CN117425507A - 多层羊膜组织移植物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织移植物产品，其包括细胞外基质的多个层积层，其中所述细胞外基质来源于羊膜，并且其中细胞外基质层的基质侧存在于所述组织移植物产品的上表面和下表面两者上。还提供了制备和使用所述组织移植物产品的方法。

Description

多层羊膜组织移植物及其用途

本申请要求于2021年4月13日提交的美国临时专利申请号63/174,280和2022年2月10日提交的美国临时专利申请号63/267,820的优先权，这些申请的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明部分涉及多层羊膜组织移植物及其在眼部应用中的用途。

背景技术

人羊膜(amniotic membrane)(羊膜(amnion))是羊膜囊的最内层，其与羊水直接接触。该人羊膜由单层立方形上皮细胞、基底膜和松散附着于绒毛膜的无血管基质组成。据报道，人羊膜的主要组分是胶原蛋白和弹性蛋白。其他生化组分，诸如层粘连蛋白和蛋白聚糖，也少量存在。

BIOVANCE由人羊膜制成。使原材料羊膜经受冲洗和脱细胞过程，其旨在清洁血液组分污染并从膜中去除细胞而不改变天然的基于胶原蛋白的架构。将经清洁且脱细胞的羊膜在50℃的温和温度下脱水，使得最终产品易于储存、运输并具有更长的保质期。该产品最终使用电子束辐射进行灭菌。

羊膜(AM)用于眼表重建，以治疗各种眼部病变，包括伴有和不伴有角膜缘干细胞缺陷的角膜表面疾病、作为用于角膜缘上皮细胞离体扩增的载体、结膜表面重建(例如，翼状胬肉切除、除翼状胬肉以外的大病灶切除后、睑球粘连分离后)、青光眼、瘤形成、翼状胬肉以及巩膜溶解和穿孔(Walkden，2020；Elhassan，2019；Malhotra&Jain，2014，Mamede等人2012)。

AM可用作补片或移植物。通过将AM上皮细胞朝上放置，AM充当用于上皮细胞生长的底物和支架(Malhotra&Jain，2014)。作为补片，AM充当临时生物绷带或接触镜片，促进补片下方宿主组织的再上皮化(Walden，2020，Malhotra&Jain，2014)。将AM作为补片基质侧朝下放置被认为可以通过捕获炎症细胞并诱导细胞凋亡来下调炎症反应(Dua等人2004)。因此，在存在急性炎症的情况下，尤其是当与上皮缺陷相关时，将AM以基质侧朝下放置，以保护眼部表面免受炎症细胞和介体的影响(Malhotra&Jain，2014；Mamede等人2012)。

表1基于眼部病理学将AM作为移植物或补片的用途(Safa Elhassan，2019；Understanding Amniotic Membrane Grafts)。

AM定向及应用方法：应用方法的选择取决于使用适应症、期望的结果以及伤口的深度和大小(Walkden，2020；Elhassan，2019；Malhotra&Jain，2014)。

文献中一致报道了三种应用方法：

嵌体技术(永久移植物)；

高嵌体技术(临时生物绷带或接触镜片)；和

组合嵌体-高嵌体技术(永久移植物及临时生物绷带)。

嵌体技术(永久移植物)：将AM以上皮/基底膜侧朝上放置，以为宿主细胞提供可以在上面生长的底物。随着时间的推移，AM基质经重塑成宿主角膜。因此，其充当永久移植物。

AM经修剪以适应缺陷，以上皮侧朝上放置，并且通常被缝合至角膜。大约2mm的宿主角膜上皮被清除。这允许再生上皮在AM的上皮/基底膜上方生长。根据缺陷的大小，可以使用单层或多层技术。通过多层技术，AM可以被切割成几块或毯状折叠(blanket folded)。

高嵌体技术(临时生物绷带或接触镜片)：因为宿主上皮意欲在膜下生长，AM可以以上皮/基底膜侧朝上放置或以基质侧朝上放置。预期AM会在一段时间内脱落、去除或自行降解。因此，AM充当临时生物绷带或接触镜片，提供物理屏障。其无意并入到宿主组织中。

AM的大小大于缺陷，使得在膜下方存在宿主上皮。其被缝合或胶合到合适的位置。

组合嵌体-高嵌体技术：该技术组合了嵌体技术和高嵌体技术。如上文所述，将AM在缺陷处以上皮侧朝上放置，并且预期该AM会并入到宿主组织中。可以使用单层技术或多层技术。该技术与高嵌体技术相结合，其中将移植物以上皮/基底膜侧朝上放置或以基质侧朝上放置，延伸超出缺陷的周边。通过这种技术，预期上皮会在补片下方但在最上面的嵌体移植物上方生长。

发明内容

本发明提供组织移植物产品，其包括层积在一起的多层细胞外基质，其中该细胞外基质来源于羊膜，并且其中细胞外基质层的基质侧存在于该组织移植物产品的上表面和下表面两者上。

本发明还提供包括本发明的组织移植物产品的眼组织移植物。

本发明还提供治疗受试者的眼睛疾病或损伤的方法，该方法包括使该受试者的眼睛与本发明的组织移植物产品或眼组织移植物接触的步骤。

附图说明

图1显示了依据侧面和羊膜的细胞黏附。绘制了平均值和标准差。以荧光强度(AU)测量细胞黏附。

图2显示了细胞增殖。绘制了平均值和标准差。

图3显示了相对增殖率。绘制了平均值和标准差。

图4显示了羊膜的迁移面积。绘制了平均值和标准差。迁移面积报告为px²。

图5显示了历经7天AM的E侧及S侧上的细胞活力。与DDHAM-S相比，*p≤0.05。

图6显示了4天后，AM的S侧上的细胞用钙黄绿素AM染色以显现活细胞(A)，并用鬼笔环肽染色以显现肌动蛋白(B)。

图7显示了在AM上培养24h、48h和72h的HCEC中TNFa的基因表达。*p≤0.05。

图8A和图8B显示了羊膜的免疫荧光和H&E染色。显示了DDHAM、DHAM和CHAM的免疫荧光染色(A)。膜的横截面用Hoechst染料(DNA呈蓝色)、鬼笔环肽(肌动蛋白呈绿色)和抗人I型胶原抗体(Col1呈红色)染色。显示了代表性图像并且比例尺＝50um。显示了DDHAM、DHAM和CHAM的H&E染色(细胞核呈蓝色，且细胞质呈红色)(B)。显示了代表性图像并且比例尺＝20um。

图9显示了细胞黏附。将人角膜上皮细胞接种到羊膜的上皮侧和基质侧上并孵育24h。显示了每种羊膜的上皮侧与基质侧之间的比较，并且显示了每侧羊膜之间的比较。绘制了平均值和标准差。荧光强度以任意单位(AU)表示。所示数据为平均值±SD。*p≤0.05。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜。

图10显示了第4天AM上人角膜上皮细胞的染色。将人角膜上皮细胞接种到三种AM的基质侧上，进行培养，并在第4天用钙黄绿素AM染色以显现活细胞(A)。通过第4天的肌动蛋白染色和伪色红色来监测AM上人角膜上皮细胞的形态(B)。使用落射荧光显微镜捕获图像。比例尺＝100μm。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜。

图11A和图11B显示了随时间推移的细胞活力。将人角膜上皮细胞接种到羊膜的上皮侧和基质侧上并孵育1、4和7天。在每个时间点通过阿尔玛蓝(阿尔玛蓝)测定来测量羊膜上细胞的活力。荧光强度以任意单位(AU)表示。绘制羊膜的每一侧随时间推移的平均值和标准差(A)。绘制每种羊膜随时间变化的相对细胞活力(以第1天的百分比表示)和标准差。显示了每种羊膜的上皮侧与基质侧之间的比较，并显示了每侧羊膜之间的比较。所示数据为平均值±SD。*p≤005。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜。

图12A和图12B显示了迁移的定量。所示的代表性划痕损伤图像展现了条件培养基在0h和24h时对人角膜上皮细胞迁移的影响(A)。对来自不同羊膜(有细胞和无细胞)的条件培养基进行测试，以评估单独的AM对人角膜上皮细胞迁移的影响(B)。使用Image J测量伤口面积并以正方形像素(px2)表示。迁移的面积＝面积0h-面积24h。所示数据为平均值±SD。*p≤0.05。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜；培养基对照，对照。

图13A-图13D显示了24小时时的mRNA表达。显示了GM-CSF(A)、IL-6(B)、IL-8(C)和TNF-α(D)在24小时时的相对mRNA表达。将24小时时的相对mRNA表达归一化为静息条件下的TCP。所示数据为平均值±SD。*p≤0.05。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜；GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；IL-6，白介素-6；IL-8，白介素-8；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

图14A-图14D显示了随时间变化的mRNA表达。显示了刺激条件(+TNF-α)下GM-CSF(A)、IL-6(B)、IL-8(C)和TNF-α(D)随时间变化的相对mRNA表达。随时间变化的相对mRNA表达归一化为24小时时的表达。在刺激条件下针对每种羊膜在时间点之间进行统计比较。所示数据为平均值±SD。*p≤0.05。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜；GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；IL-6，白介素-6；IL-8，白介素-8；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

图15A-图15F显示了临床案例研究。拍摄上皮表面的图像以说明临床过程：术前，显示上皮的不良不规则表面(A)，从前基膜营养不良中去除具有可见的上皮下碎片的不良上皮后(B)，对所有上皮下瘢痕和前基底膜营养不良碎片去毛刺后(C)，放置DDHAM(D)，在DDHAM上方放置绷带接触镜片(E)，并在术后一个月，显示出清晰的表面。

图16A-图16C显示了眼部AM制备。DDHAM包装为10mm圆盘(A)。为了研究，使用10mm活检穿孔器将DHAM(B)和CHAM(C)制成10mm圆盘。缩写：CHAM，冷冻保存的人羊膜；DDHAM，脱细胞脱水的人羊膜；DHAM，脱水的人羊膜。

图17显示了允许Biovance 3L目镜干燥成弧形形状的3D打印模具的模型。

图18显示了已干燥成弧形形状的Biovance 3L目镜。

具体实施方式

本发明提供组织移植物产品，其包括层积在一起的多层细胞外基质，其中该细胞外基质来源于羊膜，并且其中细胞外基质层的基质侧存在于该组织移植物产品的上表面和下表面两者上。

在一些实施例中，产品包括三层或更多层细胞外基质。在一些实施例中，产品包括恰好三层细胞外基质。

在一些实施例中，羊膜是脱细胞的。在一些实施例中，用洗涤剂和或机械破碎使羊膜脱细胞。在一些实施例中，洗涤剂是脱氧胆酸。

在一些实施例中，多层细胞外基质通过干燥来层积在一起。在一些实施例中，产品通过加热和或真空进行干燥。

在一些实施例中，组织移植物产品是脱水的。在一些实施例中，产品包含按干重计小于约20％的水。在一些实施例中，产品包含按干重计小于约15％的水。在一些实施例中，产品包含按干重计约10％的水。

在一些实施例中，产品包含按干重计约40％至约70％的总胶原蛋白。在一些实施例中，产品包含按干重计约45％至约60％的总胶原蛋白。在一些实施例中，产品包含按干重计约50％至约55％的总胶原蛋白。在一些实施例中，胶原蛋白主要是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白。

在一些实施例中，产品包含按干重计约8％至约24％的弹性蛋白。在一些实施例中，产品包含按干重计约12％至约20％的弹性蛋白。在一些实施例中，产品包含按干重计约15％至约20％的弹性蛋白。

在一些实施例中，产品包含按干重计小于约1％的糖胺聚糖。在优选的实施例中，产品包含按干重计小于约0.5％的糖胺聚糖。在一些实施例中，产品包含按干重计小于约1％的纤连蛋白。在优选的实施例中，产品包含按干重计小于约0.5％的纤连蛋白。在一些实施例中，产品包含按干重计小于约1％的层粘连蛋白。在优选的实施例中，产品包含按干重计小于约0.5％的层粘连蛋白。

在一些实施例中，羊膜是人羊膜。在一些实施例中，羊膜来源于足月妊娠。

本发明还提供包括本发明的组织移植物产品的眼组织移植物。

在一些实施例中，眼组织移植物是大致圆形的。在一些实施例中，眼组织移植物包括呈球体的一部分的形状的弧形部分。

在一些实施例中，通过将组织移植物产品干燥到模具上来赋予形状。

本发明还提供治疗受试者的眼睛疾病或损伤的方法，该方法包括使该受试者的眼睛与本发明的组织移植物产品或眼组织移植物接触的步骤。

在一些实施例中，眼睛的损伤包括擦伤。在一些实施例中，眼睛的损伤包括化学品暴露。在一些实施例中，眼睛的损伤包括割伤或撕裂伤。在一些实施例中，眼睛的疾病或损伤包括角膜的疾病或损伤。

