KR20050025588A - 올리브 식물수로부터의 히드록시티로졸-풍부 조성물 및그의 사용 방법 - Google Patents

올리브 식물수로부터의 히드록시티로졸-풍부 조성물 및그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 올리브-유래된 히드록시티로졸을 제공한다. 본 발명의 한 양태에 따르면 올리브로부터 식물수가 수집된다. 산을 첨가하여 식물수를 안정하게 하고 발효를 방지한다. 혼합물을 배양하여 올레유로페인을 히드록시티로졸로 전환한 다음 분별하여 다른 성분들로부터 히드록시티로졸을 분리한다. 히드록시티로졸은 피부 손상의 치료를 포함한 다양한 건강상의 목적을 위한 치료제 및 산화방지제로서 유용하다. 추가하여, 히드록시티로졸은 농업 및 해충 제어 용도의 천연 항균, 항바이러스 및 살진균 제품으로서 유용하다.

Description

올리브 식물수로부터의 히드록시티로졸-풍부 조성물 및 그의 사용 방법{AN HYDROXYTYROSOL-RICH COMPOSITION FROM OLIVE VEGETATION WATER AND METHOD OF USE THEREOF}
본 발명은 폴리페놀로서 알려진 올리브 나무의 열매와 잎에 존재하는 일군의 화합물의 페놀 부분에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 올레유로페인과 티로졸을 적은 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는 히드록시티로졸(3,4-디히드록시페닐에탄올)을 함유하는 올리브 추출물, 그리고 그 올리브 추출물을 얻는 방법 및 그러한 화합물의 사용 방법을 제공한다.
참고문헌
다량의 음식물 지방은 몇몇 질환의 발생에 연루된다(Owen 등, 2000c). 유방암(La Vecchia 등, 1998), 전립선암(Chan 등, 1998), 난소암(Risch 등, 1994), 결장암(Armstrong 및 Doll, 1975) 뿐만 아니라 죽상경화증(Kuller, 1997)과 관상동맥질환(Gerber, 1994)이 각각 상승된 음식물 지방에 관련되었다. 그러나, 일부 암의 병인에서는 지방의 양 뿐만 아니라 음식물 지방의 종류 역시 중요하다는 것을 나타내는 증거가 있다(Bartsch 등, 1999). 지중해 연안 음식에서의 주요한 지방 성분인 올리브유는 관상동맥질환(Owen 등, 2000b; Parthasarathy 등, 1990; Mattson 및 Grundy, 1985) 및 어떤 암들(d'Amicis 및 Farchi, 1999; Braga 등, 1998; Martin-Moreno 등,1994)의 낮은 발병률과 관련되었다.
몇몇 실험실은 올리브유 페놀계 올레유로핀과 다른 일족 구성원들의 가수분해가 강한 화학보호 활성을 가지는 작은 페놀 성분들을 가져온다는 것을 보고한 바 있다. 구체적으로, 올리브유 페놀계 히드록시티로졸은 저밀도 지질단백질(LDL) 산화(Visioli와 Galli, 1998), 혈소판응집(Petroni 등, 1995)을 방지하며, 5- 및 12-리폭시게나제(de la Puerta 등, 1999; Kohyama 등, 1997)를 억제한다. 또한, 히드록시티로졸은 퍼옥시니트라이트 의존성 DNA 염기 변형 및 티로신 질화(Deiana 등, 1999)에 대해 억제 효과를 발휘한다는 것이 발견되었고, 이는 다양한 사람 세포 시스템에서 반응성 산소 종들에 의해 유도된 세포독성을 상쇄한다(Manna 등, 2000).
종래에, 올리브유 생산은 씨를 포함한 올리브를 으깨어 농후 페이스트를 만드는 것을 포함한다. 이 과정 동안에 으깨진 올리브는 물로 계속해서 세정되는데, 이 과정이 "연화(malaxation)"로서 알려져 있다. 그 후 페이스트를 기계 프레싱하여 오일 성분을 짜낸다. 올리브유를 제공하는 것에 더하여 프레싱은 또 페이스트의 물 성분을 짜낸다. 그러한 세정 및 프레싱 단계는 "식물수"라고 하는 상당량의 물을 제공한다.
올리브의 씨와 과육에는 수용성 페놀 화합물이 풍부하다. 그러한 화합물은 연화 동안 올리브로부터 추출되며, 그들의 분배 계수에 따라서, 마침내는 식물수로 된다. 이것이 올리브 과육에서 생산된 올레유로페인 및 그 유도체와 같은 다양한 페놀 화합물들이 식물수에서 풍부하게 발견될 수 있는 이유를 설명한다. 유사하게 올리브 씨에서 생산된 티로졸 및 그 유도체들과 같은 많은 모노페놀 화합물들도 식물수에 풍부하다.
히드록시티로졸의 강한 화학보호 활성 때문에, 높은 퍼센트의 히드록시티로졸을 가지는 수성 올리브 추출물을 제조할 수 있는 방법을 개발하는 것이 바람직하다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 히드록시티로졸-풍부 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 올리브로부터, 바람직하게는 씨를 뺀 올리브의 육질(또는 과육)로부터 식물수를 제조하는 단계, (b) 바람직하게는 pH 1 내지 5, 더 바람직하게는 pH 2 내지 4를 생성하는 양으로 식물수에 산을 첨가하는 단계 그리고 (c) 식물수에 원래 존재하는 올레유로페인의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%가 히드록시티로졸로 전환될 때까지 산성화된 식물수를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 산성화된 식물수는 적어도 2개월의 기간 동안 배양되며, 더욱 더 바람직하게 산화된 식물수는 약 6 내지 12개월의 기간까지 배양된다.
한 구체예에서는, 배양이 식물수가 1:1 내지 200:1, 바람직하게는 4:1 내지 200:1, 더 바람직하게는 10:1 내지 100:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 가질 때까지 수행된다. 관련 구체예에서, 배양은 식물수가 3:1 내지 50:1, 전형적으로 5:1 내지 30:1의 히드록시티로졸 대 티로졸의 중량비를 가질 때까지 수행된다.
본 방법은 배양된 식물수를 분별하여 히드록시티로졸과 다른 성분들을 분리하는 단계, 및/또는 히드록시티로졸-풍부 식물수를 건조하여 건조 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 배양된 식물수는 유기용매로 추출되며, 이로써 20% 또는 바람직하게는 95% 이상의 히드록시티로졸 풍부 부분을 생성한다.
