CN105340415A

CN105340415A - 壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用

Info

Publication number: CN105340415A
Application number: CN201510866510.1A
Authority: CN
Inventors: 徐小龙; 张斌; 管昶; 王丽丽; 徐宏伟
Original assignee: QINGDAO BZ OLIGO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: QINGDAO BZ OLIGO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2015-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明涉及一种在植物幼苗培育上具有促生长、抗病诱导子作用的功能性寡糖，具体涉及壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。本发明壳寡糖对种子萌发具有促进作用，并且能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成。本发明通过测定与抗病相关的丙二醛的含量，证实壳寡糖是一种很好的抗病诱导因子，可以制备成寡糖生物农药加以应用。本发明还可将壳寡糖作为主要成份，配以其他成份制备成无公害农药，进一步开发壳寡糖的衍生产品。

Description

壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用

技术领域

本发明涉及一种在植物幼苗培育上具有促生长、抗病诱导子作用的功能性寡糖，具体涉及壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。

背景技术

农作物在正常生长过程中，常受各种病害的侵犯，影响农作物的产量，而且人畜食用患病作物后，可能会引起中毒。此外，一些优良品种往往因病害严重死亡而被淘汰，导致了一些名贵稀缺品种的灭绝。通过对植物预先施加诱导子在植物体内诱发防卫反应，使其处于敏感化状态，可对随后的病原物侵染产生系统抗性进而使植物自身具备抗病能力，抵御病害。利用这种内在抗性机制控制病害，将成为发展可持续农业的有效途径之一。植物诱导抗病性从广义上讲也属于生物防治的范畴，它是利用植物本身的防卫体系，借助于诱导因子激发植物整体抗性水平，提高抵抗病害的能力，是植物病害防治的一种新思维。经过大量试验表明植物诱导抗病性具有:(l)抗病的相对持久性和稳定性，而且往往具有系统性；(2)抗病的广谱性；(3)无污染等优点。正因为具备上述特点，近年来有关植物诱导抗病性的研究与应用尝试有不断增长的趋势，将会在植物防病抗病方面发挥重要作用。

在目前研究应用的诱导子中，寡糖以其天然性、无毒副作用、诱导活性高、能广谱高效地增强植物抗病性和调节植物生长发育等优势，受到广泛的关注。寡糖诱导子是一类能在DNA转录水平上调节特殊代谢基因表达的分子，可以激活植物的自我防卫系统，诱导植物产生抑制多种病原物的抗菌物质如植保素、蛋白酶抑制剂、病程相关蛋白、木质素等的合成，还可诱导植物与抗病相关的多种防御酶活性升高，从而提高植物的系统抗性。另外，寡糖诱导子还可作为抗病信号物质诱导植物的抗病防卫反应。通过对农作物喷洒寡糖及其衍生物，能控制植物开花、结实及其它生理活动，提高作物的产量和品质。据报道，寡糖类生物农药具有水溶性好、对人畜无害、不污染环境、长期或多次诱导不会使植物产生特异抗病性、使用剂量低且成本低廉等特点。寡糖农药在农作物病害防治中的安全性也是其一大特色。随着人们对绿色食品的需求量日趋增加，寡糖农药的市场将越来越大，在农作物生长发育和病害防治中具有广阔的应用空间。

目前绝大多数研究主要集中在将寡糖作为喷施剂用于植物叶片，或对完整植株的作用，或对作物产量的影响，但将寡糖应用于种子萌发和植物组织培养和器官再生的研究国内还较少，虽然国外已有一些研究，主要的研究成果如下：寡糖能促进愈伤组织的增殖和生长；在不添加生长素的条件下，增加小麦胚的不定根数量；调控番茄薄细胞层的器官再生过程；抑制胡萝卜离体培养胚胎的形成；促成胡萝卜胚性细胞向体细胞胚的发生。尽管如此，关于寡糖在植物离体培养形成愈伤组织及再分化的研究还不充分，缺乏系统性和大量数据。因此研究寡糖在种子萌发和植物离体培养中的作用，为生产和保留名贵植物品种，及植物脱毒、转基因研究提供理论基础，从而为发展我国现代农业提供可靠的技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足，提供壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用，能够促进种子萌发和植株愈伤组织及悬浮细胞的生长。