在一些实施例中，治疗包括受损组织的修复。在一些实施例中，治疗包括相对于未经治疗的眼睛减少瘢痕组织或减少疤痕组织形成。在一些实施例中，治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞迁移。在一些实施例中，治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞黏附。在一些实施例中，治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞增殖。在一些实施例中，治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞覆盖。

在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在优选的实施例中，受试者是人。

实例

实例1：Biovance的生化组成

BIOVANCE主要由胶原蛋白和弹性蛋白构成。还少量存在糖胺聚糖、纤连蛋白和层粘连蛋白。

表2：生化组成。

*列为“其他”的蛋白质包括但不限于V、VI和VII型胶原蛋白，整合蛋白和纤连蛋白前体。

表3：胶原蛋白亚型组成

实例2：眼支架对人眼上皮细胞的作用的比较研究

羊膜支架由于其独特的生物学特性已被用于治疗各种眼部疾病。实验台数据表明支架的再生特性可以影响先天愈合机制。羊膜支架可有助于加速自然愈合并减少主观疼痛和手术并发症。尽管大量研究记录了羊膜支架的固有再生能力，但组织的获取和处理仍在不断发展。还需要额外的努力以阐明何种处理方法可以生产出适合眼科应用的理想支架。

目的：为了确定三种羊膜支架(Biovance3L Ocular、)对人眼上皮细胞黏附和增殖的影响。

方法：将人角膜上皮细胞(HCEC)和人结膜上皮细胞(HConEpiC)接种到孔中。在第1天、第4天和第7天测量支架上的黏附和增殖。从孔中提取条件培养基并用于生长测定。

结果：与其他两种支架相比，Biovance3L Ocular显示出显著更高的上皮细胞活力(P＜0.001)，并且表现出显著更大的上皮细胞黏附(P≤0.011)。此外，相较于上，Biovance3L上的上皮细胞增殖率显著更大(P＜0.001)。在存在来自于Biovance3L Ocular和/>上培养的细胞的条件培养基的情况下，HCEC迁移相当(P＝0.885)，并且显著大于/>上生长的细胞(P≤0.006)。在存在来自于眼支架上培养的细胞的条件培养基的情况下，HCEC的迁移显著大于来自组织培养塑料上生长的细胞的对照条件培养基(P＜0.001)。来自不同支架的条件培养基并不影响HConEpiC的迁移。

结论：当与其他支架相比时，Biovance3L Ocular通过支持HCEC和HConEpiC两者更高的活力、黏附和增殖，而对人类上皮细胞具有显著影响。需要额外的研究来评估这些发现的临床影响。

总结：将Biovance3L Ocular与市场竞争对手和/>进行比较，以确定各种测定中的细胞生长差异。当与其他支架相比时，Biovance3L表现出HCEC和HConEpiC的优异活力、黏附和增殖。Biovance3L Ocular不含残留细胞、DNA、生长因子和细胞因子，对于眼上皮细胞表现出优异的生长测量结果，这对于实现自然修复和再生至关重要。

实例3：Biovance 3L

背景：羊膜具有广泛的临床用途。通常，在临床应用中使用单层膜。

据文献证明，如与基质侧相比，角膜上皮细胞再上皮化的优选定向是羊膜的上皮侧，其支持再上皮化。

例如，D.J Hu(Investigative Ophthalmology&Visual Science 2003年5月，第44卷，3151)比较了在角膜缺陷上以以下两个定向缝合的羊膜(AM)上方的角膜再上皮化：AM基底膜前(BMA)侧和AM基底膜后(BMP)侧。他的结论是角膜再上皮化率不受AM定向的影响。无论定向如何，角膜上皮都对AM的基底膜(上皮侧)具有更大的亲和力。临床医师应考虑这一发现并认识到，虽然上皮可能在羊膜的两侧上生长，但大部分再上皮化发生在基底膜表面上。

我们的研究问题/假设：羊膜(AM)的偏侧性(即上皮侧、基质侧)和不同的膜处理方法(即DDHAM、DHAM和CHAM)如何影响HCEC的黏附、增殖和迁移？

此外，我们的假设是，我们专有的脱细胞工艺旨在完全去除残留的细胞组分、细胞、细胞碎片、DNA、生长因子和细胞因子，并保留呈天然3维形式的具有基本细胞外基质分子的完整先天胶原蛋白框架，与其他含有残留细胞、细胞碎片、DNA以及生长因子和细胞因子的羊膜衍生产品相比，提供了优异的生物相容性和支持细胞分化功能的能力。

我们设想了一种3层膜，称为3L，其与单层膜的不同之处在于，这三层代替一层而一起干燥，从而形成新的材料配置。在膜干燥工艺之前添加了新颖的分层步骤，从而创造出具有意想不到的新特性和临床用途的产品。作为这种新颖组合物的一部分，羊膜是分层的，使得该羊膜有三层厚，其中基质侧在顶部和底部朝外。将这种膜自身分层并干燥，以从同一羊膜中产生三层的膜。

我们的新产品由从胎盘中剥离并放入温和的洗涤剂(1％脱氧胆酸)中进行浸泡的羊膜组成。使该羊膜经历机械刮擦，旨在从羊膜的表面中去除近100％的羊水细胞和绒毛膜细胞，以及从组织的物质中去除绝大多数的成纤维细胞。

最终产品是由细胞外基质构成的三层羊膜结构组织，其保留了羊膜的天然胶原蛋白结构，包括与胶原蛋白和其他基质组分结合的弹性蛋白和纤连蛋白。

在膜干燥工艺之前添加了新颖的分层步骤，从而创造出具有意想不到的新特性和临床用途的产品。

作为这种新颖组合物的一部分，羊膜是分层的，使得该羊膜有三层厚，其中基质侧在顶部和底部朝外。干燥后，将羊膜切成所需的尺寸，将每个单独的羊膜块放入内袋中，贴上标签，密封并灭菌。

Biovance 3L的意外结果与3L BIOVANCE Ocular的基质侧相对于上皮侧上的人角膜上皮细胞和人结膜细胞附着、增殖和迁移的差异有关。此外，脱细胞工艺对羊膜性能具有影响。

统计分析：自变量是AM(DDHAM、DHAM、CHAM)、侧面(上皮侧、基质侧)和时间(第1天、第4天和第7天)。因变量是细胞黏附、增殖和迁移。以下结果适用于以下三种羊膜(AM)的上皮侧和基质侧两者上的人角膜上皮细胞：Biovance3L Ocular(DDHAM)、AMBIO2(DHAM)和AmnioGraft(CHAM)。

数据显示为平均值±标准差(SD)。对数据进行测试并发现其为近似正态分布。通过双因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验来分析细胞黏附和迁移。通过三因素ANOVA与Tukey事后检验来分析细胞增殖。ANOVA结果以F统计量及其相关自由度的形式报告。当指示时，将未配对的t检验作为事后检验进行。p值＜0.05被认为是显著的。所有分析均使用IBMSPSS(构建版本1.0.0.1444)进行。

Tri-layer是一种三层、脱细胞、脱水的人羊膜(DDHAM)，其具有保留的天然上皮基底膜和完整的细胞外基质结构与其生化组分。该同种异体移植物的上皮基底膜和细胞外基质提供了允许细胞附着或浸润和生长因子储存的天然支架。/>Tri-layer提供保护罩并支持身体的伤口愈合过程。/>Tri-layer目前以3L/>和/>3L Ocular的形式市售。

Tri-layer，即脱细胞、脱水的人羊膜(DDHAM)由从胎盘中剥离并放入温和的洗涤剂(1％脱氧胆酸)中进行浸泡的羊膜组成。使该羊膜经历机械刮擦，旨在从羊膜的表面中去除近100％的羊水细胞和绒毛膜细胞。还从组织的物质中去除绝大多数的成纤维细胞。该膜自身分层并干燥，以产生/>的三层产品版本。最终产品是由细胞外基质构成的结构组织，其保留了羊膜的天然胶原蛋白结构，包括与胶原蛋白和其他基质组分结合的纤连蛋白。成品是三层羊膜，不含细胞、激素、生长因子和细胞因子。

为了简化和优化Tri-layer的制造工艺，工艺开发团队利用了工艺的所有处理步骤。在干燥膜之前添加分层步骤。灭菌步骤和放行标准也从工艺沿用至/>Tri-layer工艺。

将羊膜收集到1％脱氧胆酸溶液中并且可在2-8℃储存至多14天。收到合格的母体血检结果后，将羊膜从储存物中取出并开始处理。使羊膜在分层之前经历一系列人工刮擦和洗涤。羊膜是分层的，使得该羊膜有三层厚，其中基质侧在顶部和底部朝外。干燥后，将羊膜切成所需的尺寸，将每个单独的羊膜块放入内袋中，贴上标签，密封并提交进行目视检查。在目视检查期间，针对大小、形状、孔洞、裂口/撕裂、碎片和污渍对组织进行检查。目视检查后，将内袋中的每块羊膜放入到带有标签的外袋中，密封并灭菌。结果：

细胞黏附：

AM的基质侧上的细胞黏附(12,342.42±4,536.60AU)大于其上皮侧(9,788.50±5,704.17AU)(侧面主效应，F(1，18)＝6.714，p＝0.018)，这可能归因于与DHAM的基质侧(13,100.25±4,675.24AU，p＝0.017)、DDHAM的上皮侧(16,725.25±1,453.62AU，p＜0.001)、CHAM的上皮侧(8,392.50±1,425.86AU，p＜0.001)、DDHAM的基质侧(16,334.75±591.85AU，p＝0.002)和CHAM的基质侧(7,592.25±1,073.22AU，p＜0.001)(侧面×AM，p＝0.001)相比，DHAM的上皮侧上较低的细胞黏附(4,247.75±2,732.87AU)。

此外，AM之间的细胞黏附也存在显著差异(AM主效应，F(2，18)＝30.896，p＜0.001)，其中DDHAM上的细胞黏附(16,530.00±1,048.46AU)显著大于DHAM(8,674.00±5,912.61AU，p＜0.001)和CHAM(7,992.38±1,244.16AU，p＜0.001)。然而，如上文所指示，细胞黏附随侧面和AM而不同。DDHAM的上皮侧与DDHAM的基质侧之间(p＝0.645)以及CHAM的上皮侧与CHAM的基质侧之间(p＝0.404)的细胞黏附相似。然而，DHAM的基质侧上的细胞黏附显著大于DHAM的上皮侧(P＝0.017)。因此，DDHAM的基质侧和上皮侧上的细胞黏附显著大于DHAM的上皮侧(p≤0002)、CHAM的上皮侧(事后检验，p＜0.001)和CHAM的基质侧(事后检验，p＜0.001)，而DDHAM的基质侧与DHAM的基质侧之间的细胞黏附相似(p＝0.219)。

表4.依据侧面和羊膜的细胞黏附。提供了平均值和标准差。

*上皮侧与基质侧之间具有统计学上的显著差异。

细胞增殖：

虽然在7天的培养过程中，活细胞数量显著下降(时间主效应；(F(2，54)＝44.880，p＜0.001)，但细胞数量随侧面、AM和时间而显著变化(侧面×AM×时间交互效应；(F(4，54)＝3.633，p＝0.011)。最值得注意的是，除第4天的DDHAM的基质侧外，针对所有变量随时间变化的细胞数量都有所下降。第4天，DDHAM的基质侧上的相对增殖率(115.29±15.54％)显著大于DDHAM的上皮侧(52.27±14.41％，p＜0.001)、DHAM的上皮侧(12.54±16.79％，p＝0.012)和CHAM的基质侧(15.00±6.73％，p＜0.001)。DDHAM的基质侧与CHAM的上皮侧之间(46.83±25.69％，p＝0.731)或DDHAM的基质侧与DHAM的基质侧之间(95.54±44.25％，p＝0.430)的相对增殖率无显著差异。然而，DHAM的基质侧显著大于CHAM的基质侧(p＝0.012)。尽管细胞数量从第4天开始下降，但在第7天，DDHAM的基质侧上的相对增殖率(59.47±28.48％)显著大于CHAM的基质侧(6.87±1.77％，p＝0.035)和DHAM的上皮侧(7.54±5.84％，p＝0.017)。

