KR102177766B1

KR102177766B1 - 양막링 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102177766B1
Application number: KR1020190029777A
Authority: KR
Inventors: 김재찬; 박우찬; 김성포; 김응배
Original assignee: 주식회사 엠에스바이오
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2020-11-11
Also published as: KR20200109932A

Abstract

본 발명은 안구 표면 질환의 치료에 사용될 수 있는 양막링 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 양막링은 각막의 창상 치유를 목적으로 한 양막이식분야에서,이식된 양막의 봉합이 불필요하여 봉합에 따른 합병증을 최소화하고, 렌즈 형태를 가져 외래에서 간편하게 사용할 수 있다. 나아가, 별도의 O-링 없이 렌즈 형태로 양막의 고정이 가능하고, 지지체 표면에 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층이 위치하여 안구 삽입시 이물감과 불편함을 크게 감소시킬 수 있으며, 안구 중심에서 양막링이 이탈하지 않고 위치할 수 있다.

Description

양막링 및 이의 제조방법{AMNION RING AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 안구 표면 질환의 치료에 사용될 수 있는 양막링 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 생체소재인 양막을 링 형태로 고정한 양막링 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

안과적 영역에서 각막은 투명한 조직으로 반흔 형성에 의한 시력감소 및 각막 혼탁을 야기하는데, 이런 창상 치유과정에 있어서 반흔 형성을 조절하기 위해 양막(amnion)이 널리 사용되고 있다. 양막은 태반의 가장 안쪽에 있는 막으로 태아를 둘러싸고 있고, 모체로부터의 각종 감염 및 면역반응 등으로부터 태아를 보호하는 장벽 역할을 한다. 양막의 두께는 0.2 내지 0.5 mm로 얇고 반투명하며, 단수 입방상피(simple cuboidal epithelium)와 두꺼운 기저막, 무혈관성의 간엽성 간질(mesenchymal stroma)로 구성되어 있으며, 평활근 세포, 신경, 임파관 및 혈관이 없기 때문에 이식을 하여도 거부반응을 보이지 않는 생체막이다. 양막은 창상 치유과정에서 상피화를 촉진시키고, 염증을 감소시키며, 신생혈관형성을 억제하여 반흔 형성을 억제한다. 이러한 양막의 효과가 알려진 후, 다양한 안과 질환에 양막을 이식해 좋은 결과를 얻고 있으며, 특히 각막 및 결막의 표면질환에 양막을 이식하여 빠른 창상 치유 및 탁월한 각막 혼탁 감소 효과가 보고되었다.

상술한 바과 같이, 양막은 정상적인 상피세포의 특성을 유지시키고 상피세포 성장을 촉진하며, 항염증 작용, 신생혈관형성 억제작용 및 반흔 형성 억제작용 등을 가지고 있다고 알려져 있다. 그 작용 기전으로 양막은 각막 및 결막 모세포의 성장과 그 특성을 유지시킬 수 있는 기저막으로서 작용하므로, 부분적 각막의 윤부 결핍증이나 각막궤양에서 동반되는 반복 지속적 각막상피 탈락에서, 양막을 각막 위에 이식하면 각막상피 모세포의 기능이 회복되어 건강한 안표면이 재생되고, 지속성 각막상피결손이나 반복성 각막미란 때 각막상피의 성장을 촉진시킬 수 있다. 또한 양막은 기저막으로 작용하므로 상피의 이동과 분화를 도와주며 기저 상피세포의 유착을 강화시키고 상피의 아포토시스(apoptosis)를 억제시켜 창상 치유과정에서 상피재생을 촉진시킨다.

또한, 양막은 IL-1, IL-8, PMN elastase, Gro-alpha(growth regulated oncogene-alpha), Neutrophil activating peptide-78(ENA)를 하향조정(down-regulation)하여 항염증 작용을 나타내고, 염증세포를 흡착하며, 염증세포의 아포토시스를 유발시켜 염증세포가 창상조직에 침투하지 못하도록 하는 것으로도 알려져 있다.

기존의 양막 사용의 역사와 연구동향을 살펴보면, 1940년 De Rotth가 양막과 융모막이 붙어있는 생 태아막(live fetal membrane)을 이용해 결막 표면 재건에 사용하였고(비특허문헌 1), Sorsby 등이 1946년 양막을 안구 화상 치료에 사용하였다(비특허문헌 2). 1965년 Ropen-Hall은 양막을 안구 화학화상 후 일시적 patch로 사용하였다(비특허문헌 3). 그 후 양막은 피부화상이나 피부이식 후 상처부위의 dressing, 외과 개복수술 시 복막결손부에 이식하거나, 중이강, 관절 활액낭 수술 시에 이식하는 등 다양한 용도로 사용되어왔다.

최근에는 결막을 대체하고 각막 창상 치유를 촉진시키며, 각막상피 간세포의 미세 환경을 향상시켜 각막 윤부 결핍증의 치료에 사용되는 등 안과적으로 매우 활발히 연구 및 사용되고 있다.

