KR20030004726A

KR20030004726A - 양강의 활성 성분의 분리방법 및 이를 주성분으로 하는노화 방지제

Info

Publication number: KR20030004726A
Application number: KR1020010040369A
Authority: KR
Inventors: 허문영; 김현표
Original assignee: 허문영
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2003-01-15

Abstract

본 발명은 양강의 활성 성분의 분리방법 및 이를 주성분으로 하는 노화 방지제에 관한 것으로, 양강의 근경을 건조한 후 미세하게 분쇄하여 분말로 한 다음 일정량을 취하고 여기에 1-15배의 추출용매를 부가한 후 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출함을 특징으로 하며, 이와 같은 방법으로 추출한 추출용액은 항산화 활성, 프리 라디칼 소거작용 및 관련 활성 산소종에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성이 뛰어난 것으로, 이를 근거로 하여 노화 방지제로 유용하게 사용될 수 있는 것이다.

이와 같이 구성된 본 발명은 양강에서 가란진 등의 약리작용 활성이 우수한 성분을 함유하는 추출물을 용이하게 수득할 수 있는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 이에 의해 수득된 추출물을 주성분으로 함유하는 조성물은 제제학적으로 안정한 프리 라디칼 소거, 항 산화, 산화적 DNA 손상억제 작용을 나타내며 따라서 이들의 작용을 근거로 하여 우수한 노화방지제로 이용될 수 있는 유용한 발명이다

Description

양강의 활성 성분의 분리방법 및 이를 주성분으로 하는 노화 방지제{Extrating method of active component from Zingiberaceae and antisenility agent using thereof}

본 발명은 양강의 활성 성분의 분리방법 및 이를 주성분으로 하는 노화 방지제에 관한 것으로, 보다 자세하게는 양강으로 부터 활성 성분의 분리방법과 이 추출물의 높은 프리라디칼 소거, 항산화 및 산화적 DNA손상억제 활성작용을 규명함으로 이 추출물을 주성분으로 하는 노화 방지제에 관한 것이다.

양강(Alpiniae officinarum rhizoma)은 학명Alpinia officinarum(Zingiberaceae)의 근경을 건조한 것으로서 한방적 용도는 물에 끓여 방향성 건위, 진통, 진토약으로 사용되어왔다. 그동안 양강에서는 1,8-시네올(cineol)등의 정유성분과 가란골(galangol)등의 신미성분, 가란진(galangin), 켐페리드(kaempferid), 알피닌(alpinin)등의 후라보노이드가 분리·동정된 것이 보고되어 있다[Theencyclopedia of Wakan-Yaku(Traditional Sino-Japanese Medicine)[1], p136-137, 1993, Hoikusa, Japan].

그러나, 현재까지 양강 중의 어떠한 성분이 어떠한 약리활성이 있는지 확실히 규명되어 있지 않으며 다만, 대한민국특허 제129490호에 가란진을 포함한 후라보노이드화합물로 된 암화학예방요법제에 관하여 개시되어 있다.

한편, 생체 내의 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical)인 과산화수소, 히드록실라디칼, 슈퍼옥사이드라디칼 등과 같은 활성산소는 세포구성성분의 지질과산화를 일으켜 세포막의 파괴와 함께 세포를 손상시켜 노화가 일어나게 한다.

또한, DNA 손상을 일으키는 4가지의 중요한 과정으로는 산화(oxidation), 메틸화(methylation), 탈아미노화(deamination)와 탈퓨린화(depurinination)가 있으며, 이 중에서 산화가 가장 크게 손상을 일으킨다고 보고되어 있는데, 사람에 있어서 DNA에 대한 산화적 손상의 빈도는 10⁴/DNA/cell/day 이상이라고 추정되고 있다 (Ames B.N. : Endogeneous DNA damage as related to cancer and aging,Mutation Res.,214, 41-46(1989).

