성분들은 아세톤에 대해 용해도가 극히 부족하여 아세톤을 용제로 사용할 경우 추출이 잘 이루어지지 않으며, 소량 추출된다 하더라도 냉침을 이용하면 용해도가 극히 낮아져 침전물 형태로 침전되므로 여과에 의해 제거할 수 있어 상대적으로 고순도의 루테인을 추출할 수 있는 잇점이 있음을 확인하였다.

아세톤은 녹차 분말 중량대비 5 내지 20 배의 중량으로 사용할 수 있으며, 상기 추출은 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 응용할 수 있다.

저온 암조건 추출의 경우 냉장 조건, 구체적으로 3 내지 5 ℃에서 이루어지며, 11 내지 12 시간동안 추출할 경우 루테인의 추출효율이 높게 나타났다. 상온추출의 경우 구체적으로 20 내지 25 ℃에서 이루어지며, 22 내지 24 시간동안 추출할 경우 루테인의 추출 효율이 높게 나타났다. 초음파 추출의 경우 37 내지 40 ℃ 에서 이루어진 경우 추출시간이 160 내지 180 분의 경우 루테인 추출 효율이 높게 나타났다. 환류추출의 경우 75 내지 80 ℃에서 이루어진 경우 추출시간이 160 내지 180 분의 경우 루테인 추출효율이 높게 나타났다.

*저온 암조건 추출, 상온추출, 초음파 추출 및 환류 추출을 비교할 경우, 루테인만을 다량으로 얻기 위해서는 저온 암조건 추출이 더욱 바람직한 것으로 확인 되었다.

상기와 같이, 녹차의 건조 분말을 아세톤에 직접 침지 및 여과하여 얻은 여액을 저온 침지 및 헥산분배를 이용하여 아세톤 추출물 중 극성물질을 완전히 제거함과 동시에 열 및 산화에 의한 루테인의 분해를 방지하여, 구조적으로 안정하게 루테인을 고순도로 다량 추출할 수 있게 한다.

상기와 같이 아세톤을 사용하여 추출한 여액은 저온(4 내지 - 20 ℃)에서 12 내지 24 시간동안 정치하여 불용성 침전물을 여과한다. 상기 불용성 침전물에는 저온의 아세톤 상태에서는 용해도가 극히 낮아져 재결정화 되는 당, 배당체, 페놀성 물질, 극성 단백질 및 비타민 결합체 등 다양한 극성물질이 포함되어 있으며, 이를저온에서 방치하여 침전물을 형성한 후 여과함으로써 아세톤에 대하여 용해도가 떨어지는 극성물질의 일부를 비열처리를 통해 제거할 수 있는 잇점이 있다.

상기와 같이 저온에서 방치하여 불용성 침전물을 제거한 여액에는 아직 일부 극성물질 및 중간극성 물질이 공존하고 있으므로, 구조적 파괴를 최소화 할 수 있는 비열처리 방법인 용매분배를 이용하여 혼재된 극성물질 및 중간극성 물질을 완전히 제거한다.

즉, 불용성 침전물이 제거된 아세톤 여액에 포화식염수 및 증류수를 첨가하고, 여기에 비극성 용매이면서 비중이 낮은 헥산을 첨가하여 격렬히 흔들어 준 후 층 분리를 유도하고, 루테인이 용해되어 있는 상층인 헥산 층을 회수함으로써, 극성물질의 혼입이 없이 분리 회수할 수 있다.

한편, 아세톤은 유기용매이면서 그 외 기타 유기용매나 증류수와 잘 섞이는 특징이 있는데, 아세톤 추출물에서 극성물질을 제거하기 위해 증류수 혹은 극성용매를 단순히 첨가할 경우 상기와 같이 아세톤과 그 외 유기용매 및 증류수가 서로 잘 섞이는 특징으로 인해 층 분리가 유도되질 않고 서로 섞여버리는 현상이 발생되므로 실제 용매의 극성을 이용한 층 분리를 통해서는 아세톤 추출물 중 중간극성 및 극성물질의 제거가 불가능하다.

이에, 본 발명에서는 아세톤 추출물에 혼재된 일부 중간극성 및 극성물질을 제거하기 위하여 포화식염수를 사용한다. 이와 같이 포화식염수를 사용하는 방법은 비열처리에 의한 방법이므로 열처리에 의해 야기되는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 아세톤 추출물에 포화식염수와 증류수를 동시에 넣게 되면 증류수와 함께 사용된 포화식염수는 극성용매로 작용하게 되지만 첨가된 포화상태의 소금에 의해 증류수가 거의 용질로 포화된 상태가 되기 때문에 아세톤에 녹아있던 극성물질은 녹일 수 있으나 비극성 물질까지 용해시킬 수 있는 수준의 용해도는 완전히 상실한 상태가 된다. 이때 비극성 용매인 헥산을 첨가하면 아세톤 추출물에 함유되어 있던 비극성 물질인 루테인이 자연스럽게 포화식염수 보다는 상대적으로 극성의 친화성이 월등히 높은 헥산 층으로 이행하게 되며, 헥산 층으로 이행하지 못한 극성물질은 식염수 층으로 이행되므로, 헥산층으로 극성물질이 혼입되는 것을 배제할 수 있다.

상기 헥산 분배를 이용하여 중간극성 및 극성물질을 제거하고 고순도의 유리 상태의 루테인을 함유한 헥산용액에서 용매로 사용한 헥산을 제거한 녹차 아세톤 추출물은 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피를 수행하여 루테인의 분획을 얻고 분획을 농축 건조하여 재용해한 다음 분취 HPLC를 사용하여 순수 분리한다.

상기 순수 분리한 화합물을 NMR, MS 등의 다양한 분광분석법으로 동정한 결과, 루테인을 얻었다.

한편, 녹차로부터 아세톤을 사용하여 분리된 루테인은 체내에서 활성형인 유리형으로 존재함을 확인하였다. 이는 기존의 금잔화 추출물에서 에스테르염 상태로 존재하는 루테인을 추출하기 위하여 비누화 등의 공정을 거쳐야 하는 것과는 달리 체내에서 루테인 활성이 바로 나타나는 유리형태의 활성형 루테인을 용제를 사용한 추출 작업에 의하여 간단하게 수득할 수 있다는 잇점이 된다.