그러나 지금까지의 각막 창상 치유 목적을 위한 양막의 사용법은 양막 자체를 창상 위에 이식하기 위해 봉합법을 시행해야 하는 문제점이 있으며, 이는 봉합과정에서 합병증이 발생할 수 있고, 반복적으로 이식하여 사용하기 어려워 그 사용이 제한되어 왔다.

이러한 문제점을 보완하기 위한 노력으로, 미국 등록특허 제7,494,802호에는 안과용 외과 수술 후 사용할 목적으로 15 내지 16 mm의 구멍을 가진 폴리카보네이트 재질의 몸체에 O-링을 이용하여 양막을 물리적으로 고정시킨 예가 개시되어 있다. 마찬가지로, 한국 등록특허 제10-1132625호도 O-링을 이용해 양막을 고정시킨 렌즈를 개시하고 있다.

그러나, 이러한 제품은 딱딱한 재질의 폴리카보네이트에 의해 눈의 이물감이심하여 불편할 뿐만 아니라, 눈꺼풀의 깜박임에 의해 고정체가 안구의 중심에서 한쪽으로 치우치는 등의 문제가 있다.

미국등록특허 제7,494,802호 한국 등록특허 제10-1132625호

De Rotth A. Arch. Opthalmol., 1940; 23:525-5 Sorsby A, Symons HM. Opthalmol., 1946; 20:337-345 Ropen-H MJ, Trans Ophthalmol Soc UK, 1965;85:631-646 Kenyon KR et al., Ophthalmology., 1985; 92:1461-1470 Stark T et al., Cornea., 1991;10:196-202 Allan BD short P, Crawford CJ, et al., Br.J. Ophthalmol., 1993:77:698-701 Chen PP, Ariyasu RG, Kaza V, et al., Am.J. Ophthalomol., 1995; 120: 151-160 Tan DT et al., Arch. Ophthalmol., 1997; 115: 1235-1240 Ti SE Chee SP et al., Br.J. Ophthalmol., 2008; 84:385-389. Sridhar MS et al., Cornea., 2002; 21:305-307 Koranyi G et al., Br. J. Ophthalmol., 2004; 88:911-914 Uy HS Reyes JM et al., Br. J. Ophthamol., 2005; 112:667-671 Shimmura S, Shimazaki J, Ohashi Y, et al., Cornea., 2001; 20: 408-413 Kim JS, Kim JC, Na BK, et al., Exp Eye Res., 2000; 70: 329-337 Gris O, Campo Z. Wolley-Dod C, et al., Cornea., 2002; 21: 22-27 Takano Y, Fukagawa K, Miyake-Kashima M, et al., Cornea., 2004; 233: 723-725 Choi YS, Kim JY, Wu WR, et al., Cornea., 1998; 17:389-395 Woo HM, Kim HS, Kweon OK, et al., Br. J. Opthalmol., 2001; 85: 345-349 Batlle JF, Perdomo FJ. Opthalmol., 1993; 100:107 Kim JC, Tseng SC. Cornea., 1995; 14: 473-484 Akle CA et al., Lancet, 1981; 2:1003-1005 Dua HS et al., Br.J. Opthalmol., 1999; 83:748-752 Tsuyoshi Yoshita et al., Am. J. Ophthalmol., Vol. 138, No.3: 486-487 Gowri Pachigolla et al., Eye & Contact Lens, vol 35, No4, 2009 Noriko Koizumi et al., Current Eye Research, vol.20, No.3. 173-177, 2000

따라서, 본 발명은 안구에 적용할 수 있는 링 형태의 하이드로겔에 양막을 직접 접착 및 고정함으로써, 지지체에 양막의 고정을 위한 별도의 O-링이 필요없고, 안구 삽입시 이물감과 같은 불편함이 없으면서도 안구 중심에 잘 위치할 수 있는 양막링을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 표면에 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층을 갖는 링(ring) 형태의 지지체; 및 상기 지지체 상의 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층에 원주 가장자리가 부착된 콘택트렌즈 형상의 양막;을 포함하는, 양막링을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (1) 링(ring) 형태의 지지체의 표면을 폴리비닐알콜 하이드로겔로 코팅하여 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층을 갖는 링 형태의 지지체를 제조하는 단계; (2) 상기 지지체의 일면을 덮으면서 상기 지지체 상의 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층과 접하도록 양막을 위치시키되, 상기 양막을 위치시키기 전 또는 후에 콘택트렌즈 형상을 갖도록 양막을 성형하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)의 결과물을 가교처리하여 상기 양막을 상기 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층에 부착시키는 단계;를 포함하는, 양막링의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 양막링은 각막의 창상 치유를 목적으로 한 양막이식분야에서, 이식된 양막의 봉합이 불필요하여 봉합에 따른 합병증을 최소화하고, 렌즈 형태를 가져 외래에서 간편하게 사용할 수 있다. 나아가, 별도의 O-링 없이 렌즈 형태로 양막의 고정이 가능하고, 지지체 표면에 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층이 위치하여 안구 삽입시 이물감과 불편함을 크게 감소시킬 수 있으며, 안구 중심에서 양막링이 이탈하지 않고 위치할 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명에 따른 양막링 제조시 사용되는 성형용 몰드의 단면도이다.
도 3은 본 발명에 따른 양막링 제조시 사용되는 지지체의 사시도이다.
도 4는 본 발명에 따른 양막링 제조시 사용되는 펀치형 커팅칼날의 단면도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 양막링의 모식도이다.
도 6은 실시예 1의 양막링에 대한 세포 독성 평가 결과로, 24시간 경과 및 48시간 경과후 세포독성에 대한 세포생존률을 나타낸 그래프이다(평가예 2 참조).
도 7은 실시예 1의 양막링에 대한 이식거부 반응 평가 결과로, 상기 양막링에서 양막 및 폴리비닐알코올 하이드로겔을 분리하고, 각각을 Rat 피하에 이식한 다음, 시간(1주, 2주 및 4주) 경과에 따라 이식된 정도 및 상태를 나타낸 사진이다(평가예 3 참조).