체세포내에서 활성산소종(reactive oxygen species)들이 DNA를 공격하면 구아닌(guanine)염기가 산화생성물인 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OH2'dG)으로 변하는데[Park J.W., Cundy K.C. and Ames B.N. : Detection of DNA adducts high-performance liquid chromatography with electrochemical detection,Carcinogenesis,10, 827-832 (1989)]. 생체내에서 8-OH2'dG는 하루에 세포 1개당 거의 4,000분자 비율로 생겨나는 것으로 알려지고 있다[ ESA Inc. : DNA adductreference standards for oxidative metabolism, (1997)]. 실제로 각 분야의 연구를 통해 암을 비롯한 각종 퇴행성질환과 노화의 상태에서 이러한 산화적 스트레스관련 생화학적 지표물질(biomarker)의 증가가 확인되고 있다.

또한, 산소 자유 라다칼(oxygen free radicals)이 DNA를 공격하면 DNA가 절단(single strand break)되어 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동(single cell gel electrophoresis)에 의하여 절단된 DNA의 이동현상을 이용한 DNA손상을 검출할 수 있으며, 또한, 산소 자유 라다칼이 구아닌 염기를 공격하여 8-히드록시-2'-데옥시구아노신으로 변하는데, 이 8-OH2'dG를 지표물질로 하여 DNA 산화적 손상정도를 측정할 수 있다. 또한, 산소 자유 라다칼이 DNA를 공격하면 DNA가 절단되어 염색체 상에서도 유전독성을 나타낸다. 특히, 골수세포에서 생성되어 방출되는 성숙적혈구(reticulocyte)안에 소핵(micronucleus)을 잔류시키는데, 이러한 소핵을 동물실험에서 검출하면 염색체손상에 의한 DNA손상정도를 측정할 수 있으므로 상기의 예에서 제시한 DNA 산화적 손상성을 억제할 수 있는 물질은 생체 DNA의 산화를 방지하여 암을 예방할 수 있으며 노화를 지연시킬 수 있다.

본 발명은 양강으로부터 활성성분인 가란진을 용이하게 높은 함량으로 추출할 수 있는 분리 방법을 제공하기 위한 것이다.

더욱이, 본 발명은 상기와 같이 분리된 추출물의 약리작용을 규명하여 이들 약리작용을 기초로한 이들 활성 성분의 용도를 제공하기 위한 것으로, 즉, 본 발명은 약리작용의 규명을 통하여 이 추출물을 식품과 의약품에 응용 제조하여 우수한가란진의 용도를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이 추출물을 식품, 의약품의 원료로 사용하여 상기 용도에 적당하게 액제, 정제, 캅셀제를 제공하고자 하는 것이다.

따라서, 본 발명에서는 활성성분인 가란진함량이 높은 추출물을 얻기 위하여 가란진분말을 여러 가지 용매로 추출하여 고농도의 가란진을 함유하는 양강추출물을 제조하는 방법을 제공하고, 이렇게 수득된 이들 추출물의 약리작용에 대해 다각적인 실험을 통해 이들 추출물이 프리라디칼소거작용, 항산화활성을 가진 산화적 DNA손상억제제로 높은 활성을 나타냄을 알아 본 발명을 완성하였다.

도 1은 본 발명에 따라 수득된 양강 추출물과 가란진표준품의 HPLC 그래프이다.

본 발명은 양강의 근경을 건조한후 미세하게 분쇄하여 분말로 한 다음 일정량을 취하고 여기에 1-15배의 추출용매를 부가한 후 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출함을 특징으로 한다.

상기 추출용매로는 바람직하기로는 에탄올, 에탄올과 물의 혼합용매, 메탄올, 메탄올과 물의 혼합용매, 아세톤, 디에틸에테르, 헥산, 노말-프로판올, 이소프로판올, 노말-부탄올, 또는 에틸아세테이트가 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 추출한 추출용액은 항산화 활성, 프리 라디칼 소거작용 및 관련 활성 산소종에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성이 뛰어난 것으로, 이를 근거로 하여 노화 방지제로 유용하게 사용될 수 있는 것이다.

