KR20130023776A - 녹차 아세톤 추출물을 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

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황영선
이민석
이진호
김영걸
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Abstract

본 발명은 녹차 아세톤 추출물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아세톤을 용매로 하여 추출한 녹차 아세톤 추출물의 항산화 활성 및 항암활성을 검정하여 이들이 항산화 및 항암 활성을 가짐을 확인한 발명에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기존의 카테킨 외에 녹차의 새로운 생리활성 기능을 밝히면서 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 가능성 및 녹차의 항암 조성물로서의 새로운 기능을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Description

녹차 아세톤 추출물을 포함하는 항암 조성물{Anti-cancer composition which comprising green tea acetone extracts}
본 발명은 아세톤을 사용하여 추출한 녹차 아세톤 추출물이 항산화 활성과 항암 활성을 나타냄을 확인하고 이를 항암 조성물로 적용하고자 하는 발명이다.
최근 작물에 함유된 식이 피토케미칼(phytochemical)의 섭취가 강력한 항산화 활성을 나타내어 다양한 질병예방 및 치료에서 중요한 역할을 수행하고 있다는 것이 증명되고 있다. 다양한 항발암제와 항돌연변이제가 in vivo 상에서 종양(tumor), 암(cancer)의 중간매개 바이오마커(biomarker)의 증식과 빈도를 감소시키는 것이 확인되었으며, in vitro 상에서 단기간의 유전독성 검정을 통해 항암효능을 나타내는 것이 확인되고 있다.
다양한 동물 실험을 통해 피토케미칼이 인체에 섭취되어지는 수준 또는 그 이상의 농도에서 항암효능이 검증되고 있으나, 작물의 잎이나 과일과 같은 영양체로부터 발견되어지는 클로로필(chlorophyll)에 대한 고찰은 극히 미흡한 실정이다. 또한 작물의 활성성분 중 항산화활성에 기인하여 질병치료와 건강증진에 기여하는 것이 비타민 C나 E, 폴리페놀(polyphenol) 등과 같은 피토케미칼에 의해서 인지 혹은 클로로필이나 카로티노이드(carotenoid)와 같은 색소화합물에 의한 것인지에 대해서는 불분명하며, 대부분의 연구가 클로로필을 제외한 다른 피토케미칼에 국한되어 있는 실정이다.
클로로필은 식물의 녹색 색깔을 나타내는 본질적인 색소이며, 전자기적 스펙트럼(spectrum)에서 적색과 청색부분을 흡수하고, 광합성 과정을 통하여 태양에너지를 화학에너지로 변환시키는데 중요한 역할을 하고 있다. 광합성을 하는 동안 산소에 전자가 직접적으로 전달되거나 여기된 에너지가 공급되어 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O2 －)이나 단일항산소(singlet oxygen, 1O2)와 같은 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)이 발생하게 되며, 이러한 활성산소종은 식물체가 스트레스 하에서 방어 메카니즘을 유도하는 중요한 신호전달 물질로 작용할 수 있으나(Van Breusegem et al., 2001) 과도한 수준의 활성산소종은 광합성 기구에 유해한 좋지 않은 환경을 제공할 수 있다(Alscher et al. 1997). 이러한 측면에서 엽록체(chloroplast)에는 광산화적 손상(photo-oxidative damage)이나 광저해(photo-inhibition)에 대한 효과적인 방어 메카니즘이 발달될 필요가 있다 (Foyer et al., 1994; Asada, 2000). 식물체에는 이러한 이유로 여러 가지 항산화물질을 포함하고 있으며 클로로필 유도체는 강력한 산화제 혹은 항산화제의 원천이 되어 질 수 있을 것으로 생각된다.
그러나, 이러한 클로로필 유도체의 생리활성적 고찰은 현재 거의 이루어지지 않고 있는 실정이며 이들에 대한 활용도 거의 전무한 실정이다. 이러한 이유는 클로로필류를 정제된 형태로 얻기 어려움과 구조적 불안정성에 기인한 분해양상에 의한 것으로 판단되어진다. 이러한 이유에 기인한 까닭 인지 클로로필 자체의 항산화 활성과 항발암활성 (anticarcinogenecity)에 대한 보고는 현재까지 거의 전무한 실정이다.
식물체에 존재하는 색소성분으로서, 식물체에 존재하는 카로티노이드 계열의 하나인 루테인(lutein)은 녹색 채소에 존재하는 하이드록시 카로티노이드(hydroxyl carotenoid) 이다.
루테인과 연관된 화합물인 지아잔틴(zeaxanthin)은 디하이드록시 잔토필(dihydroxy xanthophyll) 계열의 카로티노이드로서 두 개의 하이드록시(hydroxy)기를 보유하고 있는 반면, β-카로틴이나 라이코펜(lycopene)과 같은 하이드로카본 카로티노이드(hydrocarbon carotenoid)는 산소원자를 가지고 있지 않다. 루테인과 지아잔틴이 가지는 하이드록시기는 이것을 포함하고 있지 않는 카로티노이드인 하이드카본 카로티노이드보다 더 큰 극성을 나타내게 되며, 인체의 시각조직에서 유익한 효능을 나타내는데 기여한다.