본 발명은 이하에 개시된 내용에 한정되는 것이 아니라, 발명의 요지가 변경되지 않는 한 다양한 형태로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 "포함"한다는 것은 특별한 기재가 없는 한 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다. 또한, 본 명세서에 기재된 구성성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자 및 표현은 특별한 기재가 없는 한 모든 경우에 "약"이라는 용어로써 수식되는 것으로 이해하여야 한다.

양막링

본 발명은 표면에 폴리비닐알콜(PVA) 하이드로겔 코팅층을 갖는 링(ring) 형태의 지지체; 및 상기 지지체 상의 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층에 원주 가장자리가 부착된 콘택트렌즈 형상의 양막;을 포함하는, 양막링을 제공한다.

이하 도 5를 참고하여, 양막링을 구체적으로 설명한다.

상기 양막링(500)은 PVA 하이드로겔 코팅층(52)을 갖는 링 형태의 지지체(51)를 포함한다. 상기 지지체(51)는 양막링(500)의 기계적 강도를 높이면서 안구 삽입시 굴곡을 갖는 안구 중심에 밀착하여 이탈하지 않고 위치할 수 있도록 한다.

상기 지지체(51)는 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 아크릴, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리메틸메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어질 수 있고, 구체적으로 폴리에틸렌일 수 있다.

상기 지지체(51)는 링 형태를 가지되, 종단면이 두께 방향으로 볼록한 굴곡을 갖는 사다리꼴 형태를 가질 수 있다. 상기 지지체(51, 300) 일례에 대한 사시도를 도 3에 나타내었다. 도 3을 참고하면, 상기 지지체(51, 300)의 외주면은 일정 높이(33) 및 굴곡을 가지면서, 보다 좁은 상부 내경(31) 및 보다 넓은 하부 외경(32)을 가진다. 구체적으로, 상기 지지체(51, 300)는 17 내지 25 mm, 또는 17 내지 19 mm의 상부 내경(31) 및 19 내지 30 mm, 또는 19 내지 23 mm의 하부 외경(32)을 갖고, 0.5 내지 2.5 mm, 또는 0.5 내지 2 mm의 높이(33)를 가지며, 상기 굴곡에 있어서 2 내지 15 mm, 또는 2 내지 10 mm의 곡률 반경을 가질 수 있다.

상기 지지체(51)는 링 외주면을 따라 일렬로 형성된 3 내지 10개, 또는 3 내지 6개의 홀(34)을 가질 수 있고, 상기 범위 내일 때, 지지체(51) 외주면의 러프니스(roughness)를 높여 PVA 하이드로겔 코팅층(52)이 지지체(51) 외주면에 잘 부착될 수 있게 해준다. 만약, 홀(34)의 개수가 10개를 초과하면 지지체(51)의 강도가 약해질 수 있고, 3개 미만이면 PVA 하이드로겔 코팅층(52)과 지지체(51)와의 결합력이 떨어서 서로 박리될 수 있다.

상기 홀(34)은 원형, 타원형 등의 형태를 가질 수 있고, 0.1 내지 1.0 mm, 0.3 내지 0.8 mm, 또는 0.3 내지 0.6 mm의 직경을 가질 수 있다.

상기 PVA 하이드로겔 코팅층(52)은 상기 지지체(51)의 표면 전체를 둘러싸며, 상기 PVA 하이드로겔 코팅층에 상기 콘택트렌즈 형상의 양막(53)의 원주 가장자리가 부착된다. 상기 PVA 하이드로겔 코팅층(52)은 0.1 내지 2.0 mm, 또는 0.5 내지 1.0 mm 두께를 갖는다. 상기 범위 내일 때, 안구 삽입시 이물감이 적다.

상기 양막(53)은 인간 또는 소로부터 수득된 것일 수 있고, 예컨대, B형 간염, C형 간염, HIV, 매독 등의 혈청검사 결과가 음성인 산모의 제왕절개 후 태반으로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 양막링에 사용된 양막은 1겹, 또는 2겹 이상 중첩된 것일 수 있다.

상기 양막링(500)은 PVA 하이드로겔 코팅층(52)과 양막(53)이 가교제 없이 직접 부착된 형태로, 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.

