CN1665764A - 来自橄榄植物液的富含羟基酪醇的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了来自橄榄的羟基酪醇。按照本发明的一个方面，从橄榄中收集植物液。加入酸来稳定植物液并防止其发酵。培养该混合物以使油橄榄苫甙转化成羟基酪醇，然后进行分馏，从而将羟基酪醇与其它组分分离。羟基酪醇可作为治疗剂和抗氧化剂用于多种保健用途，包括用于皮肤损伤的治疗。此外，羟基酪醇可作为天然的抗菌、抗病毒和杀真菌产品用于农业和虫害控制用途。

Description

来自橄榄植物液的富含羟基酪醇的组合物及其使用方法
发明领域
本发明涉及橄榄果实和树叶中所含的一组化合物的酚类馏分，称之为多酚。具体说来，本发明提供了一种含羟基酪醇(hydroxytyrosol)(3，4-二羟苯基乙醇)和少量油橄榄苦甙(oleuropein)和酪醇或几乎不含油橄榄苦甙和酪醇的橄榄提取物，其制备方法和该化合物的应用方法。
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发明背景
许多疾病的发展都牵涉到大量的饮食脂肪(Owen等，2000c)。动脉粥样硬化症(Kuller，1997)和冠心病(Gerber，1994)以及乳腺癌(La Vecchia等，1998)、前列腺癌(Chan等，1998)、卵巢癌(Risch等，1994)和结肠癌(Armstrong和Doll，1975)各自都与升高的饮食脂肪有关。然而，证据表明在某些癌症的病原学中重要的不仅是饮食脂肪的数量，还包括饮食脂肪的类型。
橄榄油是地中海饮食的主要油脂成分，与冠心病(Owen等，2000b；Parthasarathy等，1990；Mattson和Grundy，1985)和某些癌症(d’Amicis和Farchi，1999；Braga等，1998；Martin-Moreno等，1994)较低的发病率有关。一些实验室已经指出橄榄油酚类油橄榄苦甙和其它同族物质的水解产生具有强抗癌活性的小酚类组分(Owen等，2000a；Manna等，2000)。特别地，橄榄油酚类羟基酪醇能防止低密度脂蛋白(LDL)氧化(Visioli和Galli，1998)、血小板凝集(Petroni等，1995)并抑制5-和12-脂肪氧合酶(de la Puerta等，1999；Kohyama等，1997)。此外，已经发现羟基酪醇对过亚硝酸盐决定的DNA碱基修饰和酪氨酸硝化反应产生抑制作用(Deiana等，1999)，而且它能在各种人类细胞系统中解除由活性氧类引起的细胞毒性(Manna等，2000)。最后，研究显示，羟基酪醇消化后在人体内剂量依赖性地吸收，显示出其生物利用率(Visioli等，2000)。
通常，橄榄油制造包括碾碎含核的橄榄以制造稠浆。在此工序中，不断地用水冲洗碾碎的橄榄，将该过程称为“揉拌”(malaxation)。然后将该浆料进行机械挤压以榨出油分。除了提供油分，该挤压过程还榨出浆料的水分。这些冲洗和挤压步骤产生相当多的水，称之为“植物液”(vegetation water)。
橄榄核和果肉都富含水溶性酚类化合物。这些化合物在揉拌过程中按照其分配系数从橄榄中提取出，并最终进入植物液中。这解释了为什么在植物液中可以发现大量的橄榄果肉中生成的各种酚类化合物，例如油橄榄苦甙及其衍生物。同样地，在植物液中也富含大量的橄榄核中生成的单酚化合物，例如酪醇及其衍生物。
由于酪醇的强抗癌活性，希望开发一种能制备含有高百分比的羟基酪醇的水性橄榄提取物的方法。
发明概述
一方面，本发明包括一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法。该方法包括下列步骤：(a)用橄榄，优选用去核橄榄的果肉(或果浆)制备植物液，(b)在植物液中加入酸，酸的用量优选为使pH为1至5的量，更优选为使pH为2至4的量，(c)培养酸化的植物液，直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙有至少50％，优选至少75％，更优选至少90％转化成羟基酪醇。在优选的实施例中，将酸化植物液培养至少两个月，更优选地，将酸化植物液培养大约6-12个月。
在一个实施方案中，培养植物液直至植物液中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为1∶1至200∶1，优选为4∶1至200∶1，更优选为l0∶1至100∶1。在相关实施例中，培养植物液直至植物液中羟基酪醇对酪醇的重量比为3∶1至50∶1，通常为5∶1至30∶1。
该方法进一步包括将培养后的植物液分馏，从而将羟基酪醇与其它组分分离，和/或将富含羟基酪醇的植物液干燥来制备干燥的提取物。在一个实施例中，用有机溶剂萃取培养后的植物液，来制备含20％，或优选95％或更高羟基酪醇的馏分。
本发明还提供了一种可注射组合物，其含有由一种或多种上述实施例制备的富含羟基酪醇的组合物。