AM的基质侧上的细胞数量(9,383.33±6,469.15AU)也显著大于其上皮侧(5,648.00±5,312.56AU，主效应侧面；F(1，54)＝39.545，p＜0.001)，这很大程度上是由于DDHAM和DHAM的基质侧上的细胞显著多于上皮侧而驱使(侧面×AM交互效应；p＜0.001)；DDHAM基质：14,972.00±4,973.00AU相对于DDHAM上皮：10,438.50±5,555.98AU，p＝0.047；DHAM基质：10,103.33±4,336.49AU相对于DHAM上皮：1,590.42±2,431.25AU，t(22)＝5.932，p＜0.001)。相反，CHAM的上皮侧(4,915.08±3,072.42AU)和基质侧(3,074.67±3,401.09AU，p＝0.178)上的细胞数量相似。

AM之间的细胞数量也存在显著差异(主效应AM；F(2，54)＝79.570，p＜0.001)，其中DDHAM(12,705.25±5,652.67AU)上的细胞显著多于CHAM(3,994.88±3,306.13AU，p＜0.001)。DDHAM与DHAM之间(5,846.88±5,543.10，P＝0.065)或DHAM与CHAM之间(p＝0.085)的细胞数量没有显著差异。DHAM和CHAM的相似细胞计数可以通过DHAM的上皮侧上的低细胞计数(1,590.42±2,431.25AU)来解释，该细胞计数显著低于DHAM的基质侧(10,103.33±4,336.49AU，p＜0.001)、DDHAM的基质侧(14,972.00±4,973.00AU，p＜0.001)、DDHAM的上皮侧(10,438.50±5,555.98AU，p＜0.001)和CHAM的上皮侧(4,915.08±3,072.42AU，p＝0.008)。DHAM的上皮侧和CHAM的基质侧上的细胞计数相似(3,074.67±3,401.09AU，p＝0.117)。

表5.依据侧面、羊膜和时间的细胞增殖。提供了平均值和标准差。以荧光强度(AU)测量细胞增殖。

细胞迁移：

AM之间的细胞迁移显著不同(AM主效应；F(2，49)＝6.819，p＝0.002)，其中DDHAM(466,085.13±98,339.52px²)上的细胞迁移显著大于CHAM(344,471.06±106,094.18px²，p＝0.003)。此外，培养基对照上的细胞迁移显著低于DDHAM(p＜0.001)、DHAM(420,349.88±95,109.86px²，p＜0.001)和CHAM(p＜0.001)。不存在侧面的主效应，这表明AM的上皮侧(421,669.96±113,435.95px²)和基质侧(389,934.08±107,979.51px²，F(1，49)＝0.701，P＝0.407)上的细胞迁移相似。跨羊膜和侧面的细胞迁移在统计学上并无不同(p＝0.159)。

表6.迁移面积。提供了计数、平均值和标准差。迁移面积报告为px²。

*与DDHAM相比具有统计学上显著差异。

与培养基对照相比具有统计学上显著差异。

实例4：脱细胞脱水的人羊膜衍生的生物材料支持人角膜上皮细胞功能和炎症反 应

目的陈述：基于脱细胞组织的生物材料成功应用于伤口愈合需要支持细胞功能和分化的基质组分。羊膜(AM)是来源于人类胎盘组织的天然生物材料，其具有使其适合用于眼部愈合的独特的生物和机械特性(1、2)。本研究的目的是评估偏侧性和AM处理方法对体外人角膜上皮细胞(HCEC)功能的影响。实验变量包括AM偏侧性(上皮[E]和基质[S])和AM处理方法(脱细胞和脱水的[DDHAM]、脱水的[DHAM]和冷冻保存的[CHAM])。因变量包括HCEC活力、迁移和炎症反应。

方法：选择了三种不同处理的市售眼部AM：Biovance3L Ocular(DDHAM)、(DHAM)和/>(CHAM)。将HCEC接种到AM的E侧和S侧上并孵育1、4和7天。使用阿尔玛蓝测定在AM上在每个时间点测量细胞活力。收集来自在AM上培养的HCEC的条件培养基，并使用划痕损伤测定来评估条件培养基对HCEC迁移的影响。TNFa处理诱发炎症反应。使用定量聚合酶链式反应(qPCR)比较AM对HCEC中促炎基因的表达的影响。所有统计检验的显著性水平设置为p＝0.05。利用双因素方差分析(ANOVA)来分析细胞活力，利用三因素ANOVA来分析细胞增殖，并利用单因素ANOVA来分析mRNA表达。Tukey检验和未配对的t检验用于事后分析。

结果：在第1天，DDHAM-E&S上的细胞活力显著高于CHAM-E&S(p＜0.001)和DHAM-E(p≤0.002)。在第4天，DDHAM-S上的细胞活力显著高于所有其他变量(p≤0.004，图1)。此外，在第4天，

DDHAM-E与DHAM-S之间的细胞活力相当(p＝0.147)，并且该细胞活力显著高于DHAM-E(p≤0.004)、CHAM-S&E(p≤0.017)。在第7天，DDHAM-S上的细胞活力显著高于DHAM-E(p＝0.028)和CHAM-S&E(p≤0.049)。DDHAM-E与所有其他变量之间的细胞活力相似(p≥0.097)。在存在来自于DDHAM和DHAM上培养的细胞的条件培养基的情况下，HCEC迁移相当(p＝0.885)，并且显著大于CHAM上生长的细胞(p≤0.005)。有趣的是，在DDHAM上培养的HCEC适于鹅卵石形态(图2)，其原位模拟眼上皮细胞的形态(3)。在存在来自于眼支架上培养的细胞的条件培养基的情况下，HCEC的迁移显著大于来自组织培养塑料上生长的细胞的对照条件培养基(p＜0.001)。此外，响应于TNFa引起的炎症刺激，DDHAM上的HCEC中促炎细胞因子(IL-6、IL-8和TNFa)的基因表达随时间变化显示出最初的增加，随后为下降(图3)。

结论：在这项体外研究中，DDHAM-S最佳地支持HCEC的活力和迁移。DDHAM的存在随着时间的推移也减弱了HCEC的炎症反应。

参考文献：

1.Walkden A.Clin Ophthalmol.2020；14：2057-2072。

2.Malhotra C.World J Transplant.2014；4(2)：111-121。

3.Sosnová-Netuková M.Br J Ophthalmol.2007；91(3)：372-378。

实例5：不同设计的眼部羊膜上人角膜上皮细胞活性和炎症反应的体外比较及临 床

案例研究

羊膜(AM)是天然衍生的生物材料，其具有对于眼科很重要的生物和机械特性。AM的上皮侧促进上皮化，而基质侧则调节炎症。然而，并非所有AM都是等同的。AM经历不同的处理，由此引起细胞含量和结构的变化。本研究评估了偏侧性和处理对人角膜上皮细胞(HCEC)活性的影响以及处理对HCEC炎症反应的影响，然后提出了一项案例研究。选择了三种不同处理的市售眼部AM：(1)Biovance3L Ocular，即脱细胞、脱水的人AM(DDHAM)，(2)即脱水的人AM(DHAM)，以及(3)/>即冷冻保存的人AM(CHAM)。将HCEC接种到AM上并孵育1、4和7天。使用阿尔玛蓝测定来评估细胞黏附和活力。使用划痕损伤测定来评估HCEC迁移。TNFα处理诱发炎症反应。使用定量聚合酶链式反应(qPCR)比较AM对HCEC中促炎基因的表达的影响。染色证实了DDHAM的完全脱细胞且不存在细胞核。HCEC活性在DDHAM的基质侧上得到最佳支持。在炎症刺激下，DDHAM促进较高的初始炎症反应，随时间变化该炎症反应呈下降趋势。临床上，DDHAM成功用于治疗前基底膜营养不良。与DHAM和CHAM相比，DDHAM对体外HCEC的细胞活性具有显著的积极影响，这可能表明体内眼部细胞相容性更大。

介绍：羊膜(AM)是天然衍生的生物材料，其具有使其特别适合在眼科中使用的独特的生物和机械特性(Leal-Marin等人2021；Walden，2020；Liu等人2019；Malhotra&Jain，2014；Fernandes等人2005)。羊膜组织被认为通过以下来促进眼表的愈合和重建：促进上皮化(Shayan等人2019；Meller等人2002；Meller等人1999)、减少炎症(Sharma等人2016；Tabatabaei等人2017；Tandon等人2011)、抑制瘢痕组织形成(Niknejad等人2008，Tseng等人1999，Lee等人2000)、新血管阻塞(Hao等人2000)以及能够充当抗微生物剂(Mamede&Botelho，2015；Tehrani等人2013；Sangwan等人2011；Kjaergaard等人2001；Kjaergaard等人1999，Inge等人1991)。在眼科学中，AM被广泛用于治疗各种眼部病状。在临床上，AM可以用作手术补片、作为替代受损眼组织的底物或组合用作补片和底物。

作为补片，AM充当临时生物绷带或接触镜片，促进补片下方宿主组织的再上皮化(Walden，2020，Malhotra&Jain，2014)，并以基质侧朝下放置以通过捕获炎症细胞并诱导细胞凋亡来下调炎症反应(Dua等人2004；Shimmura等人2001)。通过将AM上皮侧朝上放置，AM充当用于上皮细胞迁移和生长的底物和支架(Malhotra&Jain，2014)。尽管普遍认为AM应以上皮侧朝上放置以促进再上皮化(Hu等人2003)，但膜的基质侧已被证明可支持上皮细胞生长(Seitz等人2006)。值得注意的是，大部分现有研究限于冷冻保存的AM并且尚不清楚这些发现是否也适用于经历不同处理方法的其他AM。

在临床应用之前，对AM进行灭菌和处理，由此引起细胞含量和结构的变化(Leal-Marin等人2021；von Versen-等人2004；Lim等人2010)。该组织可以直接使用，或者可以使该组织经历额外的脱细胞工艺(Tehrani等人2021)。脱细胞是一种工艺，通过该工艺去除内源性细胞、细胞碎片和DNA残留物以防止免疫反应，同时保留细胞外基质(ECM)的天然结构和化学元素(Gholipourmalekabadi等人2015)。先前的研究已经证明ECM产品中残留DNA的数量与宿主炎症反应之间存在相关性(Keane等人2012；Seif-Naraghi等人2013)。与组织的保存一样，脱细胞也可能影响ECM内的结构和实体(Aamodt&Grainger，2016)。因此，成功的保存-脱细胞方案必须微妙地平衡细胞物质的去除与ECM固有特性和功能特征的保留(Gholipourmalekabadi等人2015；Aamodt&Grainger，2016；Balestrini等人2015)。据我们所知，尚无研究评估不同的保存-脱细胞方案如何影响人角膜上皮细胞(HCEC)的细胞活性和炎症反应。

本项目首次旨在评估：

羊膜偏侧性(即上皮相对于基质)和处理方法对HCEC的细胞活性(即黏附、活力和迁移)的影响，不同处理方法对HCEC的炎症反应(即促炎细胞因子的表达)的影响。

因此，使用了三种不同处理的市售眼部AM进行比较：

Biovance3L Ocular(Celularity，Florham Park，NJ)，即脱细胞、脱水的人羊膜(DDHAM)；

(Katena，Parsippany，NJ)，即脱水的人羊膜(DHAM)；

(Biotissue，Miami，FL)，即冷冻保存的人羊膜(CHAM)。

Ocular是三层DDHAM。其设计独特，其中基质侧面朝外。因此，无论其定向如何，基质侧都与眼表进行介面接合。此外，具有三层，也增强了其处置特性。从合格的足月胎盘中切下AM，加以清洗并进行刮擦以去除无关的组织和细胞。然后使用渗透压休克使组织脱细胞，随后为温和的洗涤剂处理，加以干燥并灭菌。先前的研究已证实，这种专有的脱细胞工艺会去除残留细胞、细胞碎片、生长因子和细胞因子，同时保留具有高胶原蛋白含量和关键生物活性分子(诸如纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖和弹性蛋白)的ECM结构(Bhatia等人2007)。

是单层、无菌处理的DHAM。脱水工艺会去除水分，同时保留组织的结构基质和生物组分(Instructions for Use，2021)，包括生长因子和细胞因子。/>