또한, 상기 설명된 하나 이상의 구체예에 의해 제조된 히드록시티로졸-풍부 조성물을 포함하는 주사가능한 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 올리브로부터 식물수를 제조하는 단계; (b) 산을 첨가하여 올레유로페인 및 다른 큰 페놀 분자들을 가수분해하는 단계; (c) 선택적으로 식물수를 건조하는 단계; (d) 선택적으로 건조된 식물수를 초임계 유체와 접촉시키는 단계; 및 (e) 접촉된 식물수로부터 히드록시티로졸-풍부 조성물을 회수하는 단계를 포함하는 히드록시티로졸-풍부 조성물의 제조방법을 포함한다. 한 구체예에서는, 히드록시티로졸-풍부 조성물이 적어도 약 95중량%의 히드록시티로졸을 포함한다. 다른 구체예에서, 히드록시티로졸-풍부 조성물은 적어도 약 97중량%의 히드록시티로졸을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 히드록시티로졸-풍부 조성물은 적어도 약 99중량%의 히드록시티로졸을 포함한다.
다른 양태에서, 히드록시티로졸-풍부 조성물을 제조하는 방법은 (a) 올리브로부터 식물수를 제조하는 단계; (b) 산을 첨가하여 올레유로페인 및 다른 큰 페놀 분자들을 가수분해하는 단계; (c) 선택적으로 식물수를 건조하는 단계; (d) 에틸아세테이트(EtAc) 같은 적합한 유기용매로 식물수를 추출하는 단계; 및 (e) 순도 95% 이상의 총 페놀 부분으로 히드록시티로졸을 함유하는 부분을 회수하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 히드록시티로졸-풍부한 조성물은 약 95중량%의 히드록시티로졸을 함유하는 페놀 부분을 적어도 20% 포함한다. 한 구체예에서, EtAc 부분을 실리카겔 크로마토그래피나 다른 겔 크로마토그래피로 정제하여 95중량% 이상의 히드록시티로졸을 함유하는 히드록시티로졸 부분을 얻는다.
한 구체예에서, 상기 설명된 회수 단계는 (a) 히드록시티로졸을 함유하는 초임계 유체를 회수하는 단계; 및 (b) 초임계 유체를 증발시켜 히드록시티로졸-풍부 조성물을 추출하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 설명된 접촉 단계는 (a) 가압 하의 모듈 내에 마주한 면들을 갖는 다공성 막을 제공하는 단계, 이 막은 유체와 고밀도 기체 사이에서 장벽계면으로서 작용하며, 상기 히드록시티로졸에 대해 비선택적이고; (b) 막의 한쪽 면 위에서 모듈로 초임계 유체를 그리고 막의 반대쪽 면에 식물수를 제공하는 단계; 및 (c) 식물수와 초임계 유체 사이의 히드록시티로졸의 농도 기울기에 의해 유도되는 대로 막을 가로질러 히드록시티로졸을 추출하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 다공성 막은 중공 섬유질 막이다. 다른 구체예에서, 초임계액은 이산화탄소이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 올리브로부터 식물수를 제조하는 단계; (b)산을 첨가하여 올레유로페인 및 다른 큰 페놀 분자들을 가수분해하는 단계; 및 (c) 산성화된 식물수를 분무건조, 즉 증발시킴으로써 히드록시티로졸을 함유하는 분말을 얻는 단계를 포함하는 히드록시티로졸-풍부 조성물의 제조방법을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 설명된 증발 단계는 산성화된 식물수에 말토덱스트린을 첨가함으로써 수행되며, 그 결과 바람직하게 약 1 내지 5%의 히드록시티로졸을 함유하는 분말, 더 바람직하게는 약 2%의 히드록시티로졸을 함유하는 분말이 얻어진다.
다른 양태에서, 본 발명은 4:1 내지 200:1, 전형적으로는 10:1 내지 100:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 함유하는 수성 올리브 추출물을 포함하는 식이보조제를 포함한다.
관련된 양태에서, 본 발명은 3:1 내지 50:1, 전형적으로 5:1 내지 30:1의 히드록시티로졸 대 티로졸의 중량비를 함유하는 수성 올리브 추출물을 포함하는 식이보조제를 포함한다.
상기 보조제는 바람직하게 분무건조에 의해 건조될 수 있으며, 이로써 분말 추출물을 제공하고, 이것은 정제, 캡슐, 알약, 또는 설탕절임 음식 첨가물로 제조할 수 있다. 또는 달리, 상기 보조제는, 예를 들어 히드록시티로졸-풍부 주사가능한 제제로 약학적 제제에 배합될 수 있다.
또한, 약 1:1 내지 약 200:1, 바람직하게는 약 4:1 내지 약 100:1, 더 바람직하게는 약 10:1 내지 약 50:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 가지는 치료제의 약학적 유효량을, 그러한 보호를 필요로 하는 피험체에 투여하는 것을 포함하는 자외선(UVR) 노출의 유해효과에 대해 피부를 보호하는 방법이 제공된다. 또, 이 치료제는 국소도포용 일광차단제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 치료제는 국소 투여된다. 바람직하게, 치료제는 경구 투여된다.
본 발명의 이들 및 다른 양태와 특징들이 하기 발명의 상세한 설명을 첨부된 도면 및 표와 함께 숙독함으로써 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1은 올리브유에서 검출된 페놀 화합물들과 그들의 전구물질의 구조를 나타낸다: 리그스트로시드(I); 올레유로페인 글루코시드(II); 리그스트로시드 아글리콘(III); 올레유로페인 글루코시드 아글리콘(IV); 카르복시메틸기가 결여된 디알데히드 형태의 리그스트로시드 아글리콘(V); 카르복시메틸기가 결여된 디알데히드 형태의 올레유로페인 글루코시드 아글리콘(VI); 티로졸(VII); 히드록시티로졸(VIII)
도 2는 씨를 뺀 올리브 육질로부터 얻은 식물수로부터 초임계 이산화탄소 추출한 후의 본 발명의 히드록시티로졸-풍부 조성물의 HLPC 분석을 나타낸다.
도 3은 초임계 이산화탄소 추출 후의 본 발명의 히드록시티로졸-풍부한 조성물의 HLPC 분석을 합성 히드록시티로졸과 함께 나타낸다.
