KR101337161B1 - 콩 아세톤 추출물을 포함하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 콩 아세톤 추출물에 대한 항산화 활성 및 다양한 암세포주에 대한 증식 억제 효과를 검증하여 콩의 새로운 생리활성 기능을 밝힘으로써 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물로서의 새로운 기능을 제시할 수 있다.

Description

콩 아세톤 추출물을 포함하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition having anticancer and antioxidant comprising soybean acetone extracts}

본 발명은 콩으로부터 추출한 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물에 관한 것이다.

인간의 질병 중 암은 현대의학의 발달에도 불구하고 아직까지 치료에 어려움이 있는 질병으로, 그 발생 요인의 80~90%는 환경적 요인에 기인하고, 이 중 30~60%가 식이 및 영양과 연관되어 있으며, 기타 다른 요인으로는 흡연, UV, X-ray와 같은 방사선 조사, 직업적 요인, 음주, 내인성 호르몬 등에 의해 유발된다고 알려져 있다(Doll and Peto, 1981).

이에 많은 연구자들이 암을 정복하기 위해 여러 방면으로 다양한 연구를 진행하고 있으며, 이러한 연구의 한 부분으로 식품이나 천연 약제 중에서 암의 증식을 차단하거나 억제하는 성분을 생물체에서 찾으려는 노력이 이루어지고 있다.

한편, 최근 작물에 함유된 식이 피토케미칼(phytochemical)을 섭취할 경우 강력한 항산화 활성을 나타내어, 다양한 질병의 예방 및 치료에서 중요한 역할을 수행하고 있음이 증명되고 있다. 구체적으로, 다양한 항발암제와 항돌연변이제가 in vivo 상에서 종양(tumor), 암(cancer)의 중간매개인 바이오마커(biomarker)의 증식과 빈도를 감소시키는 것이 확인되었으며, in vitro 상에서 단기간의 유전독성 검정을 통해 항암효능을 나타냄이 확인되고 있다.

이러한 피토케미칼로 페놀, 인돌, 방향성 이소티오시아네이티, 메틸화 플라본, 쿠마린, 식물 스테롤, 셀레늄염, 단백질분해저해제, 아스코르브산, 토코페롤, 카로틴 등이 식품으로부터 섭취가 가능하며, 다양한 동물 실험을 통해 인체에 섭취되는 수준 또는 그 이상의 농도에서 항암효능이 검증되고 있으나, 작물의 잎이나 과일과 같은 영양체로부터 발견되어지는 클로로필(chlorophyll)에 대한 고찰은 극히 미흡한 실정이다.

클로로필은 식물의 녹색색깔을 나타내는 본질적인 색소이며, 전자기적 스펙트럼(spectrum)에서 적색과 청색부분을 흡수하고, 광합성 과정을 통하여 태양에너지를 화학에너지로 변환시키는데 중요한 역할을 하고 있다. 광 존재 하에서 클로로필의 산화촉진활성(pro-oxidant)은 산소에 에너지를 전달하여 수퍼옥사이드 라디칼(O₂ ^·－)이나 단일항산소(¹O₂)와 같은 활성산소종을 형성하는 것으로 알려져 있으나(Enod et al., 1985a; Endo et al., 1985b), 암조건하에서 클로로필이나 페오피틴은 식용 유지의 자동산화를 막음으로써 유지의 산패를 막는 효과를 가지고 있고, 수소공여 메카니즘에 의해 라디칼 형성 연쇄반응을 파괴하는 항산화 기능을 가지고 있음이 보고되었다(Usuki et al., 1984). 뿐만 아니라 클로로필을 구성하는 본질적인 화학적 구조인 포르피린(porphyrin) 구조는 항산화 활성에 본질적인 기능을 수행하는 것으로 보고되어지고 있다(Ursula et al., 2005).

현재 천연의 클로로필이 다양한 과일 및 영양체에 높은 수준으로 포함되어진 점에 기인하여 인간의 건강에 영향을 미치는 효과에 대한 관심이 높아지고 있으나, 이러한 자연적인 클로로필의 농도의존적인 반응에 대한 항산화 활성이나 항발암활성(anticarcinogenecity)에 대한 활용할 만한 자료는 거의 없는 실정이다.

식물체에 존재하는 카로티노이드 계열의 하나인 루테인(lutein)은 녹색 채소에 존재하는 항산화제 중 하나로, 천연 소재에서 분리된 약 700개의 카로티노이드 중에서 자유라디칼(free radical)을 소거할 수 있는 가장 효율적이며 중요한 하이드록시 카로티노이드(hydroxyl carotenoid)이다.

루테인과 연관된 화합물인 지아잔틴(zeaxanthin)은 디하이드록시 잔토필(dihydroxy xanthophyll) 계열의 카로티노이드로서 두 개의 하이드록시(hydroxy)기를 보유하고 있는 반면, β-카로틴이나 라이코펜(lycopene)과 같은 하이드로카본 카로티노이드(hydrocarbon carotenoid)는 산소원자를 가지고 있지 않다. 루테인과 지아잔틴이 가지는 하이드록시기는 이것을 포함하고 있지 않는 카로티노이드인 하이드카본 카로티노이드보다 더 큰 극성을 나타내게 되며, 인체의 시각조직에서 유익한 효능을 나타내는데 기여한다.

루테인은 유일하게 높은 에너지의 청색광에 대한 필터로 작용하거나 광촉매 라디칼(radical)이나 활성산소종을 제거하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Krinsky, 1989). 질병과 관련되어 루테인의 섭취는 노인성황반변성(Age-related macular degeneration)이나 백내장(cataract)과 같은 안질환에 효율적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

한편, 콩(Glycine max L.)은 우리나라의 주요 식량작물로서 단백질(약 40%)과 지질(약 20%)을 다량 함유하여 영양 면에서 우수한 식품이며, 중요한 식물성 기름의 원료이기도 하다. 콩은 된장, 청국장, 고추장, 간장 등의 발효제품, 콩나물 같은 발아제품과 두유, 두부, 식용유 등 기타 제품의 형태로 가공되어 식품으로서의 이용도가 높고, 또한 의약품, 화장품, 비누 등 공업용 제품의 원료로서도 널리 이용되고 있다.

콩은 주요 영양적 기능 외에도 인체에 유익한 다양한 생리활성 물질이 함유되어 있는 것으로 평가되므로 이들 영양성분과 생리활성 물질의 분석기법 확립 및 국내ㆍ외 유용자원에 대한 체계적 검토는 향후 국내 식량작물의 경쟁력 강화를 위한 주요 요소로 작용할 것이다.