本发明壳寡糖(Chitosanoligosaccharide，COS)是从虾蟹壳中提取出的一种天然的、水溶性和稳定性较好、纯度较高的碱性寡糖，可以从市面上购买得到。

本发明所述的壳寡糖(Chitosanoligosaccharide，COS)含量在90％以上。

本发明的一个目的：壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。

所述的壳寡糖在作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用中，所述壳寡糖优选浓度为1.0-100ppm的水溶液。

本发明的另一个目的：壳寡糖作为抗病诱导子在促进种子萌发中的应用。

本发明所述的壳寡糖在促进种子萌发中的应用中，所述壳寡糖浓度优选为50.0-150.0mg/L的水溶液。

本发明的另一个目：所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的应用。

本发明所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的应用中，所述壳寡糖浓度优选为1.0-4.0mg/L的水溶液。

科学研究发现，从虾蟹壳中提取的壳寡糖是一种很好的诱导因子，能够健进植物生长和诱导提高植物的系统抗性，从而激活植物自身的防御反应，增强植物的杭病力，在农业上具有很好的开发利用价值。

本发明选取有代表性的蔬菜作物：黄瓜和番茄，分别探讨壳寡糖对黄瓜种子萌发的促进效果、对番茄子叶愈伤组织诱导效果。通过浸种、水培等处理方式，分别测试黄瓜种子萌发的相关指标，最终证明了壳寡糖对黄瓜种子萌发具有促进作用，并且能增强幼苗的素质，促进壮苗的形成。丙二醛含量是植物抗病机制的重要生理指标，与植物的抗病性密切相关。本发明通过测定与抗病相关的丙二醛的含量，确定经壳寡糖处理后，植株叶片的丙二醛量显著增加。因此，壳寡糖是一种很好的抗病诱导因子，可以制备成寡糖生物农药加以应用。相关实验数据将在实施例中详细说明。本发明从综合防治的角度，还可将壳寡糖作为主要成份，配以其他成份制备成无公害农药，进一步开发壳寡糖的衍生产品。

附图说明

图1壳寡糖对黄瓜种子活力指数的影响

具体实施方式

实施案例一：壳寡糖对黄瓜种子萌发的影响

1材料与方法

1.1材料与处理

供试黄瓜种子“晨丰106”由海南晨峰种业有限公司生产。种子精选后，置于初始温度为45℃的水中浸泡9小时，后取出。用0.3％KMnO₄溶液消毒30min、无菌水冲洗3次后均匀排列在培养皿中，进行发芽试验。

1.2发芽试验

试验以蒸馏水为对照组(CK)，实验组用不同梯度浓度(0、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm)的壳寡糖溶液处理。取直径为120mm的干燥培养皿，培养皿内以双层滤纸作为发芽床。将种子整齐排列在培养皿中，每床摆放100粒吸胀的“晨丰106”黄瓜种子，每个浓度处理重复3次，并用铅笔标上编号，放好种子，滴加溶液至保证双层滤纸湿润，溶液埋没种子1/2即可。将上述培养皿移入温度为25℃的人工培养箱中，光照强度为3000LX，每天观察出苗及发芽情况(每天定时滴加蒸馏水±2.0ml和相应浓度的壳寡糖溶液，以保持培养皿内培养液浓度不变)。按以下公式计算发芽势、相对发芽势、发芽率、相对发芽率。

发芽势(GE)＝前4d内正常发芽的种子数/供试种子数×100％

发芽率(GP)＝前4d内正常发芽的种子数/供试种子数×100％

1.2.1幼苗形态指标

在处理后的第15天，在每个浓度处理重复3次中分别随机抽取幼苗10株，测定其株高、根长。

1.2.2幼苗生长指标

在处理后的第15天，在各处理3次重复中分别随机采样10株测定植株的地上部鲜重、根鲜重和根冠比，并仔细观察幼苗的生长状况。

1.2.3分光光度法测定叶绿素的含量

在处理后的第15天，取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂、碳酸钙粉、3mL乙醇95％，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白，静置3～5min。

取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，滤液流至100mL棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部冲入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀得到叶绿体色素提取液。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm和652nm下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

1.2.4丙二醛(MDA)含量

在处理后的第15天，称取剪碎混匀的叶片0.5g，加入2ml10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆于离心机上在4000r/min离心10min，吸取上清液2ml(对照组加入2ml蒸馏水)，加入2ml0.6％TBA溶液，混合后在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心10min，取上清液分别测定其在450nm、532nm和600nm波长下的吸光值，按下列公式计算丙二醛的含量：