도 4는 씨를 뺀 올리브 육질로부터 얻은 식물수의 산성 가수분해 후의 본 발명의 히드록시티로졸-풍부 조성물의 HLPC 분석을 나타낸다.
도 5는 씨를 뺀 올리브로부터 얻어서 산 첨가 가수분해한 식물수로부터의 히드록시티로졸의 에틸아세테이트 추출 후의 본 발명의 히드록시티로졸-풍부 조성물의 HLPC 분석을 나타낸다.
도 6은 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후 얻어진 순수한(95% 이상) 히드록시티로졸의 HLPC 분석을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 히드록시티로졸-풍부 조성물의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 히드록시티로졸의 단편화 경로를 예시한다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허출원 또는 다른 참고문헌들은 각 간행물, 특허, 특허출원 또는 참고문헌들이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고자료로서 수록된 것으로 나타낸 것처럼 그 전체가 본원에 참고자료로서 수록된다.
1. 정의
달리 지시되지 않으면, 여기서 사용된 모든 용어는 본 발명 분야의 당업자들에게 동일한 의미를 가질 것이다. 설명된 특정한 방법, 프로토콜, 및 시약들은 변할 수 있으며, 따라서 본 발명은 그들에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
"올레유로페인"은 세코이리도이드 글루코시드 올레유로페인을 의미한다(도 1의 구조 II).
"티로졸"은 4-히드록시페네틸 알코올을 의미한다(도 1의 구조 VII).
"히드록시티로졸"은 3,4-디히드록시페네틸 알코올을 의미한다
(도 1의 구조 VIII).
II. 본 발명의 방법
한 양태에서, 본 발명은 올리브-유래 식물수로부터 히드록시티로졸-풍부 조성물을 제공한다. 아래 설명된 바와 같이, 특정한 조건 하에서 올리브의 식물수로부터 히드록시티로졸이 얻어질 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명을 실행하는데 있어서의 단계들이 하기 고찰된다.
A. 식물수 제조 단계
본 발명의 방법은 재배자 등의 종래의 그리고 상업적으로 이용할 수 있는 공급원으로부터 얻을 수 있는 올리브를 사용한다. 바람직하게, 식물수는 씨를 뺀 올리브로부터 얻어진다. 본원에 개시된 방법에 따라서 가공되는 올리브는 어떤 적합한수단에 의해 씨를 뺄 수 있다. 올리브의 씨는 식물수에서 바람직하지 않은 성분인 티로졸을 함유하는데, 이것은 하기 설명된 산 처리에 의해 분명히 파괴되지 않을 수도 있다. 손으로 또는 아래 설명된 자동 방식으로 과육에서 씨가 분리될 수 있다. 바람직하게, 그러한 수단은 씨를 부수지 않으면서 분리할 수 있어야 하며, 그렇지 않다면 식물수에서 티로졸 농도가 더 높아질 수 있다. 다른 구체예에서는, 씨를 빼지 않은 올리브로부터 얻어진 식물수로부터 히드록시티로졸이 추출된다.
식물수를 제조하기 위해서, 먼저 올리브 과육을 가공하여 올리브유, 식물수 그리고 고체 부산물을 포함하는 액상 혼합물을 얻는다. 그 후, 식물수가 나머지 액상 혼합물로부터 분리되어 수집된다. 식물수를 얻는 전형적인 방법이 공동 소유의 미국특허출원 No. 6,165,475 및 6,197,308(모두 R. Crea)에 설명되며, 이것은 각각 그 전체가 참고자료로서 본원에 수록된다.
상업적 생산을 위해서, 본 발명의 다양한 양태들을 자동화하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 한 구체예는 본원에 참고자료로 수록된 미국특허 No. 4,452,744, 4,522,119 및 4,370,274(각각 Finch 등)에 개시된 장치의 사용을 고려한다. 간단히 말해서, Finch 등은 올리브로부터 올리브유를 회수하기 위한 장치를 교시하고 있다. 처음에 올리브는 올리브로부터 올리브 씨를 분리하는 과육채취기에 공급되며 씨가 없는 올리브 육질이 얻어진다. 다음에 이 육질은 오일, 물 그리고 적은 부분의 올리브 과육을 포함하는 액상을 뽑아낼 만큼 충분한 추출 압력을 육질에 가하는 추출 스크류에 의해 보내진다. 액상이 상자에 수집되고, 그 후 액상에서 과육을 분리하는 깨끗한 원심분리기로 보내져 올리브유과 식물수를 포함하는 혼합물이 얻어진다. 다음에, 정제된 원심분리기가 식물수와 적은 부분의 고체 물질을 혼합물로부터 분리하며, 이로써 실질적으로 식물수를 함유하지 않는 올리브유가 얻어지고, 이것은 탱크에 수집된다. Finch 등에 따르면 물은 하수도와 같은 폐기 수단으로 보내진다. 반대로, 본 발명은 히드록시티로졸을 추출하기 위한 식물수의 수집, 저장 및 사용을 제공한다.
본 발명을 실행하는데 사용될 수 있는 추가의 장치가 본원에 참고자료로 수록된 이탈리아 특허 No. 1276576 및 1278025에 개시된다. 상기와 같이, 이들 장치는 으깨어진 올리브 과육을 오일, 물, 및 고체 잔류물로 가공하기 전에 전에 과육과 씨를 분리하는데 사용될 수 있다.
B. 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환
본 발명의 한 양태에서, 식물수에 함유된 올레유로페인이 히드록시티로졸로 전환된다. 식물수의 pH는 산의 첨가에 의해 감소될 수 있으며, 식물수는 본 발명의 발견에 따르는 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 산 가수분해를 촉진하는 조건 하에서 배양되도록 허락된다. 다음에, 샘플이 분별 또는 추출되어 다른 화합물들로부터 히드록시티로졸이 분리된다.
바람직한 구체예에서, 첨가되는 산은 시트르산이다. 산은, 바람직하게는 pH 1 내지 5, 더 바람직하게는 pH 2 내지 4로 조절되도록 식물수에 첨가된다. 식물수 약 1000 갤론 당 바람직하게는 약 25 내지 50 파운드의 산(acid) 양으로 고체 시트르산을 계속 교반하면서 첨가할 수 있다. 결과의 용액의 pH가 모니터링될 수 있으며, 필요하다면 산을 더 첨가하여 원하는 pH를 달성할 수 있다. 시트르산의 첨가 후 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환을 나타내는 전형적인 방법이 실시예 1 및 2에 주어진다.
