JP2659665B2 - プロポリス製品及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、アレルギーの原因と
なるアレルギー物質（アレルゲン）を除去した副作用の
ない安全なプロポリス製品及びその製造方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】プロポ
リスとは、蜜蜂が種々植物から採取した樹脂状物質を素
材とし、花粉や蜜蜂自身の腺物質が混ざって構成された
ものをいい、別名「蜂やに」ともよばれているものをい
う。蜂の生活においてこのプロポリスは外敵、即ち有害
なウイルス、バクテリア等の微生物、他の昆虫が蜂の巣
へ侵入するのを防ぐために使用され、巣内の隙間に塗り
付けられるものである。このような殺菌作用は人の社会
においても活用され、古代エジプトにおいてはミイラ化
する素材として、また養蜂のメッカであるギリシアにお
いても紀元前から家庭常備薬として珍重されていた。

【０００３】プロポリスは世界の各地で採取されている
が、その植物相が異なるため、その組成は若干の相違が
認められるが、主な成分としてはワックス、レジン様物
質、フラボノイド類、クマル酸や柱皮酸等のフェノール
性有機酸類、トリプシン、カテプシン、アミラーゼ等の
酵素類、各種ミネラル類、ビタミン類が挙げられる。プ
ロポリスは主に東欧諸国で研究、応用が盛んであり、種
々の科学的文献によりその薬理作用としては鎮静、静
菌、収斂、抗炎症、抗酸化、麻酔作用が報告されてい
る。特に、外用としてキズの治療、組織再生に応用され
ている。

【０００４】プロポリスは褐色乃至黒色の固体であり、
そのままで用いることは通例ない。不純物ワックスやロ
ウを除去後、多くはこの中の有効成分であるフラボノイ
ド類や芳香族カルボン酸、アルデヒドを有機溶剤で抽出
しチンキとしてそのまま用いられるか、加工して適当な
剤型とされる。例えば、クリーム、ローション、錠剤、
カプセル、粉末などである。製品の多くは薬店、薬局や
健康食品店で販売されている。近年、各国で天然由来の
製品を珍重する傾向がみられ、プロポリスの需要も急速
に高まっている。しかしながら、外用や内服の際に人に
よっては皮膚に湿布した後発赤、湿疹がみられたり、口
内にかいようが発生するなど副作用が深刻な問題となっ
ている。

【０００５】皮膚病、火傷、糖尿病、呼吸器病等種々の
疾患に対し有効な成分を含有し免疫増強活性もあること
から、プロポリスは現在幅広く使用されており、副作用
の問題解決が急がれている。

【０００６】ハウゼンらはプロポリス中のアレルギー性
物質を化学的かつ臨床的に検討し、問題とされる成分は
イソプレニルカフェ酸とフェニルエチルカフェ酸である
ことを見出した。特に、前者は強力なアレルギー作用を
示すことを報告している（Ｂ．Ｍ．Ｈａｕｓｅｎら、Ｃ
ｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，１７巻，１６３
〜１７０頁，１９８７、同１７巻，１７１〜１７７頁，
１９８７、同１９巻、２９６〜３０３頁，１９８８、同
２６巻，３４〜４４頁，１９９２）。そして、プロポリ
ス製品の使用にあっては注意深くする必要があると警告
している。

【０００７】その他の研究者によってもアレルギー物質
の分離、性質やアレルギー試験が報告されている（Ｖ．
Ｓ．Ｂａｎｋｏｖａら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２８巻，８７１〜８７３頁、Ｅ．Ｗｏｌｌｅｎｗｅ
ｂｅｒ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，４２Ｃ巻，１
０３０〜１０３４頁，１９８７、Ｊ．Ｂｏｕｑｕｅｔ
ら、Ａｌｌｅｒｇｏｌ．ｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏ
ｌ．，１０巻，５（３９５〜３９８），１９８２、Ｂ．
Ｗａｎｓｃｈｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，９４巻，４５１頁，１
９８８、Ｋ．Ｄ．Ｈａｙら，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．Ｏｒ
ａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．，７０巻，５
８４〜５８６頁，１９９０）。

【０００８】アレルギー物質を除去した例としては、プ
ロポリスをエタノールに浸漬して蒸留する方法があるが
（オーストリア特許第８７６８２８４号）、この方法は
他の芳香性成分が一緒に除去されてしまうという問題が
ある。また、有機溶剤を用いた抽出法によりアレルギー
物質のみを除去しようとしても、フラボノイド類等の有
用な生理活性物質も同時に有機溶剤中に抽出されるた
め、アレルギー物質を分離除去することができないとい
う問題があった。