본 발명의 녹차로부터 분리된 루테인에 대해서는 ESR(Electron Spin Resornance)과 화학적 방법을 적용하여 DPPH 기 소거활성, 하이드록시 기 소거활성, 수퍼옥사이드 음이온 소거활성 등의 활성산소종에 대한 소거활성과 환원력 검정을 수행하였고, MTT 분석을 통한 암세포증식 억제 활성과 전립선암 세포주를 대상으로 하는 웨스턴 블로팅(western blotting)을 통하여 암세포증식 억제작용을 검토하였다.

상기 녹차로부터 분리된 루테인을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 및 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 점막 또는 국소, 경피 등 에 적용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화 된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하 주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화 될 수 있다.

본 발명의 조성물 유효 투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등 에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 20 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 10 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식용되는 녹차로부터 분리되었으므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 암 예방 및 개선 효과를 갖는 건강식품으로 개발될 수 있다.

본 발명의 조성물을 건강식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.

즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수 있으며, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이 외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 녹차로부터 분리한 루테인은 항산화제로서 유리기와 활성산소종을 소거하거나 다른 항산화제를 보호하는 기능을 수행함으로써 세포내 DNA를 보호할 수 있으며 임상질환에 대하여 치료 및 예방효과가 기대되어진다.

또한, 본 발명에 의하면, 기존에 널리 알려진 녹차 카테킨 외에도 녹차의 루테인이 항암 조성물로 사용할 수 있음을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 녹차 아세톤 추출물을 저온 침지 및 헥산 분획을 수행하여 중간극성 및 극성물질을 제거하여 루테인의 순도를 향상시킨 아세톤 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 루테인의 질량분석스펙트럼이다.
도 3은 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 루테인의 NMR 스펙트럼이다.
도 4는 녹차 아세톤 추출물, 루테인 및 α-토코페롤의 DPPH 기 소거활성을 비교한 것이다. α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었고, 대조구는 어떠한 항산화제도 사용하지 않았다. 흡광도는 517 nm에서 측정되었으며, 결과는 평균 ± S.D. 로 나타내었다[n=3].
도 5는 녹차(Camellia sinensis , GT) 아세톤 추출물, 루테인 및 BHA의 환원력을 비교한 것이다. BHA는 양성대조구로 사용되었으며, 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
도 6은 루테인, 아스코르빈산 및 β-카로틴의 농도별 수퍼옥사이드 기 소거능을 ESR 스펙트럼에 의하여 측정한 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 패널은 루테인, 아스코르빈산 및 β-카로틴의 농도별 소거활성을 저해율(%)로 나타내었으며[n=3] 오른쪽 패널은 루테인(20mM), 아스코르빈산(20mM) 및 β-카로틴(20mM)의 첨가에 따른 수퍼옥사이드 기의 ESR 신호세기를 나타낸 그림이다. 10 mM의 잔틴과 0.25 U의 잔틴 옥시다아제가 반응하여 생성된 수퍼옥사이드 기를 DMPO(0.3M)와 반응시킨 것을 음성 대조구로 사용하였고, 잔틴과 잔틴 옥시다아제가 반응하여 형성된 수퍼옥사이드 기에 β-카로틴과 아스코르빈산을 첨가하여 소거되는 수퍼옥사이드기가 양을 DMPO(0.3M)와 반응시킨 것을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 7은 녹차 아세톤 추출물 및 루테인의 NBT 환원에 대한 수퍼옥사이드기 생성 저해율을 나타낸 것으로, α-토코페롤이 양성 대조구로 사용되었으며, 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
도 8은 루테인, 아스코르빈산 및 β-카로틴의 농도별 하이드록시 기 소거능을 ESR 스펙트럼에 의하여 측정한 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 패널은 루테인, 아스코르빈산 및 β-카로틴의 농도별 소거활성을 저해율(%)로 나타내었으며[n=3] 오른쪽 패널은 루테인(20mM), 아스코르빈산(20mM) 및 β-카로틴(20mM)의 첨가에 따른 수퍼옥사이드 기의 ESR 신호세기를 나타낸 그림이다. 10 mM의 H₂O₂와 10mM FeSO₄의 펜톤 반응에 따라 생성된 하이드록시 기를 DMPO(0.3M)와 반응시킨 것을 음성 대조구로 사용하였고, 펜톤 반응에 의하여 형성된 하이드록시 기(OH)에 β-카로틴과 아스코르빈산을 첨가하여 소거되는 수퍼옥사이드기가 양을 DMPO(0.3M)와 반응시킨 것을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 9는 녹차 아세톤 추출물(GT, 100 ㎍/㎖) 및 루테인(5 ㎍/㎖)의 하이드록시기 소거 활성을 화학적으로 검정한 결과를 나타낸 것이다. BHA(butylated hydroxyl anisole)와 α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었으며, 음성 대조구는 항산화제를 첨가하지 않은 아세톤을 사용하였다. 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
도 10은 24 시간 배양한 LNCaP 전립선암 세포의 PCNA(36 kDa) 단백질 발현에 대한 카로티노이드(β-카로틴, 라이코펜 및 루테인)의 효과를 나타낸 것이다. β-액틴(Actin) (43 kDa)은 내부 대조구로서 사용되었고, 결과는 평균 ± S.D.[n=3] 수치는 스투던트 t-테스트(Student’ t-test)에 의하여 측정되었고, “*”는 0 μM 처리구와 유의적으로 차이를 가지는 데이터를 나타낸다[p < 0.05].
도 11은 24 시간 배양한 LNCaP 전립선암 세포의 cyclinD₁(36 kDa) 단백질 발현에 대한 카로티노이드(β-카로틴, 라이코펜 및 루테인)의 효과를 나타낸 것이다. β-액틴(Actin) (43 kDa)은 내부 대조구로서 사용되었고, 결과는 평균 ± S. D.[n=3] 수치는 스투던트 t-테스트(Student’ t-test)에 의하여 측정되었고, “*”는 0 μM 처리구와 유의적으로 차이를 가지는 데이터를 나타낸다[p < 0.05].

