JP2005532398A - オリーブ植物水由来のヒドロキシチロソール富化組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、オリーブ由来のヒドロキシチロソールを提供する。本発明の１つの局面に従って、植物水は、オリーブから収集される。酸が、植物水を安定化し、発酵を妨げるために添加される。この混合物を、オレウロペインがヒドロキシチロソールに変換するようにインキュベートし、次いでヒドロキシチロソールを他の成分から分離するために分画される。このヒドロキシチロソールは、種々の健康目的（皮膚損傷の処置を含む）のための治療剤および抗酸化剤として有用である。加えて、このヒドロキシチロソールは、農業および害虫制御適用のための天然の抗細菌産物、抗ウイルス産物、殺菌産物として有用である。

Description

（発明の分野）
本発明は、ポリフェノールとして公知である、オリーブ植物の果実および葉に存在する一群の化合物のフェノール類画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に関する。詳細には、本発明は、少量のオレウロペインおよびチロソールを含むかまたはそれらを実質的には含まない、ヒドロキシチロソール（３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール）を含有しているオリーブ抽出物、ならびにこれを得るための方法およびこのような化合物の使用方法を提供する。

（参考文献）

（発明の背景）
大量の食事による脂肪は、いくつかの疾患の発症に関係している（Ｏｗｅｎら、２０００ｃ）。アテローム性動脈硬化症（Ｋｕｌｌｅｒ、１９９７）および冠状動脈性心疾患（Ｇｅｒｂｅｒ、１９９４）、ならびに乳癌（Ｌａ Ｖｅｃｃｈｉａら、１９９８）、前立腺癌（Ｃｈａｎら、１９９８）、卵巣癌（Ｒｉｓｃｈら、１９９４）、および結腸癌（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＤｏｌｌ、１９７５）はそれぞれ、増大した食事による脂肪に関係している。しかし、これが量だけに関係するのではなく、食事による脂肪の型にも関連し、これがいくつかの癌の病因において重要であることを、証拠は示している（Ｂａｒｔｓｃｈら、１９９９）。

地中海料理の主な脂肪成分であるオリーブ油は、冠状動脈性心疾患（Ｏｗｅｎら、２０００ｂ；Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙら、１９９０；ＭａｔｔｓｏｎおよびＧｒｕｎｄｙ、１９８５）および特定の癌（ｄ’ＡｍｉｃｉｓおよびＦａｒｃｈｉ、１９９９；Ｂｒａｇａら、１９９８；Ｍａｒｔｉｎ−Ｍｏｒｅｎｏら、１９９４）の低い発病率に関連している。いくつかの研究室が、オリーブ油のフェノール類オレウロピンおよび他のファミリーのメンバーの加水分解によって強力な化学的防御活性を有する小さいフェノール類成分を誘導することを報告している（Ｏｗｅｎら、２０００ａ；Ｍａｎｎａら、２０００）。詳細には、オリーブ油のフェノール類ヒドロキシチロソールは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化（ＶｉｓｉｏｌｉおよびＧａｌｌｉ、１９９８）、血小板の凝集（Ｐｅｔｒｏｎｉら、１９９５）を妨げ、そして５−リポキシゲナーゼおよび１２−リポキシゲナーゼを阻害する（ｄｅ ｌａ Ｐｕｅｒｔａら、１９９９；Ｋｏｈｙａｍａら、１９９７）。ヒドロキシチロソールはまた、ペルオキシ硝酸塩依存性のＤＮＡ塩基の改変およびチロシンニトロ化に対して阻害作用を発揮することも見出されており（Ｄｅｉａｎａら、１９９９）、そしてこれは種々のヒトの細胞系における反応性酸素種によって誘導される細胞毒性を中和する（Ｍａｎｎａら、２０００）。最後に、複数の研究が、ヒドロキシチロソールが、経口摂取後にヒトにおいて用量に依存して吸収されることを示しており、このことはそのバイオアベイラビリティを示している（Ｖｉｓｉｏｌｉら、２０００）。

従来は、オリーブ油の生成は、濃厚なペーストを生じるための、種を含むオリーブの粉砕を含む。この手順の間、粉砕されたオリーブは連続的に水で洗浄される。このプロセスは「練和」として知られている。次いで、ペーストは油成分を搾り出すために機械で圧搾される。オリーブ油を提供することに加えて、圧搾はまた、ペーストの水成分も搾り出す。このような洗浄工程および圧搾工程によって、「植物水（ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ ｗａｔｅｒ）」と呼ばれる相当量の水が生じる。

オリーブの種および果肉の両方ともが、水溶性のフェノール類化合物を多く含む。このような化合物は、それらの分配係数に従って練和の間にオリーブから抽出され、そして植物水となる。このことは、オリーブの果肉中で生成される種々のフェノール類化合物（例えば、オレウロペインおよびその誘導体）が植物水中に多量に見出され得る理由を説明する。同様に、オリーブの種の中で生成される多数のモノフェノール類化合物（例えば、チロソールおよびその誘導体）もまた、植物水中に多量に存在する。

ヒドロキシチロソールの強力な化学的防護活性のために、高い割合のヒドロキシチロソールを有する水性のオリーブ抽出物を生成する方法を開発することが所望される。

（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）オリーブ（好ましくは、種を取り除いたオリーブの果肉（ｍｅａｔ）（または果肉（ｐｕｌｐ）））から植物水を生成する工程、（ｂ）好ましくは１〜５（より好ましくは２〜４）のｐＨを生じるための量の酸を、植物水に添加する工程、および（ｃ）植物水中にもともと存在するオレウロペインの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、そしてより好ましくは少なくとも９０％がヒドロキシチロソールに転換されるまで、酸性化した植物水をインキュベートする工程。好ましい実施形態において、酸性化した植物水は、少なくとも２ヶ月間インキュベートされ、そしてさらにより好ましくは、酸性化した植物水は、約６ヶ月〜１２ヶ月間までインキュベートされる。

１つの実施形態において、インキュベートする工程は、植物水が、１：１と２００：１、好ましくは、４：１と２００：１、より好ましくは、１０：１と１００：１との間の、ヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比を有するまで行われる。関連する実施形態において、インキュベートする工程は、植物水が、３：１と５０：１、代表的には、５：１と３０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールの重量比を有するまで、行われる。