【０００９】この発明は上記のような従来の問題に着目
してなされたものである。その目的とするところは、ア
レルギー物質はそのアレルギー性が実質的に発現されな
い程度に消失され、アレルギーを誘発するおそれがない
プロポリス製品を提供することにある。また、他の目的
は、アレルギー物質以外の成分、例えばフラボノイド類
等の生理活性を有する成分が除去されることなく、プロ
ポリス本来の薬理作用を十分に発揮させることができる
とともに、毒性の点においても安全なプロポリス製品を
提供することにある。さらに、他の目的は、アレルギー
性が実質的に発現されないプロポリス製品を容易かつ確
実に得ることができるプロポリス製品の製造方法を提供
することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段及び作用】この発明者ら
は、アレルギー物質のみを効率的に除去乃至修飾する方
法について鋭意検討を重ねた。プロポリスは医薬品では
ないので、その加工には食品として許容される方法が望
まれ、この限定された条件下で検討した。そして、その
構造が酵素により変化を受けやすいものであるのではな
いかとの発想のもとに研究を重ねた。そして、種々の酵
素の中で加水分酵素又は酸化還元酵素がその目的に合致
することを見出しこの発明を完成した。

【００１１】即ち、請求項１に記載のプロポリス製品の
発明では、プロポリスを含有し、酵素の作用によりアレ
ルギー物質をアレルギー性が実質的に発現されない程度
に消失させたものである。また、請求項２に記載の発明
では、前記酵素が加水分解酵素又は酸化還元酵素であ
る。請求項３に記載の発明では、前記加水分解酵素がエ
ステラーゼである。請求項４に記載の発明では、前記酸
化還元酵素がラッカーゼ、チロシナーゼ、フェノラー
ゼ、ビリルビンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼから
なる群より選ばれた１種以上の酵素である。

【００１２】さらに、請求項５に記載のプロポリス製品
の製造方法の発明では、プロポリスに酵素を作用させ、
アレルギー物質をアレルギー性が実質的に発現されない
程度に消失させたことを特徴とするものである。

【００１３】この発明に用いるプロポリスの産地は中
国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメ
リカがあるがいずれであってもよい。プロポリスはその
ままでは処理が困難な場合があるので、通常ワックス等
を除去した後の有機溶剤抽出物、例えばエタノールエキ
スを使用するとよい。この場合、フラボノイド類とカフ
ェ酸は分離せず、ともに有機溶剤中に存在する。これを
そのまま又はこれに水を添加して懸濁液や適当な樹脂、
例えばシリカゲルの親水性樹脂、オクタデシルシラン修
飾の疎水性樹脂により分画されたアレルギー物質を高濃
度に含有するものであってもよい。有機溶剤中において
もエステラーゼなどの酵素反応は進行するが、好ましく
は水を若干添加するか水系で反応せしめる。

【００１４】酵素のうち、加水分解酵素はエステル結合
に作用し、その結合を切断して分解させるものであり、
カルボキシルエステラーゼ等のエステラーゼ、トリアシ
ルグリセロールリパーゼ、タンナーゼ等が使用される
が、分解能力等の点からカルボキシルエステラーゼが最
も好ましい。また、酸化還元酵素はアレルギー物質に作
用してそれをポリマー化するものである。この酸化還元
酵素としては、ラッカーゼ、チロシナーゼ、フェノラー
ゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カテ
コールオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ｏ
−アミノフェノールオキシダーゼ、各種オキシゲナーゼ
等が使用される。これらのうち、ラッカーゼ、チロシナ
ーゼ、フェノラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ又はペル
オキシダーゼがアレルギー物質に対する反応の活性の点
から好ましい。これらは１種又は２種以上を適宜組合せ
て使用される。また、使用する酵素の純度は特に規定さ
れない。即ち、酵素を産生する微生物培養物や動物から
のホモジネートでもよい。

【００１５】上記プロポリスに各種酵素を添加し反応さ
せるが、溶液のｐＨはそのまま、即ちｐＨ３〜４であっ
てもよいが、酵素の至適ｐＨへ変化させることにより速
やかに進行することは言うまでもない。通例、クエン酸
ナトリウム等を添加して、加水分解酵素ではｐＨ６〜１
０、酸化還元酵素においてはｐＨ５〜８とするのが好ま
しい。酵素量は溶液ｐＨにより任意に選ぶことができる
が、反応を１日以内の短時間で終了させたい場合にはプ
ロポリス固形分１ｇに対して０．１〜０．５ｇを用いれ
ばよいが、使用する酵素の純度により異なる。一方、長
時間、例えば３日で反応させる場合には酵素の使用量は
その１０分の１程度でよい。