양막링의 제조방법

본 발명은 (1) 링(ring) 형태의 지지체의 표면을 폴리비닐알콜(PVA) 하이드로겔로 코팅하여 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층을 갖는 링 형태의 지지체를 제조하는 단계; (2) 상기 지지체의 일면을 덮으면서 상기 지지체 상의 PVA 하이드로겔 코팅층과 접하도록 양막을 위치시키되, 상기 양막을 위치시키기 전 또는 후에 콘택트렌즈 형상을 갖도록 양막을 성형하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)의 결과물을 가교처리하여 상기 양막을 상기 PVA 하이드로겔 코팅층에 부착시키는 단계;를 포함하는, 양막링의 제조방법을 제공한다.

먼저, 본 발명의 양막링의 제조방법에 따르면 양막을 다음과 같이 준비할 수 있다. 상기 양막은 앞서 설명한 바와 같이 인간 또는 소로부터 수득된 것일 수 있고, B형 간염, C형 간염, HIV, 매독 등의 혈청검사 결과가 음성인 산모의 제왕절개 후 태반으로부터 분리한 후, 세척 및 멸균하여 얻을 수 있다.

예를 들어, 산모의 양막을 멸균 생리식염수 및 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 사용하여 수회 반복 세척한 후 양막의 기질층을 스크래퍼로 제거하고, 이후 멸균 생리식염수로 수회 반복 세척한 뒤 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 종이에 부착시킨 후, 약 4x5cm 크기로 잘라 20 내지 50 중량%의 글리세롤이 포함된 DMEM(Dulbecco modified eagle medium) 동결보존액에 넣어 -40℃ 이하의 냉동고에서 사용 전까지 보관할 수 있다.

이때, 글리세롤은 상기 함량 범위 내일 때 양막의 안정성 측면에서 보다 유리하고, 상기 범위보다 초과하여 사용하는 경우에는 세포독성의 문제가 야기되고, 상기 범위 미만으로 사용하는 경우에는 동결보존액의 결정화로 양막이 손상될 수 있다.

상기 PVA 하이드로겔은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.

먼저, 연질의 PVA 하이드로겔을 준비한다. PVA 하이드로겔은 중탕을 이용한 1차 융해단계 및 고압 멸균을 이용한 2차 융해단계에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 정제수가 담긴 용기에 100,000 내지 200,000 Da, 또는 100,000 내지 150,000 Da 중량평균분자량을 갖는 고형의 PVA를 넣어준 후, 용기 바닥에 늘러붙지 않도록 교반하면서 3분 내지 2시간 동안 중탕하고, 고압멸균하여 잔존하는 고형의 PVA를 완전히 용해시켜 PVA 하이드로겔을 제조한다. 제조된 PVA 하이드로겔은 5 내지 50 중량%, 5 내지 40 중량% 또는 10 내지 30 중량%의 양으로 PVA를 포함할 수 있다. 상기 범위 내일 때, 기계적 특성이 우수하고, 지지체 코팅에 적합한 적정한 점도를 유지할 수 있다. 만약, 상기 범위보다 적게 사용하는 경우 기계적 특성이 저하되고, 초과하여 사용하는 경우에는 점도가 과하게 높아져 코팅 작업이 원활하지 않다.

상기 지지체는 앞서 설명한 바와 같은 재질의 원료들을 고압사출기로 성형하여, 17 내지 25 mm, 또는 17 내지 19 mm의 상부 내경 및 19 내지 30 mm, 또는 19 내지 23 mm의 하부 외경을 갖고, 0.5 내지 2.5 mm, 또는 0.5 내지 2 mm의 높이를 가지며, 굴곡에 있어서 2 내지 15 mm, 또는 2 내지 10 mm의 곡률 반경을 갖도록 제작할 수 있다.

상술한 바와 같은 PVA 하이드로겔을 사용하여 앞서 상술한 바와 같은 링 형태의 지지체의 표면을 코팅하여 PVA 하이드로겔 코팅층을 형성하고(단계 (1)), 상기 지지체 상의 PVA 하이드로겔 코팅층과 접하도록 양막을 위치시킨 다음(단계 (2)), 화학적 및/또는 물리적 가교처리하여 상기 양막을 상기 PVA 하이드로겔 코팅층에 부착시킨다(단계 (3)).

상기 단계 (1) 및 (2)는 성형용 몰드에서 수행될 수 있다.

도 1을 참고하면, 상기 성형용 몰드(100)는 렌즈 성형용 몰드일 수 있고, 상판(11), 기둥(12) 및 하판(13)을 포함할 수 있다.

상기 몰드(100)는 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 스테인레스 스틸 및 티타늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재질로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

몰드의 상판(11)은 가운데 기둥(12)이 위치할 직경 16 내지 18 mm 홀이 형성되어 있고, 하판(13)과 결합시 상판(11)과 하판(13) 간에는 1 내지 10 cm³ 또는 3 내지 5 cm³의 공간이 생길 수 있다. 상기 범위 내일 때, 지지체 상에 형성된 PVA 하이드로겔 코팅층이 적정 두께를 가질 수 있다.