另一方面，本发明包括一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法，包括下列步骤：(a)用橄榄制备植物液；(b)加入酸使油橄榄苦甙和其它酚类大分子水解；(c)任选地，将植物液干燥；(d)将任选干燥的植物液与超临界流体接触；和(e)从接触后的植物液中回收富含羟基酪醇的组合物。在一个实施例中，富含羟基酪醇的组合物含有至少大约95wt％的羟基酪醇。在另一个实施例中，富含羟基酪醇的组合物含有至少大约97wt％的羟基酪醇。在又一个实施例中，富含羟基酪醇的组合物含有至少大约99wt％的羟基酪醇。
另一方面，一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法，包括下列步骤：(a)用橄榄制造植物液；(b)加入酸使油橄榄苦甙和其它酚类大分子水解；(c)任选地，将植物液干燥；(d)用合适的有机溶剂，例如乙酸乙酯(EtAc)萃取植物液；和(e)回收羟基酪醇含量为酚类馏分总量的95wt％或更高的馏分。在一个实施例中，富含羟基酪醇的组合物包括至少20％含大约95wt％羟基酪醇的酚类馏分。在一个实施例中，通过硅胶色谱法或其它凝胶色谱法提纯EtAc馏分，以获得含有95wt％或更高羟基酪醇的羟基酪醇馏分。
在一个实施例中，上述回收步骤包括下列步骤：(a)回收超临界流体，其中超临界流体含有羟基酪醇；和(b)将超临界流体蒸发以提取富含羟基酪醇的组合物。在另一个实施例中，上述接触步骤包括下列步骤：(a)提供在受压组件中的具有两个侧面的多孔膜，该膜作为流体和高密度气体之间的阻隔界面，该膜对所述羟基酪醇是非选择性的；(b)超临界流体在膜的一侧上流入组件，而植物液在膜的另一侧；(c)植物液和超临界流体之间的羟基酪醇浓度梯度驱使羟基酪醇穿过该膜提取出来。在一个实施例中，多孔膜是中空纤维膜。在另一个实施例中，超临界流体是二氧化碳。
在另一个实施例中，本发明包括一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法，其包括下列步骤：(a)用橄榄制造植物液；(b)加入酸使油橄榄苦甙和其它酚类大分子水解；(c)将酸化植物液进行喷雾干燥，即蒸发，由此制成含羟基酪醇的粉末。在另一个实施例中，通过在酸化植物液中加入麦芽糖糊精进行上述蒸发步骤，优选制成含大约1至5％羟基酪醇的粉末，更优选制成含大约2％羟基酪醇的粉末。
另一方面，本发明包括一种含橄榄水性提取物的膳食补充剂，该橄榄水性提取物中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为4∶1至200∶1，通常为10∶1至100∶1。
在相关方面，本发明包括一种含橄榄水性提取物的膳食补充剂，该橄榄水性提取物中羟基酪醇对酪醇的重量比为3∶1至50∶1，通常为5∶1至30∶1。
可以将上述补充剂干燥，优选通过喷雾干燥法干燥，来获得一种粉状提取物，该粉状提取物可以配制成片状、胶囊状、丸状或糖膏剂食品添加剂。或者，可以将上述补充机加入药用制剂中，例如加入富含羟基酪醇的可注射制剂。
本发明还提供保护皮肤抵御紫外线辐射(UVR)照射造成的不利效果的方法，包括对需要这种保护的对象施用治疗有效量的治疗剂，该治疗剂中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约1∶1至大约200∶1，优选为大约4∶1至大约100∶1，更优选为大约10∶1至大约50∶1。该试剂在局部敷用时还可以含有遮光剂。在一个实施例中，局部敷用该试剂。优选地，口服该试剂。
结合附图和表来阅读本发明的下列详细说明，可以更充分地理解本发明的这些和其它方面和特征。
附图简要说明
图1表示在橄榄油中测出的酚类化合物及其前体的结构：ligstroside(I)；油橄榄苦甙葡糖苷(II)；ligstroside的糖苷配基(III)；油橄榄苦甙葡糖苷的糖苷配基(IV)；缺少羧甲基的ligstroside糖苷配基的二醛形态(V)；缺少羧甲基的油橄榄苦甙葡糖苷糖苷配基的二醛形态(VI)；酪醇(VII)；羟基酪醇(VIII)。
图2表示本发明的富含羟基酪醇的组合物在从由去核橄榄果肉制成的植物液中用超临界二氧化碳提取出来后进行的HPLC分析。
图3表示超临界二氧化碳提取后，加入合成的羟基酪醇的本发明的富含羟基酪醇的组合物的HPLC分析。
图4表示本发明的富含羟基酪醇的组合物在由去核橄榄果肉制成的植物液酸性水解后的HPLC分析。
图5表示本发明的富含羟基酪醇的组合物在用乙酸乙酯从由去核橄榄果肉制成并经过加酸水解的植物液中萃取出羟基酪醇后的HPLC分析。
图6表示通过在硅胶上进行凝胶色谱法提纯后制得的纯净(95％或更高)羟基酪醇的HPLC分析。
图7表示本发明的富含羟基酪醇的组合物的质谱图。
图8表示羟基酪醇的碎裂途径。
发明详述
本申请引用的所有出版物、专利、专利申请文件或其它参考文献全部经此引用并入本文，如同每篇出版物、专利、专利申请文件或参考文献各自明确并单独地经此引用并入本文。
I.定义
除非另行说明，本文使用的所有术语具有本发明所属领域的技术人员所理解的意思。可以理解的是，本发明并不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些是可以改变的。
“油橄榄苦甙”是指裂环烯醚萜类葡糖苷油橄榄苦甙(secoiridoidglucoside oleuropein)(图1中的结构II)。