【００１６】プロポリス中には数多くの成分があり、酵
素に対して阻害的に働くものもあるので、アレルギー物
質標準品を用いて酵素反応を行なう場合の１０倍以上使
用することが好ましい。但し、これも反応時間との兼ね
合いにより任意に選択できる。酵素反応は酵素の至適温
度、即ち２０〜５０℃で行う。プロポリスと酵素の反応
は振盪して行なうことがよく、これはアレルギー成分が
水に分散している場合、酵素と十分に接触させる必要が
あること及び酸化還元酵素のように反応に際し十分な酸
素を必要とすることによる。なお、酸化還元酵素を用い
る場合、酵素反応終了後にさらに６０〜１００℃程度ま
で数十時間加熱して、さらに生成物のポリマー化を促進
させてもよい。

【００１７】水系での反応終了時には、加水分解酵素に
おいてはエステル結合の切断により脂肪族炭化水素（イ
ソプレニルカフェ酸の場合）又は芳香族化合物（フェニ
ルエチルカフェ酸の場合）の遊離により白色の沈澱が生
成される。酸化還元酵素においては、反応液の色が濃褐
色に変化するためその段階で反応を終了させればよい。
その後、溶媒を留去し、その残渣に有機溶媒を添加しプ
ロポリスの有効成分のみを溶解させ、濾過することによ
り所望とする無アレルギー性のプロポリスが得られる。

【００１８】アレルギー物質消去確認のための標準品合
成については、浅川らの報告（Ｚ．Ｎｑｔｕｒｆｏｒｓ
ｃｈ．，４３Ｃ巻，４７０〜４７２頁，１９８８）に準
じて合成でき、その分離分析についてはＶ．Ｓ．Ｂａｎ
ｋｏｖａらの報告（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２
８巻，８７１〜８７３頁，１９８９）、Ｅ．Ｗｏｌｌｅ
ｎｗｅｂｅｒの報告（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，
４２Ｃ巻、１０３０〜１０３４頁，１９８７）を準用で
きる。調整された標準品を用いて酵素反応前後の高速液
体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、アレ
ルギー物質のピークは全く消失した。また、同様にプロ
ポリスにおいても同様の結果を得た。

【００１９】これら酵素処理を施されたプロポリスは次
の(1) 〜(3) の特長を有する。 (1) アレルギー物質の消失、(2) カフェ酸量の増加、
(3) フェノールポリマー物質の増加 このように、一定条件下で酵素反応を行うことにより、
アレルギー物質を容易な操作で、しかも確実に実質上ア
レルギー性を発現しない程度に消失させることができ
る。

【００２０】次に、プロポリス製品の形態としては、そ
のままチンキとして、又は濃縮したエキス、凍結乾燥や
減圧乾燥その他乾燥手段による粉末、これに賦形剤を添
加した錠剤、カプセル剤、さらに化粧品の基剤を混合し
たクリームやローションとして調整される。

【００２１】この発明のプロポリス製品は後述するよう
に、抗酸化能等の活性が従来のプロポリスと全く同様の
作用を示すこと、毒性試験においても安全な製品である
ことが確認されている。しかるに、この発明の無アレル
ギー性プロポリス製品はその副作用の心配が全く無くな
り、幅広く食品、化粧品等に応用が可能である。

【００２２】

【実施例】以下に実施例及び試験例をあげてこの発明を
さらに具体的に詳述するが、この発明は勿論これらに限
定されるものではない。 （試験例１）カフェ酸（半井化学（株）製、特級）２．
１ｇをヘキサメチルリン酸トリアミド（東京化成（株）
製）１５０ｍｌに懸濁させ、更に２５％水酸化ナトリウ
ム２．５ｍｌを添加し、１時間室温で撹拌反応させた。
その後、これに１−ブロモ−３−メチル−２−ブテン
（東京化成（株）製）３．５ｇを添加し、室温で２４時
間反応させた。この液を氷水にとり、ジエチルエーテル
で２回抽出した。エーテル層は１Ｎ塩酸及び水で順次洗
浄し、硫酸マグネシウム脱水後溶媒を留去して茶色オイ
ル物質１．９５ｇを得た。

【００２３】この物質を薄層クロマトグラフィーによる
分画をし、紫外線ランプで位置を確認後、目的物をかき
とり酢酸エチルで溶出した（５０℃、１時間）。溶媒を
留去し、茶色の乾固物１．０２ｇを得た。このものに酢
酸エチル：クロロホルム（２：８）混液を加え溶解し、
シリカゲルクロマトグラフィーにより精製（移動相酢酸
エチル：クロロホルム（２：８））した。その結果、黄
色結晶０．３３ｇを得、これをエ−テルとヘキサンの混
液で再結晶し、０．１６ｇのイソプレニルカフェ酸を得
た。