종래 이러한 콩의 성분 중 단백질이나 이소플라본을 위주로 한 연구가 주류를 이루고 있으며, 이를 이용한 기술개발이 주로 이루어지는 상황으로서, 그 외 다양한 기능성 성분에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다.

Doll R and Peto, R. (1981) The cause of cancer ; Quantitative estimate of available risks of cancer in the United States today. Journal of the National Cancer Institute 66:1191-1192.1111 Ames BN. (1983) Dietary carcinogens and anticarcinogens : Oxygen radicals and denerative diseases. Science 221:1256-1264 Wattenberg LW. (1985). Chemoprevention of cancer. Cancer Research 45:1-8.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 포함하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 포함하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 콩의 새로운 생리활성 기능을 밝히면서 항암 및 항산화 활성을 가지는 조성물로서의 새로운 원천을 제시할 수 있으며, 콩 아세톤 추출물의 항암 및 항산화 효과를 검정하여 새로운 기능을 제시할 수 있는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 콩 아세톤 추출물은 클로로필류, 루테인 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것이 좋으며, 특히 상기 클로로필류는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것이 바람직하다.

상기 콩 아세톤 추출물은 약학적 조성물에 0.01 내지 80중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 콩 아세톤 추출물은 콩, 발아콩 또는 콩나물로부터 추출할 수 있다.

구체적으로, 상기 콩 아세톤 추출물은 콩의 종실을 발아시키는 단계, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 콩을 아세톤을 용매로 하여 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 환류추출 또는 초음파 추출하는 단계; 상기 추출한 여액을 저온(4~20 ℃)에서 12~24 시간동안 정치하여 불용성 침전물을 제거하는 단계; 상기 불용성 침전물이 제거된 아세톤 추출물에 포화식염수, 증류수 및 헥산을 첨가하여 헥산 분배하여 중간극성 및 극성물질을 제거하는 단계; 및 상기 중간극성 및 극성물질이 제거된 아세톤 추출물로부터 헥산을 제거하는 단계로 추출되는 것이 좋다.

상기와 같은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 폐암, 신장암, 결장암, 전립선암 또는 유방암에 대하여 우수한 항암 활성을 나타낸다.

또한 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공한다.

상기 콩 아세톤 추출물은 건강보조식품에 0.01 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 콩 아세톤 추출물은 화장료 조성물에 0.01 내지 40중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 콩 아세톤 추출물에 대한 항산화 활성 및 다양한 암세포주에 대한 증식 억제 효과를 검증하여 콩의 새로운 생리활성 기능을 밝힘으로써 항암 및 항산화 활성을 가지는 조성물로서의 새로운 원천을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물에서 분리한 클로로필 a(분리색소 2)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물에서 분리한 클로로필 b(분리색소 1)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물에서 분리한 루테인의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물의 처리 시 리놀레산 산화에 의해 발생하는 과산화물의 시간의 경과에 따른 발생저해효과를 흡광도로 나타낸 것이다
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 물/리놀레산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭 분석법(β-carotene bleaching assay method)에 의하여 측정된 콩 아세톤 추출물의 농도별 항산화활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물과 α-토코페롤의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낸 것이다. α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었고, 흡광도는 517㎚에서 측정되었으며, 결과는 평균± S.D.로 나타내었다(n=3).
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물과 BHA의 환원력을 나타낸 것이다. BHA는 양성대조구로 사용되었으며, 결과는 평균± S.D.로 나타내었다(n=3).
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물의 NBT 환원에 대한 수퍼옥사이드 라디칼 생성 저해율을 나타낸 것이다. α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었으며, 결과는 평균± S.D.로 나타내었다(n=3).
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 콩 아세톤 추출물의 하이드록시기 소거 활성을 나타낸 것이다. BHA와 α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었으며, 음성 대조구는 항산화제를 첨가하지 않은 아세톤을 사용하였다. 결과는 평균± S.D.로 나타내었다(n=3).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 인간의 건강을 위한 콩 추출물의 생리활성적 고찰과 이러한 콩 추출물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 아세톤을 이용하여 콩 아세톤 추출물을 추출하고, 콩 아세톤 추출물에 대한 항산화 활성 및 항암 활성을 검정, 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명에서 설명하는 콩은 콩과에 속하는 식물 종자를 모두 의미하는 것으로, 순수한 콩 이외에 통상의 방법으로 콩을 발아시켜 얻어지는 발아콩(배축부가 1㎝ 이하) 및 콩나물(배축부가 5~10㎝)을 모두 포함하는 것은 물론이다.

본 발명의 약학적 조성물은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 콩 아세톤 추출물은 추출용매를 아세톤으로 사용하여 통상적인 방법에 의해 콩으로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 추출용매로 아세톤을 1~30배, 바람직하게는 5~15배 부피량을 10~50℃, 바람직하게는 실온에서 0.5~48시간, 바람직하게는 20~30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출할 수도 있다.

구체적으로, 본 발명에서 콩 아세톤 추출물을 제조하기 위해 실시한 일예는 다음과 같다.

먼저, 콩의 종실을 발아시킨 후, 상기 발아된 콩을 건조하고 분쇄하여 건조 분말을 만드는데, 이때 건조된 발아콩은 다양한 방법으로 분쇄하여 분말화할 수 있다.

콩의 발아는 콩의 종실을 물에 침지한 다음 상온다습이 유지되는 암(暗)상태에서 간헐 살수하여 이루어진다. 상기 침지는 18~25℃의 상온의 물에서 4~12시간 침지하는 것이 원활한 발아를 위하여 바람직하다. 충분한 침지가 이루어진 후 상온다습, 즉 상온에서 상대습도 50~100%로 유지되는 암상태에서 발아시킨다. 상기한 콩은 콩과에 속하는 식물의 종자이면 모두 적용 가능하다.

상기 간헐 살수는 4~6시간 간격으로 1~10분간 살수하여 이루어질 수 있으며, 타이머가 장착된 장치를 사용할 경우 재배가 편리하다. 발아는 콩의 자엽과 배축부 분리 시점부터 20일간, 바람직하기로는 4~15일간 이루어지는 것이 좋다.

상기 발아된 콩은 자엽과 배축부를 포함하여 이루어진 것으로, 콩이 발아 후 자엽과 배축부가 분리된 시점부터의 발아된 콩을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 발아 후 2~20일 경과한 것을 사용하는 것이 추출물의 수득 측면에서 바람직하다.