“酪醇”是指4-羟苯基乙醇(图1中的结构VII)。
“羟基酪醇”是指3，4-二羟苯基乙醇(图1中的结构VIII)。
II.本发明的方法
本发明一方面提供了取自橄榄植物液的富含羟基酪醇的组合物。已经发现，在下文所述的特定条件下，可以从橄榄的植物液中制得羟基酪醇。下文描述的是实施本发明的步骤。
A. 制备植物液
本发明的方法使用来自例如种植商的常规和商业来源的橄榄。优选地，植物液是由去核橄榄制成的。按照本文公开的方法处理的橄榄可以通过任何适当的方法进行去核。橄榄核中含有的酪醇是植物液中不希望有的组分，而且基本上不能被下述酸处理分解。可以如下所述通过手工或自动化方式将果核与果肉分离。优选地，这些方式应该能够完整地分离出果核，否则会使植物液中酪醇的浓度变高。在另一个实施例中，从用没有去核的橄榄制成的植物液中提取羟基酪醇。
为了制备植物液，首先将橄榄果肉挤压来获得含橄榄油、植物液和固体副产物的液相混合物。随后，将植物液与其余液相混合物分离并收集。在同属于R.Crea的美国专利申请号6,165,475和6,197,308中描述了植物液制备方法的范例，这两个申请各自明确完整地经此引用并入本文。
为了进行工业生成，最好使本发明的各个方面都自动化。为此，一个实施例考虑使用美国专利4,452,744，4,522,119和4,370,274中公开的装置，这些专利都属于Finch等人，而且各自明确地经此引用并入本文。简要地说，Finch等人描述了从橄榄中获得橄榄油的装置。首先，将橄榄装入果肉采集器，将橄榄核与橄榄分离，制成无核橄榄肉。然后用压榨螺杆处理果肉，对果肉施加足以榨出含油、水和少量橄榄果浆的的液体相的压榨压力。将液相收集在一个料斗中，然后送入净化离心机，将果浆与液相分离以制成含橄榄油和植物液的混合物。净化离心机然后将植物液和少量固体物质从混合物中分离出来，制成几乎不含植物液的橄榄油，将其收集在油罐中。按照Finch等人所说，将植物液排入下水道之类的排污装置中。本发明则完全相反，是将植物液收集、保留并用来提取羟基酪醇。
在意大利专利1276576和1278025中公开了用于实施本发明的其它设备，这两个专利各自明确的经此引用并入本文。如上所述，可以在将碾碎的橄榄果肉加工成油、水和固体残渣之前，使用这些设备来分离果肉和果核。
B. 油橄榄苦甙转化成羟基酪醇
在本发明的一个方面，将植物液中所含的油橄榄苦甙转化成羟基酪醇。可以加入酸降低植物液的pH值，并将植物液在按照本发明的发现能够促进油橄榄苦甙酸性水解成羟基酪醇的条件下进行培养。然后将试样分馏或萃取，从而将羟基酪醇与其它化合物分离。
在一个优选实施例中，加入的酸是柠檬酸。在植物液中加入酸，优选将pH值调节至1-5，更优选调节至2-4。可以加入固体柠檬酸，同时不断搅拌，加入量优选为大约每1000加仑植物液中加入大约25-50磅的酸。监测所得溶液的pH值，可能需要再加入酸以获得所需的pH值。实施例1和2给出了加入柠檬酸后将油橄榄苦甙转化成羟基酪醇的示范方法。
酸也可以是柠檬酸以外的其他有机酸或无机酸。可用于本发明的典型的酸包括称作矿物酸的无机物-硫酸、硝酸、盐酸和磷酸和属于羧酸、磺酸和苯酚(苄基)类的有机化合物。向植物液中加入酸有几个目的：(i)使植物液稳定，以免酚分子发生空气(氧气)聚合；(ii)防止植物液被内生的和/或外生的细菌和酵母发酵；和(iii)如实施例1和2所示，使含羟基酪醇的油橄榄苦甙和其它酚类大分子水解，从而将它们转化成羟基酪醇。实施例1中的表1和实施例2中的表2包含来自两个植物液样品的数据和加入柠檬酸后经过一定时间样品中各种组分各自的百分比组成。在一个实施例中，培养该混合物直至其中的羟基酪醇占油橄榄苦甙和羟基酪醇总量的75-90％。在另一个实施例中，原始混合物中的油橄榄苦甙几乎都没有留下。
C. 羟基酪醇的提纯
油橄榄苦甙转化成羟基酪醇(优选加入酸使其转化)后，可以通过本领域已知的许多方法将培养后的植物液分馏。示例性的分馏方法包括用例如乙酸乙酯的有机溶剂分相、包括凝胶色谱法和高效液相色谱法(HPLC)在内的色谱法或超临界流体。
或者，如上所述制得的植物液酸化后，产生一种富含低分子量多酚，特别是羟基酪醇，和少量酪醇和油橄榄苦甙的溶液。加工液中羟基酪醇的浓度为每升4-5克至每升10-15克，这取决于橄榄油提取过程中加水稀释的程度。在一个实施例中，本发明提供了一种提取或提纯方法，该方法在没有添加污染物的前提下选择性地提高羟基酪醇含量。因此，主要的多酚组分，即羟基酪醇，与多酚类中的其它物质、杂质、悬浮固体、丹宁酸和植物液所含的其它分子分离。因此可以以目前的合成或天然提取方法不容易实现的纯度和量来制备羟基酪醇。
超临界流体是在临界温度和压力之上变得非常稠密的气体。其性质介于气体和液体之间，因此具有更高的溶解化合物的能力。其相对较高的密度、高扩散率和低粘性使其提取化合物的速度快于常规的液体溶剂。二氧化碳是最广泛用于食品和食品成分的超临界流体处理的气体，因为它天然、无毒、不可燃、相对惰性而且不会残留在提取产物中。典型的用超临界二氧化碳进行的液体提取通常如下：在大接触柱或塔中使一种相分散在另一种相中，其中含溶质的流体，例如果汁，由于重力作用向下流动，而超临界二氧化碳向上流动。在两种相之间的界面上发生质量传递。