또한, 산은 시트르산 이외의 유기 또는 무기산일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전형적인 산은 무기산으로서 알려진 무기 물질, 예를 들어 황산, 질산, 염산 및 인산, 그리고 카르복실산, 술폰산 및 페놀(벤질) 군에 속하는 유기 화합물을 포함한다. 식물수에 산을 첨가하는 것은 몇 가지 목적을 위해서인데, (i) 그것은 페놀계 분자의 공기(산소) 중합으로부터 식물수를 안정하게 하고; (ii) 내인성 및/또는 외인성 세균 및 효모에 의한 식물수의 발효를 방지하고; (iii) 실시예 1 및 2에 나타낸 대로 올레유로페인과 히드록시티로졸을 함유하는 다른 큰 페놀계 분자들의 가수분해를 제공하여 그들을 히드록시티로졸로 전환시킨다. 실시예 1 및 2의 표 1 및 표 2는 각각 2개의 식물수 샘플로부터의 데이타와 시트르산의 첨가 후 시간의 경과에 따른 샘플 중의 다양한 성분의 각 조성 퍼센트를 함유한다. 한 구체예에서, 혼합물은 히드록시티로졸이 올레유로페인과 히드록시티로졸의 총 조합의 75 내지 90%가 될 때까지 배양되도록 허락된다. 다른 구체예에서는, 원래 혼합물에 실질적으로 올레유로페인이 없는 상태가 유지된다.
C. 히드록시티로졸 정제
바람직하게는 산의 첨가에 의한 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환 후, 배양된 식물수는 본 분야에 공지된 많은 방법에 의해 분별될 수 있다. 전형적인 분별 방법은 에틸아세테이트 같은 유기용매를 사용한 분배 방법, 겔 크로마토그래피와 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함한 크로마토그래피 방법, 또는 초임계 유체를 사용하는 것이다.
또는 달리, 산성화 후에 상기 설명된 대로 얻어진 식물수는 저분자량 폴리페놀, 특히 히드록시티로졸이 풍부하고 티로졸과 올레유로페인이 소량인 용액을 제공한다. 가공된 물에서 히드록시티로졸의 농도는 올리브유 추출 동안의 물의 첨가에 의한 희석도에 따라서, 리터 당 4 내지 5g에서 리터 당 10 내지 15g까지의 범위일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 오염물질의 추가 없이 히드록시티로졸의 함량을 선택적으로 풍부하게 하는 추출 또는 정제 방법을 제공한다. 이와 같이 주요한 페놀 성분인 히드록시티로졸이 폐놀계 일족에 속한 다른 구성원, 불순물, 현탁된 고체, 탄닌, 그리고 식물수에 함유된 다른 분자들로부터 분리된다. 따라서, 히드록시티로졸은 현재의 합성 또는 천연 추출 방법에 의해서는 쉽게 이용할 수 없는 순도 및 양으로 생성될 수 있다.
초임계 유체는 그것의 임계 온도 및 압력 이상에서 매우 고밀도로 되는 기체이다. 초임계 유체의 성질은 기체와 액체의 사이이며, 그 결과 화합물을 용해하는 능력이 높아진다. 초임계 유체의 상대적인 고밀도, 고확산성, 그리고 저점도는 종래의 액체 용매보다 더 빠른 화합물의 추출을 허락한다. 이산화탄소는 천연물질이고, 비독성, 비인화성이며, 비교적 불활성이고, 추출 생성물에 잔류하지 않기 때문에, 음식 및 음식 원료의 초임계 유체 가공에서 가장 널리 사용되는 기체이다. 초임계 이산화탄소를 사용한 전형적인 액체 추출은 통상 큰 접촉 칼럼 또는 타워에서 한 상을 나머지 한 상에 분산시킴으로써 행해지며, 이 때 유체를 함유한 용질, 예를 들어 쥬스는 중력에 의해 아래쪽으로 흐르고, 초임계 유체는 위쪽으로 흐른다. 두 상 사이의 계면에서 질량 이동이 발생한다.
또는 달리, 접촉 칼럼 대신에 이산화탄소와 같은 초임계 유체와 다공성 막을 사용하여 액체 및 현탁액의 연속 추출이 달성될 수 있다. 상들을 분산시키는 대신에, 액체는 중공 섬유 묶음이나 나선형으로 감긴 시트로서 형성된 다공성 폴리프로필렌 막을 통해 연속적으로 공급된다. 액체가 가압 모듈 내의 다공성 막을 통과하는 동시에 초임계 이산화탄소가 막의 다른쪽 위를 역전류적으로 흐른다. 모듈 안의 압력은 본질적으로 동일하며, 이로써 유체와 초임계 이산화탄소 사이의 농도 기울기에 의해 추출이 추진된다. 추출물은 리사이클링 동안 이산화탄소를 증발시킴으로써 회수될 수 있다. 초임계 이산화탄소 및 다공성 막을 사용한 추출의 전형적인 방법은 본원에 참고자료로 수록된 미국특허 No. 5,490,884에 설명된다.
이산화탄소 대신에 또는 이산화탄소와 조합하여 다른 초임계 유체가 사용될 수 있다. 이들 유체는 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 이소부탄, 에텐, 프로펜, 히드로플루오로카본, 테트라플루오로메탄, 클로로디플루오로메탄, 이산화탄소, 일산화이질소, 육불화황, 암모니아, 및 염화메틸을 포함한다.
실시예 3은 본 발명을 지지하는 소규모의 실험을 설명하며, 여기서는 초임계 이산화탄소와 다공성 막을 사용하여 식물수로부터 히드록시티로졸이 분리되었다. 분리된 히드록시티로졸의 HPLC와 질량분광 분석은 이 샘플이 97-99%의 순수한 히드록시티로졸임을 나타낸다. 이와 같이, 본 발명은 적어도 약 80% 히드록시티로졸, 바람직하게는 적어도 약 90% 히드록시티로졸, 더 바람직하게는 적어도 약 95% 히드록시티로졸, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 97% 히드록시티로졸, 아주 더욱 바람직하게는 적어도 약 99% 히드록시티로졸을 함유하는 히드록시티로졸-풍부 조성물을 제공한다.