이하. 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹차 아세톤 추출물의 제조 및 루테인의 분리

녹차 잎을 분쇄하여 60 mesh 체로 통과시킨 후 분쇄시료 20g에 아세톤 2L를 첨가하고 40℃ 조건의 초음파추출기에서 3시간 추출하였으며, 같은 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출된 용액은 모두 합쳐 Whatman No. 2 여지를 이용하여 여과하였고, -20℃ 저온고에서 24시간 동안 정치하면서 불용성 침전물을 재 여과하였다.

*여과된 아세톤 추출액 중 600mL를 분획여두에 옮기고, 여기에 포화식염수 200mL와 증류수 1,000mL를 첨가하고, 다시 헥산 300mL를 첨가하여 격렬하게 흔들어 준 후 층 분리를 유도하였으며, 층이 분리된 후 아래층의 포화식염수 층은 버리고 상층의 헥산 층을 완전 회수하였다.

여과된 헥산 층은 40℃ 감압농축장치에서 농축하여 헥산 용매가 제거된 흑갈색 겔(gel) 상태의 녹차 아세톤 추출물을 제조하였다.

상기 녹차 아세톤 추출물을 대상으로 분취(preparative) HPLC(Agillent 1200 series, USA)를 이용하여 분리를 수행하였는데, 분취 HPLC의 분리 조건으로 컬럼은 HiQ sil C18-10 (21.0 × 250mm, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 430nm, 분당 유속 10mL, 분석 용매로 A용매는 75% 메탄올, B용매는 에칠아세테이트를 농도구배(0분 : 70% A, 25분 : 15% A, 26분 : 70% A, 35분 : 70% A)로 사용하였고, 시료 주입량은 2mL로 조절하여 고순도 분리를 실시하였다. 분리를 수행한 결과 황색, 녹색 및 갈색을 나타내는 수종의 화합물을 분리하였다.

실시예 2. 녹차로부터 분리된 루테인의 확인

상기 실시예 1에 의하여 얻어진 수종의 화합물의 자외가시 분광특성 및 질량분석을 수행하여 각 화합물을 동정하였고, 특히 분리화합물 중 Peak 1에 해당하는 루테인에 대해서는 NMR 및 추가적인 질량분석을 수행하여 완전한 화학구조를 해석하였다. 그 결과는 도 1 내지 3과 표 1 및 2에 나타내었다.

Peak	Compound	λmax (nm)	MS (m/z, M+H)
1	(all-trans)-lutein	422, 446, 474	569

도 3 에 나타낸, 루테인에 해당하는 피크(peak) 1의 ¹H-NMR(300MHz, CDCl₃) 스펙트럼을 측정한 결과를 살펴보면 ¹H-¹H 상관관계(correlation)를 볼 때 Me-18'(1.63ppm)과 H-3'(4.25ppm)이 지환 화합물 영역의 앞쪽 H-2'(eq, 1.86ppm 및 ax, 1.38ppm) 양성자와 상관관계가 있는 것을 추정해 볼 때, 5.55ppm의 피크는 H-4'으로 결정할 수 있었고, H-7'(5.44ppm)은 H-8'(6.15ppm)과 H-6'(2.42ppm) 피그의 ¹H-¹H 상관관계 시그널에 의해 동정할 수 있었다. 아울러 H-3과 H-3'에 해당하는 2개의 2차 하이드록시 그룹(hydroxy group)의 양성자는 각각 4.00ppm과 4.25ppm 영역에서 확인할 수 있었으며, 1D selective NOESY에 의해 H-16/H-2ax, H-16/H-17, H-18/H-17에 해당하는 피크가 상관관계를 나타내는 것으로 보아 CH₃-16, CH₃-18, H-2ax, H-3이 모두 동일한 고리에 존재함을 알 수 있다. 또한 H-19/H-7, H-19/H-10, H-20/H-14 피크의 NOESY 상관관계에 의해 하이드로카본 그룹에 결합된 CH₃를 동정할 수 있고, 동일한 방법으로 H-19'과 H-20'을 동정하였다. 올레핀(Olefin) 그룹의 양성자 피크는 5 ~7ppm사이에서 확인할 수 있었고, 특히 6.65ppm까지의 다중 시그널(multiplet signal)은 H-15/H-15'(6.65ppm), H-11/H-11'(6.63ppm), H-7/H-7'(6.44ppm), H-12/H-12' (6.36ppm), H-14/H-14'(6.25ppm), H-8/H-8'(6.12ppm) 양성자 짝에 의한 피크로 동정 하였다. 한편 H-2(1.48ppm 및 1.79ppm)와 H-2'(1.38ppm 및 1.86ppm)의 양성자가 기타 올레핀 그룹의 양성자와 다른 영역에서 확인된 것은 H-2 및 H-2'의 양성자가 올레핀 그룹의 양성자와 짝짓기(coupling) 하는 대신에 주위에 있는 메틸 그룹과 짝짓기하기 때문에 1.3～1.8ppm 부근에서 확인되었다. 기타 메틸기(CH₃, H-16～H-20, H-16'～H-20')는 전형적인 메틸 피크가 나타나는 영역인 1～2ppm 부근에서 확인할 수 있었다.