或者，可以使用例如二氧化碳的超临界流体和多孔膜而非接触塔来实现液体和悬浮液的连续提取。将液体连续加料通过中空纤维束或螺旋缠绕片造型的多孔聚丙烯膜，而不是使相分散。液体通过受压组件内的多孔膜，同时超临界二氧化碳在膜的另一面上逆向流动。组件内的压力基本相同，因此提取由流体和超临界二氧化碳之间的浓度梯度驱动进行。可以通过蒸发再利用二氧化碳来回收提取物。在美国专利号5,490,884中描述了使用超临界二氧化碳和多孔膜进行提取的示例性方法，该专利明确完整地经此引用并入本文。
可以用其它超临界流体来代替二氧化碳或与二氧化碳联用。这些流体包括甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、乙烯、丙稀、氢氟碳、四氟甲烷、氯二氟甲烷、二氧化碳、一氧化二氮、六氟化硫、氨和甲基氯。
实施例3描述了一个支持本发明的小规模实验，其中使用超临界二氧化碳和多孔膜从植物液中离析出羟基酪醇。离析出的羟基酪醇的HPLC和质谱分析表明样品是纯度为97-99％的羟基酪醇。因此，本发明提供了含至少大约80％羟基酪醇，优选至少大约90％羟基酪醇，更优选至少大约95％羟基酪醇，再优选至少大约97％羟基酪醇，还优选至少大约99％羟基酪醇的富含羟基酪醇的组合物。
用超临界流体提取之前，可以在植物液中加入本领域技术人员已知的载体，例如麦芽糖糊精(maltodextran)和/或聚丙稀珠；和/或可以将溶液干燥。干燥步骤优选从植物液中去除至少大约90％，更优选至少大约95％，再优选至少大约98％的水分。
膜反应器的一个重要特征在于可以独立于流体速率增加接触表面界面面积的事实。相应地，本发明考虑使用一组大规模装置，其中提取用的膜的膜表面积为至少大约100平方码，优选为至少大约300平方码，更优选为至少大约600平方码，这样就可以从大量的植物液中来分离羟基酪醇。因此，一方面，本发明的膜系统可以接受每分钟1-20升，优选每分钟5-10升的流速。
按照上述本发明也可以使用其它提纯方法。在Ficarra等，1991；Romani等，1999；和Tsimidou，1992中描述了羟基酪醇的HPLC离析法，这些文献各自明确地经此引用并入本文。
III.富含羟基酪醇的膳食补充剂
应该意识到由上述方法制备的羟基酪醇可用于多种用途。例如，由本发明的方法制得的羟基酪醇可以用于：(i)可作为天然抗菌、抗病毒和/或杀真菌产品用于农业和/或虫害控制用途，和(ii)作为治疗剂和/或抗氧化剂用于多种保健用途。在一个具体实施例中，将羟基酪醇施用于哺乳动物对象，例如期望获得一种或多种与羟基酪醇有关的益处的人。
因此，本发明提供了抵御紫外线辐射(UVR)照射引起的皮肤损伤的组合物和方法。由本发明的方法制得的羟基酪醇可以口服或肠道外施用。口服剂型可以是固体或液体形式。该剂型可以由纯化的羟基酪醇配制而成，或者可以由水或水-醇提取物配制而成。对于后者，可以将水或水-醇(例如水或水-乙醇)提取物喷雾干燥来获得干燥粉末，该粉末与其它药学上可以接受的载体一起配制成口服剂型。配制水或水-醇提取物，使其含有的羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比介于4∶1至200∶1之间，优选大约10∶1至大约100∶1之间。也可以配制该提取物，使其所含羟基酪醇对酪醇的重量比介于大约2∶1至大约50∶1之间，优选大约5∶1至大约30∶1之间。
优选地，将该组合物口服给药需要抵御UVR照射引起的皮肤损伤的患者。以制药领域公知的方式制备本发明的固体口服剂型组合物，其含有羟基酪醇和至少一种药学上可以接受的载体。在制造这类组合物时，通常将富含羟基酪醇的组合物，无论其是以几乎纯净的形态还是作为粗馏物或提取物的组分之一，与载体混合、稀释或封装。载体可以是作为活性成分的赋形剂、载体或介质的固体、半固体或液体材料。或者，载体可以是利于口服的胶囊形式或其它包装。因此，按照本发明施用的固体口服剂型可以是片状、丸状、粉状、软或硬胶囊状。
或者，按照本发明制得的口服羟基酪醇可以是液态，其中药学上可以接受的载体是水或水-醇介质。
在本发明中施用的组合物也可以与其它常用的药学上可以接受的赋形剂一起配制，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、树胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、水、醇等。制剂还可以包括例如滑石、硬脂酸镁和矿物油的润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、例如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯之类的防腐剂、甜味剂或增味剂。此外，可以配制本发明的组合物使其施用于对象后活性成分快速、持续或延缓释放。