몰드의 하판(13)과 기둥(12)이 결합하는 부위, 예를 들어, 기둥(12)의 볼록부(121) 및 하판(13)의 오목부(131, 132)는 자석(14, 15)을 더 구비할 수 있고, 상기 자석(14, 15)에 의해 상기 하판(13)에 상기 기둥(12)이 자력으로 세워질 수 있다.

이때, 상기 하판(13)의 일면에 형성된 오목부(131)의 중앙 부분은 상기 기둥(12)과의 결합을 위해 원형, 타원형 등의 오목한 형태를 가질 수 있다.

상기 하판(13)의 타면에 형성된 오목부(132)는 자석(15)이 구비될 수 있다.

상기 기둥(12)의 볼록부(121)는 상기 하판(13)의 오목부(131)에 대응되도록 원형, 타원형 등의 볼록한 형태를 가질 수 있고, 상기 볼록부(121)는 상기 오목부(131)의 접촉면적과 동일하거나 또는 작을 수 있다.

상술한 바와 같은 성형용 몰드에서 상기 단계 (1), 및/또는 단계 (2)가 수행될 수 있다.

구체적으로, 단계 (1)의 경우, 상기 지지체(51)를 몰드에 삽입한 후, 그 주변에 PVA 하이드로겔을 주입하여 수행될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 지지체(51)의 상부가 아래로 향하도록 몰드의 하판(13, 23) 위에 위치시킨 뒤 상기 준비된 양막(53)을 올려 놓는다. 양막(53)은 기질층 또는 상피층이 위를 향하게 놓을 수 있다. 양막(53)과 지지체(51)의 고정을 위해 기둥의 볼록부(121, 221)를 하판 오목부(131, 231)에 결합시켜 양막(53)을 고정시킨다. 양막(53)은 상기 기둥의 볼록부(121, 221) 및 하판의 오목부(131, 231)의 결합에 의해 콘택트렌즈 형상으로 성형될 수 있다. 상기 공정 중 양막(53)은 핀셋을 이용해 위치를 조정할 수 있다. 그 다음, 상기 PVA 하이드로겔을 양막(53)과 몰드의 하판(13, 23) 사이, 및 기둥(12, 22)의 외주면을 따라 고르게 주입하여 지지체(51)의 표면을 코팅할 수 있다.

그 다음, 핀셋을 이용해 양막(53)의 가장자리를 당기듯이 기둥의 원주면 쪽으로 펴주면서 지지체(51) 상의 PVA 하이드로겔 코팅층(52)과 양막(53)이 접하도록 한 뒤, 몰드 상판(11, 21)을 결합시켜 콘택트렌즈 형상으로 성형된 양막(53)의 가장자리를 PVA 하이드로겔 코팅층(52)에 한번 더 강하게 부착시켜 양막(53)이 상기 지지체(51)의 일면을 덮으면서, 상기 지지체(51) 상의 PVA 하이드로겔 코팅층(52)에 부착될 수 있도록 한다.

몰드 내에서 수행되는 이러한 방법 외에도, 상기 PVA 하이드로겔이 담긴 용기에 상기 지지체를 일정시간 침지시켜 지지체의 표면을 코팅한 다음, 콘택트렌즈 형상으로 성형시킨 양막을 부착하거나 또는 양막을 부착시킨 후 콘택트렌즈 형상으로 성형시키는 공정을 수행할 수도 있다.

그 다음, 상기 단계 (2)의 결과물을 화학적 및/또는 물리적 가교처리하여 상기 양막과 PVA 하이드로겔 코팅층이 분리되지 않도록 부착(단계 (3))시켜 목적하는 양막링을 제조한다.

상기 가교처리는 다음과 같은 화학적 가교 또는 물리적 가교에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 화학적 가교는 카르보디이미드(carbodiimide), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylamonopropyl)carbodiimide; EDC, EDAC), 글루타르 알데히드(glutaraldehyde), 붕산(boric acid), 붕사(borax), 포름알데하이드(formaldehyde) 및 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate, HMDI)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 용액에 상기 단계 (2)의 결과물을 침지시켜 수행될 수 있다.

상기 물리적 가교는 동결융해, 자외선 조사, 방사선 조사 또는 탈수 열처리에 의해 수행될 수 있다.

상기 동결융해는 20 내지 -80℃의 조건에서 2 내지 18시간을 동결하고 20 내지 36℃ 조건에서 1 내지 6시간 융해하는 공정을 1 내지 10회 반복함으로써 수행될 수 있고, 방사선 조사는 2.5 내지 50 kGy, 또는 15 내지 25 kGy 선량의 감마선, 전자빔 등을 조사하여 수행될 수 있다. 상기 범위 내일 때, 상기 PVA 하이드로겔 코팅층의 기계적 강도가 적정 수준(안구 삽입시 이물감 또는 건조함이 느껴지지 않는 정도)으로 높아지고 양막과의 부착력도 향상되어 분리되지 않는다.