是单层CHAM。使用专有的冷冻保存方法/>保存AM。冷冻保存工艺使羊膜上皮细胞无法存活，同时保持完整的细胞结构并保存生长因子和细胞因子(Rodriguez-Ares等人2009)。

DDHAM保留其天然ECM，并且不含所有细胞组分、DNA、生长因子和细胞因子。因此，作者推测，与另外两种含有残留DNA和其他细胞组分的眼部AM相比，DDHAM将提供对细胞更加友好的基质，从而支持HCEC的细胞活性和炎症反应。来自此项体外研究的结果将进一步加深对于以下的基本了解：羊膜组织的保存和脱细胞如何影响人眼部上皮细胞的活性。其还具有阐明DDHAM用于支持角膜和结膜相关损伤或缺陷的临床应用(诸如角膜上皮缺陷愈合、翼状胬肉修复、穹窿重建和其他眼部手术)的潜力。

材料及方法：由于测试材料是市售产品并且本研究不需要与人类受试者(供体)直接互动，因此不需要机构审查委员会的批准。

眼部AM：本研究中使用了三种眼部AM：DDHAM、DHAM和CHAM。将DDHAM(批次号OCLR0010)和DHAM样品在室温下储存。将CHAM样品储存于-80℃。所有AM均根据制造商的说明进行处置。DDHAM样品以单独包装的10mm圆盘形式提供。因此，使用10mm活检穿孔器(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)由DHAM片材制成10mm圆盘。将每块(5cm×10cm)CHAM解冻并在培养皿中在20mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤10分钟(min)以去除冷冻保护剂，并使用10mm活检穿孔器由洗涤后的AM制成10mm圆盘。DDHAM是多层的(三层的)，其中AM的基质侧在两侧上都面朝外。为了评估DDHAM的偏侧性，制备了一种不同设计的版本(三层)，其中AM的上皮侧在两侧上都面朝外，即DDHAM(E)。将每个AM样品的10mm圆盘放入48孔板(Cell-Repellent 48-Well Microplate，Greiner Bio-One，Monroe，NC，USA)的孔中(1个圆盘/孔)，其中AM的基质侧或上皮侧与细胞接触。将测量为2mm宽度与7mm内径的无菌O形环(McMaster-Carr，Robbinsville，NJ，USA)放置在每个AM的顶部上，以将AM固持到合适的位置。将羊膜用生长培养基(0.4mL/孔)在37℃预调节2小时(h)，之后用细胞接种。在本研究中，每种类型的AM使用了至少两批(供体)。在每个独立实验中，使用来自每种AM的四个样品(n＝4)，其中两个样品来自一个批次，而两个样品来自另一批次。对于每个单独的测定，进行至少两次独立的实验。

原代细胞：人角膜上皮细胞(HCEC，目录号PCS-700-010，批次号80915170)、角膜上皮细胞基础培养基和角膜上皮细胞生长试剂盒购自ATCC(Manassas，VA，USA)。根据制造商的说明制备用于HCEC的完全生长培养基。

关于细胞对AM黏附的评估：按照制造商的说明，将第4代(P4)的HCEC在10cm细胞培养皿中培养至80％汇合度。用5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)/培养皿冲洗细胞一次。将一毫升的0.25％胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)添加到每个培养皿中，并在37℃孵育5min。将两毫升的含有10％FBS的最低必需培养基-α(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)培养基添加到培养皿中以中和胰蛋白酶。将细胞转移至15mL锥形管中，并以1000RPM(每分钟转数)离心5min。将细胞重悬于完全生长培养基中并使用血细胞计数器进行计数。

将HCEC(2×104/孔)添加到含有经预调节的AM的每个孔中。将板在37℃与5％CO2和95％湿度下孵育。孵育24h后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次。使用阿尔玛蓝测定来检测黏附细胞的活力。简而言之，将0.2mL/孔的阿尔玛蓝溶液(其由完全生长培养基+10％阿尔玛蓝试剂(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)组成)添加至每个孔，并在37℃孵育45min。孵育后，将0.1mL/孔的上清液转移至96孔板。使用多模式酶标仪(TECAN，Switzerland)在激发/发射(Ex/Em)＝540nm/590nm下测量荧光强度。荧光强度以任意单位(AU)表示。

AM和细胞的染色：为了可视化AM的结构特征，将三种不同的AM再水化、洗涤并垂直嵌入Tissue-Tek O.C.T.化合物(Sakura，Torrance，CA，USA)中。使用Leica CM1850低温恒温器(Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL，USA)制备五微米/切片冷冻切片。将显微镜载玻片上的冷冻切片用4％多聚甲醛固定1h，并在PBS中的0.5％Triton X100中透化1h。将固定和透化的样品用抗人I型抗体(ab34710，Abcam，Cambridge，MA，USA)染色过夜。然后用Alexa Fluor 555-抗兔IgG、Alexa 488-鬼笔环肽(Life Technology，Carlsbad，CA，USA)和Hoechst染料33258(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)对样品染色60 min。染色后，在ProLong Gold Antifade Mountant(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)的存在下将盖玻片封片到每个样品上。

为了可视化不同AM上的活细胞，如“关于细胞对于羊膜的黏附的评估”中所描述，将HCEC在不同的AM上培养1或4天。在每个时间点，从每个孔中去除培养基，并向每个孔中添加0.2mL/孔的含有50nM钙黄绿素AM(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)的新鲜完全生长培养基。在37℃孵育30min后，去除培养基。用PBS洗涤细胞两次并准备进行成像。

为了可视化细胞形态，将在不同AM上培养4天的HCEC细胞用4％多聚甲醛固定1h，并在PBS中的0.5％Triton X100中透化1h。将固定和透化的细胞用Alexa 488-鬼笔环肽(Life Technology，Carlsbad，CA，USA)染色30min，并在落射荧光显微镜(Zeiss ObserverD1，Jena，Germany)下观察。

AM的H&E染色：将AM的冰冻切片在60℃烘烤过夜，在4％多聚甲醛中固定30min，并用PBS冲洗三次。将样品在Harris苏木精溶液(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO)中染色10min，并在流动的自来水中冲洗1min。然后将载玻片浸入分化溶液(0.25mL浓盐酸至100mL70％酒精)中两次。随后，将载玻片在流动的自来水下冲洗1min，随后浸入Scott自来水替代品(1％硫酸镁(MgSO4)和0.06％碳酸氢钠)中60秒。在95％试剂酒精中进行30秒洗涤后，将样品在酒精曙红Y溶液(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO 68178)中复染10min。染色完成后，将载玻片通过在100％无水乙醇中进行三次洗涤，随后进行三次Histoclear II洗涤来脱水。将载玻片使用Permount封片剂(Fisher Scientific Inc.)封片并使用Zeiss AxioObserver A1显微镜成像。

随着时间推移AM上的细胞活力的评估：将HCEC(1×104/孔)添加到含有经预调节的AM的48孔板的每个孔中。针对每种细胞类型设置三组板，并在37℃与5％CO2和95％湿度下孵育1、4和7天。在第一个时间点，去除来自所有板的每个孔的培养基，并添加新鲜培养基。使用阿尔玛蓝测定来测量第一组板中细胞的活力。将第二组板和第三组板在37℃培养。在第二个时间点，测量第二组板中细胞的活力。将第三组板在37℃在新鲜培养基中培养。在第三个时间点，使用阿尔玛蓝测定来测量第三组板中细胞的活力。

用于迁移测定的条件培养基：在测试条件下，将HCEC(2×104/孔)添加到含有经预调节的AM的48孔板的每个孔中。在对照条件下，未将HCEC添加到经预调节的AM中。培养24h后，去除培养基。将0.4mL/孔的新鲜生长培养基添加到含有或不含细胞的每个孔中，并在37℃孵育24h。从每个孔中收集上清液(24-h条件培养基)并立即用于迁移测定。AM的基质侧用于本实验。

划痕损伤迁移测定：将5×104/孔HCEC添加到组织培养处理的聚苯乙烯48孔板的每个孔中，并在37℃与5％CO2和95％湿度下培养2天。使用无菌金属棒的尖端在汇合的单层上造成划痕损伤。去除培养基，并将从于AM上培养的细胞收集的条件培养基添加至伤口。在0h时拍摄伤口区域的图像。针对每个测试组，监测至少四个区域。将板在37℃孵育24h。24h时对完全相同的伤口区域(带有标记参考)进行成像。使用ImageJ软件(NIH)以任意单位(平方像素，px2)测量伤口面积。迁移的面积＝面积0h-面积24h。

HCEC的炎症反应的刺激：将2×104/孔HCEC接种在不同的AM上并培养24h。去除培养基，并将新鲜培养基“-肿瘤坏死因子-α(TNF-)”或含有10ng/mL人TNF-/>的新鲜培养基(目录号300-01A，PeproTech，Cranbury，NJ)“+TNF-/>”添加至细胞中并孵育24h、48h或72h。在每个时间点，收集上清液用于多重分析，并将细胞裂解于0.2mL的RNA裂解缓冲液(Promega，Durham，NC)中以用于定量聚合酶链式反应(qPCR)分析，如下文所述。

通过qPCR评估相对mRNA表达：如先前所述，通过qPCR对细胞因子的相对基因表达进行定量(Mao等人2021)。简而言之，使用SV 96总RNA分离系统(Promega)纯化来自细胞裂解物的总RNA。使用TECAN Spark Nano板(TECAN，Morrisville，NC)测量RNA浓度和纯度。cDNA制备和qPCR如所述进行(Mao等人2017)。用于本研究的qPCR引物来自QuantiTect(Qiagen，Germantown，MD)：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF：QT00000896)、白介素6(IL-6：QT00083720)、白介素-8(IL-8：QT00000322)、肿瘤坏死因子α(TNF-QT01079561)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH：QT01192646)。将每个样品一式两份地运行。运行完成后，使用原始数据进行二阶导数分析以确定每个样品的平均Cp(交叉点-PCR循环)。对于每个基因的表达，GAPDH的表达充当内部对照。通过Pfaffl分析确定相对mRNA表达(EΔCp目标/EΔCp参考)，其中引物效率E＝10^(-1/斜率)并且ΔCp＝样品的平均Cp-对照的平均Cp。组织培养聚苯乙烯(TCP)上的细胞表达或24h时的细胞表达用作分析的“对照”，其在“结果”的具体分析中进行定义。

统计方法：在HCEC活性的评估中，自变量为AM(DDHAM、DHAM、CHAM)、侧面(上皮侧、基质侧)和时间(第1天、第4天和第7天)。因变量是细胞黏附、细胞活力和迁移。在通过mRNA表达对HCEC炎症反应进行的评估中，自变量为羊膜(DDHAM、DHAM、CHAM、对照[TCP])、条件(静息、刺激)和时间(24h、48h和72h)。在通过蛋白质水平对HCEC炎症反应进行的评估中，自变量是羊膜(DDHAM、DHAM、CHAM、对照[TCP])和条件(静息、刺激、仅AM)。因变量是细胞因子(GM-CSF、IL-6、IL-8和TNF-α)的相对mRNA表达以及细胞因子和趋化因子(GM-CSF、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-8、TGFβ2和VEGF)的蛋白质水平。

所有分析均使用IBM SPSS(构建版本1.0.0.1444)进行。所有统计检验的显著性水平设置为p＝0.05。对数据进行测试并发现其为正态分布。通过双因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验来分析细胞黏附和迁移。通过三因素ANOVA与Tukey事后检验来分析细胞增殖。用双因素ANOVA与Tukey事后检验对24h时的相对mRNA表达进行分析，以评估每个测试条件下的每个因变量。用单因素ANOVA与Tukey事后检验对随时间变化的相对mRNA表达进行分析，以评估每个测试条件下的每个因变量。通过简单的主效应分析与Sidak校正进行多重比较来评估显著的相互作用。在文本和图式中，数据以平均值±标准差(SD)报告。

结果：

AM的结构：为了评估这三种AM的结构，对AM的横截面进行细胞组分(DNA和肌动蛋白)和ECM(I型胶原蛋白)染色(图8A)。虽然在DHAM和CHAM中检测到强力的细胞核染色和肌动蛋白染色，但在DDHAM中未检测到肌动蛋白和细胞核染色。在所有三种AM中均检测到I型胶原蛋白的存在。三种AM的H&E染色(图8B)证实与DHAM和CHAM相比，DDHAM完全脱细胞且不存在细胞核。DHAM显示深蓝色核残留物的微弱染色，而CHAM显示针对细胞核的完整深蓝色染色，其显示细胞的存在。