그 다음, 상기 분쇄된 발아콩은 아세톤을 용매로 하여 추출한다. 아세톤은 콩 분말 중량대비 5 내지 20 배의 중량으로 사용할 수 있으며, 상기 추출은 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 환류추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 응용할 수 있다.

저온 암조건 추출의 경우 냉장 조건, 구체적으로 3 내지 5℃에서 10 내지 24시간 동안 추출하는 것이 아세톤 추출물의 추출효율 증대에 있어 좋다. 상온 추출의 경우, 구체적으로 20 내지 25℃에서 22 내지 24시간 동안 추출하는 것이 아세톤 추출물의 추출효율 증대에 있어 좋다. 또한, 초음파 추출의 경우 37 내지 40℃에서 160 내지 180분 동안 추출하는 것이 아세톤 추출물의 추출효율 증대에 있어 좋으며, 환류추출의 경우에는 75 내지 80℃에서 120 내지 180분 동안 추출하는 것이 아세톤 추출물의 추출효율 증대에 있어 좋다.

저온 암조건 추출, 상온추출, 초음파 추출 및 환류 추출을 비교할 경우, 아세톤 추출물을 다량으로 얻기 위해서는 환류추출이 더욱 바람직하며, 작업의 편이성을 위해서는 초음파 추출을 이용하는 것도 좋다.

상기와 같이, 콩 건조 분말을 아세톤에 직접 침지하여 추출물을 얻어내는 것은, 콩에 함유되어 있는 페놀성 및 극성물질을 제거하기 위해 콩을 열수로 수차례 추출하고, 여과한 잔사를 건조 및 재분쇄하여 다시 아세톤에 침지하여 추출물을 얻는 일반적인 추출 방법과 비교할 경우, 열수를 사용한 극성물질 추출 시 고온 및 물에 의해 야기되는 아세톤 추출물에 함유된 성분(클로로필류, 루테인 등)의 열분해 및 산화에 따라 구조적으로 파괴되는 양상을 억제할 수 있고, 열수 추출 후 건조, 재분쇄 등 부수적으로 발생되는 단계별 추출 외에 작업을 간소화할 수 있는 잇점이 있다.

반면, 본 발명에서는 하기한 저온 침지 및 헥산분배를 이용하여 아세톤 추출물 중 극성물질을 완전히 제거함과 동시에 고온 및 물에 의해 발생될 수 있는 성분들의 열 및 산화에 의한 분해를 방지하여, 구조적으로 안정하게 아세톤 추출물을 다량 추출할 수 있게 한다.

상기와 같이 아세톤을 사용하여 추출한 여액은 저온(4~20 ℃)에서 12~24 시간동안 정치하여 불용성 침전물을 여과한다. 상기 불용성 침전물에는 저온의 아세톤 상태에서는 용해도가 극히 낮아져 재결정화되는 당, 배당체, 페놀성 물질, 극성 단백질, 비타민 결합체 등 다양한 극성물질이 포함되어 있으며, 이를 저온에서 방치하여 침전물을 형성한 후 여과함으로써 아세톤에 대하여 용해도가 떨어지는 극성물질의 일부를 비열처리를 통해 제거할 수 있는 잇점이 있다.

상기와 같이 저온에서 방치하여 불용성 침전물을 제거한 여액에는 아직 일부 극성물질 및 중간극성 물질이 공존하고 있을 수 있으므로, 구조적 파괴를 최소화할 수 있는 비열처리 방법인 용매분배를 이용하여 혼재된 극성물질 및 중간극성 물질을 완전히 제거한다.

한편, 아세톤은 유기용매이면서 그 외 기타 유기용매나 증류수와 잘 섞이는 특징이 있는데, 아세톤 추출물에서 극성물질을 제거하기 위해 증류수 또는 극성용매를 단순히 첨가할 경우 상기와 같이 아세톤과 그 외 유기용매 및 증류수가 서로 잘 섞이는 특징으로 인해 층 분리가 유도되질 않고 서로 섞여버리는 현상이 발생되므로 실제 용매의 극성을 이용한 층 분리를 통해서는 아세톤 추출물 중 중간극성 및 극성물질의 제거가 불가능하다.

이에, 본 발명에서는 아세톤 추출물에 혼재된 일부 중간극성 및 극성물질을 제거하기 위하여 포화식염수를 사용한다. 이와 같이 포화식염수를 사용하는 방법은 비열처리에 의한 방법이므로 열처리에 의해 야기되는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 아세톤 추출물에 포화식염수와 증류수를 동시에 넣게 되면 증류수와 함께 사용된 포화식염수는 극성용매로 작용하게 되지만 첨가된 포화상태의 소금에 의해 증류수가 거의 용질로 포화된 상태가 되기 때문에 아세톤에 녹아있던 극성물질은 녹일 수 있으나, 비극성 물질까지 용해시킬 수 있는 수준의 용해도는 완전히 상실한 상태가 된다. 이때 비극성 용매인 헥산을 첨가하면 아세톤 추출물에 함유되어 있던 비극성 물질인 클로로필 및 루테인 성분이 자연스럽게 포화식염수보다 상대적으로 극성의 친화성이 월등히 높은 헥산 층으로 이행하게 되며, 헥산층으로 이행하지 못한 극성물질은 식염수층으로 이행되므로, 헥산층으로 극성물질이 혼입되는 것을 배제할 수 있다.

상기 헥산 분배를 이용하여 중간극성 및 극성물질을 제거하고, 용매로 사용한 헥산을 제거함으로써 콩 아세톤 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 현시점에서 콩으로부터 이상적으로 콩 아세톤 추출물을 수득할 수 있는 방법을 상술하였으나, 상기 콩 아세톤 추출물을 분리하는 방법에 본 발명이 한정되는 것이 아님은 자명할 것이다. 본 발명의 약학적 조성물이 포함하는 콩 아세톤 추출물은 과거 또는 향후 개선 및 개발될 식물체로부터 아세톤 추출물을 추출하는 방법에 의하여 추출될 수 있음은 물론이다.

상기와 같이 추출된 콩 아세톤 추출물에는 클로로필류 0.01 내지 200㎍/g, 루테인을 0.1 내지 500㎍/g 정도로 포함하는 것이 좋다. 이때, 상기 클로로필류는 콩으로부터 분리한 모든 클로로필류를 의미하는 것으로, 특히 클로로필 a 및 클로로필 b인 것이 좋다. 본 발명의 콩 아세톤 추출물에 포함되는 클로로필류와 루테인의 함량은 크게 제한되지 않으나, 특히 본 발명의 콩 아세톤 추출물이 전술한 함량범위내로 클로로필류와 루테인을 포함할 경우 본 발명의 콩 아세톤 추출물을 포함하는 조성물에 더욱 효과적인 항암 및 항산화 효과를 부여할 수 있게 된다.