상기 단계 (3) 이후에는, 상기 양막링의 외곽선을 절단하는 단계 및/또는 상기 양막링을 멸균하는 단계를 더 수행할 수 있다. 구체적으로, 가교처리가 끝난 양막링을 몰드에서 분리한 다음, 펀치형의 커팅 칼날(도 4 참조), 수술용 가위, 메스 등을 이용해 상기 양막링의 외곽선을 따라 원형으로 절단할 수 있다.

절단된 양막링은 정제수, 생리식염수를 사용해 수회 세척한 다음, 감마선, 전자빔 등을 5 내지 35 kGy, 또는 15 내지 25 kGy의 선량으로 조사하여 멸균시킬 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 양막링은 각막의 창상 치유를 목적으로 한 양막이식 분야에서, 이식된 양막의 봉합이 불필요하여 봉합에 따른 합병증을 최소화하고, 렌즈 형태를 가져 외래에서 간편하게 사용할 수 있다. 나아가, 별도의 O-링 없이 렌즈 형태로 양막의 고정이 가능하고, 지지체 표면에 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층이 위치하여 안구 삽입시 이물감과 불편함을 크게 감소시킬 수 있으며, 안구 중심에서 양막링이 이탈하지 않고 위치할 수 있다.

상기 내용을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 실시예의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

제조예 1: 양막 준비

양막은 한국 인체조직안전 및 관리 등에 관한 법률에 의거 인체조직안전에 관한 규칙을 준수하여 가공처리하였다.

구체적으로, B형 간염, C형 간염, 후천성면역결핍증(에이즈, HIV), 매독 등의 전염성 질환이 없는 산모의 제왕절개술 후 얻어진 태반에서 양막을 분리하였다. 상기 양막을 멸균 생리식염수 및 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 수회 반복하여 세척한 뒤, 최종적으로 멸균 생리식염수로 반복 세척하였다. 세척이 완료된 양막은 DMEM(Dulbecco modified eagle medium)과 글리세롤이 4:1(v/v)로 혼합된 동결보존액에 넣어 -40℃ 이하의 냉동고에서 사용 전까지 보관하였고, 냉동보관된 양막은 사용 전 실온에서 녹인 뒤 생리식염수에 침지시켜 동결보존액을 제거한 후 사용하였다.

제조예 2: 폴리비닐알코올( PVA ) 하이드로겔 제조

PVA는 130,000 Da 분자량을 갖는 것을 사용하여 정제수에 20%(w/w)의 비율로 첨가한 후 30분간 중탕한 뒤, 121℃에서 20분간 고압멸균하여 완전히 용해시키고 일회용 주사기에 소분하여, 사용하기 전까지 80℃ 이상의 히팅블럭 내에서 굳지 않도록 보관하였다.

제조예 3: 성형몰드 준비

양막링 제작을 위해 다음과 같은 크기 및/또는 형태를 갖는 상판, 하판 및 기둥을 포함하는 성형몰드를 준비하였다.

상판은 상부 직경이 46 mm이고, 높이가 24.6 mm이고, 기둥이 결합될 중앙 부위에 17.7 mm 직경의 홀을 구비하였다.

하판의 일면에는 기둥을 고정시키기 위한 직경 10.1 mm의 원형의 오목부 및 타면에는 자석이 구비된 오목부가 형성되어 있다.

기둥은 17.6 mm의 직경을 가지며, 하판 일면의 오목부과 결합하되 자석이 구비된 볼록부가 형성되어 있다.

제조예 4: 지지체 준비

지지체는 폴리에틸렌 원료를 이용하여 고압 사출성형기로 제작하였다.

지지체는 상부 내경이 18.3 mm, 하부 외경이 21.6 mm, 및 높이가 1.5 mm였다. 지지체 외측의 곡률 반경은 8 mm이고, 120° 간격으로 직경 0.6 mm의 홀을 3개 구비하였다.

실시예 1 : 양막링의 제조

상기 제조예 1 내지 4에서 준비한 원료 및 몰드를 이용하여 다음과 같은 방법으로 양막링을 제조하였다.

몰드 하판에 지지체의 상부 내경이 아래를 향하도록 위치시키고, 양막의 상피층이 위를 향하도록 지지체 위에 얹은 뒤, 기둥의 볼록부를 하판의 일면의 오목부에 결합시켜 양막을 고정하였다. 그 다음, PVA 하이드로겔을 양막과 지지체 사이에 천천히 주입하고 지지체 둘레 전체에 PVA 하이드로겔이 주입되면 핀셋을 사용해 양막을 수평으로 펼친 뒤 몰드 상판을 하판에 결합시켜 몰드에 양막을 완전히 밀착시켰다.

그 다음, 동결융해법에 의해 양막과 PVA 하이드로겔 코팅층을 물리적으로 가교처리하여 접착시켰다. 구체적으로, 가교시 양막과 PVA 하이드로겔 코팅층의 수분 증발을 방지하기 위해 알루미늄 트레이에 몰드를 올려놓고 덮개로 덮은 다음, 알루미늄 호일로 감싸고, -40℃ 이하에서 6시간 동결 후 20 내지 25℃ 상온에서 6시간 해동 과정을 총 5회 반복하여 가교처리하였다.