【００２４】これについて、紫外線吸収スペクトル分析
（ＵＶ）、赤外線吸収スペクトル分析（ＩＲ）及び質量
分析（Ｍａｓｓ）を行った。その結果を次に示す。ＵＶ
max ３３３ｎｍ，３０３ｎｍ，２４８ｎｍ，２２０ｎ
ｍ，２０８ｎｍ。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）３４７５，３
３１０，１６８０，１６３５，１６００，１５３０，１
４４０，１２９５，１２７５，１１７０，１０９５，９
７０，９２５，８４０，８０５。Ｍａｓｓ ｍ／ｚ
（％） ２４８（Ｍ⁺ ，２％），１８０（１００％），
１６３（６６％），１３５（２２％），１３４（４２
％），１１７（２０％），８９（４３％），７７（２０
％），６９（５９％），５３（４５％），４１（９５
％）。 （試験例２）カフェ酸１．９８ｇをヘキサメチルリン酸
トリアミド１５０ｍｌに懸濁させ、更に、２５％水酸化
ナトリウム２．２８ｍｌを添加し、室温で１時間反応さ
せた。その後、これに予めヘキサメチルリン酸トリアミ
ド１０ｍｌにβ−ブロモエチルベンゼン５．７ｍｌを混
ぜた液を滴下し、５５時間室温で撹拌した。試験例１と
同様に抽出し、乾固後茶色のオイル状物質５．２５ｇを
得た。同様にシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶剤
はエタノール：ヘキサン＝２：８の混液）を行い、１．
３９ｇの黄色乾固物を得た。薄層クロマトグラフィーに
より黄色結晶０．８５ｇを得た。このものをエーテル／
ヘキサン混液で再結晶し、フェニルエチルカフェ酸０．
４９ｇを得た。

【００２５】これについて、分析を行った。ＵＶ_max ３
３３ｎｍ，３０２ｎｍ，２４８ｎｍ，２１４ｎｍ。ＩＲ
（ＫＢｒ，ｃｍ^-1）３４８０，３３２０，１６８０，１
６３２，１６０２，１５３５，１４４０，１３８０，１
３５５，１２９５，１２７５，１１７５，１１００，９
７０。Ｍａｓｓ ｍ／ｚ（％） ２８４（Ｍ⁺ ，１２
％），１８０（１００％），１６３（３６％），１３５
（３％），１３４（２７％），１１７（１５％），１０
４（５３％），９１（６６％），８９（２６％），７７
（１４％）。 （実施例１）イソプレニルカフェ酸４．４４ｍｇを１０
％エタノール１２ｍｌに溶解させ１．５ｍＭ溶液を調製
した。この溶液に、５種類の酵素、即ちビリルビンオキ
シターゼ（天野製薬（株）製、２．８４ｕ／ｍｇ）、ラ
ッカーゼ（シグマ社製、２３５ｕ／ｍｇ）、ペルオキシ
ターゼ（シグマ社製、５３ｕ／ｍｇ）、チロシナーゼ
（シグマ社製、２１００ｕ／ｍｇ）、カルボキシルエス
テラーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製、１３０ｕ／
ｍｇ）５ｍｇをそれぞれ作用させた。各々３５℃に保
ち、一定間隔で振盪し２４時間反応させた。

【００２６】その後、反応液より１００μｌずつ採取
し、真空濃縮により溶媒を留去した。これにジメチルホ
ルムアミドを１ｍｌ加え、０．４５μｍのメンブレンフ
ィルターで濾過後、その１００μｌを高速液体クロマト
グラフィー（島津製作所製）で分析した。カラム：ＧＰ
Ｃゲル濾過モード、カラム温度：４０°Ｃ、移動相：ジ
メチルホルムアミド、流速：０．５ｍｌ／分、検出器：
２８０ｎｍ，３３０ｎｍ。

【００２７】図１〜３に高速液体クロマトグラフィーの
クロマトグラムを示す。これから、相対保持時間２０．
５分のイソプレニルカフェ酸のピークが酵素処理により
消失したことが判る。従って、カルボキシルエステラー
ゼではアレルギー成分であるイソプレニルカフェ酸が分
解され、その他のチロシナーゼ等の酵素ではイソプレニ
ルカフェ酸がポリマー化しているのが証明された。 （実施例２）フェニルエチルカフェ酸５．１０ｍｇを１
０％エタノール１２ｍｌに溶解させ、１．５ｍＭ溶液を
調製した。この溶液に、５種類の酵素、即ちビリルビン
オキシターゼ（天野製薬（株）製）、ラッカーゼ（シグ
マ社製）、ペルオキターゼ（シグマ社製）、チロシナー
ゼ（シグマ社製）、カルボキシルエステラーゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）５ｍｇをそれぞれ作用させ
た。各々３５℃に保ち、一定間隔で振盪し２４時間反応
させた。