상기와 같은 방법으로 추출한 추출용액을 감압 농축시켜 추출물로서 0.001-10%, 바람직하게는 0.01-5%의 양으로 식품, 의약품에 첨가하여 사용함으로서 노화방지에 우수한 효과를 나타낸다.

상기의 노화방지의 목적으로 본 발명의 추출물은 경구 투여에 적합한 유기 또는 무기, 고체 또는 액체 부형제와 같은 제약에 적합한 담체와 혼합되어 제약 제조물의 형태로서 이용될 수 있다. 제약의 제제화는 캅셀제, 정제, 당의정, 과립, 액제, 현탁액등으로 할 수 있다.

본 발명의 추출물의 용량은 복용자의 나이나 상태에 따라 변화할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예로 보다 상세히 설명하나 본 발명이 여기에 한정되지는 않는다.

[실시예 1]

정제수로 세척하고 건조시킨 양강을 분말로 한 다음 1kg을 정량하여 25% 에탄올 3L에 넣고 실온에서 15일간 침적한 후 와트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하고 여액을 냉각콘덴서가 달린 감압 농축장치에서 농축하여 건조물 59.5g을 얻었다.

[실시예 2]

추출용매로 25% 에탄올 대신 50% 에탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 105.5g을 얻었다.

[실시예 3]

추출용매로 25% 에탄올 대신 70% 에탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 117.3g을 얻었다.

[실시예 4]

추출용매로 25% 에탄올 대신 100% 에탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은방법으로 추출하여 46.3g을 얻었다.

[실시예 5]

추출용매로 25% 에탄올 대신 80% 메탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 95.2g을 얻었다.

[실시예 6]

추출용매로 25% 에탄올 대신 100% 메탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 73.3g을 얻었다.

[실시예 7]

추출용매로 25% 에탄올 대신 아세톤을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 43.1g을 얻었다.

[실시예 8]

추출용매로 25% 에탄올 대신 디에틸에테르를 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 35.4g을 얻었다.

[실시예 9]

추출용매로 25% 에탄올 대신 헥산을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 15.7g을 얻었다.

[실시예 10]

추출용매로 25% 에탄올 대신 노말-프로판올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 31.6g을 얻었다.

[실시예 11]

추출용매로 25% 에탄올 대신 이소프로판올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 36.3g을 얻었다.

[실시예 12]

추출용매로 25% 에탄올 대신 노말-부탄올을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 38.3g을 얻었다.

[실시예 13]

추출용매로 25% 에탄올 대신 에틸아세테이트를 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 37.7g을 얻었다.

[실시예 14]

추출용매로 25% 에탄올 대신 클로로포름를 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 30.1g을 얻었다.

[비교예]

추출용매로 25% 에탄올 대신 물을 사용하는 외에 실시예 1과 같은 방법으로 추출하여 89.5g을 얻었다.

[실험예 1]

1) 양강추출물 중 가란진의 정량법(HPLC assay method)

상기 각 실시예 및 비교예에 따라 추출한 양강추출물 약 25mg을 정밀히 달아 50㎖ 갈색 용량플라스크에 넣고 이동상으로 녹인 후 표선을 채워 검액으로 했다. 그 다음 가란진 표준품 2∼3㎎을 정밀히 달아 25㎖ 갈색 용량플라스크에 넣고 이동상으로 녹인 후 표선을 채워 표준액으로 했다. 검액 및 표준액 각 3㎕씩을 가지고C18 컬럼을 장착하여 UV280nm 검출기를 사용한 HPLC로 이동상을 아세토니트릴:물 (80:20)로 사용하여 검액 및 표준액의 피크 면적으로부터 다음식으로 가란진의 함량(%)을 구했다. 도 1에 실시예 3에 따라 70% 에탄올로 추출한 추출물로부터 분리한 가란진(유지시간 96.8분, 왼쪽 : 실시예3의 양강추출물, 오른쪽 : 가란진표준품)의 피크를 나타냈다.