この方法はさらに、他の成分からヒドロキシチロソールを分離するために、インキュベートした植物水を分画する工程、および／またはヒドロキシチロソール中に多量に含まれる植物水を乾燥させ、乾燥させた抽出物を生成する工程を包含し得る。１つの実施形態において、インキュベートした植物水は、有機溶媒で抽出されて、ヒドロキシチロソール中２０％、または好ましくは９５％以上の、富化画分を生じる。
上記の１つ以上の実施形態により調製されるヒドロキシチロソール富化組成物を含む注射可能な組成物がまた、提供される。

別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法を含む：（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；（ｂ）酸の添加により、オレウロペインおよび他の大きなフェノール類分子を加水分解する工程；（ｃ）必要に応じて、植物水を乾燥させる工程；（ｄ）必要に応じて乾燥させた植物水を超臨界流体と接触させる工程；ならびに（ｅ）接触させた植物水からヒドロキシチロソール富化組成物を回収する工程。１つの実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９５重量％のヒドロキシチロソールを含む。別の実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９７重量％のヒドロキシチロソールを含む。なお別の実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、少なくとも約９９重量％のヒドロキシチロソールを含む。

別の局面において、ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；（ｂ）酸の添加により、オレウロペインおよび他の大きなフェノール類分子を加水分解する工程；（ｃ）必要に応じて、植物水を乾燥させる工程；（ｄ）植物水を適切な有機溶媒（例えば、酢酸エチル（ＥｔＡｃ））で抽出する工程；ならびに（ｅ）全フェノール類画分の９５％以上の純度でヒドロキシチロソールを含む画分を回収する工程。１つの実施形態において、ヒドロキシチロソール富化組成物は、約９５重量％のヒドロキシチロソールを含む少なくとも２０％のフェノール類画分を含む。１つの実施形態において、ＥｔＡｃ画分が、シリカゲルクロマトグラフィーまたは他のゲルクロマトグラフィーにより精製されて、９５重量％以上のヒドロキシチロソールを含むヒドロキシチロソール画分を得る。

１つの実施形態において、上記の回収工程は、以下の工程を包含する：（ａ）超臨界流体を回収する工程であり、ここで、超臨界流体はヒドロキシチロソールを含む工程；および（ｂ）超臨界流体を蒸発させ、ヒドロキシチロソール富化組成物を抽出する工程。別の実施形態において、上記の接触工程は、以下の工程を包含する：（ａ）圧力下のモジュール中で反対側を有する多孔性膜を提供する工程であり、この膜は、液体と濃縮気体との間のバリア界面として作用し、この膜は上記のヒドロキシチロソールについて非選択的である、工程；（ｂ）膜の一方のモジュールに超臨界流体および膜の反対側に植物水を提供する工程；および（ｃ）植物水と超臨界流体との間のヒドロキシチロソールの濃度勾配によって駆動されるにつれて膜を通過する、ヒドロキシチロソールを抽出する工程。１つの実施形態において、多孔性膜は、中空繊維膜である。別の実施形態において、超臨界流体は二酸化炭素である。

別の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法を含む：（ａ）オリーブから植物水を生成する工程；（ｂ）酸の添加により、オレウロペインおよび他の大きなフェノール類分子を加水分解する工程；ならびに（ｃ）酸性化した植物水を噴霧乾燥（すなわちエバポレート）させ、それによりヒドロキシチロソールを含む粉末を得る工程。別の実施形態において、上記のエバポレーション工程は、マルトデキストリンの酸性化した植物水への添加により実施され、好ましくは、約１％〜５％のヒドロキシチロソールを含む粉末、そしてより好ましくは、約２％のヒドロキシチロソールを含む、粉末を生じる。
別の局面において、本発明は、オリーブの水性抽出物を含有している栄養補助食品を含む。これは、４：１と２００：１との間、代表的には、１０：１と１００：１との間の、ヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比で含まれる。

関連する局面において、本発明は、オリーブの水性抽出物を含有している栄養補助食品を含む。これは、３：１と５０：１との間、代表的には、５：１と３０：１との間のヒドロキシチロソールとチロソールの重量比で含まれる。

上記の補助食品は、（好ましくは、噴霧乾燥によって）乾燥され、粉末抽出物を提供し得る。これは、錠剤、カプセル、丸剤、または糖剤食品添加物に処方され得る。あるいは、上記の補助食品は、薬学的処方物（例えば、ヒドロキシチロール富化注射可能処方物）中に組み込まれ得る。
紫外線放射（ＵＶＲ）に対する曝露の悪影響に対して皮膚を保護する方法がまた提供される。この方法は、このような保護を必要とする被験体に約１：１と約２００：１との間、好ましくは、約４：１と約１００：１との間、そしてより好ましくは、約１０：１と約５０：１との間のヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比を有する薬学的有効量の治療剤を投与する工程を包含する。この治療剤はまた、局所的適用のための日焼け止めを含み得る。１つの実施形態において、この治療剤は、局所的に投与される。好ましくは、この薬剤は、経口投与される。

本発明のこれらおよび他の局面および特徴は、以下の発明の詳細な説明が添付の図面および表と組合せて読まれる場合に、より完全に理解される。
（発明の詳細な説明）
個々の刊行物、特許、特許出願または参考文献が参考として援用されることが特にかつ個別に示されるように、本願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願または他の参考文献が、本明細書中でその全体が参考として援用される。

（Ｉ．定義）
他に示されなければ、本明細書中で使用される全ての用語は、それらが本発明の分野で習熟されているものと同じ意味を有する。本発明が、これらが変更し得るように、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬には限定されないことが理解されるべきである。

「オレウロペイン」によって、セコイリドイドグルコシドオレウロペイン（図１の構造ＩＩ）が意図される。

「チロソール」によって、４−ヒドロキシフェネチルアルコール（図１の構造ＶＩＩ）が意図される。

「ヒドロキシチロソール」によって、３，４−ジヒドロキシフェネチルアルコール（図１の構造ＶＩＩＩ）が意図される。

（ＩＩ．発明の方法）
本発明は、１つの局面において、オリーブ由来植物水からのヒドロキシチロソール富化組成物を提供する。以下に記載するような特定の条件下で、ヒドロキシチロソールがオリーブの植物水から得られ得ることが発見されている。本発明の実行の工程を、以下に検討する。