초임계 유체로 추출하기 전에 식물수는 용액에 첨가된 말토덱스트란 및/또는 폴리프로필렌 비드와 같은 당업자에게 잘 알려진 담체를 가질 수 있고; 및/또는 용액은 건조될 수 있다. 건조 단계는 식물수로부터 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람하게는 적어도 약 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 98%의 물을 제거한다.
막 반응장치의 중요한 특징은 접촉표면 계면 면적이 유체 속도에 독립적으로 추가될 수 있다는 사실이다. 따라서, 본 발명은 추출에 사용된 막의 표면 막 면적이 적어도 약 100 평방 야드, 바람직하게는 적어도 약 300 평방 야드, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 600 평방 야드이며, 이로써 큰 부피의 식물수로부터 히드록시티로졸을 분리하도록 하는 대규모 장치를 고려한다. 이와 같이 한 양태에서, 본 발명의 막 시스템은 분 당 1 내지 20 리터, 바람직하게는 분 당 5 내지 10 리터의 유속을 수용할 수 있다.
또, 상기 언급된 바와 같이 본 발명에 따르는 추가의 정제 방법이 사용될 수 있다. 히드록시티로졸의 HPLC 분리가 Ficarra 등, 1991; Romani 등, 1999, 그리고 Tsimidou, 1992에 설명되며, 이들은 각각 본원에 참고자료로 수록된다.
III. 히드록시티로졸-풍부 식이보조제
상기 설명된 방법에 의해 제조된 히드록시티로졸이 다양한 용도에서 사용될 수 있다는 것이 인정되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히드록시티로졸은 (i) 농업 및/또는 해충 제어 용도를 위한 천연 항균, 항바이러스 및/또는 살진균 제품으로서 그리고 (ii) 다양한 건강상의 목적을 위한 치료제 및/또는 산화방지제로서 사용될 수 있다. 한 전형적인 구체예에서, 히드록시티로졸은 포유동물 피험체, 예를 들어 히드록시티로졸에 연관된 한 가지 이상의 이점들을 원하는 사람에게 투여된다.
따라서, 본원에서는 자외선(UVR) 노출로 인한 피부 손상을 보호하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히드록시티로졸은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구용 제형은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 그러한 제형은 정제된 히드록시티로졸로부터 제조될 수 있거나, 또는 수성 또는 수성-알콜계 추출물로부터 제조될 수 있다. 후자에 관하여, 수성 또는 수성-알콜계(예를 들어, 물 또는 물-에탄올) 추출물이 분무건조되어 건조 분말을 제공할 수 있으며, 이 분말이 다른 약학적으로 허용되는 담체와 함께 경구 제형으로 제조될 수 있다. 수성 또는 수성-알콜계 추출물은 4:1 내지 200:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 100:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 다양한 중량비를 함유하도록 제조될 수 있다. 또, 추출물은 약 2:1 내지 약 50:1, 바람직하게는 약 5:1 내지 약 30:1의 히드록시티로졸 대 티로졸의 다양한 중량비를 함유하도록 제조될 수 있다.
바람직하게, 조성물은 UVR 노출로 인한 피부 손상에 대한 보호가 필요한 환자에게 경구 투여된다. 본 발명에 따르는 고체 경구용 제형 조성물은 약학적 분야에 잘 공지된 방식으로 제조되며, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 히드록시티로졸을 포함한다. 그러한 조성물의 제조에서, 실질적으로 순수한 형태이거나 또는 미정제 증류물 또는 추출물의 성분으로서의 히드록시티로졸-풍부 조성물은 통상 담체와 혼합되거나, 담체로 희석되거나, 또는 담체로 싸여진다. 담체는 고체 형태, 반-고체 또는 액체 재료일 수 있고, 이것은 활성 성분용 비히클, 담체 또는 매질로서 작용한다. 또는 달리, 담체는 경구 투여를 용이하게 하는 캡슐이나 또는 다른 용기의 형태일 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 투여를 위한 고체 경구용 제형은 정제, 알략, 분말 또는 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.
또는 달리, 경구 투여용의 본 발명에 따라서 얻어진 히드록시티로졸은 액체 형태일 수 있으며, 이 때 약학적으로 허용되는 담체는 물이나 수성-알콜 매질이다.
또한, 본 발명에서 투여용 조성물은, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 녹말, 검, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스, 물, 알콜 등을 포함하는 다른 통상의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제조될 수 있다. 제제는 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일과 같은 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 메틸- 및 프로필히드록시벤조에이트와 같은 보존제, 감미제 또는 향미제를 추가로 포함할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 조성물은 피험체에의 투여 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제조될 수 있다.
본 발명에 따라서 사용되는 비경구 제제는 본 분야의 표준 기술을 사용하여 제조된다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 그러한 제제는 통상 등장 식염수 용액과 같은 비경구적으로 허용되는 담체를 사용한 멸균 주사액으로서, 또는 피험체에게 주사하기 전 멸균 완충액이나 등장 식염수로 복원하도록 제조된 멸균 포장 분말로서 통상적으로 제조된다. 한 바람직한 구체예에서, 비경구 제제는 본 발명의 히드록시티로졸-풍부 조성물을 1 내지 500mg/mL으로 포함하는 주사가능한 제제이다. 더 바람직하게, 주사가능한 제제는 1 내지 100mg/mL의 히드록시티로졸-풍부 조성물, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 100mg/mL의 히드록시티로졸-풍부 조성물, 가장 바람직하게는 약 10mg/mL의 히드록시티로졸-풍부 조성물을 포함한다.
전술한 바로부터, 본 발명의 다양한 목적 및 특징들이 어떻게 충족되는지를 볼 수 있다. 이제 당업자는 전술한 설명으로부터 본 발명의 광범위한 교시가 다양한 형태로 이행될 수 있다는 것을 인정할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 특정한 구체예 및 실시예들과 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 실제 범위는 그렇게 제한되어서는 안된다. 첨부된 청구항에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형들이 만들어질 수 있다.
아래의 실시예들은 본 발명에 따른 히드록시티로졸-풍부 조성물의 제조방법을 예시한다. 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
1000 갤론 당 약 25 파운드의 시트르산 첨가 후 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환
표 1은 식물수 1000 갤론 당 시트르산 약 25 파운드를 첨가한 후 시간의 경과에 따른 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환을 나타낸다. 표 1에서 백분율은 용액에 있는 총 페놀계 화합물의 중량 백분율로서 나타낸다. 표 1에 증명된 대로, 12시간 후 용액 중에서 히드록시티로졸은 80% 이상의 페놀계 화합물로 이루어진다.