使用本领域标准工艺来制备按照本发明施用的肠道外制剂。本文使用的术语肠道外包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、膜(intrasternal)注射或输液技术。这类制剂通常使用例如等渗压盐水溶液的肠道外注射用载体制成无菌注射溶液，或制成无菌成包粉末，在施用于对象之前用无菌缓冲剂或等渗压盐水使之复原。在一个优选实施例中，肠道外制剂是含有1至500mg/ml本发明的富含羟基酪醇的组合物的可注射制剂。更优选地，该可注射制剂含有1至100mg/ml富含羟基酪醇的组合物，再优选地，含有10至100mg/ml富含羟基酪醇的组合物，最优选含有大约10mg/ml富含羟基酪醇的组合物。
从前文可以看出本发明的各种目的和特征是如何实现的。根据前文的描述，本领域技术人员现在可以看出，能够通过多种方式实践本发明的广义原理。因此，尽管用具体实施方案及其实施例对本发明进行了描述，但本发明的实际范围并不限于此。可以在不脱离所附权利要求所界定的本发明范围的前提下对其进行各种改变和修正。
下列实施例阐明了制备本发明的富含羟基酪醇的组合物的方法。这些实施例旨在举例说明而决不是限制本发明的范围。
实施例
实施例1
每1000加仑加入大约25磅柠檬酸后，油橄榄苦甙转化成羟基酪醇
表1表示在每1000加仑植物液加入大约25磅柠檬酸后，经过一定时间油橄榄苦甙转化成羟基酪醇的情况。表1中的百分比是占溶液中酚类化合物总量的重量百分比。如表1所示，羟基酪醇在12个月后构成溶液内酚类化合物的80％以上。
                                表1
      每1000加仑加入大约25磅柠檬酸后，油橄榄苦甙转化成羟基酪醇
组分   T＝2个月时的组成   T＝3个月时的组成   T＝4.5个月时的组成  T＝12个月时的组成
  羟基酪醇   30.4％   32％   48.4％  80.2％
  酪醇   2.5％   5％   2.2％  3.6％
  油橄榄苦甙   41％   36.6％   25.1％  1.2％
  油橄榄苦甙糖苷配基 4.2％ 4.6％ 2.7％ 3.7％
实施例2
每1000加仑加入大约50磅柠檬酸后，油橄榄苦甙转化成羟基酪醇
表2表示在每1000加仑植物液加入大约50磅柠檬酸后，经过一定时间油橄榄苦甙转化成羟基酪醇的情况。表2中的百分比是占溶液中酚类化合物总量的重量百分比。明显地，如表2所示，羟基酪醇在2个月后构成溶液内酚类化合物的45％以上。
                              表2
   每1000加仑加入大约50磅柠檬酸后，油橄榄苦甙转化成羟基酪醇
  组分     T＝2个月时的组成    T＝12个月时的组成
  羟基酪醇     45.7％    78.5％
  酪醇     2.9％    3.3％
  油橄榄苦甙     28.7％    1.5％
  油橄榄苦甙糖苷配基     4.1％    3.5％
实施例3
从植物液中提取羟基酪醇
将含大约40毫克干燥固体(麦芽糖糊精)的植物液等分试样(0.5毫升)与聚丙烯多孔珠混合并干燥。该干燥混合物用超临界二氧化碳来提取(PoroCrit，LLC，Berkeley，CA)。通过HPLC分析收集到的样品(大约2.0毫克)。图2表示样品分布图，表3表明主峰下的面积达到97％。在样品中加入合成羟基酪醇并通过HPLC分析时，如图3所示呈现一个主峰，表明样品的主要产物是羟基酪醇(表4)。
                                 表3
                        图2HPLC结果的峰值分析
峰号 时间 高度(μV)     面积(μV-sec) 面积(％)
    1     5.935    215542     6687705   97.476
    2     11.433    5686     173104   2.523
                             表4
                    图3HPLC结果的峰信分析
峰号 时间 高度(μV)    面积(μV-sec) 面积(％)
    1     2.875     1345     13895     0.26
    2     3.278     1076     14140     0.265
    3     6.641     211204     5241105     98.240
    4     11.961     2587     65811     1.233
实施例4
从酸化的植物液中提取羟基酪醇
将酸性水解后的植物液等分试样(0.5毫升)在摇动烧瓶中与乙酸乙酯一起剧烈摇动。将有机溶剂从水溶液中分离出来并用旋转式汽化器蒸发掉。收集制得的稠油(大约20克)并通过HPLC分析。图5表示该样品分布图，表5显示主峰下的面积达到97.457％，表明羟基酪醇构成植物液中多酚总馏分的大约95％或更高。通过标准比色分析进行的总酚类测定表明油中羟基酪醇的含量约为20wt％。
                            表5
                    图5HPLC结果的峰值分析
峰号 时间 高度(μV)   面积(μV-sec) 面积(％)
    1     3.873    7620   46501   2.542