（Ａ．植物水の生成）
本発明の方法は、生長植物のような便利でかつ市販の供給源から得ることができるオリーブを使用する。好ましくは、植物水は、種を取り除かれたオリーブから得られる。本明細書中で開示される方法にしたがって処理されたオリーブは、任意の適切な手段によって種を取り除かれ得る。オリーブの種は、植物水中の所望されない成分であり、そして以下に記載される酸処理によってはあまり分解され得ないチロソールを含む。種は、果肉から手作業で、または以下に記載されるように自動化された様式で分離され得る。好ましくは、このような手段は、オリーブを傷つけることなく種を分離することが可能でなければならず、そうでなければ、植物水中でより高濃度のチロソールを生じ得る。別の実施形態において、ヒドロキシチロソールは、種を取り除かれていないオリーブから得られる植物水から抽出される。

植物水を生成するために、オリーブに由来するオリーブの果肉は、最初に、オリーブ油、植物水、および固形物である副生成物を含む液体相混合物を得るために圧搾される。その後、植物水は、液体相の混合物の残りから分離され、そして回収される。植物水を得る例示的な方法は、両方ともＲ．Ｃｒｅａに対する、共有に係る米国特許出願番号第６，１６５，４７５号および同第６，１９７，３０８号に記載されている。これらのそれぞれが、それらの全体において本明細書中で参考として明確に援用されている。

商業的生産の目的のために、本発明の種々の局面を自動化することが所望され得る。これに関しては、１つの実施形態は、米国特許第４，４５２，７４４号、同第４，５２２，１１９号、および同第４，３７０，２７４号（それぞれ、Ｆｉｎｃｈらに対するものであり、そしてそれぞれが本明細書中で参考として明確に援用されている）に開示されるような装置の使用を企図する。簡潔には、Ｆｉｎｃｈらは、オリーブからオリーブ油を回収するための装置を教示する。最初に、オリーブは、種のないオリーブの果肉を得るために、オリーブからオリーブの種を分離する果肉採取器に送られる。次いで、果肉は、抽出スクリューによって取り上げられる。抽出スクリューは、油、水、および微量の割合のオリーブの果肉を含有している液体相を取り除くために十分な抽出圧に果肉を供する。液相がビンの中に回収され、次いでオリーブ油および植物水を含有している混合物を得るために液相から果肉を分離する、浄化遠心分離に送られる。次いで、精製遠心分離によって、植物水を実質的に含まないオリーブ油（これはタンク内に回収される）を得るために、混合物から植物水および少量の固形物を分離する。Ｆｉｎｃｈらに従うと、水は、下水溝のような処理手段に送られる。対照的に、本発明は、ヒドロキシチロソールを抽出するための植物水の回収、保存、および使用を提供する。

本発明の実施において使用され得るさらなるデバイスは、イタリア特許第１２７６５７６号および同第１２７８０２５号に開示されている。これらのそれぞれが、本明細書中で参考として明確に援用されている。上記のように、これらのデバイスは、粉砕したオリーブの果肉の、油、水、および固形残渣への処理の前に種から果肉を分離するために使用され得る。

（Ｂ．オレウロペインのヒドロキシチロソールへの転換）
本発明の１つの局面において、植物水中に含まれるオレウロペインは、ヒドロキシチロソールに転換される。植物水のｐＨは、酸の添加によって低下させられ得、そして植物水は本発明の発見に従って、オレウロペインのヒドロキシチロソールへの酸加水分解を促進する条件下でインキュベートされ得る。次いで、このサンプルは、他の化合物からヒドロキシチロソールを分離するように分画され得るか、または抽出され得る。

好ましい実施形態において、添加される酸はクエン酸である。酸は、好ましくはｐＨを１〜５（より好ましくは、２〜４）に調整するように植物水に添加される。固体のクエン酸が、約１０００ガロンの植物水あたり好ましくは約２５から５０ポンドの酸の量で、持続的に攪拌しながら添加され得る。得られる溶液のｐＨがモニターされ得、そして所望されるｐＨに到達させるために、酸のさらなる添加が必要とされ得る。クエン酸の添加後のヒドロキシチロソールへのオレウロペインの転換を示す例示的な方法は、実施例１および２に提供される。

酸はまた、クエン酸以外の有機酸または無機酸でもあり得る。本発明で使用され得る例示的な酸として、鉱酸−硫酸、硝酸、塩酸、およびリン酸−として公知の無機物質、ならびにカルボン酸、スルホン酸、およびフェノール（ベンジル）類に属する有機化合物が挙げられる。植物水への酸の添加は、いくつかの目的を果たす：（ｉ）これによって植物水をフェノール類分子の空気重合（酸化重合）から安定化させる；（ｉｉ）これによって内因性および／または外因性の細菌および酵母による植物水の醗酵を防ぐ；ならびに（ｉｉｉ）実施例１および２に示されるように、これによってオレウロペインおよびヒドロキシチロソールを含有している他の大きなフェノール類分子を加水分解し、これらのヒドロキシチロソールへの転換を提供する。実施例１および２の表１および２は、それぞれ、植物水の２つのサンプルによるデータ、およびクエン酸の添加後の、経時的なサンプル中の種々の成分の組成物のそれぞれの割合を含む。１つの実施形態において、混合物は、ヒドロキシチロソールが、オレウロペインとヒドロキシチロソールとの組合せ全体の７５〜９０％となるまでインキュベートされる。別の実施形態において、元の混合物中のオレウロペインは、実質的に残っていない。

（Ｃ．ヒドロキシチロソールの精製）
好ましくは酸の添加による、ヒドロキシチロソールへのオレウロペインの転換後、インキュベートされた植物水は、当該分野で公知の多数の方法によって分画され得る。例示的な画分方法として、有機溶媒（例えば、酢酸エチル）、クロマトグラフィー法（ゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる）、または超臨界流体での分配が挙げられる。