2) 양강으로부터 각 용매추출물의 엑스함량과 양강추출물 중 가란진의 함량

상기 각 실시예 및 비교예의 엑스함량(%)은 1.6 - 11.7%를 나타내었다. 이 중에서 실시예 3의 70% 에탄올에서 수득율이 가장 높았다. 한편, 엑스 중 가란진 함량(%)은 0 - 16.9%로서 물로 추출한 비교예의 추출물에는 가란진이 전혀 검출되지 않았으며, 아세톤과 에틸아세테이트 추출시(실시예 7 및 13) 가장 높았다.

상기 실험예 1에 따라 정량된 각 실시예 및 비교예에 의하여 추출된 용매추출물의 엑스함량과 양강 추출물 중의 가란진 함량은 다음 표 1과 같다.

표 1. 양강으로부터 각 용매추출물의 엑스함량과 양강추출물 중 가란진의 함량

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추출 용매 엑스(%) 양강추출물 중 가란진(%)

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실시예1 25% 에탄올 9.0 0.4

실시예2 50% 에탄올 10.6 2.6

실시예3 70% 에탄올 11.7 4.5

실시예4 100% 에탄올 4.6 9.7

실시예5 80% 메탄올 9.5 5.8

실시예6 100% 메탄올 7.3 8.2

실시예7 아세톤 4.3 16.9

실시예8 에틸에테르 3.5 15.4

실시예9 헥산 1.6 0.8

실시예10 프로판올 3.2 14.8

실시예11 이소프로판올 3.6 14.5

실시예12 부탄올 3.8 13.1

실시예13 에틸아세테이트 3.8 16.9

실시예14 클로로포름 3.8 10.1

비교예 물 6.0 0

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이하의 실험예의 양강추출물의 생리활성실험을 위해서는 엑스 수득율이 가장 높은 실시예 3을 사용하여 실험하였다.

[실험예 2]

자유 라디칼 소거 작용시험

자유라디칼소거작용은 60 uM 1,1-디페닐-2-피크릴-2-히드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, DPPH)에탄올용액 2ml에 양강추출물의 디메틸설폭시드(DMSO)용액 2ml를 가해 30분간 상온에서 반응시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정하여 다음식으로부터 자유 라디칼 소거작용(%)을 구한다.

자유 라디칼 소거작용(%) = 100 - [추출물처리시의 흡광도/대조군의 흡광도 x 100]

그 결과를 표 2에 나타내었다. 양강 추출물은 유의성있는 활성을 나타내었으며, IC₅₀을 비교해 볼 때 양강 추출물이 조(crude) 추출물임에도 불구하고 함유성분인 가란진과 공지의 항 산화물질인 비타민 E보다는 낮았지만 비교될 만한 유의성있는 억제활성을 나타내었다.

표 2. 양강 추출물(YG), 가란진(Galangin) 및 비타민E(Vit-E)의 자유 라디칼 소거작용

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처리 OD_520nm

(ug/ml) Mean ± S.D. 저해율(%) IC₅₀(ug/ml)

-----------------------------------------------------------------------------

YG 0 0.197 ± 0.006

10 0.116 ± 0.002^**41.22 1434.29

100 0.117 ± 0.001^**41.55

1000 0.104 ± 0.003^**47.30

Galangin 0 0.197 ± 0.006

1 0.118 ± 0.011^**40.37 350.24

10 0.107 ± 0.002^**45.61

100 0.109 ± 0.004^**44.59

Vit-E 0 0.348 ± 0.017

10 0.309 ± 0.000^*25.55

50 0.290 ± 0.006^**28.80 318.83

100 0.211 ± 0.004^**51.29

500 0.185 ± 0.000^**58.47

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¹n=3, 양성 대조군과의 유의성 차 ( Student's t-test )

^*P〈 0.05 ,^**P〈 0.01

[실험예 3]