루테인은 유일하게 높은 에너지의 청색광에 대한 필터로 작용하거나 광촉매 기(radical)나 활성산소종을 제거하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Krinsky, 1989). 질병과 관련되어 루테인의 섭취는 노인성황반변성(Age-related macular degeneration)이나 백내장(cataract)과 같은 안질환에 효율적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
녹차는 차나무(Camellia Sinensis)의 싹이나 잎을 이용하여 차엽 속에 존재하는 산화효소를 화열이나 증기로 실활시켜 제조한 것으로서, 기원전부터 기호차로서 음용되어져 왔다. 녹차에서 수색의 차이는 잎에 함유된 클로로필 및 이의 유도체를 포함하는 포르빈계 화합물의 함량에 따라 차이가 나며, 클로로필과 이들 유도체의 함량이 높을수록 수색이 녹색을 띠며 품질이 우수한 양상을 나타낸다.
최근에는 녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메카니즘이 점차 밝혀짐에 따라 녹차 추출물을 식용뿐만 아니라, 다양한 용도로 사용하는 방법이 개발되어 지고 있다.
그러나, 이러한 녹차와 관련된 연구는 대부분 카테킨의 특성을 활용한 용도가 대부분이며, 카테킨 이외의 성분에 대한 연구는 충분히 이루어지지 않고 있다.
본 발명의 발명자들은 인간의 건강을 위한 클로로필 유도체 및 루테인의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 녹차로부터 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a, 페오피틴 b 등 클로로필 유도체와 카로티노이드 계열의 색소인 루테인을 포함하는 녹차 아세톤 추출물을 획득하여, 이의 항산화 활성 및 항암활성을 검정한 결과, 녹차 아세톤 추출물이 항산화 및 항암 활성을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 상기 녹차 아세톤 추출물을 포함하는 항암 조성물 및 건강 보조식품을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 항암 조성물은, 녹차 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 녹차 아세톤 추출물은 클로로필류 함량이 0.1 내지 20 mg/g 범위로 포함된 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기 항암 조성물을 포함하는 암 개선 및 예방용 건강 보조식품을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 항암 조성물을 녹차 아세톤 추출물을 수득하는 일례를 위주로 하여 구체적으로 설명한다. 또한, 하기 명세서에서 클로로필류가 의미하는 것은 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b이다.
먼저, 녹차 분말을 제조하기 위하여 녹차의 잎을 건조하고 분쇄하여 건조 분말을 만드는데, 이렇게 건조시킨 녹차 잎은 다양한 방법으로 분쇄하여 분말화한다.
상기 녹차 분말은 아세톤을 용매로 하여 클로로필 및 이의 유도체를 추출한다. 아세톤은 녹차 분말 중량대비 5 내지 20 배의 중량으로 사용할 수 있으며, 상기 추출은 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 환류추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 응용할 수 있다.
저온 암조건 추출의 경우 냉장 조건, 구체적으로 3 내지 5 ℃에서 이루어지며, 10 내지 24 시간동안 추출할 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출효율이 높게 나타났다. 상온 추출의 경우 구체적으로 20 내지 25 ℃에서 이루어지며, 22 내지 24 시간동안 추출할 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출 효율이 높게 나타났다. 초음파 추출의 경우 37 내지 40 ℃에서 이루어진 경우 추출시간이 160 내지 180 분의 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 추출 효율이 높게 나타났다. 환류추출의 경우 75 내지 80 ℃에서 이루어진 경우 추출시간이 120 내지 180 분의 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 추출효율이 높게 나타났다.
저온 암조건 추출, 상온추출, 초음파 추출 및 환류 추출을 비교할 경우, 클로로필류를 다량으로 얻기 위해서는 환류추출이 더욱 바람직하며, 작업의 편이성을 위해서는 초음파 추출도 가능하다.
상기와 같이, 녹차의 건조 분말을 아세톤에 직접 침지하여 추출물을 얻어내는 것은, 녹차에 함유되어 있는 페놀성 및 극성물질을 제거하기 위해 녹차를 열수로 수차례 추출하고, 여과한 잔사를 건조 및 재분쇄하여 다시 아세톤에 침지하여 추출물을 얻는 기존의 방법과 비교할 경우, 열수를 사용한 극성물질 추출시 고온 및 물에 의해 야기되는 클로로필류의 열분해 및 산화에 따라 구조적으로 파괴되는 양상을 억제할 수 있고, 열수 추출 후 건조 및 재 분쇄 등 부수적으로 발생되는 단계별 추출 외 작업을 간소화할 수 있는 잇점이 있다.