Position		δH	Position		δH
1			1'
2	ax	1.48 (m)	2'	ax	1.38 (dd, 13, 7)
	eq	1.79 (m)		eq	1.86 (m)
3		4.00 (m)	3'		4.25 (m, br)
4	ax	2.05 (m)	4'		5.55 (m, br)
	eq	2.38 (m)
5			5'
6			6'		2.42 (d, 9.5)
7		6.12 ova	7'		5.44 (dd, 15.5, 10.1)
8		6.12 ova	8'		6.15 ova
9			9'
10		6.17 ova	10'		6.14 ova
11		6.63 (dd, 14.3, 11.4)	11'		6.61 (dd, 15.0, 11.4)
12		6.36 (d, 14.7)	12'		6.36 (d, 14.7)
13			13'
14		6.25 (m)	14'		6.25 (m)
15		6.65 (m)	15'		6.65 (m)
16		1.07 (s)	16'		1.00 (s)
17		1.07 (s)	17'		0.85 (s)
18		1.74 (s)	18'		1.63 (s)
19		1.97 (s)	19'		1.91 (s)
20		1.97 (s)	20'		1.97 (s)

실험예 1. 녹차로부터 분리된 루테인(lutein)의 DPPH 기 소거활성

녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 DPPH 기 소거활성은 Schimada 등 (1992)에 의한 방법으로 검정하였다. 0.5 mM의 DPPH 에탄올 용액 1 ㎖와 2 ㎖의 0.1M 아세테이트 완충액(acetate buffer)을 혼합하고 여기에 농도별(10 ～ 50 ㎍/㎖) 녹차 아세톤 추출물과 루테인을 처리한 후 상온에서 암상태로 30분 동안 정치하여 둔 후 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, japan)를 사용하여 517nm에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. 양성 대조군으로는 10 ～ 50 ㎍/㎖의 α-토코페롤(α-tocopherol, VE)을 사용하여 비교하였다. 그 결과는 다음 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물과 루테인의 DPPH 기 소거활성을 α-토코페롤과 비교 검정하여 본 결과 루테인이 20 ㎍/㎖에서 약 79%의 저해율을 나타낸 반면, α-토코페롤은 동일한 수준의 저해율이 약 40 ㎍/㎖을 처리한 경우에서 관찰되었다. 녹차 아세톤 추출물의 경우 10 ㎍/㎖를 처리하는 경우 26%의 저해율을 나타내어 28%의 저해율을 나타내는 양성대조군 α-토코페롤과 유사한 소거활성을 나타내었으나, 20 ㎍/㎖를 처리하는 경우 41%, 30 ㎍/㎖를 처리하는 경우 46%의 저해율을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 단지 일정한 수준으로 유지되는 경향만을 나타내었다. 루테인의 라디칼 소거활성은 루테인 자체의 소수성 특성과 구조상 교호적으로 연결되어 있는 이중결합에 기인하는 것으로 생각된다.

실험예 2. 녹차로부터 분리된 루테인의 환원력 비교

녹차 아세톤 추출물과 분리 루테인의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법에 따라 측정하였으며, 항산화 물질에 대한 철 이온의 환원력을 측정하였다. 0.2M 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 1 ㎖, 농도별 시료 (10 ～ 100 ㎍/㎖) 1 ㎖, 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 1 ㎖를 혼합하고, 이 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시킨 후 10% TCA(triobarbituric acid) 1 ㎖를 첨가하였다. 반응이 끝난 혼합물을 13,000 × g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액 2 ㎖에 메탄올 2 ㎖를 넣고, 0.1% 염화철(iron chloride) 0.1 ㎖를 넣은 후 UV/VIS 분광분석기를 이용하여 흡광도 700nm에서 측정하였다. 대조구는 BHA를 사용하였으며, 소거율은 다음과 같은 식으로서 (%)=[1-(A₀/A₁)] × 100 계산하여 검정하였다 [A₀= blank, A₁=extract]. 그 결과는 다음 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물과 분리 루테인의 환원력을 BHA와 비교한 결과 녹차 아세톤 추출물의 경우 농도가 증가함에 따라 환원력이 비례적으로 증가하는 결과를 나타내었으며, 20 ～ 80 ㎍/㎖까지 처리할 경우 대조군인 BHA보다 우수한 환원력을 나타내다가 100 ㎍/㎖ 이상에서는 BHA보다 낮은 활성을 나타내었다. 반면 루테인의 경우 20 ㎍/㎖ 수준에서 약 89%의 환원력을 나타내어 대조군 BHA 보다 높은 수준의 환원력을 나타내었으며, 20 ㎍/㎖ 이상의 농도에서도 90% 수준의 환원력이 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다. BHA의 경우 20 ㎍/㎖에서는 약 8%의 환원력을 나타내었고, 60 ㎍/㎖까지 28%로 약하게 증가하다가 80 ㎍/㎖에서 48%, 100 ㎍/㎖에서 86%의 환원력을 나타내어, 단지 루테인 20 ㎍/㎖가 처리되어졌을 경우와 유사한 환원력만을 나타내었다. 루테인의 환원력은 수소 공여능력에 기인한다는 것으로 생각되며, 이 결과를 통해 루테인은 전자공여체로서 작용할 뿐 아니라 라디칼과 반응하여 안정한 화합물로 변화됨으로서 라디칼 연쇄 반응(radical chain reaction)을 종결시킬 수 있는 기능을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. 녹차로부터 분리된 루테인의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성 검정

녹차로부터 분리된 루테인의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 잔틴(xanthine)과 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase)의 반응에 의해 발생한 수퍼옥사이드 음이온과 이들과 급속하게 반응하는 니트론 스핀 트랩(nitrone spin trap)인 DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline- N-oxide)를 이용하여 측정하였다. 즉, 0.1 M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.4) 120 ㎕에 농도별 시료, 아스코르빈산 및 β-카로틴의 농도별 시료 각 20 ㎕, 3 M DMPO 20 ㎕, 10 mM 잔틴 20 ㎕, 0.25U 잔틴 옥시다제 20 ㎕를 첨가, 혼합하여 총량이 200 ㎕가 되게 한 다음 실온에서 2.5분 방치하고, 석영 모세관(quartz capillary tube)에 옮겨 ESR 분광분석기(JES-FA ESR spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 대조구(blank)는 시료 대신에 아세톤 20 ㎕를 첨가하여 사용하였으며, ESR의 자기장(magnetic field) 336.5 mT, 전력(power)은 20 mW, 진동수(frequency)는 9.8 GHz, 진폭 변조(modulation amplitude)는 1.0 가우스(gauss), 게인(gain)은 200, 스캔 타임(scan time)은 0.5 분으로 조정하였고, 스캔 넓이(scan width)는 10 mT로 하였으며, 시간 상수(time constant) 0.03 sec, 온도는 25 ℃로 고정하여 측정하였다. 시료에 대한 수퍼옥사이드 음이온의 소거활성 계산은 처리구와 대조구의 시그널 강도(signal intensity)에 대한 평균 높이의 차이를 이용하여 아래의 공식에 의해 검정하였다. 그 결과는 다음 도 6에 나타내었다.