あるいは、酸性化後に上記のように得られた植物水は、低分子量ポリフェノール（特に、ヒドロキシチロソールならびに少量のチロソールおよびオレウロペイン）を多く含む溶液を提供する。処理された水の中でのヒドロキシチロソールの濃度は、オリーブ油の抽出の間の水の添加による稀釈度に依存して、１リットルあたり４〜５グラムから１リットルあたり１０〜１５グラムの範囲であり得る。１つの実施形態においては、本発明は、汚染物質を添加せずにヒドロキシチロソールの含有量を選択的に富化させる、抽出または精製の方法を提供する。従って、主要なポリフェノール類成分であるヒドロキシチロソールは、ポリフェノールファミリーの他のメンバー、不純物、懸濁された固形物、タンニン、および植物水中に含まれる他の分子から単離される。従って、ヒドロキシチロソールは、現在の合成または本来の抽出方法によっては容易には得ることができない純度および量で生成され得る。

超臨界流体とは、その臨界温度および臨界圧力を超えて、非常に高濃度になる、気体である。その特性は、気体と液体の特性の間にあり、それによって化合物を溶解させる能力の増大を生じる。その比較的高い密度、高い拡散率、および低い粘性によって、それが従来の液体溶媒よりも速く化合物を抽出することを可能にする。二酸化炭素は、食品および食品成分の超臨界流体処理に最も広く使用される気体である。なぜなら、これは、天然のものであり、無毒であり、不燃性であり、かつ比較的不活性であり、そして抽出された産物中に残留物を残さないからである。代表的な超臨界二酸化炭素での液体抽出は、通常は、大きな接触カラムまたは塔中の他の相に１つの相を分散させることによって行われる。ここでは、溶質を含有している流体（例えば、果汁）が重力によって下降させられ、そして超臨界二酸化炭素が上向きに流れる。質量輸送は、２つの相の間の界面で生じる。

あるいは、液体および懸濁物の連続的な抽出は、超臨界流体（例えば、二酸化炭素）、および接触カラムの代わりの多孔性膜を使用して達成され得る。相の分散の代わりに、液体は、中空繊維束または螺旋状に巻き付けられたシートのように構成された多孔性ポリプロピレン膜を通じて連続して送られる。この液体は、加圧されたモジュールの中の多孔性膜を通過する一方、超臨界二酸化炭素が膜の他の側から逆流する。モジュール内の圧力は、本質的には同じであり、その結果、抽出は、流体と超臨界二酸化炭素との間の濃度勾配によって駆動される。抽出物は、再利用のために二酸化炭素を蒸発させることによって回収され得る。超臨界二酸化炭素および多孔性膜を使用する例示的な抽出方法は、米国特許第５，４９０，８８４号に記載されている。これは、その全体において本明細書中で明確に援用されている。

二酸化炭素の代わりまたはそれと組合せられる他の超臨界流体。これらの液体としては、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、エテン、プロペン、ヒドロフルオロカーボン、テトラフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、二酸化炭素、一酸化二窒素、六フッ化イオウ、アンモニア、および塩化メチルが挙げられる。

実施例３は、本発明を支持する小規模の実験を記載する。ここでは、ヒドロキシチロソールは、超臨界二酸化炭素および多孔性膜を使用して植物水から単離された。単離されたヒドロキシチロソールのＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析は、サンプルが９７〜９９％の純度のヒドロキシチロソールであることを示す。従って、本発明は、少なくとも約８０％のヒドロキシチロソール、好ましくは、少なくとも約９０％のヒドロキシチロソール、より好ましくは、少なくとも約９５％のヒドロキシチロソール、なおより好ましくは、少なくとも約９７％のヒドロキシチロソール、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９９％のヒドロキシチロソールを含有している、ヒドロキシチロソール富化組成物を提供する。

超臨界流体での抽出の前に、植物水は、マルトデキストランおよび／またはポリプロピレンビーズのような当該分野で公知であり、溶液に添加されるキャリアを有し得；そして／またはこの溶液は乾燥され得る。乾燥工程は、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９８％の水を、植物水から除去する。

膜反応の重要な特徴は、接触表面の界面面積が、液体の粘性とは無関係に加えられ得るという事実である。従って、本発明は、抽出に使用される膜の外膜面積が少なくとも約１００平方ヤード、好ましくは、少なくとも約３００平方ヤード、そしてなおより好ましくは、少なくとも約６００平方ヤードである大規模なユニットを、大量の植物水からのヒドロキシチロソールの分離を可能にするために企図する。従って、本発明の膜システムは、１つの局面においては、１分あたり１〜２０リットルの間、好ましくは、１分あたり５〜１０リットルの間の流速に適応することが可能である。

さらなる精製方法もまた、上記の本発明に従って使用され得る。ヒドロキシチロソールのＨＰＬＣ単離は、Ｆｉｃａｒｒａら、１９９１；Ｒｏｍａｎｉら、１９９９；およびＴｓｉｍｉｄｏｕ、１９９２に記載されている。これらのそれぞれは、本明細書中で参考として明確に援用されている。

（ＩＩＩ．ヒドロキシチロソール富化栄養補助食品）
上記の方法によって産生されたヒドロキシチロソールが、種々の適用のために使用され得ることが理解されるべきである。例えば、本発明の方法によって得られたヒドロキシチロソールは、以下のように使用され得る：（ｉ）天然の殺菌剤、抗ウイルス薬、ならびに／または農業用および／もしくは害虫の制御への適用のための殺真菌性物質として、ならびに（ｉｉ）種々の健康目的のための治療薬および／または抗酸化剤として。１つの例示的な実施形態においては、ヒドロキシチロソールは、哺乳動物の被験体（例えば、ヒドロキシチロソールに付随する１つ以上の利点を要求する個体）に投与される。

従って、紫外光放射（ＵＶＲ）に対する暴露から生じる皮膚への損傷の保護のための組成物および方法が、本明細書中で提供される。本発明の方法によって得られたヒドロキシチロソールは、経口でまたは非経口的に投与され得る。経口の投与形態は、固体または液体の形態であり得る。このような投与形態は、精製されたヒドロキシチロソールから処方され得るか、またはこれらは、水性抽出物もしくは水−アルコール性抽出物から処方され得る。後者に関して、水性抽出物または水−アルコール性（例えば、水または水−エタノール）抽出物は、他の薬学的に受容可能なキャリアとともに経口投与形態に処方され得る乾燥粉末を提供するように、噴霧乾燥させられ得る。水性抽出物または水−アルコール性抽出物は、４：１と２００：１との間、好ましくは、約１０：１と約１００：１との間の、種々の重量比のヒドロキシチロソールとオレウロペインを含むように処方され得る。抽出物はまた、約２：１と約５０：１との間、好ましくは、約５：１と約３０：１との間の、種々の重量比のヒドロキシチロソールとチロソールとを含むように処方され得る。