본 발명은 상기와 같이 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 활성을 갖는 약학적 조성물을 제공하는 바, 상기 콩 아세톤 추출물은 약학적 조성물에 0.01 내지 80중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 50중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.01중량% 미만일 경우에는 약학적 조성물의 항암 및 항산화 효과가 극히 미미할 수 있으며, 80중량%를 초과할 경우에는 사용량 대비 항암 및 항산화 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.

본 발명의 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골순, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.

이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 경구투여, 비경구 투여용, 주사용 등의 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 제제화에 필요한 통상의 성분들과 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 엘릭시르(elixirs), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이때, 정제, 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 혼합할 수도 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 혼합할 수도 있다.

또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 약학적 조성물의 유효투입량은 환자의 연령, 신체적 조건, 몸무게 등의 상태를 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위로 조절될 수 있다. 일반적으로, 상기 약학적 조성물의 유효투입량은 성인 환자 체중 1kg 당 1 내지 20㎎/일이고, 바람직하기로는 5 내지 10㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2회 내지 5회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품을 제공하는 바, 본 발명의 건강보조식품은 널리 식용되는 콩으로부터 추출된 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하다.

상기 콩 아세톤 추출물은 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품에 0.01 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 30중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.01중량% 미만일 경우에는 건강보조식품의 항암 및 항산화 증진 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과할 경우에는 첨가 농도 대비 항암 및 항산화 증진 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.

상기 건강보조식품으로는 그 종류가 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품으로 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수도 있다. 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류 등으로 제조될 수도 있다. 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있음은 물론이다.

또한, 본 발명의 건강보조식품에 포함되는 콩 아세톤 추출물은 항산화 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 콩 아세톤 추출물은 통상의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수도 있다.

상기 식품류로는 전형적인 식품뿐만 아니라, 음료(알코올성 음료도 포함함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 포함함은 물론이다.

또한, 본 발명은 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 콩 아세톤 추출물은 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물에 0.01 내지 40중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 20중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 0.01중량% 미만일 경우에는 제조된 화장료의 항산화 활성이 미미할 수 있으며, 40중량%를 초과할 경우에는 투입 농도대비 항산화 효과가 상대적으로 낮을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 콩 아세톤 추출물을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 콩 아세톤 추출물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제, 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다.

화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알코올, 유동 파라핀 등이 있다.

상기와 같은 본 발명의 화장료 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐) 등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. 콩 아세톤 추출물 제조

풍산나물콩 500g의 콩을 6㎝(가로)× 6㎝(세로)× 14㎝(높이)인 플라스틱 재배용기에 넣어 20℃의 물에 4시간 침지한 후 자체 개발한 생육장치(Hanbaek Co., HB-301L, Seoul)를 이용하여 온도 20℃, 습도 80%의 암 상태에서 10일 동안 발아시켰다. 콩의 발아기간 동안 타이머가 달린 자동 살수 장치를 이용하여 물을 4시간 마다 3분씩 위에서 살수하였다.

상기 발아된 발아콩(콩나물)의 자엽부분을 채취하여 -80℃에서 냉동시켜 동결건조하고 60메쉬(mesh)로 분쇄하였다.

상기 발아콩 분쇄물 20g에 아세톤 2L를 첨가하고 40℃ 조건의 초음파추출기에서 3시간 추출하였으며, 같은 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출된 용액은 모두 합쳐 와트만(Whatman) No. 2 여지를 이용하여 여과하였고, -20℃ 저온고에서 24시간 동안 정치하면서 불용성 침전물을 재여과하였다.

여과된 아세톤 추출액 중 600㎖를 분획여두에 옮기고, 여기에 포화식염수 200㎖와 증류수 1,000㎖를 첨가하고, 다시 헥산 300㎖를 첨가하여 격렬하게 흔들어 준 후 층 분리를 유도하였다. 층 분리 후, 아래층의 포화식염수층은 버리고 상층의 헥산층을 완전 회수하였다.

이렇게 여과된 헥산 층은 40℃ 감압농축장치에서 농축하여 헥산 용매가 제거된 겔(gel) 상태의 콩 아세톤 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 콩 아세톤 추출물로부터 클로로필류 분리 및 확인
상기 실시예 1의 콩 아세톤 추출물을 분취(preparative) HPLC(Agillent 1200 series, USA)를 이용하여 클로로필류를 분리하였다. 이때, 분취 HPLC의 분리조건은, 컬럼은 HiQ sil C18-10(21.0× 250㎜, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 430㎚, 분당 유속 10㎖, 분석 용매로 A용매는 75% 메탄올, B용매는 에틸아세테이트를 농도구배(0분: 70% 용매A, 25분: 15% 용매A, 26분: 70% 용매A, 35분: 70% 용매A)로 사용하였고, 시료 주입량은 2㎖로 조절하여 고순도 분리를 실시하여 클로로필 a와 클로로필 b를 분리하였으며, 상세한 분리 조건은 하기 표 1과 같다.
분리 수행으로 얻어진 수종의 분리화합물 중 클로로필에 해당하는 물질에 대하여 NMR, UV-VIS 스펙트럼 분석 및 질량분석을 수행하였으며, 클로로필의 ¹H-NMR(300MHz, CDCl₃) 결과의 화학적 이동치 분석 결과는 표 2에 나타내었고, ¹H-NMR 스펙트럼은 도 1(클로로필 a)과 도 2(클로로필 b)에 나타내었다.