[(A_blank-A_sample)/A_blank]× 100%

도 6에 나타낸 바와 같이, 녹차로부터 분리된 루테인의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 ESR 분광분석기를 통하여 검정하고 β-카로틴 및 아스코르빈산과 비교하여 본 결과, 수퍼옥사이드 음이온 소거활성은 양성대조군인 β-카로틴이나 아스코르빈산 보다 루테인이 모든 농도에서 가장 높았다. 루테인의 경우 40μM에서 38%의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 나타내었고, 아스코르빈 산의 경우 동일 농도에서 34.5%, β-카로틴은 11.6%의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성을 나타내었다.

항산화제의 처리 없이 발생된 대조구(control)의 수퍼옥사이드 음이온 ESR 시그널 강도(signal intensity)에 대하여 루테인 첨가 시 약 69%의 감소율을 나타내었으며, 아스코르빈 산의 경우 42%, β-카로틴의 경우 10% 정도의 감소를 나타내었다. 이러한 결과를 통하여 루테인의 수퍼옥사이드 음이온 소거활성은 동일한 농도의 아스코르빈 산 보다 우수하며, β-카로틴 보다는 약 5배 정도로 높은 활성을 나타냄을 알 수 있다.

한편, 상기 ESR을 이용한 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 수퍼옥사이드 기 소거활성에 대한 결과를 확인하기 위한 수퍼옥사이드 기 소거활성은 NBT(nitro-blue tetrazolium)환원법을 사용하여 검정하였다(Nagai et al., 2005). 즉, 3 mM 잔틴 0.02 ㎖, 0.05 mM 소듐 카보네이트 완충액(sodium carbonate buffer, pH 10.5) 0.48 ㎖, 3 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) 0.02 ㎖와 0.15% 소태아 혈청 알부민(bovine serum albumin) 0.02 ㎖, 0.75 mM NBT 0.02 ㎖로 구성된 혼합액에 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인을 각각 10, 20, 40, 60 ㎍/㎖의 농도로 처리하였으며, 이 혼합물을 25℃ 에서 10분간 인큐베이션 하였으며, 다시 1.0 ㎖의 XOD(6 mU/mL)를 첨가하여 반응을 시작한 후 25℃에서 20분간 반응하였다. 그 후 0.02 ㎖의 6 mM CuCl를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 시료 첨가 양에 따른 NBT 환원에 대한 저해율을 나타내었으며, α-토코페롤을 양성대조구로 사용하여 비교하였다. 그 결과는 다음 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, ESR를 사용하여 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 수퍼옥사이드 기 소거활성을 NBT(nitro-blue tetrazolium)환원법을 사용하여 확인한 결과, 녹차 아세톤 추출물은 10 ㎍/㎖을 처리하는 경우 약 26%의 수퍼옥사이드 기 소거활성을 나타내었으며, 모든 농도에서 α-토코페롤이나 루테인 보다는 낮은 수퍼옥사이드 기 소거활성을 나타내었으나, 60 ㎍/㎖까지 지속적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 루테인은 20 ㎍/㎖에서 약 87%의 소거활성을 나타내었고 그 이상의 농도에서 일정하게 유지되는 결과를 나타낸 반면, α-토코페롤의 경우 60 ㎍/㎖ 처리한 경우의 수퍼옥사이드 기 소거율이 루테인 20 ㎍/㎖을 처리한 경우의 수퍼옥사이드 기 소거율과 유사하여 수퍼옥사이드 기의 소거에 있어 루테인이 α-토코페롤 보다 약 3배 이상의 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

상기 결과를 통하여 루테인은 동일한 농도의 어떠한 항산화제보다 높은 수퍼옥사이드 기 소거활성을 가지고 있음을 확인하였다.

실험예 4. 녹차로부터 분리된 루테인의 하이드록시 기(hydroxy radical) 소거활성 검정

녹차로부터 분리된 루테인의 농도별 하이드록시 기 소거활성 검정을 위해 ESR을 이용한 하이드록시 기의 생성 저해활성을 검정하였다. 하이드록시 기 생성은 펜톤 반응(fenton reaction, H₂O₂ + FeSO₄)을 이용하였으며, 하이드록시 기와 급속하게 반응할 수 있는 DMPO를 사용하였다. 0.1 M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)에 루테인, β-카로틴, 아스코르빈 산의 농도별 각 20 ㎕, 0.3 M DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline- N-oxide) 0.2 ㎖, 10 mM FeSO₄ 0.2 ㎖, 10mM H₂O₂ 0.2 ㎖를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 2.5분 방치한 후 석영 모세관(quartz capillary tube)에 옮겨 ESR 분광분석기(JES-FA ESR spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 대조구 (control)는 시료 대신에 아세톤 20 ㎕를 첨가하여 사용하였으며, ESR의 자기장 336.5 mT, 전력은 20 mW, 진동수는 9.8 GHz, 진폭 변조는 1.0 가우스, 게인은 200, 스캔 타임은 0.5 분으로 조정하였고, 스캔 넓이는 10 mT로 하였으며, 시간 상수는 0.03 sec, 온도는 25 ℃로 고정하여 측정하였다. 시료에 대한 하이드록시 기의 소거활성 계산은 처리구와 대조구의 시그널 강도에 대한 평균 높이의 차이를 이용하여 검정하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

[(A_control-A_blank)-(A_blank-A_sample)/A_control-A_blank] × 100%

도 8에 나타낸 바와 같이, 루테인을 10 μM 수준으로 처리할 경우 DMPO-OH signal은 18.6%의 생성 저해율을 보인 반면, 아스코르빈 산과 β-카로틴의 경우 동일 농도에서 약 2.5% 미만의 생성 저해율을 나타내었다. 농도가 증가함에 따라서 루테인의 하이드록시 기 생성저해율은 약 40 μM에서 58.9%의 저해율을 나타낸 반면, β-카로틴은 동일 농도에서 10.6%의 저해율을 나타내었고, 아스코르빈 산의 경우 8.5% 수준의 저해율을 나타내었다. 이 결과를 통해 루테인은 β-카로틴이나 아스코르빈 산 보다 월등히 우수한 하이드록시 기 소거활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