好ましくは、この組成物は、ＵＶＲへの暴露から生じる皮膚損傷に対して保護の必要な患者に経口投与され得る。本発明に従う固形の経口投与形態の組成物は、薬学分野で周知の様式で調製され、そして少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされたヒドロキシチロソールを含む。このような組成物の作製においては、ヒドロキシチロソール富化組成物（実質的に純粋な形態、または未処理の留出物もしくは抽出物の成分のいずれかとして）が、通常は、キャリアと混合されるか、キャリアで稀釈されるか、またはキャリアで封入される。このキャリアは、固体形態、半固体、または液体物質であり得、これは、有効成分についてビヒクル、キャリア、または媒体として作用する。あるいは、キャリアは、経口投与を容易にするためのカプセルまたは他の容器の形態であり得る。従って、本発明に従う投与のための固体の経口投与形態は、錠剤、丸剤、散剤、または軟ゼラチンカプセルもしくは硬ゼラチンカプセルの形態であり得る。

あるいは、経口投与のための本発明に従って得られたヒドロキシチロソールは、液体形態であり得、ここで薬学的に受容可能なキャリアは、水または水−アルコール性媒体である。

本発明の投与のための組成物はまた、他の一般的な薬学的に受容可能な賦形剤（ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガム、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、アルコールなどを含む）とともに処方され得る。処方物は、さらに、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、保存料（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル）、甘味料または香料を含有し得る。さらに、本発明の組成物は、被験体への投与後の有効成分の迅速な放出、徐放、または遅延させられた放出を提供するように、処方され得る。

本発明に従う使用のための非経口用の処方物は、当該分野の標準的な技術を使用して調製される。本明細書中で使用される用語「非経口の」は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、胸骨内注射、または注入技術を含む。これらの処方物は、一般的には、非経口的に受容可能なキャリア（例えば、等張生理食塩水）を使用して滅菌の注射可能溶液として、または被験体への投与前の滅菌緩衝液もしくは等張生理食塩水での再構成のために調製された滅菌のパッケージされた散剤として、調製される。１つの好ましい実施形態において、非経口処方物は、本発明の１ｍｇ／ｍｌと５００ｍｇ／ｍｌとの間のヒドロキシチロソール富化組成物を含む注射可能な処方物である。より好ましくは、注射可能な処方物は、１ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌの間のヒドロキシチロソール富化組成物、さらにより好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌの間のヒドロキシチロソール富化組成物を含み、そして最も好ましくは、約１０ｍｇ／ｍｌのヒドロキシチロソール富化組成物を含む。

上記から、本発明のいかに種々の目的および特徴が満たされるかがわかる。当業者は、本発明の広範囲の教示が種々の形態で実施され得ることを、上記の記載からここで理解することができる。従って、本発明は、特定の実施形態およびその実施例と組合せて記載されているが、本発明の真の範囲はそのようには限定されるべきではない。種々の変更および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義される通りに本発明の範囲を逸脱することなく行われ得る。

以下の実施例は、本発明に従うヒドロキシチロソール富化組成物の産生方法を例示する。実施例は、本発明を説明するように意図され、決して本発明の範囲を限定するようには意図されない。

（実施例１）
（約２５ポンドのクエン酸／１０００ガロンの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）
表１は、１０００ガロンの植物水あたり約２５ポンドのクエン酸の添加後の、経時的なオレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換を示す。表１中の割合は、溶液中の全フェノール化合物の重量パーセンテージとして示される。表１に示すように、ヒドロキシチロソールは、１２ヶ月後に溶液中のフェノール化合物の８０％より多くを構成する。
（表１）
（約２５ポンドのクエン酸／１０００ガロンの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）

（実施例２）
（約５０ポンドの酸／１０００ガロンの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）
表２は、１０００ガロンの植物水あたり約５０ポンドのクエン酸の添加後の、経時的なオレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換を示す。表２のパーセンテージは、溶液中の全フェノール化合物の重量パーセンテージとして示される。有意に、表２に示すように、ヒドロキシチロソールは、２ヶ月後に溶液中のフェノール化合物の４５％より多くを構成する。

（表２）
（約５０ポンドの酸／１０００ガロンの添加後の、オレウロペインからヒドロキシチロソールへの転換）

（実施例３）
（植物水からのヒドロキシチロソールの抽出）
約４０ｍｇの乾燥固体（マルトデキストラン）を含有している植物水のアリコート（０．５ｍｌ）をポリプロピレン多孔性ビーズと混合し、そして乾燥させた。乾燥混合物を、超臨界二酸化炭素（ＰｏｒｏＣｒｉｔ，ＬＬＣ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）での抽出に使用した。収集したサンプル（約２．０ｍｇ）をＨＰＬＣによって分析した。サンプルのプロフィールを図２に示し、そして表３は、主要ピーク下の面積が９７％であることを示す。合成ヒドロキシチロソールをサンプルに添加しそしてＨＰＬＣによって分析した場合には、図３に示すような１つの主要なピークが現れ、これはサンプルの主生成物がヒドロキシチロソールであることを示している（表４）。

（表３）
（図２のＨＰＬＣ結果のピーク分析）

（表４）
（図３のＨＰＬＣ結果のピーク分析）

（実施例４）
（酸性化した植物水からのヒドロキシチロソールの抽出）
酸性の加水分解後の植物水のアリコート（１リットル）を、振盪フラスコ中で酢酸エチルと力強く振盪させた。有機溶媒を、水溶液から分離し、そしてロータリーエバポレーターにより蒸発させた。生じた濃い油（約２０ｇ）を、収集し、ＨＰＬＣにより分析した。このサンプルのプロフィールを、図５に示し、そして表５は、主要ピークの面積が９７．４５７％であることを示し、ヒドロキシチロソールが水中の約９５％または９５％を超える総ポリフェノール類画分を表すことを示す。標準的な比色計アッセイによる総フェノールの測定は、ヒドロキシチロソールがおよそ２０重量％で油中に含まれることを示す。