【００２８】その後、反応液より１００μｌずつ採取
し、真空濃縮により溶媒を留去した。これに０．０５％
トリフルオロ酢酸を含む９９％アセトニトリルを１ｍｌ
加えて溶解し、０．４５μｍのメンブレンフィルターで
濾過後、その１００μｌを高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）で分析した。カラム：ＯＤＰ逆相モー
ド（４．６×２５０ｍｍ）、カラム温度：室温、移動相
Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニ
トリル、移動相Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸を含む
９９％アセトニトリル，０〜３０分でＢ濃度が１００％
とするグラジエント、流速：０．６ｍｌ／分、検出器：
２５０ｎｍ。

【００２９】図４〜６に高速液体クロマトグラフィーの
クロマトグラムを示す。これから判るように、相対保持
時間１９．３分のフェニルエチルカフェ酸のピークが酵
素処理により消失したことが判る。従って、カルボキシ
ルエステラーゼの場合にはフェニルエチルカフェ酸が分
解し、他の酸化還元酵素についてはいずれも、生成物は
保持時間が長くなり、極性の低い、より疎水性のポリマ
ー物質に変換されていることが判る。 （実施例３）中国産プロポリス原塊１Ｋｇを粉砕し、こ
れに９５％エタノール２Ｋｇを加え、温室で時々かきま
ぜながら１週間放置した。その後、この上清をろ紙（Ｎ
ｏ．２）で濾過し、プロポリス抽出液を得た。その抽出
液中、プロポリス固形分として１０％となるようにエタ
ノールで調整したエキス２Ｋｇを得た。この１０ｍｌを
とり、水９０ｍｌを加え懸濁液とした。

【００３０】このものにビリルビンオキシターゼ（天野
製薬（株）製）１００ｍｇを添加し、３５°Ｃで８時間
作用させた。反応終了後、ロータリエバポレータで溶媒
を留去した。乾固物にエタノール１０ｍｌを加え４０℃
に加温して溶解し、ろ紙で濾過した。その固形分を測定
したところ８．２％であった（酵素無処理 ８．８
％）。得られたエキスの２０μｌをとり溶媒を留去後、
ジエチルエーテルに溶かし、さらに硫酸マグネシウムを
加えて脱水した。

【００３１】これを濾過後、溶媒を留去してこのものに
トリメチルシリル化剤（トリメチルシリルアセトアミド
とトリメチルクロルシランを２：１に混合したもの）１
ｍｌを加え、５０℃で１０分間反応させた。この液２μ
ｌをガスクロマトグラフィー分析に供した。イソプレニ
ルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ酸標準品それぞ
れ、及び酵素処理のないプロポリスエキス２０μｌにジ
エチルエーテル３ｍｌを加え、分析のためにシリル化し
た。

【００３２】ガスクロマトグラフィーの条件 機器：島津製作所製 ＧＣ−１４Ａ、充填剤：シリコン
ＯＶ−１（１００〜１２０メッシュ）、SUPPORT Unipor
t HP、カラム温度：１００〜２８０℃、３℃／分で昇
温、カラム：ガラスカラム ３ｍｍ×２ｍ、キャリアガ
ス：窒素、注入温度：２００℃、検出器：水素炎イオン
化検出器（ＦＩＤ） このガスクロマトグラフィーによるクロマトグラムを図
７〜９に示した。このクロマトグラムをみてわかるとお
り、イソプレニルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ酸
のピークが消失していることが確認された。 （実施例４）実施例３のプロポリス懸濁液５０ｍｌを用
い、ビリルビンオキシターゼ１０ｍｇを添加し、３０℃
で４８時間反応させた。以下、実施例３に準じて操作
し、エキスの固形分は７．９％であった。その結果、実
施例３と同様にイソプレニルカフェ酸及びフェニルエチ
ルカフェ酸のピークが消失していることがわかった。 （実施例５）実施例３のプロポリス懸濁液１００ｍｌを
用い、カルボキシルエステラーゼ１０ｍｇを添加し、４
０℃で３時間反応させた。以下、実施例３に準じて操作
したところ、エキス固形分は７．６％であった。また、
クロマトグラムを図１０に示した。このクロマトグラム
をみてわかるとおり、イソプレニルカフェ酸及びフェニ
ルエチルカフェ酸のピークが消失していることが確認さ
れた。 （実施例６）実施例３のプロポリス懸濁液１００ｍｌを
用い、ラッカーゼ１ｍｇを添加し、３７℃で２０時間反
応させた。以下実施例３に準じて操作し、エキスの固形
分は８．４％であった。その結果、イソプレニルカフェ
酸及びフェニルエチルカフェ酸のピークが消失している
ことが確認された。 （実施例７）プロポリス原塊５００ｇに９５％エタノー
ルを２，０００ｍｌ添加し、５０℃の温浴でその塊を溶
解した。その後、室温で冷却して上層のワックス層を除
去し、下層のエタノール液をろ紙で濾過した。その抽出
液中、プロポリス固形分として１０％となるようにエタ
ノールで調整したエキス１．５Ｋｇを得た。この５０ｍ
ｌをとり、水５０ｍｌを加え懸濁液とした。