이후, 가교처리된 결과물(PVA 하이드로겔 코팅층에 양막이 부착된 상태)을 펀칭형의 커팅칼날(내경 21.5 mm)을 이용하여 상기 양막링의 외곽선을 절단하였다. 이때, 몰드의 하판에 부착된 양막의 일면을 위로 향하게 핀셋을 이용하여 펼쳐준 뒤 프레스기를 사용해 양막링의 외곽선을 절단하였다. 절단된 양막링은 1개당 50 ml 생리식염수를 사용하여 10분간 100 내지 120 rpm조건으로 5회 반복하여 세척하였다. 세척이 완료된 양막링은 멸균생리식염수에 넣어 15 내지 25 kGy 선량의 감마선(또는 동일선량의 전자빔)을 조사하여 멸균시켰다.

[ 평가예 ]

평가예 1: 이물감 평가

상기 실시예 1을 통해 제작한 양막링은 일반인 10명을 대상으로 안구에 양막링 적용에 따른 이물감을 3일간 평가하였다. 10명 중 5명은 오른쪽(R1, R3, R5, R7, R9), 나머지 5명은 왼쪽(L2, L4, L6, L8, L10) 안구에 양막링을 적용하였고, 반대쪽 안구에는 치료용 렌즈를 적용하여 양막링에 대한 이물감을 상대적으로 비교하였다. 10명 모두 양막링 및 치료용 렌즈 적용 후 일상적인 생활을 하도록 하였고, 2시간 마다 인공눈물을 투여하도록 하였다.

평가는 주관적인 통증 척도 방법인 visual analog scale(VAS)을 사용하였고, 이물감 정도에 따라 0점(이물감 없음), 1점(이물감은 있으나 통증은 없음), 2점(이물감 및 통증은 있으나 참을만함), 3점(이물감 및 통증으로 불편함), 4점(이물감 및 통증이 심하여 참기 힘듬)으로 이물감에 대해 설문지를 사용하여 양막링 적용 후 1일, 2일, 3일차에 각각 평가하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1의 결과를 살펴보면, 실험대상 10명 모두 최초 양막링 적용에 따른 이물감을 느꼈고, 그 중 9명은 이물감에 따른 통증이 발생하여 5명은 불편하다고 답변하였다. 2일차에 1명은 이물감이 없다고 답변하였고, 9명은 이물감이 느껴지며 그 중 4명은 통증은 없다고 하였다. 4명은 통증은 있으나 참을만 하다고 하였으며 나머지 1명은 통증으로 불편하다고 답변하였다. 양막링 적용 3일째에는 4명이 이물감이 없었으며, 나머지 6명 중 5명은 이물감만 느낄 뿐 통증은 없거나 참을만하다고 답변하였고, 나머지 1명은 이물감에 따른 통증을 보인다고 답변하여 전체적으로 시간이 지남에 따라 양막링 착용감이 좋아짐을 확인하였다.

평가예 2: 세포 독성 평가

상기 실시예 1을 통해 제작한 양막링을 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM 배지를 사용해 용출하여 세포독성실험을 수행하였다. 세포는 mouse fibroblast cells(ATCC CCL 1, L929) 세포주를 사용하였고, 배지는 양막링 1 g 당 5 ml의 DMEM(with 10% FBS)을 넣어 37±1℃에서 24±2시간 용출한 뒤 상등액만 취하여 사용하였다. 세포 사멸사에 대한 음성대조군으로 H₂O₂를 사용하였다. 계대배양을 통해 얻어진 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 300 ul에 2.5 x 10⁴(cells/ml) 농도가되도록 접종한 뒤 48-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한 후 24시간 배양하였고, 세포의 컨플루언시(confluency)가 80% 이상인 것을 확인한 뒤 각 웰의 배양액을 제거한 후, 10% FBS만 포함된 DMEM 배지를 사용한 양성대조군과 음성대조군, 시험군인 용출배지를 각각 300 ul씩 처리하여 배양하였다. 세포의 생존율은 표준 프로토콜에 따라 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 배양 24시간, 48시간째 웰에 있는 배지를 제거하고, 각 웰에 MTT 용액(0.5 mg/ml) 300 ul를 첨가하여 2시간 동안 인큐베이션 시킨 뒤, 웰 플레이트 내 배지를 제거하고 DMSO 200 ul를 각 웰에 첨가하여 포르마잔을 용해하였고, 분광광도계로 540 nm 파장에서 홉광도를 측정하여 세포생존율을 평가하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6의 결과를 살펴보면, 양성대조군과 시험군의 생존율은 24시간과 48시간에 유의성 없이(∵ p>0.05), 유사한 생존율을 보여 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있다.