HCEC在不同AM上的黏附：通过比较24h时的细胞活力(反映黏附细胞的数量)来评估不同AM和AM的不同侧面上的细胞黏附。荧光强度以任意单位(AU)表示。

偏侧性的影响。AM的基质侧上的细胞黏附大于其上皮侧(侧面主效应，p＝0.018)，这可以通过与DHAM的基质侧相比，DHAM的上皮侧上的较低细胞黏附来解释(p＜0.001；侧面×AM，p＝0.001；图9)。DDHAM的上皮侧与基质侧之间(p＝0.822)或CHAM的上皮侧与基质侧之间(p＝0.645)不存在显著差异。

AM的影响。此外，AM之间的细胞黏附存在显著差异(AM主效应，p＜0.001)，其中DDHAM上的细胞黏附显著大于DHAM(p＜0.001)和CHAM(p＜0.001)。然而，如先前所指示，细胞黏附随侧面和AM而不同(p＝0.001；图9)。在上皮侧上，DDHAM上的细胞黏附显著大于DHAM(p＜0.001)和CHAM(p＜0.001)，并且CHAM与DHAM之间不存在显著差异(p＝0.076)。在基质侧上，CHAM上的细胞黏附显著低于DDHAM(p＜0.001)和DHAM(p＝0.014)，并且DDHAM与DHAM之间不存在显著差异(p＝0.207)。这些结果表明，在这三种AM中，DDHAM的上皮侧和基质侧最佳支持细胞黏附。

第4天在不同AM上HCEC的活力和形态：上皮细胞的活染色。细胞接种后4天观察到不同AM(DDHAM、CHAM、DHAM)的基质侧上HCEC的活力(图10)。与定量结果一致，DDHAM和DHAM上的HCEC在细胞接种后第4天似乎已黏附并扩散，而CHAM上的HCEC似乎杂乱无章并采用异质形态。在第4天通过肌动蛋白染色来监测AM上HCEC的形态(图10)。DDHAM上的HCEC采用具有致密肌动蛋白环结构的鹅卵石形态。

随时间推移不同AM上的细胞活力：监测不同AM上细胞的活力至多7天。虽然在7天的培养过程中，活细胞数量显著下降(时间主效应，p＜0.001)，但细胞活力随侧面、AM和时间而显著变化(侧面×AM×时间交互效应，p＝0.011)。最值得注意的是，除第4天的DDHAM的基质侧外，针对所有变量随时间变化的细胞活力都有所下降(图11A)。

偏侧性的影响。AM的基质侧上的细胞活力也显著大于其上皮侧(主效应侧面，p＜0.001)，这可以通过第4天和第7天在两侧之间相对细胞活力的差异来解释(图11B)。在第4天，DDHAM的基质侧上的相对细胞活力显著大于DDHAM的上皮侧(p＜0.001)，并且DHAM的基质侧上的相对细胞活力显著大于DHAM的上皮侧(p＜0.001)。相反，CHAM的上皮侧上的相对细胞活力显著大于CHAM的基质侧(p＝0.039)。在第7天，DDHAM(p＝0.102)或CHAM(p＝0.157)的上皮侧与基质侧之间的相对细胞活力不存在显著差异。然而，DHAM的基质侧上的相对细胞活力显著大于DHAM的上皮侧(p＜0.001)。

AM的影响。AM之间的细胞数量也存在显著差异(主效应AM，p＜0.001)，其中DDHAM上的活细胞显著多于DHAM(p＜0.001)和CHAM(p＜0.001)，并且DHAM上的活细胞显著多于CHAM(p＝0.036)。AM的主效应很大程度上通过第4天和第7天相对细胞活力的显著差异来解释(图11B)。

在第4天的上皮侧上，DDHAM上的相对细胞活力显著大于DHAM(p＝0.032)，同时DDHAM与CHAM之间(p＝0.978)以及CHAM与DHAM之间(p＝0.077)的相对细胞活力相似。在第7天的上皮侧上，三种羊膜之间不存在显著差异(p≥0.219)。

在第4天的基质侧上，DDHAM上的相对细胞活力显著大于CHAM(p＜0.001)，并且DHAM上的相对细胞活力显著大于CHAM(p＜0.001)。在第4天，在DDHAM与DHAM之间在基质侧上的相对细胞活力方面不存在显著差异(p＝0.477)。然而，在第7天的基质侧上，CHAM上的相对细胞活力显著低于DDHAM(p＝0.003)和DHAM(p＝0.002)。与上皮侧一样，在第7天的基质侧上，在DDHAM与DHAM之间在相对细胞活力方面不存在显著差异(p＝0.999)。

与DHAM和CHAM相比，AM的基质侧上的更高细胞活力以及DDHAM上的更好活力维持的发现表明，细胞活力在DDHAM的基质侧上得到最佳维持。

HCEC在不同AM上的迁移：测试了在不存在HCEC的情况下来自不同AM的条件培养基，以评估单独的AM对HCEC迁移的影响。此外，在细胞存在的情况下比较AM之间的迁移差异，以确定在不同AM上培养的HCEC所释放的因子是否影响细胞迁移。将在AM上培养的细胞调节24h。使用划痕损伤测定来评估在存在来自不同AM的条件培养基的情况下HCEC的迁移。监测伤口闭合24h(图12A和图12B)。

羊膜的影响与细胞的存在之间存在显著的相互作用(p＝0.006；图12A和图12B)。在DDHAM(p＝0.009)和DHAM(p＜0.001)上，有细胞情况下的迁移显著高于无细胞情况下的迁移。在CHAM上(p＝0.291)或在对照上(p＝0.265)，无论是否有细胞，迁移没有显著差异。

AM的影响。此外，在存在细胞的情况下收集的条件培养基(CM)当中，来自CHAM上的细胞的CM中的迁移显著低于DDHAM(p＝0.004)和DHAM(p＝0.002)。DDHAM与DHAM之间的迁移不存在显著差异(p＝1.000)。与存在细胞的对照相比，DDHAM(p＜0.001)、DHAM(p＜0.001)和CHAM(p＝0.005)上来自细胞的CM中的迁移显著更高。

HCEC中炎症细胞因子的基因表达：由于AM的基质侧经报道可调节炎症反应(Dua等人2004；Shimmura等人2001)，因此评估这三种AM的基质侧对HCEC的炎症反应的影响。选择先前已证明在伤口愈合中发挥作用的细胞因子，包括GM-CSF、IL-6、IL-8或TNF-(Rho等人2015；Arranz-Valsero等人2014；Ebihara等人2011；Nishida等人1992；Hafezi等人2018；Strieter等人1992；Koch等人1992；Wang等人2020；Yang等人2019)。为此，通过用TNF-/>刺激24h来模拟体外炎症条件下HCEC的炎症反应。通过qPCR与标准细胞培养表面TCP上培养的细胞中的基因表达相比，评估不同AM上HCEC中GM-CSF、IL-6、IL-8或TNF-/>的基因表达(相对mRNA水平)。

GM-CSF。24h时GM-CSF的表达因刺激条件(±TNFα)和AM而显著变化(p＝0.049)(图13A)。在刺激下，DHAM(p＜0.001)上的GM-CSF表达显著增加，但DDHAM(p＝0.226)、CHAM(p＝0.664)或TCP(p＝0.827)上的GM-CSF表达并没有显著增加。比较静息条件下羊膜之间GM-CSF的表达，显示出DDHAM、DHAM、CHAM和TCP上GM-CSF的相似表达(p≥0.134)。比较刺激条件下羊膜之间GM-CSF的表达，显示出DHAM上的表达显著大于DDHAM(p＝0.001)、CHAM(p＜0.001)和TCP(p＜0.001)。

IL-6。24h时IL-6的表达因刺激条件和羊膜而显著变化(p＝0.002)(图13B)。在刺激下，DDHAM(p＜0.001)、CHAM(p＝0.017)和TCP(p＝0.014)上的IL-6的表达显著增加，但DHAM(p＝0.128)上的IL-6的表达并不显著增加。比较静息条件下羊膜之间的IL-6的表达，显示出DDHAM、DHAM、CHAM和TCP上的IL-6的相似表达(p≥0.717)。在刺激条件下，DDHAM上IL-6的表达显著高于DHAM(p＜0.001)、CHAM(p＜0.001)和TCP(p＜0.001)。没有发现其他显著差异。

IL-8。尽管24h时IL-8的表达并没有因刺激条件和AM而显著变化(p＝0.188)，但存在刺激条件(p＜0.001)和AM(p＝0.002)的主效应。IL-8的总体表达随着刺激而显著增加。事后分析揭示，DHAM上的总体IL-8表达显著大于CHAM(p＝0.018)和TCP(p＝0.014)，并且DDHAM上的总体IL-8表达显著大于CHAM(p＝0.022)和TCP(p＝0.017)。DHAM与DDHAM之间(p＝1.000)或CHAM与TCP之间(p＝0.999)的IL-8表达不存在显著差异。

TNFα。尽管24h时TNFα的表达并没有因刺激条件和AM而显著变化(p＝0.194)，但存在刺激条件(p＝0.001)和AM(p＜0.001)的主效应(图13D)。TNFα的总体表达随刺激而显著增加。事后分析揭示，DDHAM上的总体TNFα表达显著大于CHAM(p＜0.001)和TCP(p＜0.001)，并且DHAM上的总体TNFα表达显著大于CHAM(p＝0.022)和TCP(p＝0.024)。DDHAM与DHAM之间(p＝0.095)或CHAM与TCP之间(p＝1.000)的TNFα表达不存在显著差异。

这些结果表明，在24h时，DDHAM和DHAM的存在比CHAM或TCP上的细胞更能刺激HCEC中的GM-CSF、IL-6、IL-8和TNF-α的表达。

随时间推移HCEC中炎症细胞因子的基因表达：炎症反应是一个动态过程。细胞因子在不同时间点的表达表明伤口愈合过程中的阶段。为了评估细胞因子历经72-h时程的表达，以24h间隔分析每种细胞因子的表达(图14A-图14D)。

在刺激条件下对于DDHAM(p＝0.206)、DHAM(p＝0.078)或CHAM(p＝0.215)，GM-CSF的表达随时间变化并不存在显著变化(图14A)。TCP是例外，其在刺激条件下在GM-CSF的表达方面随时间变化而发生显著变化(p＜0.001)。GM-CSF在TCP上随时间变化的表达从24至72h(p＜0.001)和从48至72h(p＜0.001)显著增加。TCP上的GM-CSF表达从24至48h保持相似(p＝0.700)。

IL-6。在刺激条件下随时间变化在DDHAM(p＝0.007)、DHAM(p＜0.001)、CHAM(p＜0.001)和TCP(p＝0.002)上的IL-6的表达并不存在统计学上显著的变化(图14B)。比较IL-6在DDHAM上的表达，显示出从24至72h(p＝0.007)和从48至72h(p＝0.021)的显著下降。DDHAM上的IL-6表达从24至48h保持相似(p＝0.623)。比较IL-6在DHAM上随时间变化的表达，显示出从24至48h的显著增加(p＝0.003)，然后从48至72h的显著下降(p＜0.001)。DHAM上的IL-6表达从24至72h保持相似(p＝0.321)。比较IL-6在CHAM上随时间变化的表达，显示出从24至48h(p＜0.001)和从24至72h(p＜0.001)的显著下降。CHAM上的IL-6表达在48和72h两者时均检测不到。IL-6在TCP上随时间变化的表达显示出从24至48h的显著增加(p＝0.008)，然后从48至72h的显著下降(p＝0.002)。TCP上的IL-6表达从24至72h保持相似(p＝0.407)。

IL-8。虽然在刺激条件下随时间变化在CHAM(p＝0.024)和TCP(p＜0.001)上IL-8的表达存在统计学上显著的变化，但DDHAM(p＝0.179)和DHAM(p＝0.282)上的IL-8表达随时间变化保持相似(图14C)。IL-8在CHAM上的表达从24至72h(p＝0.040)和从48至72h(p＝0.033)显著增加。CHAM上的IL-8表达从24至48h保持相似(p＝0.984)。如同CHAM，TCP上IL-8的表达从24至72h(p＜0.001)和从48至72h(p＜0.001)显著增加。TCP上的IL-8表达从24至48h保持相似(p＝0.071)。