ESR를 이용한 분리 루테인의 하이드록시 기 소거 활성에 대한 결과를 확인하기 위하여 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 하이드록시 기 소거 활성검정을 펜톤 반응에 의한 2-데옥시리보스(Deoxyribose)가 하이드록시 기에 의해 산화되어 말론알데하이드로 변환되어 크로마겐을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 통해 확인하였다. 2.8 mM 2-데옥시리보스, 100 μM FeCl₃, 104 μM EDTA, 1 mM H₂O₂를 포함하는 용액에 20 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4)를 첨가하여 1 ㎖의 혼합물을 조제하였다. 여기에 녹차 아세톤 추출물 및 루테인의 농도별 시료를 에펜도르프 튜브에 넣고 37 ℃, 암상태로 1시간 동안 반응시킨 후 0.75 ㎖의 1.0% (w/v) TBA를 넣어 반응을 종결하였다. 반응액을 98 ℃ 물에 20분 동안 처리한 후 상온에서 냉각시키고 아세톤 1 ㎖를 첨가하여 색깔을 안정화 시켰으며, UV-1200 UV/VIS 분광분석기 (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 535nm에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. 하이드록시 기 소거활성 검정은 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 첨가에 따라 하이드록시 기에 의해 2-데옥시리보스가 산화되는 것을 저해하는 비율로 계산하였으며 기존의 항산화제인 α-토코페롤(VE) 및 BHA와 상호 비교하였다. 그 결과는 다음 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, ESR에 의한 녹차 아세톤 추출물 및 분리 루테인의 하이드록시 기 소거 활성을 확인하기 위해 녹차 아세톤 추출물과 루테인의 하이드록시 기 소거활성을 펜톤 반응을 이용하여 확인한 결과 녹차 아세톤 추출물은 약 150 ㎍/㎖에서 85%의 저해율을 나타낸 반면, 루테인은 약 5 ㎍/㎖ (농도 약 10μM)에서 79.6%의 저해활성을 나타내었다. 반면 양성대조구인 BHA는 90 ㎍/㎖ (농도 약 400μM), α-토코페롤의 경우에서는 180 ㎍/㎖ (농도 약 400μM)에서 유사한 수준의 하이드록시 기 소거활성을 나타내었으며, 동일 수준의 항산화 효능을 나타내는 데 필요한 처리농도로 볼 때 루테인은 BHA에 대해 18배, α-토코페롤에 대해 36배의 하이드록시 기 소거활성을 나타내어, 녹차 아세톤 추출물 및 녹차로부터 분리된 루테인이 강력한 하이드록시 기 소거활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 하이드록시 기는 H₂O₂에서 유도되어지며 혹독한 스트레스 하에서 식물체가 종종 만들어내는 라디칼로 활성 산소종들의 생성 메카니즘과 이들 활성산소종이 다른 환원된 형태의 분자와 반응하는데 있어 가장 반응성이 높고 독성이 강한 것으로 알려져 있다(Foyer et al., 1994; Asada, 2000). 활성산소종의 소거와 제거에 있어 루테인이 다른 항산화제보다 하이드록시 기에 대한 소거활성이 상대적으로 극히 높다는 것은 항산화제로서 루테인이 산화적 손상에 의해 유발되는 다양한 질병에 대한 치료와 예방적 효과가 매우 높다는 것을 나타낸다고 하겠다.

상기 결과를 통하여 ESR(electron spin resonance)은 생물학적이거나 화학적인 시스템에서 자유 라디칼의 생성 정도를 검정할 수 있는 직접적이면서 가장 감도가 높은 방법 중 하나로 생각된다. 본 연구를 통하여 ESR 적용기술은 루테인의 활성산소종의 제거 및 소거능력에 대한 직접적인 근거를 제공할 수 있음을 확인하였고, 다른 화학적 방법을 통하여 증명하였다.

실험예 5. 녹차로부터 분리된 루테인의 암세포 증식 억제율 검정

녹차 아세톤 추출물과 분리된 루테인의 암 세포주에 대한 세포증식 억제율을 검정하기 위하여 인간 폐암 세포주 A549, 위암 세포주 ACHN, 전립선암 세포주 LNCaP, 결장암 세포주 HCT-15, 유방암 세포주 MCF-7를 대상으로 녹차 아세톤 추출물과 분리 루테인을 농도별(200, 100, 50 ㎍/㎖)로 처리하고, MTT 분석을 통해 세포 생존률(cell viability)을 검정하였다. 각 암세포주를 96 웰 플레이트에 (1 × 10⁴/웰) 배양한 후에 시료를 농도별로 처리하고 36시간동안 더 배양하였다. 세포 생존율은 시판 키트(Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, WI)를 통하여 검정하였는데, 테트라졸륨 화합물(tetrazolium compound) MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium, inner salt]와 PMS(electron coupling reagent phenazine methosulfate)를 포함하는 혼합물 20 ㎕를 각 웰에 첨가하고 다시 1시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양한 후 enzyme-linked immunosorbent assay plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 3에 나타내었다[n=3].