항 산화활성시험

항 산화작용의 측정은 펜톤반응(Fenton reaction)에 의한 지질 과산화반응계(lipid peroxidation system)를 이용한 티오바르비츄릭산법(TBA assay)로 측정하였다. 즉, 에틸리놀레이트 10 mu l, 0.2% 소디움도데실설폭시드(SDS), 염화제일철 10 mu mol, 과산화수소 2 mu mol을 함유하는 25mM 트리즈마(Trizma)염산/0.75mM 염화칼륨 완충액 5ml에 양강 추출물의 디메틸설폭시드(DMSO)시험용액을 가한 후 55℃에서 16시간 배양한 후 4% 디부틸히드록실톨루엔(BHT) 50 mu l를 가한 후 반응을 정지시킨다. 다음 이 용액 0.3ml를 시험관에 넣고 0.05N 염산 3.0ml, 0.67% 티오바르비츄릭산(TBA)용액을 가하고 30분간 끓인다. 다음 이 반응액을 냉각시킨 후 85% 부탄올 4.0ml을 가하고 원심분리 후 부탄올 층의 흡광도를 535nm에서 측정하여 항 산화효과(%)를 다음식으로 구한다.

항 산화작용(%) = 100 - [추출물처리시의 흡광도/대조군의 흡광도 x 100]

양강 추출물의 항 산화활성을 표 3에 나타내었다. 양강 추출물은 유의성있는 활성을 나타내었으며, IC₅₀을 비교해 볼 때 양강 추출물이 조 추출물임에도 불구하고 함유성분인 가란진 보다는 낮았지만 공지의 항 산화물질인 비타민 E보다는 훨씬 높은 유의성 있는 억제활성을 나타내었다.

표 3. 양강 추출물, 가란진 및 비타민E의 항 산화작용

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처리 OD_535nm

(ug/ml) Mean ± S.D. 저해율(%) IC₅₀(%)

-----------------------------------------------------------------------------

YG 0 0.316 ± 0.015

10 0.212 ± 0.008^**32.88

50 0.167 ± 0.007^**47.31 98.03

100 0.161 ± 0.010^**49.10

250 0.084 ± 0.012^**73.45

Galangin 0 0.316 ± 0.015

10 0.198 ± 0.003^**37.41

50 0.135 ± 0.004^**57.22 42.89

100 0.118 ± 0.012^**62.59

250 0.071 ± 0.005^**77.45

Vit-E 0 0.361 ± 0.001

10 0.326 ± 0.001^**20.61

50 0.306 ± 0.002^**26.34 351.67

100 0.234 ± 0.007^**46.40

500 0.197 ± 0.007^**57.67

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¹n=3, 양성 대조군과의 유의성 차 ( Student's t-test )

^*P〈 0.05 ,^**P〈 0.01

[실험예 4]

단 세포 겔 전기영동(Single cell gel electrophoresis ; SCGE, Comet assay)에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성시험

액체질소탱크에 있는 차이니즈 햄스터 폐(Chinese hamster lung) 섬유아세포를 사용하여 수시로 계대(繼代)하여 실험목적에 맞게 배양하였다. 세포배양은 10% FBS(GIBCO), 1% l-glutamine(GIBCO), 1% penicillin-streptomycin(GIBCO)을 함유한 MEM배지(GIBCO)를 사용하였다.