    2     13.575    95112   1782793   97.457
该馏分用凝胶色谱法来进一步提纯羟基酪醇。将干燥硅石(150克)悬浮在乙酸乙酯(300毫升)中，制得粘稠浆料。将该浆料导入玻璃柱中并使硅石放置15分钟直至沉积。将含大约20％(4克)羟基酪醇的稠油溶于25毫升乙酸乙酯并倒入硅胶中。通过产物的重力洗脱和加入作为溶剂的乙酸乙酯将羟基酪醇提纯。收集含纯羟基酪醇的馏分并汇集在一起。蒸发溶剂直到制得黄色油。如图6和表6所示，经HPLC和质谱法证实，该油是基本纯净的羟基酪醇(97-99％)。提纯的产量约为2.8-3.0克羟基酪醇或ca.65％。
                              表6
                      图6HPLC结果的峰值分析
峰号 时间 高度(μV)    面积(μV-sec) 面积(％)
    1     2.875  1345    13895     0.26
    2     3.278  1076    14140     0.265
    3     6.641  211204    5241105     98.240
    4     11.961  2587    65811     1.233
如图7所示，按照实施例3和4中两个步骤所述制得的样品的质谱分析证实主要产物是羟基酪醇。用甲醇将样品稀释至最终浓度为每毫升26微克，并在安装有ESI探针的Finnigan LCQ上以负电荷电离模式进行分析。使用一体式注射泵以每分钟3微升的速度进行输液。温度是270℃，指针电压+4.2V，夹套气(sheath gas)45单位，辅助气体10单位。羟基酪醇的碎裂途径表示在图8中。从图7中可以看出，羟基酪醇(质量/电荷153.1)及其碎裂产物(123.1和105.1质量/电荷)占据了多级谱中富含的产品的大部分。
实施例5
抵御紫外线辐射造成的皮肤损伤
Olivenol组合物
测试物是Olivenol(Lot#1A-1B)。Olivenol是通过旋转式蒸发器将植物液的酸性水解液(500毫升)蒸发至干燥、随后再冷冻干燥制得的粗制水制品。测试物赋形剂是0.5％w/v甲基纤维素水溶液(口服)和甲醇，99.9％A.C.S.分光光度等级(局部敷用)。在研究过程中一次性制备制剂，为了进行剂量计算，将测试物视作75％活性。
小鼠
将一百只雄性Crl：SKH1-hrBR无毛小鼠(来源：Charles RiverLaboratories，Inc.，Portage，Michigan USA)随机分配到十个剂量组(组1至组10)，每组十只小鼠，如表1所示。雄鼠的体重为17至28克。
                                  表5：实验设计
组   制剂及剂量(mg/kg/day)*    浓度(mg/ml)* 给药途径 雄鼠数量   制剂施用频率(天)
    1   0(赋形剂)    0(赋形剂)   口服   10   31
    2   Olivenol(1)    0.1   口服   10   31
3   Olivenol(10) 1.0 口服 10 31
4   Olivenol(100) 10.0 口服 10 31
5   Olivenol(100) 10.0 口服 10 10
    6   0(赋形剂)    0(赋形剂)   局部   10   31
    7   Olivenol(1)    0.25   局部   10   31
8   Olivenol(10) 2.50 局部 10 31
9   Olivenol(100) 25.00 局部 10 31
10   Olivenol(100) 25.00 局部 10 10
*组1-5：剂量＝10毫升/千克
组6-10：剂量和浓度假设小鼠体重为25克并对每只鼠施用0.1毫升的量(即100mcL/鼠)。
施用Olivenol组合物及UVR照射
每天一次将制剂口服施用给合适的小鼠(通过管饲法)，持续31天(组1至4)或10天(组5)。每天一次将制剂局部敷用给合适的小鼠(100mcL/小鼠)，持续31天(组6至9)或10天(组10)。
在施用制剂的第28天(组1至4和组6至9)或第7天(组5和10)，将组1至组10的小鼠暴露在UVR(即电磁波谱的UVB和UVA部分的波长)下。辐射源是带有连到Orlel光导管上的WG320 Schott玻璃滤光镜(1mm)的Berger Compact Arc高强度太阳能模拟器(SolarLight Company，Philadelphia，PA)。用PMA 2100仪表(Solar LightCompany，Philadelphia，PA)或类似设备连续监测辐射源的辐射强度。在第28或第7天，施用制剂与开始暴露在UVR下之间的间隔对多数小鼠低于15分钟，而对少数小鼠略高于15分钟。
每天检测两次成活力。至少每周记录临床观察结果，包括在第一次施用制剂之前记录一次，在马上要暴露在UVR下之前记录一次。还在辐射后大约24、48和72小时记录临床观察结果。在给药周期内每周记录一次体重并在最终死亡后记录体重。
小鼠的死亡