MDA的浓度(μmol/L)＝6.45(D₅₃₂-D₆₀₀)－0.56D₄₅₀

MDA的含量(μmol/g^-1FW)＝MDA浓度×提取液体积/叶片鲜重

1.2.5测定抗逆指标脯氨酸(Pro)的含量

分别取0.1g实验组和对照组的黄瓜叶片，加入3mL3％磺基水杨酸(SSA)和少许石英砂，充分研磨后用2mL3％SSA冲洗研钵，用离心机5000rpm离心10min，取其上清液并记录体积。

取上清液各2mL，分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂，水浴煮沸15min，冷却后再在5000rpm下离心10min(若没沉淀可略此步骤)，分别测定A520。

1.2.6测定抗逆指标抗氧化酶(POD)的含量

分别取对照组和实验组黄瓜幼苗叶片0.1g作为实验材料，加入少许石英砂和3ml提取液(50mmol/LPBS，pH6.0，内含0.1mmol/LEDTA，1％PVP)，充分研磨后完全转入离心管中，再用2ml提取液洗研钵，于5000rpm离心10min，记录上清液体积，用于测定POD酶活性。POD测定：取POD反应混合液(10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH₂O₂，用PBS溶解)2.95ml，加入酶液50ml(空白调零用PBS取代)，立即记时，摇匀，读出反应2min时的A470。

2结果与分析

2.1壳寡糖对黄瓜种子发芽势、发芽率的影响

用不同浓度壳寡糖处理对黄瓜种子，第4d测定发芽势、发芽率，其结果见表1。

表1壳寡糖对黄瓜种子发芽势和发芽率的影响

由表1中可以看出，在发芽势方面，各个浓度壳寡糖处理的发芽势都超过了对照组，说明壳寡糖对黄瓜种子的萌发有显著的促进作用。但是随着壳寡糖浓度的逐渐增大，黄瓜种子的发芽势呈下降趋势，这说明壳寡糖用于促进种子萌发时，不宜浓度过高。

在发芽率方面，不同浓度处理的黄瓜种子发芽率总体呈下降趋势，但下降幅度很小。因此说明，不同浓度的壳寡糖对黄瓜种子的发芽率影响不显著。

2.2壳寡糖对黄瓜幼苗株高、根长的影响

表2壳寡糖对黄瓜幼苗株高、根长的影响

从表2、图1可以看出，与对照组比较，黄瓜在壳寡糖处理下,平均根长、株高整体随着壳寡糖浓度的增高呈下降趋势,但均高于对照组。表2显示，壳寡糖浓度在50-150ppm范围内对根长、株高有促进作用，更加显著的说明了低浓度壳寡糖能够促进植株的生长。

2.3壳寡糖对黄瓜幼苗生长的影响

表3壳寡糖对黄瓜幼苗生长的影响

如表3所示，在不同浓度壳寡糖溶液的处理下，幼苗地上部鲜重、根鲜重以及根冠比(R/T)差异显著。

2.4壳寡糖对幼苗中叶绿素含量的影响

不同壳寡糖浓度下黄瓜幼苗叶绿素含量见表4所示

表4壳寡糖对黄瓜幼苗叶绿素含量的影响

由以上表4中可以看出：50-100ppm范围内幼苗叶片内叶绿素含量变化较小，且有略微的上升趋势，100ppm浓度之后，叶绿素含量又呈下降趋势，尤其是在150ppm和200ppm浓度，叶绿素含量下降较为显著，但以上均高于对照组。

2.5壳寡糖对黄瓜幼苗叶片丙二醛(MDA)含量的影响

表5壳寡糖对黄瓜幼苗丙二醛含量的影响

丙二醛(MDA)是植物逆境胁迫下产生的一种膜脂过氧化产物，MDA含量的高低代表膜脂过氧化的程度。在上表5中，随着壳寡糖浓度增加，其丙二醛含量出现逐渐降低的趋势。随着壳寡糖浓度的增加，丙二醛含量下降，尤其≧200ppm时，丙二醛含量显著下降。