또한, 기존의 방법에서 극성물질의 용출 및 제거를 위해 수행된 수차례의 열수추출은 고온과 물의 사용으로 인해 클로로필류가 열분해와 산화에 의하여 구조적으로 파괴되는 현상이 수반된다.
반면, 본 발명에서는 하기한 저온 침지 및 헥산분배를 이용하여 아세톤 추출물 중 극성물질을 완전히 제거함과 동시에 고온 및 물에 의해 발생될 수 있는 클로로필류의 열 및 산화에 의한 분해를 방지하여, 구조적으로 안정하게 클로로필류를 고순도로 다량 추출할 수 있게 한다.
상기와 같이 아세톤을 사용하여 추출한 여액은 저온(4 내지 -20 ℃)에서 12내지 24 시간동안 정치하여 불용성 침전물을 여과한다. 상기 불용성 침전물에는 저온의 아세톤 상태에서는 용해도가 극히 낮아져 재결정화 되는 당, 배당체, 페놀성 물질, 극성 단백질 및 비타민 결합체 등 다양한 극성물질이 포함되어 있으며, 이를 저온에서 방치하여 침전물을 형성한 후 여과함으로써 아세톤에 대하여 용해도가 떨어지는 극성물질의 일부를 비열처리를 통해 제거할 수 있는 잇점이 있다.
상기와 같이 저온에서 방치하여 불용성 침전물을 제거한 여액에는 아직 일부극성물질 및 중간극성 물질이 공존하고 있으므로, 구조적 파괴를 최소화 할 수 있는 비열처리 방법인 용매분배를 이용하여 혼재된 극성물질 및 중간극성 물질을 완전히 제거한다.
즉, 불용성 침전물이 제거된 아세톤 여액에 포화식염수 및 증류수를 첨가하고, 여기에 비극성 용매이면서 비중이 낮은 헥산을 첨가하여 격렬히 흔들어 준 후 층 분리를 유도하고, 클로로필류가 용해되어 있는 상층인 헥산 층을 회수함으로써, 클로로필류를 극성물질의 혼입이 전혀 없이 분리회수 할 수 있다.
한편, 아세톤은 유기용매이면서 그 외 기타 유기용매나 증류수와 잘 섞이는 특징이 있는데, 아세톤 추출물에서 극성물질을 제거하기 위해 증류수 혹은 극성용매를 단순히 첨가할 경우 상기와 같이 아세톤과 그 외 유기용매 및 증류수가 서로 잘 섞이는 특징으로 인해 층 분리가 유도되질 않고 서로 섞여버리는 현상이 발생되므로 실제 용매의 극성을 이용한 층 분리를 통해서는 아세톤 추출물 중 중간극성 및 극성물질의 제거가 불가능하다.
이에, 본 발명에서는 아세톤 추출물에 혼재된 일부 중간극성 및 극성물질을 제거하기 위하여 포화식염수를 사용한다. 이와 같이 포화식염수를 사용하는 방법은 비열처리에 의한 방법이므로 열처리에 의해 야기되는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 아세톤 추출물에 포화식염수와 증류수를 동시에 넣게 되면 증류수와 함께 사용된 포화식염수는 극성용매로 작용하게 되지만 첨가된 포화상태의 소금에 의해 증류수가 거의 용질로 포화된 상태가 되기 때문에 아세톤에 녹아있던 극성물질은 녹일수 있으나 비극성 물질까지 용해시킬 수 있는 수준의 용해도는 완전히 상실한 상태가 된다. 이때 비극성 용매인 헥산을 첨가하면 아세톤 추출물에 함유되어 있던 비극성 물질인 클로로필 및 이의 유도체가 자연스럽게 포화식염수 보다는 상대적으로 극성의 친화성이 월등히 높은 헥산 층으로 이행하게 되며, 헥산 층으로 이행하지 못한 극성물질은 식염수 층으로 이행되므로, 헥산층으로 극성물질이 혼입되는 것을 배제할 수 있다.
상기 헥산 분배를 이용하여 중간극성 및 극성물질을 제거하고 고순도의 클로로필류를 함유한 헥산용액에서 용매로 사용한 헥산을 제거한 녹차 아세톤 추출물을 얻는다.
한편, 상기 녹차 아세톤 추출물을 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피를 수행하여 클로로필류의 개별적 분획을 얻고 각 분획을 농축 건고하여 재용해한 다음 분취 HPLC를 사용하여 순수 분리한다.
순수 분리된 클로로필류의 개별적 구조는 NMR, MS 등의 다양한 분광분석법으로 동정하였으며, 그 결과 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 를 확인하였다.
클로로필은 자연에서 가장 광범위하게 발견되는 색소이며, 식물체에 함유된 높은 함량, 인간의 소화과정 및 식품가공 과정에서의 분해 등 클로로필 및 대사산물이 건강에 미치는 영향에 대해 많은 연구자들이 관심을 가져왔다.
상기 녹차 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 및 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 점막 또는 국소, 경피 등에 적용될 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를함유한다.