（表５）
（図５のＨＰＬＣ結果のピーク分析）

この画分は、ゲルクロマトグラフィーによるヒドロキシチロソールのさらなる精製のために使用される。乾燥シリカ（１５０ｇ）が、酢酸エチル（３００ｍｌ）中に懸濁して、濃いスラリーを得た。このスラリーを、ガラスカラム中に注ぎ込み、そしてシリカを、１５分間置いて、沈殿させた。約２０％（４ｇ）のヒドロキシチロゾールを含む濃い油を、２５ｍｌの酢酸エチル中に溶解し、シリカゲル上にゆっくりと注いだ。ヒドロキシチロソールの精製が、生成物の引力溶出により、そして溶媒としての酢酸エチルの追加により達成された。純粋なヒドロキシチロソールを含む画分が、一緒に収集され、そしてプールされた。この溶媒を、黄色油が生成するまで蒸発した。図６および表６に示されるように、この油は、ＨＰＬＣおよび質量分光法により確かめられるように、本質的に純粋なヒドロキシチロソール（９７％〜９９％）である。この精製の収量は、約２．８ｇ〜３．０ｇのヒドロキシチロソール、すなわち、約６５％である。

（表６）
（図６のＨＰＬＣ結果のピーク分析）

図７に示されるような実施例３および４の２つの手段により記載されるように得られたサンプルの質量スペクトロメトリーが、主な生成物がヒドロキシチロソールであることを確かめた。このサンプルを、メタノールで１ミリリットル当たり２６μｇの最終濃度に希釈し、そしてＥＳＩプローブをはめ込んだＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱのネガティブイオン化モードで分析した。この注入は、統合されたシリンジポンプを使用して１分当たり３μｌであった。温度は、２７０Ｃであり、針電圧は＋４．２Ｖであり、シースガスは４５ユニットであり、そして補助ガスは、１０ユニットであった。このヒドロキシチロソールの画分経路は、図８に示される。図７に見られ得るように、ヒドロキシチロソール（質量／電荷 １５３．１）およびその画分化産物（１２３．１および１０５．１質量／電荷）が、多段階スペクトルにおいて大量にある生成物の大部分を証明する。

（実施例５）
（紫外放射からの皮膚損傷に対する保護）
（Ｏｌｉｖｅｎｏｌ組成物）
試験物は、Ｏｌｉｖｅｎｏｌ（ロット番号１Ａ−１Ｂ）である。Ｏｌｉｖｅｎｏｌは、植物水（５００ｍｌ）の酸性の加水分解により得られる未精製の水調製物であり、ロータリーエバポレーターにより乾燥するまで蒸発され、続いて凍結乾燥される。試験物ビヒクルは、水性０．５％ｗ／ｖのメチルセルロース（経口投与）およびメチルアルコール、９９．９％ Ａ．Ｃ．Ｓ．分光光度的等級（局所的投与）であった。処方物は、研究の間に一旦調製され、そして試験物は、用量計算の目的に対して７５％活性であると考えられた。

（マウス）
百匹の雄のＣｒｌ：ＳＫＨ１−ｈｒＢＲへアレスマウス（供給源：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔａｇｅ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ ＵＳＡ）が、表１に示されるように群ごとに１０匹のマウスがいる、１０の投薬群（群１〜１０）に無作為に割り当てられた。雄のマウスの体重は、１７〜２８グラムにわたる。

（表５：実験設計）

^＊群１〜５：投薬用量＝１０ｍＬ／ｋｇ
群６〜１０：投薬および濃度は、２５ｇのマウスの体重および０．１ｍＬ／マウスの投与容量（すなわち、１００ｍｃＬ／マウス）を仮定する。

（Ｏｌｉｖｅｎｏｌ組成物の投与およびＵＶＲ曝露）
処方物が、３１日間連続して（群１〜４）または１０日間連続して（群５）のいずれかで、毎日一回適当なマウスに（胃管栄養法により）経口投与された。処方物が、３１日間連続して（群６〜９）または１０日間連続して（群１０）のいずれかで、毎日一回適当なマウスに局所投与された（１００ｍｃＬ／マウス）。

処方物投与の２８日目（群１〜４および６〜９）または７日目（群５および１０）において、群１〜１０のマウスは、ＵＶＲ（すなわち、電磁スペクトルのＵＶＢ部分およびＵＶＡ部分における波長）に曝露された。放射の供給源は、Ｏｒｉｅｌライトパイプと接続されたＷＧ３２０ Ｓｃｈｏｔｔ ガラスファイバー（１ｍｍ）を有するＢｅｒｇｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ Ａｒｃ 高強度ソーラシミュレータ（Ｓｏｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）であった。供給源の放射強度は、ＰＭＡ２１００メーター（Ｓｏｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）または匹敵するデバイスと共に連続的にモニターされた。２８日目または７日目に、処方物投与とＵＶＲ曝露の開始との間の間隔は、ほとんどのマウスについて１５分未満であり、そして少数のマウスについて１５分よりわずかに長かった。

生存率についての確認は、一日２回行った。臨床的観察が、最初の処方物投与前に一回と、ＵＶＲ曝露直前の一回を含めて、少なくとも毎週記録された。臨床的観察はまた、放射後およそ２４時間、４８時間および７２時間で観察された。体重が、投与期間の間、毎週一回および末期の屠殺で記録された。

（マウスの屠殺）
全ての生き残っているマウスが、屠殺する予定である。予定された屠殺は、最後の試験の後で、ＵＶＲ曝露の完了後およそ７２時間で行った（ＣＯ_２窒息死）。ＵＶＲ曝露部位を含む背部皮膚を除去し、可能性のある病理組織学的試験のために中性緩衝化１０％ホルマリン中に保持した。

計算された平均ＵＶＲ線量レベル（ＭＥＤ）および標準偏差が、以下のような適当な群について測定された。曝露部位にて任意の皮膚応答を引き起こす最も低い機器ＵＶＲ線量が、各々のマウスについて測定された。各々の観察時点についての各々の群に対する平均の計算されたＵＶＲ線量が、決定された。試験物品の投与が、皮膚応答を惹起するのに必要とされるＵＶＲ線量における影響がない場合、この計算方法に基づいて、１．０ＭＥＤと等価な平均の計算されたＵＶＲ線量値が、放射後４８時間で予期される。１．０より大きい平均の計算されたＵＶＲ線量は、試験物品の保護効果を示す。任意の６つのＵＶＲ曝露部位において皮膚反応を有さない任意のマウスについて、２．８の入力された値が、計算の目的のために指定され、＞の記号は、群の平均の計算されたＵＶＲ線量値に対する接頭辞として含まれる。さらに、比（臨床観察）および標準偏差を有する平均（体重）が、計算された。