구분	조건
컬럼	YMC AM 303 (250×4.6㎜)
이동상 (농도구배조건)	A: 75% MeOH, B: 100% EtOAc
파장	430㎚
유속	1.0㎖
주입량	20㎕
온도	30℃

분리색소 1 및 2의 화학적 구조를 동정하기 위한 ¹H-NMR(300MHz, CDCl₃) 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 도 1, 2 및 표 2를 살펴보면, 두 물질의 NMR 스펙트럼이 고도로 유사한 양상을 나타내었다. NMR 분석에 의한 양성자들의 화학적 이동치를 검토한 결과 1.5ppm 이하에서는 소수성인 긴 사슬의 피틸(phytyl)기 양성자들(H-P5~P16)의 공명에 의한 피크를 확인할 수 있었고, 1.5ppm 부근에서 H-8², H-18¹ 및 H-P3¹에 해당하는 메틸(CH₃)기의 전형적인 양성자 피크를 확인할 수 있었다.
3~4ppm 부근의 강한 양성자 피크(분리색소 1: 3.25ppm(H-2¹), 3.46ppm(H-12¹) 및 3.74ppm(H-13⁴), 분리색소 2: 3.25ppm(H-2¹, H-7¹), 3.31ppm(H-12¹) 및 3.74ppm(H-13⁴))는 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 및 Ⅴ 고리(ring)에 결합된 메틸(CH₃)기에 의한 양성자 피크로 확인 되었는데, 이는 일반적으로 메틸기의 양성자 피크가 1.5ppm 영역에서 확인되나 F, I, N, S, 및 Br 등과 같은 할라이드(halide)가 이웃할 경우 +2ppm 미차폐된(deshielded) 영역에서 메틸기 피크가 확인되기 때문일 것이다. 또한 4.9ppm 부근에서는 H-P1에 해당하는 피틸기 내의 산소에 결합된 메틸렌(CH₂)기의 양성자 피크를 확인할 수 있었고, 5.3~5.7ppm 부근에서는 옆 사슬의 소수성 피틸기에 결합된 불포화 탄소에 결합된 H-P2의 양성자 피크로 확인되었다. 6ppm 부근에서는 H-32의 양성자에 해당하는 비닐기(CH₂=CH-)의 1차 양성자(Hcis 및 Htrans)와 H-32 위치의 양성자들에 의한 피크를 확인할 수 있었고, 8ppm 부근에서 나타나는 피크(7.84 및 7.98ppm, H-3¹)는 옆 사슬의 비닐기(H-3²)의 2차 양성자에 의한 피크이며, 8～10ppm 부근의 피크는 H-5, H-10, H-20에 해당하는 4개의 피롤(pyrrole)기를 고리형태로 결합하는 부분의 양성자들이 링 전류효과로 나타나는 피크로 확인되었다. 한편, 분리색소 1은 10.7ppm부근에서 한 개의 양성자 피크를 확인할 수 있었는데, 이는 알데하이드(aldehyde)에 결합된 양성자에 의한 피크로서 H-7¹에 해당하는 양성자 피크로 동정하였다.
또한, 분리색소 1의 질량분석 및 UV-VIS. 스펙트럼 분석 결과 m/z=907.5로 조사되었고, UV-VIS. 스펙트럼은 λ(㎚)=432, 456, 596, 645로 조사되었다.
한편 분리색소 2의 질량분석 및 UV-VIS. 스펙트럼을 분석한 결과를 보면 m/z=893.5로 조사되었고, UV-VIS. 스펙트럼은 λ(㎚)=381, 411, 430, 577, 615, 662를 나타내었다.
이상의 ¹H-NMR, MS 및 UV-VIS. 스펙트럼을 종합적으로 해석한 결과, 분리색소 1은 진녹색을 나타내며, 화학식이 C₅₅H₇₀MgN₄O₆= 907.5(R=CHO)인 클로로필 b(chlorophyll b)로 동정되었고, 분리색소 2는 청녹색을 나타내며, 화학식이 C₅₅H₇₂MgN₄O₅=893.5(R=CH₃)인 클로로필 a(chlorophyll a)로 동정되었다.
실시예 3. 콩 아세톤 추출물로부터 루테인의 분리 및 확인
상기 실시예 1의 콩 아세톤 추출물로부터 분취(preparative) HPLC(Agillent 1200 series, USA)를 이용하여 루테인을 분리하였다. 이때, 분취 HPLC의 분리 조건으로 컬럼은 HiQ sil C18-10 (21.0× 250㎜, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 430㎚, 분당 유속 10㎖, 분석 용매로 A용매는 75% 메탄올, B용매는 에칠아세테이트를 농도구배(0분: 70% 용매A, 25분: 15% 용매A, 26분: 70% 용매A, 35분: 70% 용매A)로 사용하였고, 시료 주입량은 2㎖로 조절하여 고순도 분리를 실시하였다.
분리 수행으로 얻어진 황색 및 녹색을 나타내는 수종의 화합물 중 루테인에 해당하는 물질에 대하여 NMR, UV-VIS 스펙트럼 분석 및 질량분석을 수행하였으며, 루테인의 ¹H-NMR(300MHz, CDCl₃) 결과의 화학적 이동치 분석 결과는 표 3에 나타내었고, ¹H-NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 ¹H-NMR(300MHz, CDCl₃) 스펙트럼 측정 결과를 살펴보면, ¹H-¹H 상관관계(correlation)를 볼 때 Me-18'(1.63ppm)과 H-3'(4.25ppm)이 지환 화합물 영역의 앞쪽 H-2'(eq, 1.86ppm 및 ax, 1.38ppm) 양성자와 상관관계가 있는 것을 추정해 볼 때, 5.55ppm의 피크는 H-4'으로 결정할 수 있었고, H-7'(5.44ppm)은 H-8'(6.15ppm)과 H-6'(2.42ppm) 피크의 ¹H-¹H 관련 시그널(correlation signal)에 의해 동정할 수 있었다. 아울러 H-3과 H-3'에 해당하는 2개의 2차 하이드록시 그룹(hydroxy group)의 양성자는 각각 4.00ppm과 4.25ppm 영역에서 확인할 수 있었으며, 1D selective NOESY에 의해 H-16/H-2ax, H-16/H-17, H-18/H-17에 해당하는 피크가 상관관계를 나타내는 것으로 보아 CH₃-16, CH₃-18, H-2ax, H-3이 모두 동일한 고리에 존재함을 알 수 있었다. 또한 H-19/H-7, H-19/H-10, H-20/H-14 피크의 NOESY 상관관계에 의해 하이드로카본 그룹에 결합된 CH₃를 동정할 수 있었고, 동일한 방법으로 H-19'과 H-20'을 동정하였다. 올레핀 그룹(Olefin group)의 양성자 피크는 5~7ppm사이에서 확인할 수 있었고, 특히 6.65ppm까지의 다중 시그널(multiplet signal)은 H-15/H-15'(6.65ppm), H-11/H-11'(6.63ppm), H-7/H-7'(6.44ppm), H-12/H-12'(6.36ppm), H-14/H-14'(6.25ppm), H-8/H-8'(6.12ppm) 양성자 짝에 의한 피크로 동정 하였다.
한편 H-2(1.48ppm 및 1.79ppm)와 H-2'(1.38ppm 및 1.86ppm)의 양성자가 기타 올레핀 그룹의 양성자와 다른 영역에서 확인된 것은 H-2 및 H-2'의 양성자가 올레핀 그룹의 양성자와 짝짓기(coupling)하는 대신에 주위에 있는 메틸 그룹과 짝짓기하기 때문에 1.3~1.8ppm부근에서 확인되었다. 기타 메틸기(CH₃, H-16~H-20, H-16'~H-20')는 전형적인 메틸 피크가 나타나는 영역인 1~2ppm 부근에서 확인할 수 있었다.
분리물질의 질량분석 및 UV-VIS. 스펙트럼을 분석한 결과로 보면, m/z=569.3로 조사되었고, UV-VIS. 흡광 스펙트럼은 λ(㎚)=426, 448, 476을 나타내었다.
이상의 ¹H-NMR, MS 및 UV-VIS. 스펙트럼을 종합적으로 해석한 결과, 분리물질은 황색을 나타내며, 화학식이 C₄₀H₅₆O₂=569.3인 (all-trans)-lutein으로 동정되었다.