TNF-α。虽然在刺激条件下随时间变化在DHAM(p＜0.001)和TCP(p＝0.005)上的TNF-α的表达存在统计学上显著的变化，但DDHAM(p＝0.125)和CHAM(p＝0.519)上的TNF-α表达随时间变化保持相似(图14D)。TNF-α在DHAM上随时间变化的表达从24至48h(p＝0.009)显著增加，并且从24至72h(p＝0.048)和从48至72h(p＜0.001)显著下降。此外，TNF-α在TCP上随时间变化的表达显示出从24至48h(p＝0.035)和从24至72h(p＝0.004)的显著增加。TCP上的TNF-α表达从48至72h保持相似(p＝0.201)。

对于不同AM和细胞因子，相对mRNA水平随时间变化的改变显示出不同的趋势。虽然在TCP上培养的细胞中表达水平随着时间推移而增加，但在DDHAM上培养的细胞中此类细胞因子的表达显示出下降的趋势。

临床案例研究：一名87岁女性主诉先前几个月期间发生左眼恶化。她报告，由于在长时间阅读情况下感到不适和异物感，她很难看清小号印刷字。她的双眼有干眼综合征、原发性开角型青光眼、视网膜前膜和黄斑玻璃膜疣的重大病史。支持治疗包括润滑滴眼液、高渗剂和绷带接触镜片。她的眼科手术史由双眼白内障摘除术和双眼YAG激光晶状体囊切开术组成。检查后，注意到呈地图/点构型(map/dot configuration)的上皮和上皮下瘢痕。基于她的表现、病史和仔细的角膜检查，该患者被诊断为前基底膜营养不良(ABMD)。在患者同意的情况下，决定以手术方式治疗前基底膜营养不良，使用DDHAM作为底物来以正常的鲍曼氏膜(Bowman′s membrane)(即上皮和上皮基底膜)重新填充前角膜表面。

角膜上皮和鲍曼氏膜的清创以及AM的放置(无需缝合)作为门诊手术进行。应用局部麻醉剂，并可见不规则的表面上皮(图15A)。使用金刚石磨针去除所有异常、松脱的角膜上皮(图15B)以及轻轻并均匀地去除下面的上皮下瘢痕和ABMD碎片(图15C)。然后用平衡盐溶液冲洗上皮表面。将DDHAM小心地放置在清创的膜上方(图15D)并用绷带接触镜片覆盖以帮助缓解不适和愈合(图15E)。术后，患者被指示每天使用类固醇/抗生素滴剂4次，持续10天，该用量经6周逐渐减量。她在术后1周、2周、1个月和2个月时就诊。患者报告，在日常生活活动中舒适度几乎立即得到改善。术后1个月就诊时，移植物已完全溶解到组织中并未见残留物。角膜表面光滑且可识别为正常(图15F)。

讨论

假设AM基底膜的结构促进眼表上的上皮化。胶原蛋白组成与结膜和角膜非常相似，从而使AM成为上皮细胞生长的合适底物。AM通过四种提出的机制促进角膜上皮的生长(Malhotra&Jain，2014；Walkden等人2020)：1)促进上皮细胞迁移(Meller等人2002；Meller等人1999)，2)加强基底上皮细胞黏附(Keene等人1987，Sonnenberg等人1991，Terranova等人1987)，3)促进上皮细胞分化(Guo等人1989；Streuli等人1991；Kurpakus等人1992)和4)防止细胞凋亡(Boudreau等人1996；Boudreau等人1995)。虽然有证据表明基质表面可以支持上皮细胞生长(Seitz等人2006)，但上皮化被认为优先发生在基底膜上(Hu等人2003)。然而，大多数现有研究限于冷冻保存的AM，因此尚不清楚这些发现是否适用于不同处理的AM。

不同的处理方法有可能改变AM的细胞含量和结构，并有可能影响ECM的功能特征(Gholipourmalekabadi等人2015)。先前的工作已经证明DDHAM与CHAM之间在组成和超微结构方面存在显著差异(Lim等人2010)。尽管冷冻保存是最广泛使用的保存技术之一，但其也有一些缺点，即影响细胞的活力和增殖能力，以及需要在-80℃运输和储存(Kruse等人2000)。因此，本研究试图比较偏侧性和不同的灭菌、保存和脱细胞方法如何影响HCEC黏附、活力和迁移。如先前的报告中所指示(Bhatia等人2007)，作者假设，理想的眼部AM需要去除细胞、DNA、细胞碎片以及残留的生长因子和细胞因子，并充分保存天然ECM架构和生物活性组分，以防止炎症反应并促进ECM与宿主细胞之间的动态相互作用。本研究结果通过证明DDHAM是完全脱细胞的AM，而DHAM和CHAM含有残留细胞和DNA，从而支持了我们的假设。随后发现DDHAM最佳支持HCEC的细胞活性。此外，在体外炎症条件下，DDHAM的存在增强了HCEC中的初始炎症反应并防止长期炎症反应。

染色证实DDHAM中不存在细胞和细胞核。先前的研究证明，AM在眼科学中的生物有效性由其ECM促进，而非由保存在AM中的细胞促进(Dua等人2004；Kubo等人2001；Kruse等人2000)。在脱细胞的AM中，ECM被认为可充当细胞浸润的物理管道，据此宿主细胞与ECM相互作用来提供必要的生化刺激以活化愈合反应(Bhatia等人2007)。因此，作为初步步骤，对三种AM中的每一种进行染色，以可视化细胞含量和结构。免疫荧光和H&E染色两者均证实DDHAM的完全脱细胞且不存在细胞核，而DHAM和CHAM两者均显示出细胞核含量、DHAM中的残留物以及CHAM中细胞的存在。

DDHAM的基质侧最佳支持HCEC的细胞活动。来自该体外研究的结果表明DDHAM的基质侧最佳支持HCEC活性。偏侧性不影响DDHAM或CHAM上的HCEC黏附，但DHAM的上皮侧上的HCEC黏附显著较低。DDHAM和DHAM(两种脱水的AM)之间的细胞黏附差异表明，细胞组分、DNA、生长因子和细胞因子的去除提供了对细胞更加友好的环境，从而支持HCEC的附着。

当随时间变化进行检查时，发现除DDHAM的基质侧外，对于所有偏侧性和AM组合，细胞活力均下降。在DDHAM的基质侧上，细胞活力从第1天至第4天增加。细胞活力整体下降的具体原因尚不清楚。CHAM或DHAM中羊膜细胞(冷冻保存或干燥)的存在可能会抑制这些AM支持角膜细胞增殖的能力。尽管先前已报道，对于角膜上皮细胞来说，脱细胞的羊膜是比新鲜羊膜更好的底物(Koizumi等人2000)，但这些结果表明偏侧性也可能是一个因素。此项研究发现，DDHAM的基质侧是对于HCEC的生长来说最相容的底物，而CHAM和DHAM的上皮侧或基质侧似乎都不能始终支持HCEC的黏附和生长。

这些发现进一步得到染色结果的支持。第四天，DDHAM表现出HCEC的最均匀的生长模式(图10)。如由肌动蛋白染色所指示，DDHAM上细胞的形态和组织与原位角膜上皮细胞的形态相似(图11A和图11B)(Sosnová-Netuková等人2007)。这些观察结果表明了AM上的有序生长。相反，DHAM上的生长模式似乎杂乱无章，并且尚不清楚CHAM上的HCEC是否存活或存在。公认的是，当细胞应激时，它们会改变表型(Kumar等人2013)。虽然有许多因素需要考虑，但这些结果表明脱水、冷冻保存和脱细胞工艺的差异可能会影响细胞与膜相互作用的方式，特别是在细胞黏附和细胞活力方面。

不同处理的AM也可能影响从其上培养的上皮细胞中对因子的释放。为了评估单独的AM对HCEC迁移的影响，本研究测试了来自三种不同AM的含有和不含细胞的条件培养基，并发现在DDHAM和DHAM上，相较于在存在不含细胞的条件培养基的情况下，在存在含有细胞的条件培养基的情况下，HCEC迁移得更多。然而，在CHAM或对照上，在存在含有或不含细胞的条件培养基的情况下，HCEC迁移不存在差异。这些发现表明，细胞释放的因子促进细胞迁移的作用超出了单独的AM(即DDHAM和DHAM)的作用范围。此外，HCEC的迁移在存在来自DDHAM上的细胞和来自DHAM上的细胞的条件培养基的情况下相当，并且两者均显著大于CHAM上的细胞。对这一发现的一种可能解释是，当收集条件培养基时，CHAM上的细胞较少。在较少细胞情况下，条件培养基的刺激作用可能会降低，从而导致在存在来自CHAM上的细胞的条件培养基的情况下迁移较少。此外，在存在含有细胞的条件培养基的情况下，所有三种AM上的HCEC迁移都显著大于培养基对照。总体来说，这些发现表明，从细胞和AM中释放的因子促进细胞迁移，并且释放的因子因AM而异，从而导致DDHAM和DHAM上的HCEC迁移多于CHAM。要确定这些因子的属性和来源，还需要额外的研究。

进行了一项额外的独立实验，以确定偏侧性是否会影响HCEC迁移。该实验遵循的方法与‘用于迁移测定的条件培养基’和‘划痕损伤迁移测定’部分中所述的方法相同。然而，在本实验中，在存在条件培养基的情况下HCEC的迁移，在AM的基质侧和上皮侧两者上均进行了评估。来自该实验的结果证实，在存在来自AM的上皮侧和基质侧上的细胞的条件培养基的情况下，HCEC迁移不存在差异(p＝0.407；数据未显示)。

传统上，将AM作为移植物以上皮侧朝上放置以促进缺陷上方的上皮化。DHAM和CHAM两者由于其偏侧性而均具有这种临床适用性。然而，DDHAM制造成基质侧面朝外，无论定向如何，基质侧都与眼表进行介面接合。来自该体外研究的结果表明，DDHAM的基质侧上的HCEC活性最高，因此支持其作为移植物的临床适用性。此外，所包括的案例研究还证明了DDHAM用于治疗前基底膜营养不良的成功应用。术后一个月，角膜表面光滑且可识别为正常，这可以表明正在进行中的再上皮化。然而，需要其他时间点的组织学证据，以证明角膜上皮、其基底膜和鲍曼氏层的重组和重塑。虽然令人鼓舞，但仍需要额外的更大样本量的体内研究，以更全面地评估DDHAM以及其促进眼表上的上皮化的能力。

DDHAM支持最初的炎症反应，随后随时间变化而呈下降趋势。

AM的抗炎特性已得到充分证明(Sharma等人2016；Tabatabaei等人2017；Tandon等人2011)。基于体外研究，AM减少受损眼组织中生长因子和促炎细胞因子的表达(Solomon等人2001)，同时还捕获炎症细胞并诱导细胞凋亡(Dua等人2004；Shimmura等人2001)。因此，本研究的次要目的是评估不同AM上HCEC的炎症反应。该研究通过检查即时mRNA表达以及随时间变化的趋势来实现。鉴于促炎细胞因子GM-CSF、IL-6、IL-8和TNF-α在角膜伤口愈合中的已知作用，选择它们来评估HCEC的炎症反应。

GM-CSF被认为既是炎症细胞因子(van Nieuwenhuiize等人2013)，又是免疫调节细胞因子(Parmiani等人2007)，其影响取决于剂量和环境(Bhattacharya等人2015；Parmiani等人2007；Shachar和Karin 2013)。这种多能细胞因子已被认为在炎症和伤口愈合中具有重要作用，并且更具体地说，已证明具有在体外和体内增强角膜伤口愈合的能力(Rho等人2015)。IL-6、IL-8和TNF-α是更传统的促炎细胞因子。除了调节炎症反应和免疫反应外，IL-6还显示可促进角膜伤口在体外和体内的愈合(Arranz-Valsero等人2014；Ebihara等人2011；Nishida等人1992；Hafezi等人2018)。IL-8是角膜因子，其诱导新生血管形成并被认为会调节伤口愈合(Strieter等人1992；Koch等人1992)。最后，TNF-α参与角膜损伤后的角膜炎症反应和伤口愈合(Wang等人2020；Yang等人2019)。

在本研究中，在DDHAM上培养的细胞中，炎症细胞因子(即IL-6、IL-8、TNF-α)在前24h内的表达较高，随后随时间变化呈下降趋势。这些观察结果表明，DDHAM的存在可促进HCEC细胞中的初始炎症反应并防止长期炎症反应，这在伤口愈合环境中可能是有利的。然而，需要额外的体内研究来更全面地评估这些发现。