양성 대조 물질로는 10^-3M H₂O₂와 10^-3M FeCl₂를 사용하였다. Cell 5x10⁴개를 24-웰(well)에 심고, 24hr후에 양강 추출물, 가란진, Vit-E를 농도별로 처리하고 12hr 후에 양성대조물질인 H₂O₂(최종농도 10^-3M)를 처리하였다. 30분 후 24-웰에 트립신 2ml를 넣어 세포를 수득하여 테스트 튜브에 취하였다. 1500rpm으로 원심분리 후 PBS (without Cl⁺, Mg²⁺)로 세척하고 다시 1500rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버리고 각각에 0.5%-LMPA(low melting point agarose)를 200ul 가해준 뒤 볼텍스(voltex)를 각각 10초씩 해주었다. 0.65%-NMPA 100ul를 미리 입힌 슬라이드(완전 동결)에 이 액 50ul를 떨어 뜨린 후 커버 슬라이드로 덮었다. 냉장고에서 약 15분간 굳힌 뒤 커버 슬라이드를 제거하고 그 위에 다시 0.5%-LMPA를 100ul 떨어뜨린후 커버 슬라이드로 덮고 냉장고에서 15분간 굳혔다. 커버 슬라이드를 제거한 후 라이시스 버퍼(2.5M NaCl, 100mM Na₂EDTA, 10mM Tris, pH 10, 10% DMSO, 1% triton X-100)에 담가서 약 1시간 라이시스시켰다. 그 후 전기영동 버퍼(300 mM NaOH, 1mM Na₂EDTA, pH 13)에 20분간 담가 정치하였다. 전기영동 장치에 슬라이드를 양극 쪽으로 배열한 뒤 25V, 300mA에서 15분간 전기영동하였다. 슬라이드를 꺼내 10분씩 3번 0.4M Tris(pH 7.5)에 담가 중화하였다. 트레이(Tray)에 걸어 15분 건조시킨 후 에티디움 브로마이드(2ug/ml)를 20ul씩 각각에 떨어뜨려 염색한 후 515-560nm의 여기 필터(excitation filter)와 590nm의 배리어 필터(barrier filter)를 이용하여 형광현미경으로 관찰하였다. 이때 관찰은 이미지 아날라이저(image analyzer)인 KOMET 3.1(Kinetic Imaging, England)를 사용하여 25개의 각 세포에서 DNA 절단의 결과로 나타난 테일(tail)길이(um)를 분석하였다.

단, 세포 겔 전기영동에 의한 양강 추출물의 산화적 DNA손상억제활성을 표 4에 나타내었다. 양강 추출물은 유의성있는 활성을 나타내었으며, 양강 추출물이 조 추출물임에도 불구하고 가장 억제활성이 높은 경향을 나타내었다. 함유성분인 가란진과 기지의 항 산화물질인 비타민 E도 유의성 있는 억제활성을 나타내었다.따라서, 양강 추출물은 히드록실 라디칼(^.OH)에 의한 DNA 싱글 스트랜드 브레이크(single strand break)를 억제하는 DNA 산화적 손상억제제로서 작용하였다.

표 4. 양강 추출물, 가란진, 비타민E의 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

--------------------------------------------------------------------- 처리 테일 길이(um) 저해율

( M or ug/ml ) Mean±SD (%)

--------------------------------------------------------------------

Positive 117.67±20.81

YG 10 74.93±19.28 36.3

(ug/ml) 50 63.92±7.29* 45.7

100 47.93±14.92** 59.3

Galangin 10^-6124.81±27.48 23.0

(M) 10^-5116.37±7.85 32.8

10^-4113.37±18.71 41.5

Vit-E 10^-6113.87±10.61 3.2

(M) 10^-575.21±21.39 36.1

10^-470.55±6.00* 40.0

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¹n=3, 양성 대조군과의 유의성 차 ( Student's t-test )

^*P〈 0.05 ,^**P〈 0.01

[실험예 5]

8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OH2'dG) 정량에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성

CHL 세포를 10cm디쉬(dish)에 심고 24hr동안 배양시킨 다음 검체를 농도별로 처리한 후 양성대조물질로 H₂O₂10^-3M 1ml, FeCl₂10^-3M 1ml를 가해 30분간 37℃ 인큐베이터에서 산화적 DNA 손상을 주었다. trypsin-EDTA를 이용하여 cell을 취하여 1000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 DPBS를 1ml가하여 1000 rpm에서 5분간 원심분리한다. 다시 상등액을 제거한 후 라이시스 버퍼(10 mM Tris HCl, 400 mM NaCl, 2 mM Na₂EDTA, pH 8.2) 3ml, 10% SDS (pH 7.2) 200ul,Proteinase-K (20 mg/ml) 50ul, RNAase A (20 mg/ml) 40ul를 가하여 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양시킨다. 여기에 6 M NaCl 1 ml를 가하여 거품이 생길 정도로격렬하게 볼텍스한 후 15분간 얼음에 담갔다가 2000 rpm에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 취하여 에탄올을 가하여 DNA 펠릿을 얻는다. 10mMTris (pH 7.4 containing 1mMEDTA) 0.3ml0.5Msodium acetate (NaOAc) 30ul, 0.25MMgCl₂10ul를 가한 후 5분간 끓이고 5-10분 동안 냉각하였다. Nuclease P1 (0.5mg/ml) 10ul를 가해 50℃에서 30분간 배양시키고 1MTris (pH 10.6) 10ul와 알카린 포스파타제(alkaline phosphatase) (0.1unit/ul) 10ul를 가해 37℃에서 1시간 배양시켰다. 2.9M초산 10ul를 가해 0.2um필터로 여과해서 이를 전기화학적 검출기(electrochemical-detector)와 UV-검출기를 장착한 HPLC로 C-18 칼럼을 써서 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OH2'dG)과 2'-데옥시구아노신을 동시에 분리·정량하였다.