이하 실험예들에서 기재하는 콩 아세톤 추출물은 별도의 표기가 없다하더라도 상기 실시예 2 및 3에서 확인한 바와 같이 클로로필류인 클로로필 a 및 클로로필 b와 루테인을 포함함을 의미하는 것이다.
실험예 1. 콩 아세톤 추출물의 지질과산화 저해활성

콩 아세톤 추출물에 대한 항산화 활성 검정은 Nagai 등(2005)에 의한 방법을 변형하여 사용하였다. 100㎍/㎖의 콩 아세톤 추출물 0.083㎖에 0.208㎖의 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 혼합하고, 다시 0.208㎖의 2.5%(w/v) 리놀레산(linoleic acid)을 첨가하였다. 산화 유도 시작은 0.021㎖의 0.1M 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)를 첨가하여 30℃, 암상태로 반응시키면서부터 시작하여 72시간까지 매 12시간마다 리놀레산이 산화되는 정도를 검정하였다. 산화반응 유도 시작 후 12시간마다 상기 기술한 반응액 0.1㎖에 75% 에탄올 4.7㎖, 30% 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate) 0.1㎖ 및 3.5% HCl이 포함된 0.02M 염화제1철(ferrous chloride) 0.1㎖를 혼합한 다음 3분 동안 정치하여 두었다가 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 시간의 경과에 따른 과산화물 생성정도를 500㎚에서 흡광도를 측정하여 검정하였다. 음성대조구(con)로는 콩 아세톤 추출물을 첨가하지 않고 리놀레산만을 첨가한 것을 사용하였으며, α-토코페롤(tocopherol, VE)을 분리된 콩 아세톤 추출물과 동일한 농도의 수준으로 제조하여 사용하였다. 시간의 경과에 따라 생성되는 과산화물의 생성 양을 흡광도로 나타내었으며 그 결과를 도 4에 나타내었다.

지질과산화는 유리기(free radical)에 의해 불포화지방산의 메틸렌(-CH₂-)기로부터 수소원자(H·)가 탈취됨에 따라 개시(initiation)된다. 이를 흔히 일으키는 라디칼로는 OH, RO·, ROO·, HO₂· 등이 있고, O₂ ^-와 H₂O₂는 그 자체로는 그런 능력이 없다. 수소탈취에 의해 생긴 알킬기(R·)는 분자재구성을 통해 디엔(diene) 형태로 바뀌고, 이것이 다시 산소와 결합하여 과산화기(peroxy radical)를 형성한다. 과산화기는 전술한 대로 다시 다른 불포화지방산으로부터 수소를 탈취함으로써 일종의 연쇄반응(chain reaction)이 진행되기 때문에 과산화물이 급속하게 증가하게 된다. 따라서, 항산화 활성을 평가하기 위해서는 지질과산화 개시단계에서의 평가가 매우 중요하다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 콩 아세톤 추출물의 경우 100㎍/㎖의 수준으로 처리하는 경우 12시간 경과 후에는 음성대조구(0.560)에서 발생되는 과산화물 생성 수준과 유사하게 흡광도(0.485) 증가하였으나, 24시간 이후부터는 대조구의 흡광도 증가와는 다르게 흡광도의 증가비율이 점차 감소하여 시간의 경과에 따라 α-토코페롤(VE)과 유사한 수준의 지질과산화 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 72시간 후에는 음성대조구는 2.906, α-토코페롤(VE)은 1.588 및 콩 아세톤 추출물은 1.784를 나타내어, 콩 아세톤 추출물은 동일 농도의 α-토코페롤(VE)보다 우수한 지질과산화 저해활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 콩 아세톤 추출물의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay)

콩 아세톤 추출물의 항산화 활성 검정을 위하여 물/리놀레산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭에 대한 지연능력을 Miller(1971)에 의한 방법을 변형하여 검토하였다. β-카로틴은 다른 항산화제가 없을 경우 빠른 퇴색을 보이며, 유리 리놀레산 라디칼(free linoleic acid radical)이 β-카로틴을 공격하여 이중결합을 해리하면서 특정적인 색깔 특성을 잃게 된다. 콩 아세톤 추출물은 1, 10, 100㎍/㎖의 농도로 처리하였으며, 대조구로 1μM(0.22036㎍/㎖)의 BHT를 사용하였다.

에멀젼의 제조를 위하여 β-카로틴 용액(1㎎/㎖ in chloroform) 1㎖, 40㎕의 리놀레산(20㎎)과 400㎕ Triton X-100(100㎎)을 플라스크에 넣은 후 질소 존재 하에서 클로로포름을 제거한 후, 사전에 산소로 30분간 산화시킨 이온수 100㎖의 증류수를 천천히 넣으면서 강하게 교반하여 안정한 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼 용액 3㎖를 분광분석학적 큐벳(spectrophotometric cuvette, light path 10 mm)에 넣고 콩 아세톤 추출물 농도별 시료 0.2㎖로 첨가한 후 470㎚에서 흡광도를 측정하였다. 최초 흡광도를 측정한 후 반응용액을 50℃ 수욕상에서 암상태로 보관하면서 15분 간격으로 최대 120분까지 측정하였고, 항산화 활성 정도는 대조구의 광학 밀도(optical density, D.O._initial-D.O._final)가 감소된 양을 100% 산화한 것으로 산정하여 계산하였으며, 색소가 없는 대조구에 대한 산화의 저해비율로 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 콩 아세톤 추출물을 1㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 5.8%, 10㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 12.6%, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 26.4%의 산화저해율을 나타내다가 그 이상의 농도에서는 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였으며, β-카로틴 블리칭 분석을 통하여 콩 아세톤 추출물이 100㎍/㎖로 처리되어질 경우 물/리놀레산 에멀젼 상태에서 일반적으로 기름의 산패를 막기 위해 처리되어지는 BHT 1μM을 처리한 효과와 동일한 효과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 3. 콩 아세톤 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성

콩 아세톤 추출물의 DPPH 라디칼(radical) 소거활성 검정은 Schimada 등(1992)에 의한 방법으로 검정하였다. 0.5mM의 DPPH 에탄올 용액 1㎖와 0.1M 아세테이트 완충액 2㎖을 혼합하고, 여기에 농도별(10~50㎍/㎖) 콩 아세톤 추출물을 처리하였다. 이어서, 상온에서 암상태로 30분 동안 정치한 다음, UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, japan)를 사용하여 517㎚에서 흡광도로 측정하여 DPPH 라디칼 소거활성을 검정하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 양성 대조구로는 10~50㎍/㎖의 α-토코페롤(VE)을 사용하였다.