群の平均および標準偏差は、体重および体重変化について計算され、そして表にまとめられた。

（結果）
ＵＶＲ曝露部位に生じる皮膚反応は、紅斑、浮腫およびフレーキングを含み、そして皮膚反応の重篤度は、ＵＶＲ曝露線量に依存する傾向がある。

３１日間Ｏｌｉｖｅｎｏｌを経口投与されたヘアレスマウスにおけるＵＶＲ誘導された皮膚炎症に対する軽度の線量依存保護効果および３１日間Ｏｌｉｖｅｎｏｌを局所投与されたマウスにおける中程度の線量依存保護効果のしるしが、存在した。この研究の型において、平均の計算されたＵＶＲ線量値が、ナイーブマウスにおけるＵＶＲ曝露後の４８時間での１．０にほぼ等しいことが、予期される。

３１日間Ｏｌｉｖｅｎｏｌを経口投与されたマウスにおいて（群１〜４）、ＵＶＲ曝露後４８時間での平均の計算されたＵＶＲ線量値は、０（ビヒクル）ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、および１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬群においてそれぞれ、１．２、１．３、１．４、および１．５であった。３１日間、Ｏｌｉｖｅｎｏｌを局所投与されたマウスにおいて（群６〜９）、ＵＶＲ曝露後４８時間での平均の計算されたＵＶＲ線量値は、０（ビヒクル）ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日および１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬群においてそれぞれ、１．５、１．５、＞１．９および＞２．２であった。記号＞は、群８および群９における平均の計算されたＵＶＲ線量値に対する接頭辞として含まれる。なぜなら、これらの群の各々における２匹のマウスについて、任意のＵＶＲ曝露部位において皮膚反応が生じないためである。これらの４匹のマウスについて、入力された値２．８が、計算の目的のために指定された。

ＵＶＲ曝露後７２時間では、試験物品の保護効果は、あまり決定的ではない。しかし、３１日間の間１００ｍｇ／ｋｇ／日Ｏｌｉｖｅｎｏｌを局所投与されたマウス（群９）において、平均の計算されたＵＶＲ線量は、適当なコントロール群（群６）について１．２の値であったのに対して、ＵＶＲ曝露後７２時間で１．６であった。

ＵＶＲ曝露後４８時間での群６［０（ビヒクル）、局所的投与］における１．５の平均の計算されたＵＶＲ線量値は、予期されてなかった。この値が、およそ１．０の予期された値より実質的に大きいために、ビヒクルは、ＵＶＲ曝露に対する皮膚感受性においていくらかの影響を有し得る。しかし、Ｏｌｉｖｅｎｏｌを局所的に０（ビヒクル）ｍｇ／ｋｇ／日で投与されたマウスと比較して、３１日間の間１０ｍｇ／ｋｇ／日および１００ｍｇ／ｋｇ／日のＯｌｉｖｅｎｏｌを局所投与されたマウスにおける平均の計算されたＵＶＲ線量値における明らかな増加が存在した。

適当なコントロール群と比較して、１０日間の間経口経路を介して（群５）または局所的経路を介して（群１０）１００ｍｇ／ｋｇ／日のＯｌｉｖｅｎｏｌ投薬量を投与されたヘアレスマウスにおいて、ＵＶＲ誘導された皮膚炎症に対する保護効果のしるしは、存在しなかった。１０日間の間、１００ｍｇ／ｋｇ／日のＯｌｉｖｅｎｏｌ投薬量を経口的にまたは局所的に投与されたマウスにおいて、ＵＶＲ曝露後４８時間での平均の計算されたＵＶＲ線量値は、それぞれ１．０または１．３であった。これらの値は、適当な０（ビヒクル）ｍｇ／ｋｇ／日投薬群（すなわち、群１〜６、それぞれ）において生じた値に匹敵した。

ＵＶＲ曝露後２４時間で生じた皮膚反応は、試験物品の保護可能性の決定を行う際に有用であるとは考えられなかった。なぜなら、これらの反応は、その後に起こるものと比べてあまり再現可能でない傾向にあるためである。

群１および群３の各々における２匹のマウスが、泌尿生殖器潰瘍を発達させた。群６および７のそれぞれの１匹のマウスは、塊を発達させた。これらは、雄のヘアレスマウスにおいて一般的に見出されることであり、試験物品に関連しているとは考えられなかった。剖検により、全ての組織が正常に見られたことが明らかとなった。実験プロトコールにわたって観察された体重および体重変化は、注目すべきものではなかった。

３１日間Ｏｌｉｖｅｎｏｌを経口投与された雄のヘアレスマウスにおけるＵＶＲ誘導された皮膚炎症に対する軽度の用量依存保護効果および３１日間Ｏｌｉｖｅｎｏｌを局所投与されたマウスにおける中程度の用量依存保護効果のしるしが、存在した。高いＯｌｉｖｅｎｏｌ投薬量、１００ｍｇ／ｋｇ／日が、経口投与経路および局所投与経路を介して、皮膚保護を与えた。

１０日間にわたって経口経路または局所経路を介して１００ｍｇ／ｋｇ／日Ｏｌｉｖｅｎｏｌを投与されたヘアレスマウスにおいて、ＵＶＲ誘導された皮膚炎症に対する保護効果のしるしは、存在しなかった。

上に示された本発明の詳細な説明および実施例の下で、本発明の種々の局面が達成されることが、理解され得る。

本発明が、当該分野の他の人々に本発明、本発明の原理、および本発明の実際的な適用を知らせるために、例示および例により、詳細に記載されたことが理解される。さらに、示される本発明の特定の実施形態は、本発明を網羅または限定するよう意図されず、そして多くの代替物、改変、および変更が、前述の実施例および詳細な説明のもとで当業者に明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内で、全てのこのような多くの代替物、改変、および変更を含むよう意図される。上記の実施例および記載のいくらかが、本発明が機能し得る方法についてのいくらかの結論を含む一方、本発明者らは、これらの結論および機能により束縛されることを意図せず、これらを可能性のある説明としてのみ提示する。