평가예 3: 이식거부 반응 평가

상기 실시예 1을 통해 제작한 양막링을 무균대에서 양막과 PVA 하이드로겔 코팅층을 분리하여 Rat(㈜샘타코바이오코리아)의 피하에 각각 이식하였다. 이때, PVA 하이드로겔 코팅층은 지지체를 포함하지 않는 PVA만을 의미한다. 1주, 2주 및 4주 경과 후 조직을 채취하여 포르말린으로 고정하고, 수세 및 파라핀 포매과정을 거친 후 5 um 두께로 박절하여 Hematoxyline & Eosin(H&E)(H&E stain Kit, Thermo scientific)으로 염색하고, 광학현미경을 사용해 염증정도를 조사하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과를 살펴보면, 양막과 PVA를 이식한 후, 1주 및 2주 경과시 이식 주변부로의 염증정도가 미비하게 관찰되었고, 4주 경과시에는 염증반응이나 이물반응을 보이지 않았다. 또한 양막의 경우 이식 후 1주 경과시 양막 주변으로 세포가 많이 관찰되었고, 2주 이후에는 주변 세포가 양막 내로 침투하였으며 4주 경과시 보다 많은 세포가 양막 내로 침투한 것이 관찰되어 생체에 보다 적합하다는 것을 알 수 있다.

100, 200: 성형용 몰드
11, 21: 상판 12, 22: 기둥
13, 23: 하판 14, 15, 24, 25: 자석
121, 221: 볼록부 131, 132, 231, 232: 오목부
300, 51: 지지체
31: 상부 내경 32: 하부 외경
33: 높이 34: 홀
500: 양막링
52: 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층
53: 양막

Claims

표면에 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층을 갖는 링(ring) 형태의 지지체; 및
상기 지지체 상의 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층에 원주 가장자리가 부착된 콘택트렌즈 형상의 양막;을 포함하며,
상기 지지체가 폴리에틸렌, 아크릴, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리메틸메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어진, 양막링.
삭제
제1항에 있어서,
상기 지지체의 종단면이 두께 방향으로 볼록한 굴곡을 갖는 사다리꼴 형태인, 양막링.
제3항에 있어서,
상기 지지체가 17 내지 25 mm의 상부 내경, 19 내지 30 mm의 하부 외경 및 0.5 내지 2.5 mm의 높이를 가지며, 상기 굴곡에 있어서 2 내지 15 mm의 곡률 반경을 갖는, 양막링.
제1항에 있어서,
상기 지지체가 링 외주면을 따라 일렬로 형성된 3 내지 10개의 홀을 갖는, 양막링.
제5항에 있어서,
상기 홀의 직경이 0.1 내지 1.0 mm인, 양막링.
제1항에 있어서,
상기 양막이 인간 또는 소로부터 수득된 것인, 양막링.
제1항에 있어서,
상기 양막이 2겹 이상 중첩된 것인, 양막링.
제1항에 있어서,
상기 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층의 두께가 0.1 내지 2.0 mm인, 양막링.
제1항에 있어서,
상기 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층과 양막이 가교제 없이 직접 부착된, 양막링.
(1) 링(ring) 형태의 지지체의 표면을 폴리비닐알콜 하이드로겔로 코팅하여 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층을 갖는 링 형태의 지지체를 제조하는 단계로서, 상기 지지체가 폴리에틸렌, 아크릴, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리메틸메타크릴레이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 재질로 이루어진, 단계;
(2) 상기 지지체의 일면을 덮으면서 상기 지지체 상의 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층과 접하도록 양막을 위치시키되, 상기 양막을 위치시키기 전 또는 후에 콘택트렌즈 형상을 갖도록 양막을 성형하는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)의 결과물을 가교처리하여 상기 양막을 상기 폴리비닐알콜 하이드로겔 코팅층에 부착시키는 단계;를 포함하는, 양막링의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (1) 및 (2)가 성형용 몰드에서 수행되고,
상기 단계 (1)의 코팅이 상기 지지체를 성형용 몰드에 삽입한 후 그 주변에 폴리비닐알콜 하이드로겔을 주입함으로써 수행되는, 양막링의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 몰드가 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 스테인레스 스틸 및 티타늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재질로 이루어진, 양막링의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 몰드가 상판, 하판 및 기둥을 포함하고,
상기 하판에 상기 기둥이 자력으로 세워지는, 양막링의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (1)에서 사용되는 상기 폴리비닐알콜 하이드로겔이 폴리비닐알콜을 5 내지 40 중량%의 양으로 포함하는, 양막링의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 폴리비닐알콜이 100,000 내지 200,000 Da의 중량평균분자량을 갖는, 양막링의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (3)의 가교처리가 화학적 가교 또는 물리적 가교에 의해 수행되는, 양막링의 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 화학적 가교가 카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 글루타르 알데히드, 붕산, 붕사, 포름알데히드 및 헥사메틸렌 디이소시아네이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 용액에 상기 단계 (2)의 결과물을 침지시켜 수행되는, 양막링의 제조방법.
제17항에 있어서,
상기 물리적 가교가 동결융해, 자외선 조사, 방사선 조사 또는 탈수 열처리에 의해 수행되는, 양막링의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (3) 이후, 상기 양막링의 외곽선을 절단하는 단계를 더 포함하는, 양막링의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 단계 (3) 이후, 상기 양막링을 멸균하는 단계를 더 포함하는, 양막링의 제조방법.