실험결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 콩 아세톤 추출물은 10㎍/㎖에서 8%의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성도는 증가하는 양상을 나타내어 30㎍/㎖에서 18%, 40㎍/㎖에서는 23%, 50㎍/㎖에서는 25%의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내어 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내어 고농도에서도 산화촉진제(pro-oxidant)로 작용하지 않는 반면, 양성대조구로 사용되어진 α-토코페롤의 경우 저농도에서부터 급격한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내다가 40㎍/㎖ 이상에서는 더 이상의 DPPH 라디칼 소거활성의 증대를 나타내지 않아 고농도에서 산화촉진제로 작용함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 콩 아세톤 추출물이 비교적 높은 농도에서도 안정된 항산화제로 작용할 수 있음을 나타낸 것이라 하겠다.

실험예 4. 콩 아세톤 추출물의 환원력 비교

콩 아세톤 추출물의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법에 따라 측정하였으며, 항산화 물질에 대한 철 이온의 환원력을 측정하였다. 0.2M 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 1㎖, 농도별 시료(10~100㎍/㎖) 1㎖, 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 1㎖를 혼합하고, 이 혼합물을 50℃에서 20분간 반응시킨 후 10% TCA(triobarbituric acid) 1㎖를 첨가하였다. 반응이 끝난 혼합물을 13,000× g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액 2㎖에 메탄올 2㎖를 넣고, 0.1% 염화철(iron chloride) 0.1㎖를 넣은 후 UV/VIS spectrophometer를 이용하여 흡광도 700㎚에서 측정하였다. 이때, 양성대조구로는 BHA를 사용하였으며, 소거율은 하기 수학식 1로 계산하여 검정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

[수학식 1]

(%)=[1-(A₀/A₁)]× 100 (A₀= blank, A₁=extract)

도 7에 나타낸 바와 같이, BHA와 콩 아세톤 추출물의 농도가 10㎍/㎖으로 처리될 경우 유사한 환원력을 나타내었으며, 이후 20~80㎍/㎖까지 동일 농도에서 콩 아세톤 추출물은 BHA 대비 1/2 정도의 활성을 나타내었고, 100㎍/㎖의 농도에서는 BHA의 환원력이 높은 수준으로 증대되었다. 본 발명의 콩 아세톤 추출물은 양성대조구인 BHA보다 약한 환원력을 나타내었으나, BHA 대비 농도 의존적으로 안정되게 증가하는 경향을 나타내었으며, 안정적인 활성이 유지됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여, 콩 아세톤 추출물의 경우 저농도에서 추출물에 포함되어진 여러 가지 활성물질에 기인한 환원력에 의해 안정적으로 사용될 수 있는 항산화 소재임을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 콩 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide anion) 소거활성 검정

콩 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 검정하기 위하여 잔틴(xanthine)과 잔틴산화효소(xanthine oxidase)와의 반응에 의해 발생하는 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 소거활성을 NBT(nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 검정하였다(Nagai et al., 2005).

즉, 3mM 잔틴 0.02㎖, 0.05mM 소듐 카보네이트 완충액(sodium carbonate buffer, pH 10.5) 0.48㎖, 3mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) 0.02㎖와 0.15% 소태아 혈청 알부민(bovine serum albumin) 0.02㎖, 0.75mM NBT 0.02㎖로 구성된 혼합액에 콩 아세톤 추출물을 10, 20, 40, 60㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 이 혼합물을 25℃에서 10분간 인큐베이션(incubation) 하였으며, 다시 1.0㎖의 XOD(6mU/㎖)를 첨가하여 반응을 시작한 후 25℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 0.02㎖의 6mM CuCl을 첨가하여 반응을 종결시킨 후 560㎚에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서는 농도별 시료 첨가 양에 따른 NBT 환원에 대한 저해율을 나타내었으며, α-토코페롤을 양성대조구로 사용하여 비교하였다.

콩 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 NBT(nitro-blue tetrazolium) 환원법으로 확인한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 콩 아세톤 추출물은 10㎍/㎖을 처리할 경우 약 12%의 소거활성을 나타내었으며, 60㎍/㎖까지 농도 의존적으로 안정된 활성 증대를 나타낸 반면, α-토코페롤의 경우 10㎍/㎖에서 급격한 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 나타내다가 그 이상의 농도에서는 증가 비율이 감소하는 경향을 나타내었다. 비록, 콩 아세톤 추출물이 양성대조구인 α-토코페롤 보다 특정 농도에서 낮은 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 나타내었으나, 농도 의존적으로 지속적인 수퍼옥사이드 라디칼 소거 활성을 나타내는 점을 고려하여 볼 때, 투입 농도에 기인한 안정적인 항산화 소재로 활용될 수 있을 것임을 알 수 있었다.

실험예 6. 콩 아세톤 추출물의 하이드록시 라디칼(hydroxy radical) 소거활성 검정

콩 아세톤 추출물의 농도별 하이드록시 라디칼 소거활성 검정을 위해 콩 아세톤 추출물의 하이드록시 라디칼 소거 활성검정을 펜톤(Fenton) 반응에 의한 2-데옥시리보스(2-Deoxyribose)가 하이드록시 라디칼에 의해 산화되어 말론알데하이드(malonaldehyde)로 변환되어 크로마젠(chromagen)을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 통해 확인하였다. 2.8mM 2-데옥시리보스, 100μM FeCl₃, 104μM EDTA, 1mM H₂O₂를 포함하는 용액에 20mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 첨가하여 1㎖의 혼합물을 제조하였다. 여기에 콩 아세톤 추출물의 농도별 시료를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고 37℃, 암상태로 1시간 동안 반응시킨 후, 0.75㎖의 1.0%(w/v) TBA를 넣어 반응을 종결하였다. 이 반응액을 98℃의 물에 20분 동안 처리한 후 상온에서 냉각시키고 아세톤 1㎖를 첨가하여 색깔을 안정화시켰으며, UV-1200 UV/VIS 분광분석기(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 535㎚에서 흡광도로 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 하이드록시 라디칼 소거활성 검정은 콩 아세톤 추출물의 첨가에 따라 하이드록시 라디칼에 의해 2-데옥시리보스가 산화되는 것을 저해하는 비율로 계산하였으며, 기존의 항산화제인 α-토코페롤(VE) 및 BHA를 대조구로 하여 상호 비교하였다.