또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 녹차 아세톤 추출물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 20 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 10 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 녹차 아세톤 추출물은 식용되는 녹차로부터 추출되었으므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 암의 개선 및 예방효과를 갖는 건강 보조식품으로 개발될 수 있다.
본 발명의 녹차 아세톤 추출물을 건강 보조식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.
즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수 있으며, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.
녹차로부터 분리된 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a, 페오피틴 b에 대해서 지질과산화 억제작용과 물/리놀산 에멀젼(water/linoleic acid emulsion)에서의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay), ESR(Electron Spin Resornance)과 화학적 방법을 적용하여 DPPH 기(radical) 소거활성, 하이드록시기(hydroxy radical) 소거활성, 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성 등의 활성산소종에 대한 소거활성과 환원력 검정 등을 수행하여 이들의 항산화적 활성을 검정하였으며, MTT 분석을 통한 암세포증식 억제 활성을 검정하였다.
상기한 본 발명에 의하면, 기존에 널리 알려진 녹차 카테킨 외에도 녹차 아세톤 추출물이 항암 조성물로 사용될 수 있음을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 녹차(Camellia sinensis, GT) 아세톤 추출물의 리놀산 산화에 따른 퍼옥시기 생성에 대한 항산화활성(A)과 저해율(B)을 나타낸 것이다.
도 2는 물/리놀산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭 분석법(β-carotene bleaching assay method)에 의하여 측정된 녹차 아세톤 추출물의 항산화활성을 나타낸 것이다.
도 3은 녹차 아세톤 추출물과 α-토코페롤의 DPPH 기 소거활성을 나타낸 것이다. α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었고, 대조구는 어떠한 항산화제도 사용하지 않았다. 흡광도는 517 nm에서 측정되었으며, 결과는 평균 ± S.D. 로 나타내었다[n=3].
도 4는 녹차(Camellia sinensis , GT) 아세톤 추출물과 BHA의 환원력을 나타낸 것이다. BHA는 양성대조구로 사용되었으며, 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
도 5는 녹차 아세톤 추출물의 NBT 환원에 대한 수퍼옥사이드기 생성 저해율을 나타낸 것으로, α-토코페롤이 양성 대조구로 사용되었으며, 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
도 6은 녹차 아세톤 추출물(GT, 100 ㎍/㎖)의 하이드록시기 소거 활성을 나타낸 것이다. BHA(butylated hydroxyl anisole)와 α-토코페롤은 양성 대조구로 사용되었으며, 음성 대조구는 항산화제를 첨가하지 않은 아세톤을 사용하였다. 결과는 평균 ± S.D.로 나타내었다[n=3].
이하. 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 녹차 아세톤 추출물의 제조
녹차 잎을 건조 및 분쇄하여 60 mesh 체로 통과시킨 후 분쇄시료 20g에 아세톤 2L를 첨가하고 40℃ 조건의 초음파추출기에서 3시간 추출하였으며, 같은 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출된 용액은 모두 합쳐 Whatman No. 2 여지를 이용하여 여과하였고, -20℃ 저온고에서 24시간 동안 정치하면서 불용성 침전물을 재 여과하였다.
여과된 아세톤 추출액 중 600mL를 분획여두에 옮기고, 여기에 포화식염수 200mL와 증류수 1,000mL를 첨가하고, 다시 헥산 300mL를 첨가하여 격렬하게 흔들어 준 후 층 분리를 유도하였으며, 층이 분리된 후 아래층의 포화식염수 층은 버리고 상층의 헥산 층을 완전 회수하였다.
여과된 헥산 층은 40℃ 감압농축장치에서 농축하여 헥산 용매가 제거된 흑갈색 겔(gel) 상태의 녹차 아세톤 추출물을 제조하였다.
실험예 1. 녹차 아세톤 추출물의 지질과산화 저해활성
녹차 아세톤 추출물에 대한 항산화 활성 검정은 Nagai 등(2005)에 의한 방법을 변형하여 사용하였다. 100 ㎍/㎖의 녹차 아세톤 추출물에 0.208 ㎖의 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 혼합하고 다시 0.208 ㎖의 2.5% (w/v) 리놀산(linoleic acid)을 첨가하였다. 산화 유도 시작은 0.021 ㎖의 0.1 M 2,2‘-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드[2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride]를 첨가하여 30 ℃, 암상태로 반응시키면서부터 시작하여 72시간 까지 매 12시간 마다 리놀산이 산화되는 정도를 검정하였다. 산화반응 유도 시작 후 12시간 마다 상기 기술한 반응액 0.1 ㎖에 75% 에탄올 4.7 ㎖, 30 % 암모늄 티오시아나이트(ammonium thiocyanate) 0.1 ㎖, 3.5% HCl이 포함된 0.02M 페루스 클로라이드(ferrous chloride) 0.1 ㎖를 혼합한 후에 3분 동안 정치하여 두었다가 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 시간의 경과에 따른 과산화물 생성정도를 500nm에서 흡광도를 측정하여 검정하였다. 대조구는 녹차 아세톤 추출물을 첨가하지 않고 리놀산 만을 첨가한 것을 사용하였으며, α-토코페롤(tocopherol, VE)을 동일한 농도의 수준으로 제조하여 사용하였다. 72시간 후에 대조구 흡광도에 대한 처리구의 최종 흡광도의 비율로 계산하여 최종 저해율(%)을 산출하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
지질과산화는 유리기(free radical)에 의해 불포화지방산의 메틸렌(methylene, -CH2-) 기로부터 수소원자(H·)가 탈취됨에 따라 개시(initiation)된다. 이를 흔히 일으키는 라디칼로는 ·OH, RO·, ROO·, HO2· 등이 있고 O2 -과 H2O2는 그 자체로는 그런 능력이 없다. 수소탈취에 의해 생긴 알킬기(R·)는 분자 재구성을 통해 디엔(diene) 형태로 바뀌고 이것이 다시 산소와 결합하여 과산화기(peroxy radical)를 형성한다. 과산화기는 전술한 바대로 다시 다른 불포화지방산으로부터 수소를 탈취함으로써 일종의 연쇄반응(chain reaction)이 진행되기 때문에 과산화물이 급속하게 증가하게 된다.