실시예 2
1000 갤론 당 약 50 파운드의 산 첨가 후 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환
표 2는 식물수 1000 갤론 당 시트르산 약 50 파운드를 첨가한 후 시간의 경과에 따른 올레유로페인의 히드록시티로졸로의 전환을 나타낸다. 표 1에서 백분율은 용액에 있는 총 페놀계 화합물의 중량 백분율로서 나타낸다. 의미 있게도, 표 2에 증명된 대로, 2개월 후 용액 중에서 히드록시티로졸은 45% 이상의 페놀계 화합물로 이루어진다.
실시예 3
식물수로부터 히드록시티로졸의 추출
건조 고체(말토덱스트란) 약 40mg을 함유하는 식물수 분취액(0.5mL)를 폴리프로필렌 다공성 비드와 혼합하고 건조시켰다. 건조된 혼합물을 사용하여 초임계 이산화탄소(PoroCrit, LLC, 캘리포니아 버클리)로 추출했다. HPLC로 수집한 샘플(약 2.0mg)을 분석했다. 샘플 프로파일을 도 2에 나타내며, 표 3에는 주 피크 아래 면적이 97%임이 나타나 있다. 합성 히드록시티로졸을 샘플에 첨가하여 HPLC로 분석했을 때는 도 3에 나타낸 대로 1개의 주 피크가 출현했으며, 이는 샘플의 주 생성물이 히드록시티로졸임을 나타낸다(표 4).
실시예 4
산성화된 식물수로부터 히드록시티로졸의 추출
산성 가수분해 후 식물수 분취액(1 리터)을 쉐이킹 플라스크에서 에틸아세테이트와 함께 격렬하게 흔들었다. 유기용매를 수용액과 분리하고 회전 증발기로 증발시켜 없앴다. 결과의 농후 오일(약 20g)을 수집하여 HPLC로 분석했다. 이 샘플의 프로파일을 도 5에 나타내며, 표 5에는 주 피크 면적이 97.457%임이 나타나 있으며, 이는 물 중에서 히드록시티로졸이 약 95% 이상의 총 폴리페놀계 부분에 상당한다는 것을 나타낸다. 표준 색채계 분석법에 의한 총 페놀 측정은 히드록시티로졸이 약 20중량%로 오일 중에 함유된 것을 나타낸다.
이 부분을 사용하여 겔 크로마토그래피로 히드록시티로졸을 추가 정제했다. 건조 실리카(150g)을 에틸아세테이트(300mL)에 현탁시켜서 농후 슬러리를 얻었다. 슬러리를 유리 칼럼에 붓고 실리카를 15분간 방치하여 침전시켰다. 약 20%(4g)의 히드록시티로졸을 함유하는 농후 오일을 에틸아세테이트 25mL에 용해시키고 실리카겔 위에 서서히 부었다. 히드록시티로졸의 정제는 생성물의 중력 용출과 용매로서 에틸아세테이트를 첨가하여 얻어졌다. 순수한 히드록시티로졸을 함유하는 부분들을 수집하여 함께 모았다. 황색 오일이 생성될 때까지 용매를 증발시켰다. 도 6과 표 6에 나타낸 대로, HPLC와 질량분광법에 의해 증명된 바, 이 오일은 본질적으로 순수한 히드록시티로졸(97-99%)이다. 이 정제 과정의 수율은 약 2.8-3.0g 히드록시티로졸 또는 약 65%이다.
실시예 3 및 4의 두 과정에 의해 설명된 대로 얻어진 샘플들의 질량분광분석은, 도 7에 나타낸 대로, 주 생성물이 히드록시티로졸임을 확인해 준다. 메탄올을 사용하여 26㎍/mL의 최종 농도로 샘플을 희석하고, ESI 프로브가 장착된 Finnigan LCQ 상에서 네가티브 이온화 방식으로 분석했다. 일체형 주사기 펌프를 사용하여 분 당 3㎕씩 주입했다. 온도 270℃, 바늘 전압 +4.2V, 순환 기체 45 유닛, 그리고 보조 기체 10 유닛이었다. 히드록시티로졸의 단편화 경로는 도 8에 나타낸다. 도 7에서 볼 수 있는 바 대로, 히드록시티로졸(질량/전하 153.1) 및 그것의 단편 생성물(123.1 및 105.1 질량/전하)이 다-단계 스펙트럼에 풍부한 생성물의 대부분을 차지한다.
실시예 5
자외선으로 인한 피부 손상에 대한 보호
올리베놀 조성물
테스트 제품은 올리베놀(Olivenol, Lot#1A-1B)였다. 올리베놀은 회전 증발기에서 건조상태로 증발된 식물수(500mL)를 산 가수분해한 후 이어서 동결건조하여 얻은 미정제 수(water) 제제이다. 테스트 제품의 비히클은 수성 0.5% w/v 메틸셀룰로스(경구 투여) 및 메틸알콜, 99.9% A.C.S. 분광광도법 등급(국소 투여)이었다. 연구하는 동안 제제는 단 한번 제조했고, 테스트 제품은 투약량 계산에 알맞게 75% 활성인 것으로 생각했다.
생쥐
수컷 Crl:SKH1-hrBR 무모 생쥐(공급원: Charles River Laboratories, Inc., 미국 미시간 포타지) 100 마리를 10개 투약군(1군 내지 10군)으로, 표 1에 나타낸 대로 군 당 10마리씩 무작위로 할당했다. 수컷 생쥐의 체중은 17 내지 28g의 범위였다.
올리베놀 조성물 투여 및 UVR 노출
제제를 적합한 생쥐에게 31일(1군-4군) 또는 10일(5군) 연속하여 1일 1회 경구 투여(위관영양법에 의해)했다. 제제를 적합한 생쥐에게 31일(6군-9군) 또는 10일(10군) 연속하여 1일 1회 국소 투여(100mcL/생쥐)했다.