【００３３】この液にペルオキシダーゼ（シグマ社製、
ＲＺ０．５）を５０ｍｇ及び０．０１％過酸化水素を添
加し、３０℃で５時間反応させた。反応終了後、溶媒を
エバポレータで濃縮し、次いで凍結乾燥した。乾燥物に
エタノール１００ｍｌを添加し、不溶物を除去した後、
ガスクロマトグラフィーにより分析したところ、イソプ
レニルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ酸のピークが
消失していることが確認された。 （実施例８）実施例３のプロポリス懸濁液１００ｍｌを
用い、チロシナーゼ１ｍｇ及びフェノラーゼ（シグマ社
製）１ｍｇを添加し、３０℃で２４時間反応させた。以
下、実施例３に準じて操作したところ、エキスの固形分
は８．０％であった。その結果、イソプレニルカフェ酸
及びフェニルエチルカフェ酸のピークは消失しているこ
とが確認された。 （実施例９）実施例３で調製したプロポリスエキス５０
ｍｌにクエン酸ナトリウム液を同量添加し、液のｐＨを
６．０とした溶液を作製した。この溶液にチロシナーゼ
を１０ｍｇ添加して３７℃で４８時間反応させた。その
結果、イソプレニルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ
酸のピークが消失していることが確認された。 （実施例１０）実施例９と同様にして、ｐＨ７．０の溶
液を作製し、この溶液にカルボキシルエステラーゼを５
ｍｇ添加して３７℃で４８時間反応させた。その結果、
イソプレニルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ酸のピ
ークが消失していることが確認された。 （実施例１１）実施例３のプロポリス懸濁液１００ｍｌ
を用い、フェノラーゼ１００ｍｇを添加し、３７℃で１
６時間反応させた。この反応液２００μｌをとり、溶媒
を留去後、ジエチルエーテル３ｍｌを加え、以下実施例
３に準じて操作し、ガスクロマトグラフィーにより分析
した。その結果を図１１に示す。この図に示すように、
イソプレニルカフェ酸及びフェニルエチルカフェ酸のピ
ークが消失していることが確認された。 （試験例３、過酸化脂質生成阻害（抗酸化）作用の確
認）リノレン酸メチル（東京化成工業（株）製、予めシ
リカゲルクロマトにより精製し、メタノールに溶解して
保存したもの）１４．６ｍｇを０．５％のポリエチレン
グリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル
（ナカライテスク（株）製の商品名トリトンＸ−１０
０）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０５ｍｌに懸
濁させた。実施例３、７及び９のプロポリスエキスの固
形分２０μｇあるいは５０μｇ相当量をそれぞれ採取
し、真空濃縮で溶媒を留去した。これに上記リノレン酸
溶液５ｍｌを添加した後、各懸濁液に対して紫外線（日
立製ランプ、ＧＬ−１５，１８Ｗ，照射距離２０ｃｍ）
を１時間照射した。各懸濁液は時々撹拌した。対照とし
てリノレン酸溶液５ｍｌのみで試験したものや紫外線を
照射しないものも試験した。

【００３４】各懸濁液より０．２ｍｌ採り、０．３３５
％チオバルビツール酸試液（チオバルビツール酸１．０
０５ｇを蒸留水９０ｍｌに加温溶解し、冷却後酢酸で３
００ｍｌに定容）を５ｍｌ加えて撹拌した後、９５℃の
湯浴中で３０分間加熱した。冷却後、ｎ−ブタノール−
ピリジン混液（１５：１）５ｍｌを加えて良くふりま
ぜ、遠心分離したブタノール層について５３０ｎｍの吸
光度を測定した。