녹차 아세톤 추출물의 경우 100 ㎍/㎖의 수준으로 처리할 경우 12시간 경과 시에는 낮은 흡광도를 나타내어 활성이 높았으나, 24시간부터는 흡광도의 증가속도 비율이 증가하여 최종 72시간 후에는 31.7%의 저해율을 나타내어 비타민 E 보다 낮은 수준의 지질과산화 저해활성을 나타내었다. 또한, 리놀산의 과산화 초기 단계에서의 항산화 활성을 검정하여 본 결과, 대조군이 12시간부터 빠르게 흡광도가 증가하는 반면 녹차 아세톤 추출물의 경우 대조군에 비하여 증가속도 비율이 크게 감소하는 결과를 나타내었다.
실험예 2. 녹차 아세톤 추출물의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay)
녹차 아세톤 추출물의 항산화 활성 검정을 위하여 물/리놀산 에멀젼(water/linoleic acid emulsion)에서 β-카로틴 블리칭(β-carotene bleaching)에 대한 지연능력을 Miller(1971)에 의한 방법을 변형하여 검토하였다. β-카로틴은 다른 항산화제가 없을 경우 빠른 퇴색을 보이며 유리 리놀산 기가 β-카로틴을 공격하여 이중결합을 해리시키면서 특정적인 색깔 특성을 잃게 된다. 녹차 아세톤 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였으며, 대조군으로 동일 농도의 BHT를 사용하였다. 에멀젼의 제조를 위하여 β-카로틴 용액(1 ㎎/㎖ in chloroform) 1 ㎖, 40 ㎕의 리놀산 (20 ㎎)와 400 ㎕ Triton X-100(100㎎)을 플라스크에 넣은 후 질소 존재 하에서 클로로포름을 제거한 후, 사전에 산소로 30분간 산화시킨 이온수 100 ㎖의 증류수를 천천히 넣으면서 강하게 교반하여 안정한 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼 용액 3 ㎖를 분광분석학적 큐벳(spectrophotometric cuvette, light path 10 mm)에 넣고 조제된 녹차 아세톤 추출물 0.2 ㎖를 첨가한 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최초 흡광도를 측정한 후 반응용액을 50℃ 수욕상에서 암상태로 보관하면서 15분 간격으로 최대 120분까지 측정하였고, 항산화 활성 정도는 대조구의 광학 밀도(optical density, D.O.initial - D.O. final)가 감소된 양을 100% 산화한 것으로 산정하여 계산하였으며 색소가 없는 대조구에 대한 산화의 저해비율로 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물의 경우 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 경우 48.3%의 산화저해율을 나타내다가 그 이상의 농도에서는 큰 차이를 나타내지 않았다.
실험예 3. 녹차 아세톤 추출물의 DPPH 기 소거활성
녹차 아세톤 추출물의 DPPH 기 소거활성 검정은 Schimada 등(1992)에 의한 방법으로 검정하였다. 0.5 mM의 DPPH 에탄올 용액 1 ㎖와 2 ㎖의 0.1M 아세테이트 완충액을 혼합하고 여기에 농도별(10 ～ 50 ㎍/㎖) 녹차 아세톤 추출물을 처리한 후 상온에서 암상태로 30분 동안 정치하여 둔 후 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, japan)를 사용하여 517nm에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. 양성 대조군으로는 10 ～ 50 ㎍/㎖의 α-토코페롤(VE)을 사용하여 비교하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이. 녹차 아세톤 추출물의 DPPH 기 소거활성을 α-토코페롤과 비교 검정하여 본 결과 녹차 아세톤 추출물의 경우 10 ㎍/㎖를 처리하는 경우 26%의 저해율을 나타내어 28%의 저해율을 나타내는 양성대조군 α-토코페롤과 유사한 소거활성을 나타내었으나, 20 ㎍/㎖를 처리하는 경우 41%, 30 ㎍/㎖를 처리하는 경우 46%의 저해율을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 단지 일정한 수준으로 유지되는 경향만을 나타내었다.