Extract and Compound	Con. (㎍/㎖)	Viable Cell (% of Control) / Human Cancer Cell line*
		A549	ACHN	LNCaP	HCT15	MCF-7
GT	200	18.0± 8.0	32.0± 4.0	24.0± 5.0	25.0± 4.0	16.0± 2.0
	100	21.0± 6.0	46.0± 6.0	35.0± 4.0	36.0± 2.0	29.0± 4.0
	50	54.0± 7.0	61.0± 6.0	41.0± 6.0	51.0± 4.0	58.0± 5.0
Lutein	200	22.0± 1.0	28.0± 3.0	15.0± 3.0	28.0± 1.0	19.0± 2.0
	100	35.0± 2.0	37.0± 2.0	26.0± 2.0	38.0± 2.0	28.0± 2.0
	50	46.0± 3.0	51.0± 2.0	38.0± 2.0	57.0± 2.0	39.0± 2.0

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물과 녹차로부터 분리된 루테인의 인간 암세포주에 대한 생육 및 증식억제 효과를 검정하기 위하여 폐암 세포주 (A549), 신장암 세포주 (ACHN), 결장암 세포주 (HCT15), 전립선암 세포주 (LNCaP)와 유방암 세포주 (MCF-7)를 대상으로 MTT 분석을 수행한 결과, 녹차 아세톤 추출물의 경우 모든 세포주에 대하여 100 ㎍/㎖에서 50%의 암세포 생존율을 나타내었으며, 특히 다른 세포주보다 A549 폐암 세포주와 LNCaP 전립선암 세포주, MCF-7 유방암 세포주에 대하여 200 ㎍/㎖ 처리 시 18%, 24%, 16%의 암세포 생존율을 나타내어 높은 암세포 증식 억제활성을 나타내었다.

녹차로부터 분리된 카로티노이드계 색소인 루테인의 경우 모두 암세포주에 대하여 50 ㎍/㎖로 처리한 수준에서 대조구에 비하여 약 50% 수준의 생존율을 나타내어 높은 세포 독성을 나타내었으며, 농도 의존적으로 암세포 증식 억제효능을 나타내는 것을 관찰할 수 있었고, 특히 전립선 암세포주 (LNCaP)와 유방암 세포주 (MCF-7)에 대하여 특히 높은 활성을 나타내었다.

실험예 6. 녹차로부터 분리된 루테인의 전립선 암세포 증식억제 활성에 대한 웨스턴 블롯(western blot) 검정

인간 암세포주에 대한 생육 및 증식 억제 효과 검정에서 전립선암세포주 (LNCaP)에 대해 특이성을 가지고, 높은 암세포증식 억제활성을 나타낸 루테인의 암세포 증식 억제활성 메카니즘을 구명하기 위하여 LNCaP 암세포주에 대해 분리 루테인을 농도별로 처리하고 암세포주에서 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)의 발현과 CyclinD1의 발현(expression) 정도를 검정하는 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였으며, 그 결과는 도 10과 도 11에 각각 나타내었다.

PCNA는 DNA 폴리머라제 σ의 보조단백질로서 세포주기(cell cycle)를 조절하거나 세포의 증식(proliferation)이나 분화(differentiation)를 촉진시키는 핵심적인 단백질이다. 일반적인 세포상태에서는 그 발현이 정상적이지만 발암 전과정 (pre-cancerous stage)이나 종양단계 (malignant)에서는 그 발현이 증가되고, PCNA 발현이 증가되면 일반적인 점막조직의 변질형성 (metaplasia)이 일어나거나 편평상피세포(squamous cell)가 형성 장애를 일으켜 암이 형성된다. CyclinD1은 세포주기 중 G1/S phase 사이에 작용하는 중요한 핵단백질로서 발암진행과정에서 CyclinD1의 과도발현과 유전자의 증폭이 많은 암 환자에게서 관찰되어진다. 또한 PCNA/Cyclin은 DNA 폴리머라제를 매개로하여 초기 세포증식을 조절하며, 세포주기 중 G1/S 단계(phase)의 비율을 증가시킨다.

LNCaP 전립선암 세포주를 대상으로 세포증식과 관련된 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여 LNCaP 세포주를 2.5% 챠콜-스트립된(charcoal-stripped) FBS를 포함한 DMEM F-12배지에서 24시간동안 세포밀도가 1.5 x 10⁵ cells/㎖ 되도록 배양한 후에 세포에 DMSO와 분리 루테인을 0, 10, 20, 50, 100 μM 수준으로 첨가하고 24시간 동안 배양하였으며, 대조군으로 β-카로틴과 라이코펜(lycopene)을 동일한 농도로 첨가하고 배양하였다. 배양된 각 세포에서 단백질을 추출하기 위하여 1% 프로테이나제 저해 칵테일(proteinase inhibitor cocktail, Sigma-Aldrich)를 함유한 RIPA(radioimmunoprotein assay) 완충액(50 mM TrisHCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.05% SDS와 1% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate, (Ohnishi et al., 1996)를 첨가한 후 혼합물을 원심분리(12,000 × g at 4 ℃ for 10 min)하였고, 각 과정을 2회 반복하였다. 단백질(protein)정량은 Lowry 등(1951)에 의한 방법으로 수행하였다.

단백질 전기영동은 12.5% 폴리아미드 겔(polyacrylamide gel)에서 수행하였고, 단백질의 이뮤노블로팅(immunobloting)에서는 랜(lane)당 50 ㎍을 도입하였다. SDS-PAGE는 120V 에서 3 ～ 4 시간동안 전개하였으며, 0.2μm PVDF 멤브레인(Polyvinylidene difluoride, BioRad, CA)에 트랜스퍼 하였다. 각 멤브레인을 5% 밀크가 포함된 TBST 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)에서 30 분 동안 블로킹(blocking) 한 후, 5% 밀크를 포함한 TBST 완충액에 1차 항체(primary antibody)를 첨가하고, 4 ℃에서 하루 동안 인큐베이션 하였으며, 5% 밀크를 포함한 TBST 완충액에 2차 항체(secondary antibody)를 첨가하고 90분 동안 배양하였다. PCNA 단백질은 1차 항체로 anti-PCNA human monoclone (IgG2α, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1 : 2000 으로 희석하여 사용하였으며, cyclinD1 단백질은 anti-cyclinD1 human monoclone(IgG1, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1 : 500으로 희석하여 사용하였고, anti-β-actin human clone(IgG1k, Santa Cruz Biotechnology, USA)은 1 : 1000으로 희석하여 사용하였고, 각각의 멤브레인을 2차 항체인 goat anti-mouse IgG-HRP (200 μg/1 ml, Santa Cruz, USA)를 1:1000로 희석하여 사용하였다. 이뮤노 리액티브 밴드(Immunoreactive bands)를 확인하기 위하여 퍼옥시다제 BMB(peroxidase BMB, BM blue POD substrate precipitating, Roche, Germany)를 첨가하였으며, 덴시토메터(densitometer, GC-710, Bio-Rad, USA)를 사용하여 관찰하였다.