제제 투여 후 28일째(1군-4군과 6군-9군) 또는 7일째(5군 및 10군)에 1군에서 10군의 생쥐들을 UVR(즉, 전자기 스펙트럼의 UVB 및 UVA 부분의 파장)에 노출시켰다. 복사선 공급원은 Oriel 광관과 짝을 이룬 WG320 Schott 유리필터(1mm)를 장착한 Berger Compact Arc 고강도 태양광 시뮬레이터(Solar Light Company, 펜실베니아 필라델피아)였다. PMA 2100 미터(Solar Light Company, 펜실베니아 필라델피아) 또는 비슷한 장치로 공급원의 복사 강도를 계속 모니터했다. 28일 또는 7일째에, 제제 투여와 UVR 노출 시작 사이의 간격은 대부분의 생쥐에 대해서 15분 미만, 그리고 소수의 생쥐에 대해서는 15분을 약간 넘었다.
생존능력 조사를 1일 2회 실시했다. 임상적 관찰은 적어도 주 1회 기록했으며, 여기에는 최조 제제 투여 전 1회와 UVR 노출 바로 전의 1회 관찰이 포함된다. 임상 관찰은 또한 광선 조사 후 약 24, 48 및 72시간에서 기록되었다. 투여 기간 동안 주 1회씩 그리고 최종 희생시에 체중을 기록했다.
생쥐의 희생
살아 남은 모든 생쥐를 계획표에 따라 희생시켰다. 최종 시험 후, UVR 노출 완료 후 대략 72시간째에 계획된 대로 희생시켰다(CO2 질식). 가능한 조직병리학적 시험을 위해 UVR 노출 부위를 포함하는 등쪽 피부를 제거하여 중성 완충된 10% 포르말린에 보관했다.
계산된 평균 UVR 선량 값(MED)와 표준 편차를 다음과 같이 적합한 군들에 대해 결정했다. 노출 부위에서 어떤 피부 반응을 일으키는 최저의 기계적 UVR 선량을 각 생쥐에 대해 결정했다. 각 관찰 시점에서 각 군에 대한 평균 계산한 UVR 선량을 결정했다. 테스트 제품의 투여가 피부 반응을 도출하는데 필요한 UVR 선량에 영향을 미치지 않는다면, 이 계산 방법에 기초하여, 1.0 MED와 동등한 평균 계산한 UVR 선량은 광선 조사 후 48시간째일 것으로 예상된다. 평균 계산한 UVR 선량 값이 1.0 이상이라면 이것은 테스트 제품의 보호 효과를 나타낸다. 6 군데의 UVR 노출 부위 중 어디에서도 피부 반응을 갖지 않은 어떤 생쥐에 대해서는, 계산을 위해서 2.8의 귀속 값이 할당되었으며, 이 군의 평균 계산한 UVR 선량 값에 대해서 접두사로서 기호 >이 포함되었다. 추가로, 비율(임상 관찰) 및 표준편차(체중)를 갖는 평균이 계산되었다.
군 평균과 표준편차를 계산하여 체중과 체중 변화에 대한 표로 만들었다.
결과
UVR 노출 부위에서 발생된 피부 반응은 홍반, 부종 및 박편화를 포함했으며, 피부 반응의 심한 정도는 UVR 노출 선량에 의존하려는 경향을 보였다.
31일 동안 올리베놀을 경구 투여한 무모 생쥐에서 UVR-유도 피부 염증에 대한 적은 투약량-의존성 보호 효과의 표시가 있었고, 31일 동안 올리베놀을 국소 투여한 생쥐에서는 중간 정도의 투약량-의존성 보호 효과가 있었다. 이 종류의 연구에서, 평균 계산한 UVR 선량 값은 시험 전 생쥐에서 UVR 노출 후 48시간째에 1.0과 대략 동일할 것으로 예상되었다.
31일 동안 올리베놀을 경구 투여한 생쥐에서(1군에서 4군) UVR 노출 후 48시간째에 평균 계산한 UVR 선량 값은 0(비히클), 1, 10 및 100mg/kg/일의 투약군에서 각각 1.2, 1.3, 1.4 및 1.5였다. 31일 동안 올리베놀을 국소 투여한 생쥐에서(6군에서 9군) UVR 노출 후 48시간째에 평균 계산한 UVR 선량값은 0(비히클), 1, 10 및 100mg/kg/일의 투약군에서 각각 1.5, 1.5, >1.9 및 >2.2였다. 8군 및 9군에 속한 각 2 마리의 생쥐에 대해서는 UVR 노출 부위 중 어디에서도 피부 반응이 발생하지 않았기 때문에 이들 군의 평균 계산한 UVR 선량 값에는 접두사로서 기호 >이 포함되었다. 이들 4 마리의 생쥐에 대해서는 계산을 위해서 2.8의 귀속 값이 할당되었다.
UVR 노출 후 72시간째에 테스트 제품의 보호 효과는 보다 덜 한정적이었다. 그러나, 적합한 대조군(6군)에 대한 값 1.2와 비교하여, 31일 동안 100mg/kg/일의 올리베놀을 국소 투여한 생쥐(9군)에서 평균 계산한 UVR 선량은 UVR 노출 후 72시간째에 1.6이었다.
UVR 노출 후 48시간째에 6군에서의 평균 계산한 UVR 선량 값 1.5[0(비히클), 국소 투여]는 예상치 못했던 값이었다. 이 값이 약 1.0의 예상된 값보다 실질적으로 더 크기 때문에, 비히클이 UVR 노출에 대한 피부 감수성에 어떤 영향을 미쳤을 수 있다. 그러나, 0(비히클)mg/kg/일의 올리베놀을 국소 투여한 생쥐와 비교하여, 31일 동안 10과 100mg/kg/일의 올리베놀 투약량을 국소 투여한 생쥐에서는 평균 계산한 UVR 선량 값에 분명한 증가가 있었다.
적합한 대조군과 비교하여, 경구(5군) 또는 국소(10군) 경로에 의해 10일 동안 100mg/kg/일의 올리베놀 투약량을 투여한 무모 생쥐에서는 UVR-유도 피부 염증에 대한 보호 효과의 표시가 없었다. 10일 동안 100mg/kg/일의 올리베놀 투약량을 경구 또는 국소 투여한 생쥐들에서, UVR 노출 후 48시간째에 평균 계산한 UVR 선량 값은 각각 1.0 및 1.3이었다. 이들 값은 적합한 0(비히클)mg/kg/일 투약량 군(즉, 각각 1군 및 6군)에서 발생한 값과 비슷했다. UVR 노출 후 24시간째에 발생한 피부 반응은, 이들 반응이 그 후에 발생한 반응들보다 덜 재현가능한 경향을 보이기 때문에 테스트 제품의 보호 가능성에 대한 측정을 수행하는데 유용하다고 생각되지 않았다.