AM用于眼表重建，以治疗广泛多种眼部病变，包括伴有和不伴有角膜缘干细胞缺陷的角膜表面疾病(Maharajan等人2007；Sangwan等人2012)、结膜表面重建(例如，翼状胬肉切除[等人2019；Akbari等人2017])、作为用于角膜缘上皮细胞离体扩增的载体(Rama等人2010；Shortt等人2009)、青光眼(Sheha等人2008)、瘤形成(Agraval等人2017)、巩膜溶解和穿孔(Hanada等人2001；Ma等人2002)等等。鉴于脱细胞的AM增强愈合、与宿主组织融合和避免异物反应的潜力，其近年来越来越受到关注(Gholipourmalekabadi等人2015；Fenelon等人2019；Lim等人2010；Koizumi等人2000；Salah等人2018；Fransisco等人2016；Gholipourmalekabadi等人2016；Taghiabadi等人2015)。脱细胞的AM中ECM的充分保存已被证明可改善AM内各种细胞类型的相互作用，有证据表明细胞黏附、增殖和分化得到改善(Fenelon等人2019；Koizumi等人2000；Salah等人2018；Fransisco等人2016；Gholipourmalekabadi等人2016；Taghiabadi等人2015)。此外，并且也许最重要的是，脱细胞的AM已被证明可以低免疫原性融合到生物组织中(Fenelon等人2019；Fransisco等人2016；Gholipourmalekabadi等人2016)。

AmbioDryTM是一种单层AM，其已经过低剂量电子束灭菌并通过脱水保存，其上皮层被机械除去(Hovanesian，2012)。尽管该产品不再可用，但可以从该DDHAM产品的科学评估中获得很多信息(Memarzadeh等人2008；Chuck等人2004)。Memarzadeh等人证明了该产品能够充当有效的自体结膜移植物，预防翼状胬肉复发(Memarzadeh等人2008)。此外，一项生物力学研究证实，这种DDHAM当再水化时仍能保持理想的弹性特征，使其成为用于眼表重建的的易于操作的组织(Chuck等人2004)。尽管AmbioDryTM与Ocular之间有明显差异，诸如/>Ocular的独特的三层设计以及其完全去除细胞和相关生长因子(Bhatia等人2007)，但这些先前的出版物提供了对DDHAM产品及其在眼科学中的临床应用的额外见解。

虽然来自本研究的结果令人鼓舞，但也存在一些局限性。首先，来自体外研究的发现并不能直接转化为临床应用。与眼上皮细胞的极好相容性并不一定等同于眼部伤口愈合的临床改善。与该体外研究不同，体内组织中存在多种类型的细胞并彼此相互作用。一种细胞类型的细胞行为并不一定代表组织的反应。然而，尽管存在这些局限性，该研究在比较三种市售AM上的眼细胞活性和炎症反应方面是独一无二的。此外，该研究首次证明了AM偏侧性对细胞活动的影响。

结论

总体而言，DDHAM显示为在体外支持更好的HCEC功能，这可能表明在体内更好的眼细胞相容性。需要额外的研究来评估DDHAM的伤口愈合反应以及其临床应用和结果。

参考文献

Leal-Marin S，Kern T，Hofmann N，Pogozhykh O，Framme C，M，FigueiredoC，Glasmacher B，Gryshkov O.Human Amniotic Membrane：A review on tissueengineering，application，and storage.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2021；109：1198-1215。

Walkden A.Amniotic membrane transplantation in Ophthalmology：anupdated perspective.Clin Ophthalmol.2020；14：2057-2072。

Liu J，Li L，Li X.Effectiveness of Cryopreserved Amniotic MembraneTransplantation in Corneal Ulceration：A Meta-Analysis.Cornea.2019年4月；38：454-462。

Malhotra C，Jain AK.Human amniotic membrane transplantation：differentmodalities of its use in ophthalmology.World J Transplant.2014；4：111-121。

Meller D，Pauklin M，Thomasen H，Westekemper H，Steuhl KP.Amnioticmembrane transplantation in the human eye.Dtsch Arztebl Int.2011；108：243-248。

Fernandes M，Sridhar MS，Sangwan VS，Rao GN.Amniotic membranetransplantation for ocular surface reconstruction.Cornea.2005；24：643-653。

Shayan Asl N，Nejat F，Mohammadi P，Nekoukar A，Hesam S，Ebrahimi M，JadidiK.Amniotic membrane extract eye drop promotes limbal stem cell proliferationand corn eal epithelium healing.Cell J.2019；20：459-468。

Meller D，Pires RT，Tseng SC.Ex vivo preservation and expansion ofhuman limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.BrJOphthalmol.2002；86：463-471。

Meller D，Tseng SC.Conjunctival epithelial cell differentiation onamniotic membrane.Invest Ophthalmol Vis Sci.1999；40：878-886。

Sharma N，Singh D，Maharana PK，Kriplani A，Velpandian T，Pandey RM，Vajpayee RB.Comparison of amniotic membrane transplantation and umbilicalcord serumin acute ocular chemical burns：a randomized controlled trial.Am JOphthalmol.2016；168：157-163。

Tabatabaei SA，Soleimani M，Behrouz MJ，Torkashvand A，Anvari P，YaseriM.A randomized clinical trial to evaluate the usefulness of amniotic membranetransplantation in bacterial keratitis healing.Ocul Surf.2017；15：218-226。

Tandon R，Gupta N，Kalaivani M，Sharma N，Titiyal JS，Vajpayee RB.Amnioticmembrane transplantation as an adjunct to medical therapy in acute ocularburns.Br J Ophthalmol.2011；95：199-204。

Niknejad H，Peirovi H，Jorjani M，Ahmadiani A，Ghanavi J，SeifalianAM.Properties of the amniotic membrane for potential use in tissueengineering.Eur Cells Mater.2008；15：88-99。

Tseng SC，Li DQ，Ma X.Suppression of transforming growth factor-betaisoforms，TGF-beta receptor type II，and myofibroblast differentiation incultured human corneal and limbal fibroblasts by amniotic membrane matrix.JCell Physiol.1999；179：325-335。

Lee SB，Li DQ，Tan DT，Meller DC，Tseng SC.Suppression of TGF-betasignaling in both normal conjunctival fibroblasts and pterygial bodyfibroblasts by amniotic membrane.Curr Eye Res.2000；20：325-334。

Hao Y，Ma DH，Hwang DG，Kim WS，Zhang F.Identification of antiangiogenicand antiinflammatory proteins in human amniotic membrane.Cornea.2000；19：348-352。

Mamede AC，Botelho MF.Amniotic membrane：origin，characterization andmedical applications.Mamede AC，Botelho MF，编辑.New York，NY：Springer；2015。

Tehrani FA，Peirovi H，Niknejad.Determination of antibacterial effectof the epithelial and mesenchymal surfaces of amniotic membrane onescherichia coli，staphylococcus aureus and pseudomonas aeruginosa.Qom UnivMed Sci J.2013；7：12-22。

Sangwan VS，Basu S.Antimicrobial properties of amniotic membrane.Br JOphthalmol.2011；95：1。

Kjaergaard N，Hein M，Hyttel L，Helmig RB，HC，Uldbjerg N，Madsen H.Antibacterial properties of human amnion and chorion in vitro.Eur JObstet Gynecol Reprod Biol.2001；94：224-229。

Kjaergaard N，Helmig RB，Schonheyder HC，Uldbjerg N，Hansen ES，MadsenH.Chorioamniotic membranes constitute a competent barrier to group bstreptococcus in vitro.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.1999；83：165-169。

Inge E，Talmi Y P，Sigler L，Finkelstein Y，Zohar Y.Antibacterialproperties of human amniotic membranes.Placenta.1991；12：285-288。

Dua HS，Gomes JA，King AJ，Maharaj an VS.The amniotic membrane inophthalmology.Surv Ophthalmol.2004；49：51-77。

Shimmura S，Shimazaki J，Ohashi Y，Tsubota K.Antiinflammatory effects ofamniotic membrane transplantation in ocular surface disorders.Cornea.2001；20：408-413。

Hu DJ，Basti A，Wen A，Bryar PJ.Prospective comparison of corneal re-epithelialization over the stromal and basement membrane surfaces ofpreserved human amniotic membrane.ARVO Annual Meeting Abstract，2003。

Seitz B，Resch MD，-Schrehardt U，Hofmann-Rummelt C，Sauer R，Kruse FE.Histopathology and ultrastructure of human corneas after amnioticmembrane transplantation.Arch Ophthalmol；2006；124：1487-1490。

von Versen-F，Syring C，Bachmann S，/>DE.The innuence ofdifferent preservation and sterilisation steps on the histological propertiesof amnion allografts--light and scanning electron microscopic studies.CellTissue Bank.2004；5：45-56。

Lim LS，Poh RW，Riau AK，Beuerman RW，Tan D，Mehta JS.Biological andultrastructural properties of acelagran，a freeze-driedγ-irradiated humanamniotic membrane.Arch Ophthalmol.2010；128：1303-1310。

Tehrani FD，Firouzeh A，Shabani I，Shabani A.A review on modificationsof amniotic membrane for biomedical applications.Front BioengBiotechnol.2021；13；8：606982。

Gholipourmalekabadi M，Mozafari M，Salehi M等人Development of a cost-effective and simple protocol for decellularization and preservation of humanamniotic membrane as a Soft tissue replacement and delivery system for bonemarrow stromal cells.Adv Healthc Mater.2015；4：918-926。

Keane TJ，Londono R，Turner NJ，Badylak SF.Consequences of ineffectivedecellularization ofbiologic scaffolds on the hostresponse.Biomaterials.2012；33：1771-1781。

Seif-Naraghi SB，Singelyn JM，Salvatore MA，Osborn KG，Wang JJ，Sampat U，Kwan OL，Strachan GM，Wong J，Schup-Magoffin PJ，Braden RL，Bartels K，DeQuach JA，Preul M，Kinsey AM，DeMaria AN，Dib N，Christman KL.Safety and efficacy of aninjectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardialinfarction.Sci Transl Med.2013；5：173ra25。

Aamodt JM，Grainger DW.Extracellular matrix-based biomaterialscaffolds and the host response.Biomaterials.2016；86：68-82。

Balestrini JL，Gard AL，Liu A等人Production of decellularized porcinelung scaffolds for use in tissue engineering.Integr Biol(Camb).2015；7：1598-1610。

Bhatia M，Pereira M，Rana H等人The mechanism of cell interaction andresponse on decellularized human amniotic membrane：implications in woundhealing.Wounds.2007；19：207-217。

Rodríguez-Ares MT，L6pez-Valladares MJ，R，Vieites B，Gude F，SilvaMT，Couceiro J.Effects of lyophilization on human amniotic membrane.ActaOphthalmol.2009；87：396-403。

Keene DR，Sakai LY，Lunstrum GP，Morris NP，Burgeson RE.Type VII collagenforms an extended network of anchoring fibrils.J Cell Biol.1987；104：611-621。

Sonnenberg A，Calafat J，Janssen H，Daams H，van der Raaij-Helmer LM，Falcioni R，Kennel SJ，Aplin JD，Baker J，Loizidou M等人Integrin alpha 6/beta4complex is located in hemidesmosomes，suggesting a major role in epidermalcell-basement membrane adhesion.J Cell Biol.1991；113(4)：907-917。

Terranova VP，Lyall RM.Chemotaxis of human gingival epithelial cellsto laminin.A mechanism for epithelial cell apical migration.JPeriodontol.1986；57(5)：311-317。

Guo M，Grinnell F.Basement membrane and human epidermaldifferentiation in vitro.J Invest Dermatol.1989；93：372-378。

Kurpakus MA，Stock EL，Jones JC.The role of the basement membrane indifferential expression of keratin proteins in epithelial cells.DevBiol.1992；150：243-255。

Streuli CH，Bailey N，Bissell MJ.Control of mammary epithelialdifferentiation：basement membrane induces tissue-specific gene expression inthe absence o f cell-cell interaction and morphological polarity.J CellBiol.1991；115：1383-95。

Boudreau N，Werb Z，Bissell MJ.Suppression of apoptosis by basementmembrane requires three-dimensional tissue organization and withdrawal fromthe cell cycle.Proc Natl Ac ad Sci USA.1996；93：3509-3513。

Boudreau N，Sympson CJ，Werb Z，Bissell MJ.Suppression of ICE andapoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix.Science.1995；267：891-893。

Kubo M，Sonoda Y，Muramatsu R，Usui M.Immunogenicity of human amnioticmembrane in experimental xenotransplantation.Invest Ophthal Vis Sci.2001；42：1539-1546。