하이드록시 라디칼은 모든 환원된 형태의 산소와 가장 반응성이 높은 것으로 알려져 있으며, 세포에 초기 손상을 유발하는 가장 독성이 강한 라디칼로 알려져 있다.

콩 아세톤 추출물의 하이드록시 라디칼 소거활성을 펜톤 반응을 이용하여 확인한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 콩 아세톤 추출물은 약 250㎍/㎖에서 80%의 저해율을 나타낸 반면, 양성대조구인 BHA는 90㎍/㎖(농도 약400μM), α-토코페롤은 180㎍/㎖(농도 약 400μM)에서 유사한 수준의 하이드록시 라디칼 소거활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이 결과에서 콩 아세톤 추출물의 경우 동일 수준의 항산화 효능을 나타내는데 요구되어지는 농도가 BHA나 α-토코페롤 보다 다소 높기는 하나, BHA나 α-토코페롤과 같이 하이드록시 라디칼을 소거할 수 있는 강력한 항산화 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

일반적으로 하이드록시 라디칼은 H₂O₂에서 유도되어지며 혹독한 스트레스 하에서 식물체가 종종 만들어내는 라디칼로 활성산소종들의 생성 메카니즘과 이들 활성산소종이 다른 환원된 형태의 분자와 반응하는데 있어 가장 반응성이 높고 독성이 강한 것으로 알려져 있다(Foyer et al., 1994; Asada, 2000). 상기 기술된 DPPH 라디칼에 대한 소거 활성과 환원력 검정, 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성 및 하이드록시 라디칼 소거활성에서 보는 바와 같이 본 발명의 콩 아세톤 추출물은 추출물 안에 포함된 다양한 항산화 성분에 기인하여 BHT 또는 α-토코페롤을 대체할 수 있는 농도 의존적으로 활성이 증대되는 안정적인 항산화 소재로서 활용될 수 있을 것으로 생각되며, 다양한 항산화 활성에 기인하여 콩 아세톤 추출물이 산화적 손상에 의해 유발되는 다양한 질병에 대한 치료와 예방적 효과가 매우 높다는 것을 나타낸다고 하겠다.

실험예 7. 콩 아세톤 추출물의 암세포 증식 억제율 검정

콩 아세톤 추출물의 암세포주(cnacer cell line)에 대한 세포증식 억제율을 검정하기 위하여, 인간 폐암세포주 A549, 신장암 세포주 ACHN, 전립선암 세포주 LNCaP, 결장암 세포주 HCT15, 유방암 세포주 MCF-7를 대상으로 콩 아세톤 추출물을 농도별(50, 100, 200㎍/㎖)로 처리하고, MTT 분석을 통해 세포 생존율(cell viability)을 검정하였다. 각 암세포주를 96 웰 플레이트에 (1× 10⁴/웰) 배양한 후, 시료를 농도별로 처리하고 36시간 동안 더 배양하였다. 세포 생존률은 시판 측정용 키트(Cell Titer 96 non- radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, WI)를 통하여 검정하였는데, 테트라졸륨 화합물(tetrazolium compound) MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-PMS(tetrazolium, inner salt)와 PMS(electron coupling reagent phenazine methosulfate)를 포함하는 혼합물 20㎕를 각 웰에 첨가하고 다시 1시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양한 후, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

Concentration (㎍/㎖)	Viable Cell (% of Control) / Human Cancer Cell line*
	A549	ACHN	HCT15	LNCaP	MCF-7
200	32.0± 8.0	21.0± 3.0	28.0± 2.0	12.0± 4.0	23.0± 3.0
100	51.0± 4.0	36.0± 2.0	49.0± 3.0	24.0± 5.0	48.0± 2.0
50	63.0± 6.0	51.0± 4.0	63.0± 6.0	45.0± 5.0	60.0± 4.0

콩 아세톤 추출물의 인간 암세포주에 대한 생육 및 증식 억제 효과를 검정하기 위하여 폐암 세포주(A549), 신장암 세포주(ACHN), 전립선암 세포주(LNCaP), 결장암 세포주(HCT15)와 유방암 세포주 (MCF-7)를 대상으로 MTT assay를 수행한 결과 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 콩 아세톤 추출물의 경우 모든 세포주에 대하여 100㎍/㎖에서 50% 이하의 암세포 생존율을 나타내었으며, 특히 다른 세포주보다 LNCaP 전립선암 세포주에 대하여 200㎍/㎖ 처리 시 12%의 암세포 생존율을 나타내어 높은 암세포 증식 억제활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (11)

1. 발아된 발아콩 또는 콩나물을 분쇄하고 아세톤을 용매로 하여 저온에서 추출한 후, 상기 추출한 여액을 저온(4~-20℃)에서 정치하여 불용성 침전물을 제거한 다음, 여기에 포화식염수, 증류수 및 헥산을 첨가하여 헥산 분배하여 중간극성 및 극성물질을 제거하고, 헥산을 제거하여 얻어진 발아콩 또는 콩나물로부터 추출된 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 콩 아세톤 추출물은 클로로필류, 루테인 및 이들의 혼합물 중 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 클로로필류는 클로로필 a 또는 클로로필 b인 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 콩 아세톤 추출물은 약학적 조성물에 0.01 내지 80중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 폐암, 신장암, 전립선암, 결장암 및 유방암 중 선택된 어느 하나 이상에 대하여 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 활성을 가지는 약학적 조성물.
8. 발아콩 또는 콩나물로부터 추출된 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품.
9. 제8항에 있어서,
   상기 콩 아세톤 추출물은 건강보조식품에 0.01 내지 50중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항암 및 항산화 효과 증진용 건강보조식품.
10. 발아콩 또는 콩나물로부터 추출된 콩 아세톤 추출물을 유효성분으로 하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 콩 아세톤 추출물은 화장료 조성물에 0.01 내지 40중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 화장료 조성물.

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