8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OH2'dG) 정량에 의한 양강 추출물의 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성을 표 5에 나타내었다. 양강 추출물이 조 추출물임에도 불구하고 가장 억제활성이 높은 경향을 나타내었다. 함유성분인 가란진과 공지의 항 산화물질인 비타민 E도 유의성있는 억제활성을 나타내었다. 따라서, 양강 추출물은 히드록실 라디칼(^.OH)에 의한 8-OH2'dG생성을 억제하는 DNA 산화적 손상억제제로서 작용하였다.

표 5. 양강 추출물, 가란진, 비타민E의 8-OH2'dG 정량에 의한 H₂O₂(10^-3M)와 FeCl₂(10^-3M) 유도 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

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처리 8-OH2'dG / 10⁵2'dG 저해율(%)

( M or ug/ml ) Mean ± S.D.

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Positive 173.63±30.48

YG 10 32.17±0.71** 81.5

(ug/ml) 50 27.22±6.33** 84.3

100 28.55±14.04** 83.6

Galangin 10^-669.52±4.92** 60.0

(M) 10^-575.48±16.96** 56.5

10^-475.30±12.82** 56.6

Vit-E 10^-6106.38±28.45* 38.7

(M) 10^-5129.64±41.45 25.3

10^-4130.34±26.04 24.9

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¹n=3, 양성 대조군과의 유의성 차 ( Student's t-test )

^*P〈 0.05 ,^**P〈 0.01

[실험예 6]

브롬산칼륨 유도 소핵생성에 대한 소핵억제효과

마우스 꼬리 정맥을 이용하여 소핵시험을 실시하였다. 양성 대조 물질로는 생체 내에서 산소 라디칼 생성등의 산화적 스트레스를 유발시키는 산화제 KBrO₃를 사용하였다. 마우스에 비타민 E, 가란진, 양강 추출물을 농도별로 경구투여하고 동시에 양성대조물질로 KBrO₃80mg/kg을 복강투여하여 산화적 DNA 손상을 준 다음 24hr후 마우스 꼬리 정맥을 주사바늘로 찔러 소량 분출해 나오는 혈액을 미리 아크리딘 오랜지(acridine orange)로 코팅된 슬라이드 상에 떨어뜨리고 곧 카바 글래스를 덮고 적어도 2시간 이후에 관찰하였다. 관찰은 형광현미경(blue excitation, 488nm & yellow filter, 515nm)에서 1000x로 하였다.

KBrO₃에 의한 양강 추출물의 DNA 산화적 손상에 대한 억제활성을 표6.에 나타내었다. 양강 추출물이 조 추출물임에도 불구하고 억제활성이 높은 경향을 나타내었다. 함유성분인 가란진과 공지의 항 산화물질인 비타민 E 보다도 유의성있는 억제활성을 나타내었다. 따라서 양강 추출물은 KBrO₃에 의한 염색체 손상을 억제하는 DNA 산화적 손상억제제로서 작용함을 알 수 있다.