【００３５】この方法は紫外線照射により生成した過酸
化脂質の量を測定するものである。その値については、
プロポリスエキスを添加して紫外線照射した場合をａ，
しない場合をｂ、プロポリスエキスを加えないで紫外線
を照射した場合をａ′、しない場合をｂ′とし、次式を
もってそれぞれのプロポリスエキスの酸化阻害率を求め
た。

【００３６】阻害率（％）＝〔１−（ａ−ｂ／ａ′−
ｂ′）〕×１００ その結果を表１に示す。表中の数字は阻害率（％）を示
す。

【００３７】

【表１】

【００３８】この結果より、従来のプロポリスエキスと
この発明のプロポリエキスは共に微量で過酸化脂質の生
成に対し強い阻害作用を有していることが判った。従っ
て、効力の違いも殆どないことが明かになった。 （試験例４）次に、上記のようにして得られたプロポリ
スと従来のプロポリスについて有刺激性を調べるため、
モルモットを用い、以下に示すようなマクシミゼーショ
ン法に基づき試験した。

【００３９】体重３００〜３５０ｇの雌モルモットの肩
甲骨上を４×６ｃｍの広さに刈毛した。図１２に示すモ
ルモットＭの背中において、、及びで示す破線の
位置の複数箇所に下記の試料を皮下注射した。なお、使
用したプロポリスエキスは酵素処理のないもの及び実施
例５，９で得られたもの（各々エキス５，９）をそれぞ
れの固形分濃度になるようにエタノールにより調整し
た。

【００４０】 ０．１ｍｌのフロイントの完全アジュバント ０．１ｍｌのプロポリスエキス（固形分１０％） ０．１ｍｌのフロイントの完全アジュバントでｗ／ｏ
浮化物にしたプロポリスエキス 皮下注射１週間目にプロポリスエキス（固形分２０％）
を２×４ｃｍの動物用パッチテスト用絆創膏に塗布し、
閉鎖貼布を４８時間行った。閉鎖貼布後２週間目に、図
１２に示すモルモットＭのわき腹Ｓの毛を５×５ｃｍの
広さに刈り、その部分に２×２ｃｍの動物パッチテスト
用絆創膏に２０％、１０％及び１％のエキスを塗布し、
２４時間閉鎖貼布した。除去後、２４時間目に下記表２
の判定基準で有刺激性を判断した。

【００４１】

【表２】

【００４２】この方法にい従い、行った試験の結果を表
３に示した。試験は１群５匹で実施した。

【００４３】

【表３】

【００４４】上記結果で判るように、酵素処理のないプ
ロポリスエキスは皮膚に対し刺激性を与えるのに対し、
処理をしたものは両者ともその濃度に関係なく、皮膚に
対して刺激性がなく安全なものであることが証明され
た。

【００４５】次いで、この試験例の無アレルギー性プロ
ポリスは食品としても広く応用が期待されるため、その
経口急性毒性試験を行なった。 （試験例５）マウスは４週令の雌雄Ｓｉｃ：ｄｄＹ系を
静岡実験動物農業協同組合から購入した。１３日間の検
疫飼育後、順調な発育を示したマウスを１群１０匹と
し、６週令で実験に用いた。検疫飼育ならびに検体投与
後の観察期間を通じて温度２３±２℃、湿度５５±５
％、オールフレッシュ換気回数１２回／時、午後６時か
ら１２時間照明に条件設定されたセミバリアシステム飼
育室内において、ＰＣケージで１０匹ずつ収容し、固形
飼育（ＣＥ−２、日本クレア）とろ過水道水を自由に摂
取させて飼育した。

【００４６】プロポリスは実施例３で得られたエキス２
部に乳糖１部及びバレイショデンプン１部を加えて、よ
く撹拌混合し粉末としたものを使用した。このものに、
０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液
を添加し、５．０ｇ／２０ｍｌの懸濁液を調整した。

【００４７】投与量は２０ｍｌ／Ｋｇとし、最大投与量
は金属性胃ゾンデ通過可能な量である５．０ｇ／Ｋｇと
した。対照群には０．５％カルボキシメチルセルロース
ナトリウム水溶液を用いた。

【００４８】１７時間絶食後、プロポリスを金属性胃ゾ
ンデを用いて１回強制的に経口投与し、以後１４日間一
般症状と生死を観察した。また、投与後１，２，３，
７，１０及び１４日目に体重を測定した。その結果を表
４及び表５に示した。