所有小鼠都存活到计划的死亡时间。在最终检测之后，即完成UVR照射大约72小时之后，执行预定的灭亡(CO2窒息)。移去包括UVR照射部位的背部皮肤，并保存在中性缓冲10％福尔马林中以待可能进行的组织病理学检测。
如下测定各组的UVR剂量平均计算值(MED)和标准偏差。对每只小鼠测定在照射部位造成任何皮肤反应的最低作用剂量。测定每个观察时间点时每组小鼠的UVR剂量平均计算值。如果施用测试物对根据此计算方法得出的引起皮肤反应所需的UVR剂量没有任何影响，预计在照射48小时后得到相当于1.0MED的UVR剂量平均计算值。高于1.0的UVR剂量平均计算值表示测试物具有保护效应。对于在六个UVR照射部位的任何部位都没有皮肤反应的小鼠，为了进行计算，赋予其2.8的估算值，将＞号作为这组UVR剂量平均计算值的前缀。此外，计算带有标准偏差(体重)的比率(临床观察结果)和平均值。
测量体重和体重变化的组平均值和标准偏差并制成表格。
结果
在UVR照射部位产生的皮肤反应包括红斑、水肿和剥落，皮肤反应的严重程度取决于UVR照射剂量。
在口服Olivenol达31天的无毛小鼠身上，有对UVR引起的皮肤炎症具有轻微的剂量依赖保护效应的迹象，而在局部敷用Olivenol达31天的小鼠身上，有适度的剂量依赖保护效应的迹象。在这种研究中，预计在对未试验过的小鼠进行UVR照射48小时后，UVR剂量平均计算值接近1.0。
在口服Olivenol达31天的小鼠(组1至组4)身上，在0(赋形剂)、1、10和100毫克/千克/天的剂量组中，UVR照射48小时后的UVR剂量平均计算值分别为1.2、1.3、1.4和1.5。在局部敷用Olivenol达31天的小鼠(组6至组9)身上，在0(赋形剂)、1、10和100毫克/千克/天的剂量组中，UVR照射48小时后的UVR剂量平均计算值分别为1.5、1.5、＞1.9和＞2.2。在组8和9的UVR剂量平均计算值前有前缀＞号，这是因为这两组各有两只小鼠的任何UVR照射部位都没有产生皮肤反应。对于这四只小鼠，为了进行计算，赋予其2.8的估算值。
在UVR照射72小时后，对测试物的保护效应不那么明确。然而，在局部敷用100毫克/千克/天Olivenol达31天的小鼠(组9)身上，UVR照射后72小时的UVR剂量平均计算值为1.6，而在适当的对照组(组6)，该值为1.2。
UVR照射48小时后，组6[0(赋形剂)，局部敷用]中1.5的UVR剂量平均计算值是未曾预料到的。由于该值明显高于大约1.0的预计值，赋形剂可能对UVR照射的皮肤感应性具有一定的影响，然而，与局部敷用0(赋形剂)毫克/千克/天Olivenol的小鼠相比，在局部敷用10和100毫克/千克/天Olivenol剂量达31天的小鼠身上的UVR剂量平均计算值有明显提高。
与适当的对照组相比，在通过口服(组5)或局部(组10)敷用途径施用100毫克/千克/天Olivenol剂量达10天的无毛小鼠身上，没有对UVR引起的皮肤炎症的保护效应的迹象。在口服或局部敷用100毫克/千克/天Olivenol剂量达10天的小鼠身上，UVR照射48小时后的UVR剂量平均计算值分别为1.0和1.3。这些值相当于在专门的0(赋形剂)毫克/千克/天剂量组(即分别为组1和6)中形成的值。
认为UVR照射24小时后产生的皮肤反应在确定测试物的保护潜力方面无用，因为这些反应往往在可再生性上不如随后产生的反应。
组1和组3每组各有两只小鼠产生了泌尿系统溃疡。组6和组7各有一只小鼠产生肿块。这些是雄性无毛小鼠中常见的疾病，并不认为其与测试物有关。尸检显示所有组织看上去都很正常。在整个实验规程中观察到的体重和体重变化都很寻常。
在口服Olivenol达31天的雄性无毛小鼠身上，有对UVR引起的皮肤炎症具有轻微的剂量依赖保护效应的迹象，而在口服Olivenol达31天的小鼠身上，有适度的剂量依赖保护效应的迹象。高Olivenol剂量，100毫克/千克/天，通过口服和局部敷用途径提供皮肤保护。
在通过口服或局部敷用途径施用100毫克/千克/天Olivenol剂量达10天的无毛小鼠身上，没有对UVR引起的皮肤炎症具有保护效应的迹象。
根据发明详述和上述实施例，可以看出实现了本发明的几个方面。
可以理解的是，已经通过图解和实施例具体描述了本发明，以使本领域的技术人员了解本发明、其原理及其实际应用。此外，本发明的上述具体实施方案并不是穷尽的，也不是为了限制本发明，对于本领域技术人员而言，参照上述实施例和详细描述，许多替换方案、修改和变动是显而易见的。相应地，本发明旨在包括所有落在下列权利要求的实质和范围内的替换方案、修改和变动。尽管上述一些实施例和描述包括了一些关于本发明作用方式的结论，本发明的发明人并不想受缚于那些结论和作用，它们的提出仅仅是作为可能的解释。

Claims (30)

1.一种制备富含羟基酪醇的组合物的方法，包括：
(a)用橄榄制备植物液；
(b)将酸加入植物液中，由此制得酸化的植物液；