도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 녹차 분리 루테인과 라이코펜, β-카로틴 사이에 PCNA 발현 억제 비율은 웨스턴 블롯에서 육안상으로는 큰 차이를 나타내지 않으나, 덴시토메터(densitometer)를 통해 분석하여 본 결과 라이코펜의 경우 20 ～ 100 μM의 고농도에서 통계학적으로 LNCaP 암세포주의 PCNA 발현을 농도 의존적으로 억제하였으나, 루테인과 β-카로틴의 경우에서는 50 μM이상 에서 PCNA 발현 억제율은 4 ～ 24% 수준으로 크지 않았으며, 통계학적으로 유의하지 않은 결과를 나타내었고 농도의존적인 경향도 나타내지 않았다(도 10). 반면 루테인과 β-카로틴은 cyclinD1의 발현을 농도 의존적으로 저해하였고, 매우 높은 발현 억제율을 나타내었으며, β-카로틴 보다 루테인이 더 우수한 발현 억제율을 나타내었으나, 라이코펜의 경우는 cyclinD1의 발현을 억제하지 못하였다(도 11). Wu 등(2010)의 보고에 의하면 인간 NSCLC 폐암 세포주를 대상으로 하여 라이코펜을 처리한 경우 암세포의 세포사멸(apoptosis)의 유발과 세포주기의 어레스트(arrest)가 발생하여 암세포주의 생장을 농도 의존적으로 억제하였는데, 이러한 이유로서 라이코펜이 cyclinD1의 발현을 억제함에 의해서라고 설명하였으나, 본 연구의 결과는 이와 다르게 라이코펜의 경우는 cyclinD1의 발현 억제와는 큰 연관성이 없고, 오히려 PCNA의 발현억제와 연관이 있는 것으로 판단되었다.

종양형성의 표현형적 관찰에 있어 접합(gap junction)을 통한 세포와 세포 사이의 상호작용은 매우 중요한데 이들은 세포간 신호전달을 위한 세포막 사이의 소통경로가 되므로(Kumar and Gilula, 1996) 카로티노이드와 같은 암세포 증식 억제물질의 억제활성은 세포안으로의 흡수되는 정도나 속도와 매우 밀접한 연관을 맺고 있을 수 있다고 판단되어진다.

루테인은 잔토필(xnathophyll)의 일종으로 각 구조의 끝에 폐쇄환을 가지고 있는 8개의 콘주게이트(conjugate)된 탄소 이중결합을 가지고 있는 2개의 말단 β-이온 고리(ionine ring)에 각각 하이드록시 기(hydroxy group)가 부착되어 있는 구조를 가지고 있으며, 이러한 구조는 루테인이 α-카로틴, β-카로틴 및 라이코펜과 같은 다른 하이드로카본 카로티노이드(hydrocarbon carotenoid) 들보다 더 친수성(hydrophilic) 특성을 나타내도록 하며, 이러한 특성은 다른 비극성 카로티노이드 보다 물로부터 발생하는 단일항 산소(singlet oxygen)와 더 쉽게 반응할 수 있도록 한다고 보고(Ojima et al., 1993) 되고 있다. 라이코펜은 비극성 카로티노이드이며, 세포막의 지질이중층의 소수성 부위와 부합되어 세포막에 평행한 상태로 부착되게 되어 세포 안으로 도입되는데 어려움이 있으나(Volk et al., 1984), 루테인이 가지고 있는 하이드록시 기는 친수성을 나타내 세포막 표면에 수직의 상태로 부착되고 쉽게 세포 안으로 도입되어질 수 있다는 보고(Sundqvis et al., 1989)와 비교하여 볼 때, 루테인이 라이코펜이나 β-카로틴 보다 더 낮은 농도에서 빠른 시간에 암세포 증식과 연관된 cyclinD1의 발현을 억제하는 것은 루테인이 가지고 있는 하이드록시 기(hydroxy group)에 의해 다른 카로티노이드보다 높은 친수성을 나타내게 되고, 이로 인하여 더 쉽게 세포막에 접근이 가능하여지며, 세포막을 투과하여 세포 안으로 도입되어지는 것이 용이하기 때문이라고 판단된다.

또한 본 연구에서 소수성의 특성을 가진 라이코펜을 처리하는 경우 PCNA의 발현이 급격히 감소되나, cyclinD1의 발현은 감소되는 경향이 낮고, 카로티노이드 중 친수성의 특성을 가진 루테인을 처리할 경우 반대로 PCNA 발현 감소에는 큰 영향을 미치지 못하나, cyclinD1의 발현을 크게 감소시키는 양상을 나타낸 결과를 통해 극성이 서로 다른 카로티노이드는 암세포의 증식 및 관련 유전자의 발현에 있어서 서로 대안적인 활성과 작용기전을 보이는 것으로 생각되어진다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

도면에서 GT는 녹차 추출물, α-toco는 α- 토코페롤(또는 비타민 E), BHA는 부틸레이티드 하이드록실 아니솔(butylated hydroxyl anisole)을, AsA는 아스코르빈산을, β-Car은 β-카로틴을 의미한다.

Claims (3)

1. 녹차 잎을 건조시키고 분쇄하여 녹차 분말을 제조하는 단계; 상기 녹차 분말을 아세톤에 침지하고 여과하여 얻은 여액을 4 ~ -20℃의 저온에서 12~24시간 동안 정치하여 불용성 침전물을 제거하는 단계; 상기 불용성 침전물이 제거된 아세톤 추출물에 포화식염수, 증류수 및 헥산을 첨가하여 진탕한 후 헥산 분획을 취하는 단계; 상기 헥산 분획을 감압 농축하여 헥산을 제거하는 단계; 및 상기 헥산이 제거된 녹차 아세톤 추출물을 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 cyclinD1의 발현 억제를 통한 암세포 증식 억제 활성을 가지는 루테인(lutein)의 추출방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 루테인은 유리형 루테인인 것을 특징으로 하는 루테인의 추출방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 암은 전립선암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 루테인(lutein)의 추출방법.
   

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