실험예 4. 녹차 아세톤 추출물의 환원력 비교
녹차 아세톤 추출물의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법에 따라 측정하였으며, 항산화 물질에 대한 철 이온의 환원력을 측정하였다. 0.2M 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 1 ㎖, 농도별 시료 (10 ～ 100 ㎍/㎖) 1 ㎖, 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide) 1 ㎖를 혼합하고, 이 혼합물을 50 ℃에서 20분간 반응시킨 후 10% TCA(triobarbituric acid) 1 ㎖를 첨가하였다. 반응이 끝난 혼합물을 13,000× g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액 2 ㎖에 메탄올 2 ㎖를 넣고, 0.1% 염화철(iron chloride) 0.1 ㎖를 넣은 후 UV/VIS 분광분석기(spectrophometer)를 이용하여 흡광도 700nm에서 측정하였다. 대조구는 BHA를 사용하였으며, 소거율은 다음과 같은 식으로서 (%)=[1-(A0/A1)] × 100 계산하여 검정하였다[A0= blank, A1= extract].
도 4에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물의 환원력을 BHA와 비교한 결과 녹차 아세톤 추출물의 경우 농도가 증가함에 따라 환원력이 비례적으로 증가하는 결과를 나타내었으며, 20 ～ 80 ㎍/㎖까지 처리할 경우 대조군인 BHA보다 우수한 환원력을 나타내다가 100 ㎍/㎖ 이상에서는 BHA보다 낮은 활성을 나타내었다.
실험예 5. 녹차 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 음이온( superoxide anion ) 소거활성 검정
녹차아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 소거활성을 잔틴(xanthine)과 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase)의 반응에 의해 발생한 수퍼옥사이드 음이온과 이들과 급속하게 반응하는 니트론 스핀 트랩(nitrone spin trap)인 DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline- N-oxide)를 이용하여 측정하였다. 즉, 0.1 M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.4) 120 ㎕에 녹차아세톤 추출물 및 아스코르빈산 농도별 시료 (5, 10, 25, 50 ㎍/㎖) 각 20 ㎕, 3 M DMPO 20 ㎕, 10 mM 잔틴 20 ㎕, 0.25U 잔틴 옥시다제 20 ㎕를 첨가, 혼합하여 총량이 200 ㎕가 되게 한 다음 실온에서 2.5분 방치하고, 석영 모세관(quartz capillary tube)에 옮겨 ESR 분광분석기(JES-FA ESR spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 대조구(blank)는 시료 대신에 아세톤 20 ㎕를 첨가하여 사용하였으며, ESR의 자기장(magnetic field) 336.5 mT, 전력(power)은 20 mW, 진동수(frequency)는 9.8 GHz, 진폭 변조(modulation amplitude)는 1.0 가우스(gauss), 게인(gain)은 200, 스캔 타임(scan time)은 0.5 분으로 조정하였고, 스캔 넓이(scan width)는 10 mT로 하였으며, 시간 상수(time constant) 0.03 sec, 온도는 25 ℃로 고정하여 측정하였다. 시료에 대한 수퍼옥사이드 음이온의 소거활성 계산은 처리구와 대조구의 시그널 강도(signal intensity)에 대한 평균 높이의 차이를 이용하여 아래의 공식에 의해 검정하였다.
Activity(%)＝[1-(ESR signal intensity for medium containing the additives of sample/ ESR signal intensity for the superoxide anion)]× 100
ESR을 이용한 농도별 녹차 아세톤 추출물과 아스코르빈산의 수퍼옥사이드 음이온 소거 활성결과(%)는 다음 표 1 에 비교하여 나타내었다.
Extract (㎍/㎖) Camelliasinensis(GT) Ascorbic acid
5 15.16± 1.33 5.14± 0.22
10 35.11± 2.15 17.26± 0.58
25 48.52± 1.64 25.17± 1.08
50 63.28± 2.53 36.15± 1.86
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산과 비교하여 녹차 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 소거활성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, 농도가 증가할 수 록 소거활성이 지속적으로 증가하는 결과를 나타내었다.