(c)将酸化的植物液培养一段时间直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙有至少50％转化成羟基酪醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙有至少75％转化成羟基酪醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中进行所述培养至少2个月，直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙有至少90％转化成羟基酪醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用去核橄榄的果肉或果浆来制备植物液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约1∶1至大约200∶1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约4∶1至大约200∶1。
7.根据权利要求6所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约10∶1至大约100∶1。
8.根据权利要求4所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中羟基酪醇与酪醇的重量比为大约3∶1至大约50∶1。
9.根据权利要求8所述的方法，其中进行所述培养直至植物液中羟基酪醇与酪醇的重量比为大约5∶1至大约30∶1。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将培养后的植物液分馏，将羟基酪醇与其它组分分离。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用有机溶剂萃取培养后的植物液，以制备20％或更多富含羟基酪醇的馏分。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括通过色谱法进行羟基酪醇的提纯。
13.根据权利要求11所述的方法，其中有机溶剂是乙酸乙酯。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸的加入量为使pH值为大约1至大约5的有效量。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸的加入量为使pH值为大约2至大约4的有效量。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是柠檬酸。
17.一种可注射制剂，其含有根据权利要求12所述的方法制备的富含羟基酪醇的组合物。
18.一种保护皮肤免受暴露在紫外线辐射(UVR)下引起的不利效果的方法，包括对需要这种保护的对象口服施用治疗有效量的治疗剂，该治疗剂中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约1∶1至大约200∶1。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述重量比为大约4∶1至大约100∶1。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述重量比为大约10∶1至大约50∶1。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述对象是人。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述试剂是由包含下列步骤的方法制备的：
(a)用橄榄制备植物液；
(b)在植物液中加入足以产生大约1至大约5的pH值的酸；
(c)培养该酸化的植物液直至植物液中原先存在的油橄榄苦甙有至少75％转化成羟基酪醇。
23.根据权利要求22所述的方法，其中将所述试剂干燥以获得粉状提取物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述试剂是片状、胶囊状或丸状。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述试剂是液态。
26.一种保护皮肤免受紫外线辐射(UVR)不利效果的方法，包括对需要这种保护的对象施用治疗有效量的治疗剂，该治疗剂中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约1∶1至大约200∶1，其中所述治疗剂进一步含有用于局部敷用的遮光剂。
27.一种保护皮肤免受紫外线辐射(UVR)不利效果的方法，包括对需要这种保护的对象口服治疗有效量的基本纯净的羟基酪醇或基本纯净的羟基酪醇和油橄榄苦甙混合物。
28.一种含有橄榄多酚的口服组合物，其中橄榄多酚的量足以清除自由基，而且所述橄榄多酚中羟基酪醇对油橄榄苦甙的重量比为大约1∶1至大约200∶1。
29.根据权利要求28所述的口服组合物，其中所述重量比为大约4∶1至大约100∶1。
30.根据权利要求29所述的口服组合物，其中所述重量比为大约10∶1至大约50∶1。
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