표 6. 양강 추출물, 가란진, 비타민E의 소핵시험에 의한 KBrO₃유도 염색체손상에 대한 억제작용

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처리 MNRET/1000RET 저해율

(mg/kg) Mean±S.E. (%)

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KBrO₃80mg/kg 15.00±0.41

YG 0.1 11.75±2.78 21.7

1 11.00±0.82** 26.8

10 9.75±1.65* 35.0

Galangin 0.1 14.20±1.2 5.3

1 12.00±1.76 20.0

10 8.60±0.68** 42.7

Vi-E 0.1 14.67±2.85 2.2

1 15.67±1.45 -4.5

10 7.50±0.65** 35.0

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1 n=5 양성 대조군과의 유의성 차 ( Student's t-test )

* P〈 0.05 , ** P〈 0.01

[실험예 7]

급성독성실험

ICR 마우스와 SD랫트를 대상으로 양강 추출물을 경구투여하고, 24시간내의 개체 사망율을 관찰하였다.

경구 투여량 5g/kg 까지 죽은 개체가 한 마리도 발생하지 않았다.

본 발명의 양강 추출물은 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제등과 같은 보조제와 혼합하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.

[제제실시예]

1) 정제의 제조

다음의 원료를 균질하게 혼합하여 약전 제제 총칙중 정제 제조방법에 따라서 1정이 200mg이 되도록 타정하였다.

YG60mg

유당81mg

미결정 셀룰로오스50mg

경질 무수규산1mg

크로스포비돈6mg

스테아린산마그네슘2mg

2) 캅셀제의 제조

다음의 원료를 균질하게 혼합하여 약전 제제총칙중 캅셀제 제조방법에 따라서 1캅셀에 270mg이 함유되도록 충진하였다.

YG60mg

유당204mg

경질 무수규산4.8mg

스테아린산마그네슘1.2mg

3) 연질캅셀제의 제조

다음의 조성물들을 약전 제제총칙중 연질캅셀제 제조방법에 따라 1 캅셀중 695mg이 함유되도록 충진하였다.

1) 충진조성물

YG60mg

레시틴20mg

콩기름149.4mg

야자경화유38mg

황납12mg

2) 건조한 외피조성물

젤라틴247.2mg

농글리세린78mg

디소르비톨액 70%90.05mg

파라옥시안식향산메칠0.28mg

파라옥시안식향산프로필0.07mg

에칠바닐린적 량

청색 1호적 량

황색 203호적 량

산화티탄적 량

분획야자유적 량

4) 액제의 제조

다음의 원료를 약전 제제 총칙 중 액제 제조방법에 따라서 제조하고, 100ml 용량의 갈색병에 충진, 밀봉하여 저온살균처리 하였다.

YG100mg

구연산4mg

벌꿀20mg

액상 과당58mg

니코틴산아미드20mg

안식향산나트륨70mg

포비돈적 량

황색 203호, 청색 1호적 량

멘톨후라보노향적 량

정제수적 량

상기와 같이 구성된 본 발명은 양강에서 가란진 등의 약리작용 활성이 우수한 성분을 함유하는 추출물을 용이하게 수득할 수 있는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 이에 의해 수득된 추출물을 주성분으로 함유하는 조성물은 제제학적으로 안정한 프리 라디칼 소거, 항 산화, 산화적 DNA 손상억제 작용을 나타내며, 따라서, 이들의 작용을 근거로 하여 우수한 노화방지제로 이용될 수 있는 유용한 발명이다.

Claims

양강의 근경을 건조한 후 미세하게 분쇄하여 분말로 한 다음 일정량을 취하고 여기에 에탄올, 에탄올과 물의 혼합용매, 메탄올, 메탄올과 물의 혼합용매, 아세톤, 디에틸에테르, 헥산, 노말-프로판올, 이소프로판올, 노말-부탄올, 또는 에틸아세테이트에서 선택된 하나 이상의 추출용매를 1-15배의 부가한 후 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출함을 특징으로 하는 양강의 활성 성분의 분리방법.
청구항 1에 따라얻은 추출용액을 감압 농축시킨 추출물을 주성분으로 하며 여기에 약학적으로 허용될 수 있는 첨가제가 부가된 노화 방지제.
제 2항에 있어서, 상기 주성분인 추출물이 0.001-10%의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 노화 방지제