ESR을 이용한 녹차 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드기(superoxide radical) 소거활성에 대한 결과를 확인하기 위한 수퍼옥사이드기 소거활성은 NBT(nitro-blue tetrazolium)환원법을 사용하여 검정하였다(Nagai et al., 2005). 즉, 3 mM 잔틴(xanthine) 0.02 ㎖, 0.05 mM 소듐 카보네이트 완충액(sodium carbonate buffer, pH 10.5) 0.48 ㎖, 3 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) 0.02 ㎖와 0.15% 소태아 혈청 알부민(bovine serum albumin) 0.02 ㎖, 0.75 mM NBT 0.02 ㎖로 구성된 혼합액에 녹차 아세톤 추출물을 각각 10, 20, 40, 60 ㎍/㎖의 농도로 처리하였으며, 이 혼합물을 25℃ 에서 10분간 인큐베이션(incubation) 하였으며, 다시 1.0 ㎖의 XOD(6mU/mL)를 첨가하여 반응을 시작한 후 25℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 0.02 ㎖의 6 mM CuCl를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 시료 첨가 양에 따른 NBT 환원에 대한 저해율을 나타내었으며, α-토코페롤을 양성대조구로 사용하여 비교하였다. 그 결과는 다음 도 5 에 나타내었다.
도 5 에 나타낸 바와 같이, ESR를 사용하여 녹차 아세톤 추출물의 수퍼옥사이드 기 소거활성을 NBT(nitro-blue tetrazolium)환원법을 사용하여 확인한 결과 녹차 추출물은 10 ㎍/㎖을 처리하는 경우 약 26%의 수퍼옥사이드 기 소거활성을 나타내었으며, 60 ㎍/㎖까지 지속적으로 증가하는 경향을 나타내었다.
실험예 6. 녹차 아세톤 추출물의 하이드록시 기( hydroxy radical ) 소거활성 검정
녹차 아세톤 추출물의 농도별 하이드록시 기 소거활성 검정을 위해 ESR을 이용한 하이드록시 기의 생성 저해활성을 검정하였다. 하이드록시 기 생성은 펜톤 반응(fenton reaction, H2O2 + FeSO4)을 이용하였으며, 하이드록시 기와 급속하게 반응할 수 있는 DMPO를 사용하였다. 0.1 M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.4)에 녹차아세톤 추출물 및 아스코르빈 산의 농도별 시료 (5, 10, 25, 50 ㎍/㎖) 각 20 ㎕, 0.3 M DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline- N-oxide) 0.2 ㎖, 10 mM FeSO4 0.2 ㎖, 10mM H2O2 0.2 ㎖를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 2.5분 방치한 후 석영 모세관(quartz capillary tube)에 옮겨 ESR 분광분석기(JES-FA ESR spectrometer, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 대조구 (control)는 시료 대신에 아세톤 20 ㎕를 첨가하여 사용하였으며, ESR의 자기장 336.5 mT, 전력은 20 mW, 진동수는 9.8 GHz, 진폭 변조는 1.0 가우스, 게인은 200, 스캔 타임은 0.5 분으로 조정하였고, 스캔 넓이는 10 mT로 하였으며, 시간 상수는 0.03 sec, 온도는 25 ℃로 고정하여 측정하였다. 시료에 대한 하이드록시 기의 소거활성 계산은 처리구와 대조구의 시그널 강도에 대한 평균 높이의 차이를 이용하여 검정하였다.
Activity (%)＝[1-(ESR signal intensity for medium containing the additives of sample/ ESR signal intensity for the superoxide anion)]×100
ESR을 이용한 녹차 아세톤 추출물과 아스코르빈산의 하이드록시기 소거 활성(%)을 다음 표 2에 비교하여 나타내었다.
Concentration (㎍/㎖) Camellia sinensis(GT) Ascorbic acid
5 7.68± 2.14 3.56± 0.54
10 29.14± 1.15 8.65± 0.75
25 34.64± 1.31 9.25± 1.56
50 39.22± 2.25 9.85± 1.44
Activity (%)＝[1-(ESR signal intensity for medium containing the additives of sample/ ESR signal intensity for the superoxide anion)]×100
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산과 비교하여 녹차 아세톤 추출물의 하이드록시기 소거활성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, 농도가 증가할 수 록 소거활성이 지속적으로 증가하는 결과를 나타내었다.
ESR를 이용한 녹차 아세톤 추출물의 하이드록시기 소거 활성을 펜톤(Fenton) 반응에 의한 2-데옥시리보스(2-Deoxyribose)가 하이드록시기에 의해 산화되어 말론알데하이드(malonaldehyde)로 변환되어 크로마젠(chromagen)을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 통해 확인하였다. 2.8 mM 2-데옥시리보스, 100 μM FeCl3, 104 μM EDTA, 1 mM H2O2를 포함하는 용액에 20 mM 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.4)를 첨가하여 1 ㎖의 혼합물을 조제하였다. 여기에 녹차 아세톤 추출물의 농도별 시료를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고 37 ℃, 암상태로 1시간 동안 반응시킨 후 0.75 ㎖의 1.0% (w/v) TBA를 넣어 반응을 종결하였다. 반응액을 98℃ 물에 20분 동안 처리한 후 상온에서 냉각시키고 아세톤 1 ㎖를 첨가하여 색깔을 안정화 시켰으며, UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 535nm에서 흡광도로 측정하여 검정하였다. 하이드록시기 소거활성 검정은 녹차 아세톤 추출물의 첨가에 따라 하이드록시기에 의해 2-데옥시리보스가 산화되는 것을 저해하는 비율로 계산하였으며 기존의 항산화제인 α-토코페롤(VE) 및 BHA와 상호 비교하였다. 그 결과는 다음 도 6 에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, ESR에 의한 녹차 아세톤 추출물의 하이드록시기 소거활성을 확인하기 위해 녹차 아세톤 추출물의 하이드록시기 소거활성을 펜톤(Fenton) 반응을 이용하여 확인한 결과 녹차 아세톤 추출물은 약 150 ㎍/㎖에서 85%의 저해율을 나타낸 반면, 양성대조구인 BHA는 90 ㎍/㎖ (농도 약 400μM), α-토코페롤의 경우에서는 180 ㎍/㎖ (농도 약 400μM)에서 유사한 수준의 하이드록시 기 소거활성을 나타내었다.