図１は、オリーブ油中で検出される以下のフェノール類化合物およびそれらの前駆体の構造を示す：リグストロシド（ｌｉｇｓｔｒｏｓｉｄｅ）（Ｉ）；オレウロペイングルコシド（ＩＩ）；リグストロシドのアグリコン（ＩＩＩ）；オレウロペイングルコシドのアグリコン（ＩＶ）；カルボキシメチル基を欠失したリグストロシドアグリコンのジアルデヒド形態（Ｖ）；カルボキシメチル基を欠失したオレウロペイングルコシドアグリコンのジアルデヒド形態（ＶＩ）；チロソール（ＶＩＩ）；ヒドロキシチロソール（ＶＩＩＩ）。 図２は、種を取り除かれたオリーブの果肉から得られる植物水からの超臨界二酸化炭素抽出後の、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図３は、合成のヒドロキシチロソールを用いた、超臨界二酸化炭素抽出後の本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図４は、種を抜かれたオリーブの果肉から得られる植物水の酸性加水分解後の、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図５は、種を抜かれたオリーブから得られ、そして酸添加により加水分解された植物水由来のヒドロキシチロソールの酢酸エチル抽出後の、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物のＨＰＬＣ分析を示す。 図６は、シリカゲル上のゲルクロマトグラフィーによる精製後に得られる、純粋な（９５％以上の）ヒドロキシチロソールのＨＰＬＣ分析を示す。 図７は、本発明のヒドロキシチロソール富化組成物の質量スペクトルを示す。 図８は、ヒドロキシチロソールの断片化経路を説明する。

Claims (30)

1. ヒドロキシチロソール富化組成物を生成する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）オリーブから植物水を生成する工程；
   （ｂ）該植物水に酸を添加し、それにより酸化した植物水を生成する工程；および、
   （ｃ）該植物水中に当初に存在したオレウロペインの少なくとも５０％がヒドロキシチロソールに転換されるまでの期間、該酸性化した植物水をインキュベートする工程、
   を包含する、方法。
2. 前記インキュベートする工程が、前記植物水中に当初に存在したオレウロペインの少なくとも７５％がヒドロキシチロソールに転換されるまで行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記インキュベートする工程が、少なくとも２ヶ月間、そして前記植物水中に当初に存在したオレウロペインの少なくとも９０％がヒドロキシチロソールに転換されるまで、行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記植物水が、種を取り除いたオリーブの果肉から生成される、請求項１に記載の方法。
5. 前記インキュベートが、前記植物水が約１：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有するまで行われる、請求項４に記載の方法。
6. 前記インキュベートが、前記植物水が約４：１と約２００：１との間の、オレウロペインに対するヒドロキシチロソールの重量比を有するまで行われる、請求項５に記載の方法。
7. 前記インキュベートが、前記植物水が約１０：１と約１００：１との間の、ヒドロキシチロソールとオレウロペインとの重量比を有するまで行われる、請求項６に記載の方法。
8. 前記インキュベートが、前記植物水が約３：１と約５０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を有するまで行われる、請求項４に記載の方法。
9. 前記インキュベートが、前記植物水が約５：１と約３０：１との間の、ヒドロキシチロソールとチロソールとの重量比を有するまで行われる、請求項８に記載の方法。
10. 前記方法が、他の成分からヒドロキシチロソールを分離するために、インキュベートした植物水を分画する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
11. 前記方法が、有機溶媒と共にインキュベートした植物水を抽出して、ヒドロキシチロソール中の２０％以上の富化画分を生成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
12. 前記方法が、クロマトグラフィーによるヒドロキシチロゾールの精製をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記有機溶媒が、酢酸エチルである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記酸が、約１と約５との間のｐＨを生じるのに有効な量で添加される、請求項１に記載の方法。
15. 前記酸が、約２と約４との間のｐＨを生じるのに有効な量で添加される、請求項１に記載の方法。
16. 前記酸が、クエン酸である、請求項１に記載の方法。
17. 請求項１２の方法により調製される、ヒドロキシチロソール富化組成物を含む、注射可能な処方物。
18. 紫外線放射（ＵＶＲ）に対する曝露の悪影響に対して皮膚を保護する方法であって、このような保護の必要な被験体に約１：１と約２００：１との間のヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比を有する薬学的有効量の治療剤を経口投与する工程を包含する、方法。
19. 前記重量比が、約４：１と約１００：１との間である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記重量比が、約１０：１と約５０：１との間である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記被験体がヒトである、請求項１８に記載の方法。
22. 前記治療剤が、以下：
    （ａ）オリーブから植物水を生成する工程；
    （ｂ）約１と約５との間のｐＨを生じるのに有効な量で、該植物水に酸を添加する工程；および、
    （ｃ）該植物水中に最初に存在したオレウロペインの少なくとも７５％がヒドロキシチロソールに転換されるまで、酸性化した植物水をインキュベートする工程、
    を包含する工程により、調製される、請求項１８に記載の方法。
23. 前記治療剤が、粉末抽出物を提供するように乾燥される、請求項２２に記載の治療剤。
24. 前記治療剤が、錠剤、カプセル剤、または丸剤の形態である、請求項２３に記載の栄養補助食品。
25. 前記治療剤が、液体形態である、請求項２２に記載の方法。
26. 紫外線放射（ＵＶＲ）に対する曝露の悪影響に対して皮膚を保護する方法であって、このような保護の必要な被験体に約１：１と約２００：１との間のヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比を有する薬学的有効量の治療剤を投与する工程を包含する、方法。
27. 紫外線放射（ＵＶＲ）に対する曝露の悪影響に対して皮膚を保護する方法であって、このような保護の必要な被験体に実質的に精製されたヒドロキシチロソール、または実質的に精製されたヒドロキシチロソールとオレウロペインの混合物を経口投与する工程を包含する、方法。
28. フリーラジカルを捕捉するのに有効な量のオリーブポリフェノールを含む経口組成物であって、該オリーブポリフェノールが、約１：１と約２００：１との間のヒドロキシチロソールとオレウロペインの重量比を有する、経口組成物。
29. 前記重量比が、約４：１と約１００：１との間の、請求項２８に記載の経口組成物。
30. 前記重量比が、約１０：１と約５０：１との間の、請求項２９に記載の経口組成物。

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