1군 및 3군에 속한 각 2 마리의 생쥐에서는 비뇨생식 궤양이 발생했다. 6군 및 7군에 속한 각 1 마리의 생쥐에서는 덩어리(들)이 발생했다. 이들은 수컷 무모 생쥐에서 통상 발견되는 것으로 테스트 제품과는 무관한 것으로 생각되었다. 검시에서는 모든 조직이 정상인 것으로 밝혀졌다. 실험 프로토콜 내내 관찰된 체중 및 체중 변화는 두드러진 바 없었다.
31일 동안 올리베놀을 경구 투여한 수컷 무모 생쥐에서 UVR-유도 피부 염증에 대한 적은 투약량-의존성 보호 효과의 표시가 있었고, 31일 동안 올리베놀을 국소 투여한 생쥐에서는 중간 정도의 투약량-의존성 보호 효과가 있었다. 100mg/kg/일의 높은 올리베놀 투약량은 경구 및 국소 투여 경로에 의해 피부를 보호할 수 있었다.
경구 및 국소 경로에 의해 10일 동안 100mg/kg/일의 올리베놀 투약량을 투여한 무모 생쥐에서는 UVR-유도 피부 염증에 대한 보호 효과의 표시가 없었다.
발명의 상세한 설명 및 상기 제시된 실시예에 비추어, 본 발명의 몇 가지 양태들이 달성될 수 있다는 것이 인정될 수 있다.
본 발명이 본원 발명, 그의 원리 및 그의 실제적 응용과 함께 당업자들이 알 수 있도록 예시 및 실시예의 방식으로 설명되었다는 것이 이해되어야 한다. 더 나아가, 앞서 기술된 본 발명의 특정한 구체예들은 본 발명을 모두 설명하거나 또는 제한하려 의도되지 않으며, 많은 변경, 변형 및 변화가 전술한 실시예와 상세한 설명에 비추어 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항들의 정신 및 범위 내에 들어가는 모든 그러한 변경, 변화 및 변형들을 포함하도록 의도된다. 상기 실시예 및 설명 중 일부는 본 발명이 기능할 수 있는 방식에 대한 어떤 결론을 포함하지만, 본 발명자들은 이들 결론 및 기능에 의해 결부되는 것을 의도하는 것이 아니라 그들은 단지 가능한 설명으로서 제시되었을 뿐이다.

Claims (30)

  1. (a) 올리브로부터 식물수를 제조하는 단계;
    (b) 식물수에 산을 첨가함으로써 산성화된 식물수를 제조하는 단계;
    (c) 식물수에 원래 존재하는 올레유로페인의 적어도 50%가 히드록시티로졸로 전환될 때까지의 기간 동안 산성화된 식물수를 배양하는 단계
    를 포함하는 히드록시티로졸-풍부 조성물의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 식물수에 원래 존재하는 올레유로페인의 적어도 75%가 히드록시티로졸로 전환될 때까지 상기 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 적어도 2개월 동안, 그리고 식물수에 원래 존재하는 올레유로페인의 적어도 90%가 히드록시티로졸로 전환될 때까지 상기 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 식물수는 씨를 뺀 올리브 육질 또는 과육으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 식물수가 약 1:1 내지 약 200:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 가질 때까지 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 식물수가 약 4:1 내지 약 200:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 가질 때까지 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 식물수가 약 10:1 내지 약 100:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인의 중량비를 가질 때까지 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 식물수가 약 3:1 내지 약 50:1의 히드록시티로졸 대 티로졸의 중량비를 가질 때까지 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 식물수가 약 5:1 내지 약 30:1의 히드록시티로졸 대 티로졸의 중량비를 가질 때까지 배양 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 배양된 식물수를 분별하여 히드록시티로졸과 다른 성분들을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 배양된 식물수를 유기용매로 추출하여 히드록시티로졸 풍부 부분을 20% 이상 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 크로마토그래피에 의한 히드록시티로졸 정제 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 유기용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 약 1 내지 약 5의 pH를 생성하는데 효과적인 양으로 상기 산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 약 2 내지 약 4의 pH를 생성하는데 효과적인 양으로 상기 산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 산은 시트르산인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항의 방법에 의해 제조된 히드록시티로졸-풍부 조성물을 포함하는 주사가능한 제제.
  18. 약 1:1 내지 약 200:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인 중량비를 갖는 치료제의 약학적 유효량을 피부보호가 필요한 피험체에게 경구 투여하는 것을 포함하는 자외선(UVR) 노출의 유해효과에 대한 피부보호 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 중량비는 약 4:1 내지 약 100:1 임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 중량비는 약 10:1 내지 약 50:1 임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 피험체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 치료제는
    (a) 올리브로부터 식물수를 제조하는 단계;
    (b) 약 1 내지 약 5의 pH를 생성하는데 효과적인 양으로 식물수에 산을 첨가하는 단계;
    (c) 식물수에 원래 존재하는 올레유로페인의 적어도 75%가 히드록시티로졸로 전환될 때까지 산성화된 식물수를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 치료제를 건조시켜서 분말 추출물을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 치료제는 정제, 캡슐 또는 알약의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 치료제는 액체 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 약 1:1 내지 약 200:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인 중량비를 갖는 치료제의 약학적 유효량을 피부보호가 필요한 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 자외선(UVR) 노출의 유해효과에 대한 피부보호 방법으로서, 상기 치료제는 국소 도포용 일광차단제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 실질적으로 정제된 히드록시티로졸이나 또는 히드록시티로졸과 올레유로페인의 실질적으로 정제된 혼합물의 약학적 유효량을 피부보호가 필요한 피험체에게 경구 투여하는 것을 포함하는 자외선(UVR) 노출의 유해효과에 대한 피부보호 방법.
  28. 자유 라디칼을 소거하는데 효과적인 양으로 올리브 폴리페놀을 포함하며, 상기 올리브 폴리페놀은 약 1:1 내지 약 200:1의 히드록시티로졸 대 올레유로페인 중량비로 이루어진 것을 특징으로 하는 경구 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 중량비는 약 4:1 내지 약 100:1 임을 특징으로 하는 경구 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 중량비는 약 10:1 내지 약 50:1 임을 특징으로 하는 경구 조성물.
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