일반적으로 하이드록시 기는 H2O2에서 유도되어지며 혹독한 스트레스 하에서 식물체가 종종 만들어내는 라디칼로 활성 산소종들의 생성 메카니즘과 이들 활성산소종이 다른 환원된 형태의 분자(molecule)와 반응하는데 있어 가장 반응성이 높고 독성이 강한 것으로 알려져 있다(Foyer et al., 1994; Asada, 2000). 활성산소종의 소거와 제거에 있어 녹차 아세톤 추출물의 높은 하이드록시 기에 대한 소거활성은 항산화제로서 녹차 아세톤 추출물이 산화적 손상에 의해 유발되는 다양한 질병에 대한 치료와 예방적 효과가 매우 높다는 것을 나타낸다고 하겠다.
실험예 7. 녹차 아세톤 추출물의 암세포 증식 억제율 검정
녹차 아세톤 추출물의 암세포주에 대한 세포증식 억제율을 검정하기 위하여 인간 폐암세포주 A549, 위암 세포주 ACHN, 전립선암 세포주 LNCaP, 결장암 세포주 HCT-15, 유방암세포주 MCF-7를 대상으로 녹차 아세톤 추출물을 농도별(200, 100, 50 ㎍/㎖)로 처리하고, MTT 분석을 통해 세포 생존율(cell viability)을 검정하였다. 각 암세포주를 96 웰 플레이트에 (1 × 104/well) 배양한 후에 시료를 농도별로 처리하고 36시간동안 더 배양하였다. 세포 생존율은 시판 측정용 키트(Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, WI)를 통하여 검정하였는데, 테트라졸륨 화합물 (tetrazolium compound) MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium, inner salt]와 electron coupling reagent phenazine methosulfate (PMS)를 포함하는 혼합물 20 ㎕를 각 웰에 첨가하고 다시 1시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양한 후 enzyme-linked immunosorbent assay plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 3에 나타내었다[n=3].
Extract Concentration (㎍/㎖) Viable Cell (% of Control) / Human Cancer Cell line*
A549 ACHN LNCaP HCT15 MCF-7
GT 200 18.0± 8.0 32.0± 4.0 24.0± 5.0 25.0± 4.0 16.0± 2.0
100 21.0± 6.0 46.0± 6.0 35.0± 4.0 36.0± 2.0 29.0± 4.0
50 54.0± 7.0 61.0± 6.0 41.0± 6.0 51.0± 4.0 58.0± 5.0
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 녹차 아세톤 추출물의 인간 암세포주(human cancer cell line)에 대한 생육 및 증식억제 효과를 검정하기 위하여 폐암 세포주 (A549), 신장암 세포주 (ACHN), 결장암 세포주 (HCT15), 전립선암 세포주 (LNCaP)와 유방암 세포주 (MCF-7)를 대상으로 MTT 분석을 수행한 결과, 녹차 아세톤 추출물의 경우 모든 세포주에 대하여 100 ㎍/㎖에서 50%의 암세포 생존율을 나타내었으며, 특히 다른 세포주보다 A549 폐암 세포주와 LNCaP 전립선암 세포주, MCF-7 유방암 세포주에 대하여 200 ㎍/㎖ 처리 시 18%, 24%, 16%의 암세포 생존율을 나타내어 높은 암세포 증식 억제활성을 나타내었다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
도면에서 GT는 녹차 추출물을 의미하고, VE는 비타민 E(α-토코페롤)을 의미하며, α-toco는 α-토코페롤(vitamin E)를 의미하며, BHA는 부틸레이티드 하이드록실 아니솔(butylated hydroxyl anisole)을 의미한다.

Claims (5)

  1. 녹차 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 녹차 아세톤 추출물은 클로로필류 함량이 0.1 내지 20 mg/g 범위로 포함된 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 클로로필류는 클로로필 a, b, 페오피틴 a 및 b 인 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 암은 폐암, 전립선암, 및 유방암 중에서 선택된 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 항암 조성물.
  5. 청구항 1 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 항의 항암 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 개선 및 예방용 건강 보조식품.
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