2.6壳寡糖对黄瓜幼苗叶片脯氨酸(PRO)含量的影响

表6壳寡糖对黄瓜幼苗叶片脯氨酸(PRO)含量的影响

脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质，在逆境条件下，脯氨酸会主动积累，引起细胞渗透势下降，从而提高细胞的吸水能力或阻止水分外渗，有助于细胞和组织的持水，避免细胞过度失水。实验结果显示，壳寡糖能够使黄瓜幼苗保持一个相对高水平的脯氨酸含量水平，提供植物的抗逆性。

2.7壳寡糖对黄瓜幼苗叶片过氧化物酶(POD)含量的影响

表7壳寡糖对黄瓜幼苗叶片过氧化物酶(POD)含量的影响

植物在某种或多种胁迫作用会导致细胞膜的损伤和破坏、细胞的空间结构被打破以及损伤信号的转导等一系列生理生化变化。细胞中H₂O₂的含量显著增加，而H₂O₂的增加对细胞是有害的。POD是植物体内担负清除H₂O₂的主要酶类之一,POD能催化H₂O₂氧化其他底物后产生H₂O。POD含量的增加也是黄瓜高抗逆境能力的反应，由表7可以看出，壳寡糖能够提高黄瓜的抗逆性。

实施案例二：壳寡糖对番茄愈伤组织的影响

1材料和方法

1.1药品及试剂

COS(壳寡糖)、IAA(吲哚乙酸)、ZT(玉米素)、MS培养基、琼脂粉、蔗糖、无水乙醇、次氯酸钠。

1.2材料

KT3003番茄种子

1.3实验方案

1.3.1菌苗及愈伤组织的获得

选取新鲜的饱满大小一致的KT3003番茄种子用清水浸泡备，用70％的乙醇消毒种子30s，然后用无菌水冲洗3次。用3％的次氯酸钠消毒处理5min，最后无菌水冲洗3次，消毒处理后的种子接种于MS培养基上。

当种子萌发长出幼嫩子叶时，随机选取健康的番茄幼苗，切取番茄子叶接种于分别附加IAA1.00mg/L及0、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L的壳寡糖愈伤组织诱导MS培养基中，每个接种30个外植体，置于黑暗条件下培养，第28d和第42d分别统计愈伤组织的出愈率和不定芽的分化率。

出愈率＝(形成愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数)×100％。

再生率＝(分化不定芽的外植体数/接种外植体总数)×100％。

2结果与分析

2.1壳寡糖浓度配比对子叶愈伤组织形成的影响

接种后的子叶慢慢膨大，一周后开始在伤口处陆续长出愈伤组织。由表8可以看出，番茄子叶在不同壳寡糖配比的培养基上诱导愈伤组织的出愈率不同。在壳寡糖浓度为1.0-4.0mg/L时，外植体比1.0mg/LIAA的出愈率高；壳寡糖浓度为2.0mg/L时，子叶出愈率为94.6％，达到最高。

表8壳寡糖浓度对番茄子叶愈伤组织诱导的影响

注：+、++、+++、++++、+++++分别表示愈伤组织量少、较少、一般、较多、多。

2.2壳寡糖浓度配比对不定芽诱导的影响

从表9可以看出，与对照组相比，无论是壳寡糖还是IAA都能提高番茄子叶不定芽的诱导率。表9显示每块愈伤上的平均诱导子叶芽数量普遍比对照组多。而相比于IAA组，只有壳寡糖浓度为2.0mg/l时再生率才能跟IAA达到一样，但是不定芽数却比IAA组的少，然而壳寡糖浓度为4.0mg/l组虽然再生率不是最高的，但是不定芽数确是最多的。

表9不同壳寡糖浓度配比对不定芽诱导的影响

3结论

研究结果表明，在番茄子叶离体培养过程中，壳寡糖对愈伤组织、不定芽的形成具有促进作用。当浓度为2.0-4.0mg/L时，对愈伤组织形成和不定芽再生最有利。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.壳寡糖作为抗病诱导子在植物幼苗培育中的应用。

2.如权利要求1所述的壳寡糖在促进种子萌发中的应用。

3.如权利要求1或2所述的壳寡糖在促进种子萌发中的应用，其特征在于：所述壳寡糖是浓度为50.0-150.0mg/L的水溶液。

4.如权利要求1至3所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的的应用。

5.如权利要求4所述的壳寡糖在愈伤组织诱导中的应用，其特征在于：所述壳寡糖是浓度为1.0-4.0mg/L的水溶液。