【００４９】

【表４】

【００５０】

【表５】

【００５１】上記の結果から、最大投与量においても何
ら中毒症状は観察されず、１匹の死亡例もなかった。従
って、この実施例の無アレルギー性プロポリス製品は安
全なものであることが証明された。 （実施例１２）実施例１で得られた無アレルギー性プロ
ポリスを用いて、以下の処方によりカプセル剤を調製し
た。

【００５２】無アレルギー性プロポリス ２０ｇ、乳糖
５０ｇ、バレイショデンプン ３０ｇ、タルク ３ｇ （実施例１３）実施例１で得られた無アレルギー性プロ
ポリスを用いて、以下の処方により化粧品用クリーム剤
を調製した。

【００５３】無アレルギー性プロポリス ２ｇ、ミツロ
ウ １１ｇ、パラフィンワックス６ｇ、イソプロピルミ
リステート ６ｇ、スクワレン ８ｇ、流動パラフィン
２８ｇ、アラントイン ０．５ｇ、ＰＯＥソルビタンモ
ノステアレート １．５ｇ、ソルビタンモノステアレー
ト ４ｇ、防腐剤 適量、プロピレングリコール２ｇ、
ホウ砂 １ｇ、水 ２８ｇ。

【００５４】無アレルギー性プロポリスからプロピレン
グリコールまでを混合し、これに約７５℃で加熱したホ
ウ砂、水の混合液を撹拌しながら加え、冷却して５５℃
で香料を適宜加え、４５℃まで撹拌を続ける。これを放
置してクリームとなした。

【００５５】

【発明の効果】以上詳述したように、この発明のプロポ
リス製品は、酵素の作用によりプロポリス中のアレルギ
ー物質はアレルギー性が実質的に発現されない程度に消
失され、アレルギーを誘発するおそれがないという優れ
た効果を奏する。また、この発明のプロポリス製品はア
レルギー物質以外の成分、例えばフラボノイド類等の活
性成分は保持され、プロポリス本来の薬理作用を十分に
発揮させることができ、その上毒性の点においても安全
であるという優れた効果が得られる。

【００５６】加えて、この発明のプロポリス製品の製造
方法によれば、アレルギー性が実質的に発現されないプ
ロポリス製品が容易に、しかも確実に得られるという優
れた効果を発揮する。従って、この発明は、食品分野、
化粧品分野及び許容されれば漢方的、医療的分野に適用
することができて幅広い応用が可能となり、産業上極め
て有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明を具体化した実施例１における酵素処
理をしない場合の高速液体クロマトグラフィーによるク
ロマトグラムである。

【図２】同じく実施例１のチロシナーゼ処理をした場合
の高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムで
ある。

【図３】同じく実施例１のカルボキシルエステラーゼ処
理をした場合の高速液体クロマトグラフィーによるクロ
マトグラムである。

【図４】実施例２における酵素処理をしない場合の高速
液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。

【図５】実施例２のカルボキシルエステラーゼ処理をし
た場合の高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグ
ラムである。

【図６】実施例２のビリルビンオキシターゼ処理をした
場合の高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラ
ムである。

【図７】実施例３でイソプレニルカフェ酸及びフェニル
エチルカフェ酸を用いた場合のガスクロマトグラフィー
によるクロマトグラムである。

【図８】実施例３で酵素処理をしない場合のガスクロマ
トグラフィーによるクロマトグラムである。

【図９】実施例３でビリルビンオキシターゼ処理をした
場合のガスクロマトグラフィーによるクロマトグラムで
ある。

【図１０】実施例３でカルボキシルエステラーゼ処理を
した場合のガスクロマトグラフィーによるクロマトグラ
ムである。

【図１１】実施例１１でフェノラーゼ処理をした場合の
ガスクロマトグラフィーによるクロマトグラムである。

【図１２】皮膚刺激性の試験に用いたモルモットを示す
平面図である。

【符号の説明】

Ｍ…刺激性を調べるためのモルモット

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロポリスを含有し、酵素の作用により
   アレルギー物質をアレルギー性が実質的に発現されない
   程度に消失させたプロポリス製品。
2. 【請求項２】 前記酵素が加水分解酵素又は酸化還元酵
   素である請求項１に記載のプロポリス製品。
3. 【請求項３】 前記加水分解酵素がエステラーゼである
   請求項２に記載のプロポリス製品。
4. 【請求項４】 前記酸化還元酵素がラッカーゼ、チロシ
   ナーゼ、フェノラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ及びペ
   ルオキシダーゼからなる群より選ばれた１種以上の酵素
   である請求項２に記載のプロポリス製品。
5. 【請求項５】 プロポリスに酵素を作用させ、アレルギ
   ー物質をアレルギー性が実質的に発現されない程度に消
   失させたことを特徴とするプロポリス製品の製造方法。