Kruse FE，Joussen AM，Rohrschneider K等人Cryopreserved human amnioticmembrane for ocular surface reconstruction.Graefe′s Arch Clin ExpOphthalmol.2000；238：68-75。

Koizumi N，Fullwood NJ，Bairaktaris G，Inatomi T，Kinoshita S，QuantockAJ.Cultivation of corneal epithelial cells on intact and denuded humanamniotic membrane.Invest Ophthalmol Vis Sci.2000；41：2506-2513。

Sosnová-NetukováM，Kuchynka P，Forrester J V.The suprabasal layer ofcorneal epithelial cells represents the major barrier site to the passivemovement of small molecules and trafficking leukocytes.Br J Ophthalmol.2007；91：372-378。

Kumar V，Abbas AK，Aster JC.Cell Injury，Cell Death，and Adaptations.在：Kumar V，Abbas AK，Aster JC编辑Robins Basic Pathology.Philadelphia：ElsevierSaunders，2013：1-28。

Solomon A，Rosenblatt M，Monroy D，Ji Z，Pflugfelder SC，TsengSC.Suppression of Interleukin 1 alpha and Interleukin 1 beta in the humanlimbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix.BrJOphthalmol.2001；85：444-449。

van Nieuwenhuijze A，Koenders M，Roeleveld D，Sleeman MA，van den Berg W，Wicks IP.GM-CSF as a therapeutic target in innammatory diseases.MolImmunol.2013；56：675-682。

Parmiani G，Castelli C，Pilla L，Santinami M，Colombo M P，RivoltiniL.Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant incancer patients.Ann Oncol.2007；18：226-232。

Bhattacharya P，Budnick I，Singh M，Thiruppathi M，Alharshawi K，Elshabrawy H，Holterman MJ，Prabhakar BS.Dual Role of GM-CSF as a Pro-Inflammatory and a Regulatory Cytokine：Implications for Immune Therapy.JInterferon Cyto kine Res.2015；35：585-599。

Shachar I，Karin N.The dual roles of inflammatory cytokines andchemokines in the regulation of autoimmune diseases and their clinicalimplications.J Leukoc Biol.2013；93：51-61。

Rho CR，Park MY，Kang S.Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating(GM-CSF)factor on corneal epithelial cells in corneal woundhealing model.PLoS One.2015；10：e0138020。

Hafezi F，Gatzioufas Z，Angunawela R，Ittner LM.Absence of IL-6 preventscorneal wound healing after deep excimer laser ablation in vivo.Eye(Lond).2018；32：156-157。

Arranz-Valsero I，Soriano-Romani L，García-Posadas L，López-García A，Diebold Y.IL-6 as a corneal wound healing mediator in an in vitro scratchassay.Exp Eye Res.2014；125：183-192。

Ebihara N，Matsuda A，Nakamura S，Matsuda H，Murakami A.Role of the IL-6classic-and trans-signaling pathways in corneal sterile inflammation andwound healing.Invest Ophthalmol Vis Sci.2011；52：8549-8557。

Nishida T，Nakamura M，Mishima H，Otori T，Hikida M.Interleukin 6facilitates corneal epithelial wound closure in vivo.Arch Ophthalmol.1992；110：1292-1294。

Strieter RM，Kunkel SL，Elner VM，Martonyi CL，Koch AE，Polverini PJ，ElnerSG.Interleukin-8.A corneal factor that induces neovascularization.Am JPathol.1992；141：1279-1284。

Koch AE，Polverini PJ，Kunkel SL，Harlow LA，DiPietro LA，Elner VM，ElnerSG，Strieter RM.Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator ofangiogenesis.Science.1992；258：1798-1801。

Wang X，Zhang S，Dong M，Li Y，Zhou Q，Yang L.The proinflammatorycytokines IL-1β and TNF-α modulate corneal epitheli al wound heal ing throughp16Ink4a suppressing STAT3 activity.J Cell Physiol.2020；235：10081-10093。

Yang L，Zhang S，Duan H，Dong M，Hu X，Zhang Z，Wang Y，Zhang X，Shi W，ZhouQ.Difierent efiects of pro-Innammatory factors and hyperosmotic stress oncorneal epithelial stem/progenitor cells and wound healing in mice.Stem CellsTransl Med.2019；8：46-57。

Sangwan VS，Basu S，MacNeil S，Balasubramanian D.Simple limbalepithelial transplantation(SLET)：a novel surgical technique for the treatmentof unilaterallimbal stem cell deficiency.BrJ Ophthalmol.2012年7月；96(7)：931-934。

Maharajan VS，Shanmuganathan V，Currie A，Hopkinson A，Powell-Richards A，Dua HS.Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction：indications and outcomes.Clin Exp Ophthalmol.2007年3月；35：140-147。

T，Bramkamp M，Bartz-Schmidt KU，/>D.A retrospective study tocompare the recurrence rate after treatment of pterygium by conjunctivalautograft，primary closure，and amniotic membrane transplantation.Med SciMonit.2019；25：7976-7981。/>

Akbari M，Soltani-Moghadam R，Elmi R，Kazemnejad E.Comparison of freeconjunctival autograft versus amniotic membrane transplantation for pterygiumsurgery.J Curr Ophthalmol.2017；29：282-286。

Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbalstem-cell therapy and long-term corneal regeneration.N Engl J Med.2010；363：147-155。

Shortt AJ，Secker GA，Lomas RJ，Wilshaw SP，Kearney JN，Tuft SJ，DanielsJT.The effect of amniotic membrane preparation method on its ability to serveas a substrate for the ex-vivo expansion of limbal epithelialcells.Biomaterials.2009；30：1056-65。

Sheha H，Kheirkhah A，Taha H.Amniotic membrane transplantation intrabeculectomy with mitomycin C for refractory glaucoma.J Glaucoma.2008；17：303-307。

Agraval U，Rundle P，Rennie IG，Salvi S.Fresh frozen amniotic membranefor conjunctival reconstruction after excision of neoplastic and presumedneoplastic conjunctival lesions.Eye(Lond).2017；31：884-889。

Hanada K，Shimazaki J，Shimmura S，Tsubota K.Multilayered amnioticmembrane transplantation for severe ulceration of the cornea and sclera.Am JOphthalmol.2001；131：324-331。

Ma DH，Wang SF，Su WY，Tsai RJ.Amniotic membrane graft for themanagement of scleral melting and corneal perforation in recalcitrantinfectious scleral and corneoscleral ulcers.Cornea.2002；21：275-283。

Fenelon M，Maurel DB，Siadous R等人Comparison of the impact ofpreservation methods on amniotic membrane properties for tissue engineeringapplications.Mat Sci Eng C.2019；104：109903。

Salah RA，Mohamed IK，El-Badri N.Development of decellularized amnioticmembrane as a bioscaffold for bone marrow-derived mesenchymal stem cells：ultrastructural study.J Mol Histol.2018；49：289-301。

Francisco JC，Correa Cunha R，Cardoso MA，Baggio Simeoni R，Mogharbel BF，Picharski GL，Silva Moreira Dziedzic D，Guarita-Souza LC，CarvalhoKA.Decellularized Amniotic Membrane Scaffold as a Pericardial Substitute：AnIn Vivo Study.Transplant Proc.2016；48：2845-2849。

Gholipourmalekabadi M，Sameni M，Radenkovic D，Mozafari M，Mossahebi-Mohammadi M，Seifalian A.Decellularized human amniotic membrane：how viable isit as a delivery system for human adipose tissue-derived stromal cells？CellProlif.2016；49：115-121。

Taghiabadi E，Nasri S，Shafieyan S，Firoozinezhad SJ，AghdamiN.Fabrication and characterization of spongy denuded amniotic membrane basedscaffold for tissue engineering.Cell J.2015；16：476-487。

Memarzadeh F，Fahd AK，Shamie N，Chuck RS.Comparison of de-epithelialized amniotic membrane transplantation and conjunctival autograftafter primary pterygium excision.Eye(Lond).2008；22：107-112。

Chuck RS，Graff JM，Bryant MR，Sweet PM.Biomechanical characterizationof human amniotic membrane preparations for ocular surfacereconstruction.Ophthalmic Res.2004；36：341-348。

Hovanesian JA.History of amniotic membranes in pterygium surgery.在：Hovanesian JA编辑Pterygium：techniques and technologies for surgicalsuccess.Thorofare：SLACKIncorporated；2012：65-75。

实例6：弧形Biovance 3L目镜

在本发明实例中，Biovance 3L目镜以弧形型式产生，以更好地贴合角膜和眼球。

通过3D打印来制造具有不同球面半径、高度和直径的模具(图17)。将分层的膜干燥到模具上并小心地取出。经干燥的产品，如图18，在弧形单元之间的空间中被切割。

表7.弧形biovance 3L目镜

本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了所描述的那些之外，根据前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用整体并入用于所有目的。对任何出版物的引用均由于其在申请日之前公开，不应解释为承认本发明因现有发明而无权先于此类出版物。

Claims (44)

1.一种组织移植物产品，其包括层积在一起的多层细胞外基质，其中所述细胞外基质来源于羊膜，并且其中细胞外基质层的基质侧存在于所述组织移植物产品的上表面和下表面两者上。

2.根据权利要求1所述的组织移植物产品，其中所述产品包括三层或更多层细胞外基质。

3.根据权利要求1所述的组织移植物产品，其中所述产品包括恰好三层细胞外基质。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组织移植物产品，其中所述羊膜是脱细胞的。

5.根据权利要求4所述的组织移植物产品，其中用洗涤剂和或机碱破碎使所述羊膜脱细胞。

6.根据权利要求5所述的组织移植物产品，其中所述洗涤剂是脱氧胆酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组织移植物产品，其中所述多层细胞外基质通过干燥来层积在一起。

8.根据权利要求7所述的组织移植物产品，其中所述产品通过热和或真空进行干燥。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组织移植物产品，其中所述组织移植物产品是脱水的。

10.根据权利要求9所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约20％的水。

11.根据权利要求9所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约15％的水。

12.根据权利要求9所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约10％的水。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约40％至约70％的总胶原蛋白。

14.根据权利要求13所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约45％至约60％的总胶原蛋白。

15.根据权利要求13所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约50％至约55％的总胶原蛋白。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的组织移植物产品，其中所述胶原蛋白主要是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白。

17.根据权利要求9至16中任一项所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约8％至约24％的弹性蛋白。

18.根据权利要求17所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约12％至约20％的弹性蛋白。

19.根据权利要求17所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计约15％至约20％的弹性蛋白。

20.根据权利要求9至19中任一项所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约1％的糖胺聚糖。

21.根据权利要求20所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约0.5％的糖胺聚糖。

22.根据权利要求9至21中任一项所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约1％的纤连蛋白。

23.根据权利要求22所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约0.5％的纤连蛋白。

24.根据权利要求9至23中任一项所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约1％的层粘连蛋白。

25.根据权利要求24所述的组织移植物产品，其中所述产品包含按干重计小于约0.5％的层粘连蛋白。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的组织移植物产品，其中所述羊膜是人羊膜。

27.根据权利要求26所述的组织移植物产品，其中所述羊膜来源于足月妊娠。

28.一种眼组织移植物，其包括根据权利要求1至27中任一项所述的组织移植物产品。

29.根据权利要求28所述的眼组织移植物，其中所述眼组织移植物是大致圆形的。

30.根据权利要求28所述的眼组织移植物，其中所述眼组织移植物包括呈球体的一部分的形状的弧形部分。

31.根据权利要求30所述的眼组织移植物，其中通过将所述组织移植物产品干燥到模具上来赋予所述形状。

32.一种治疗受试者的眼睛的疾病或损伤的方法，所述方法包括以下步骤：使所述受试者的所述眼睛与根据权利要求1至27中任一项所述的组织移植物产品或根据权利要求28至31中任一项所述的眼组织移植物按触，以便由此治疗所述受试者。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述眼睛的所述损伤包括擦伤。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述眼睛的所述损伤包括化学品暴露。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述眼睛的所述损伤包括割伤或撕裂伤。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述眼睛的所述疾病或损伤包括角膜的疾病或损伤。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括受损组织的修复。

38.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括相对于未经治疗的眼睛减少瘢痕组织或减少瘢痕组织形成。

39.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞迁移。

40.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞黏附。

41.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞增殖。

42.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述治疗包括相对于未经治疗的眼睛增加上皮细胞覆盖。

43.根据权利要求32至42中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述受试者是人。