CN109364090B - 油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，属于防治胎儿酒精综合症药物技术领域。本发明解决的技术问题为提供油橄榄叶提取物的一种新用途。即油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用。发明人研究发现，油橄榄叶提取物表现出对乙醇诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的形态学保护，其中油橄榄叶提取物对乙醇诱导斑马鱼胚胎体内促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调分别具有一定的抑制凋亡作用。本发明发现油橄榄叶提取物能降低乙醇导致的斑马鱼胚胎发育的形态变化，抑制凋亡发生，对斑马鱼胚胎具有一定的保护功能，为胎儿酒精综合症的预防和治疗提供新的方法。

Description

油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用
技术领域
本发明涉及油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，属于防治胎儿酒精综合症药物技术领域。
背景技术
胎儿酒精综合症(fetal alcohol syndrome，FAS)是由于孕妇在怀孕期间酗酒引起胎儿发育受损的一系列综合症状，其临床表现主要是：发育迟缓，颅面部畸形，中枢神经系统功能障碍等。由于酗酒的广泛存在，新生儿中受到酒精严重毒害的比例接近1/200，而中等程度受损的比例更高。现代医学对FAS的病因病理研究取得巨大突破，但治疗上仍需特效药物。
传统研究FAS的实验模型是小鼠。大量研究表明，经过乙醇处理的斑马鱼胚胎在发育过程中也表现出相似的FAS特征，包括发育迟缓，小眼，面额畸形，中枢神经系统受损，胎儿期接触乙醇导致斑马鱼产生长期的行为异常等，因此斑马鱼被认为是研究胎儿酒精综合症理想的替代模型。斑马鱼是脊椎生物，与人类有87％的基因同源性，其胚胎透明，体外发育，在体视显微镜下可直观其发育过程中的形态变化，并且发育时间短，产卵量大，可重复性和可靠性较高，便于管理。斑马鱼已经成为世界第三大模式生物，被广泛用于药物筛选，毒理研究，生物发育研究等。
油橄榄(Olea europaea L.)是世界有名的木本油料树种，原产地是地中海地区。研究揭示，油橄榄叶中含有丰富的抗氧化活性成分，其中主要成分为橄榄苦苷。油橄榄叶提取物具有降血脂，降血压，预防阿尔兹海默病和癌症，抑制病毒和细菌感染，对外源化学毒物包括双酚A、阿霉素、甲状腺素、4-羟基壬烯醛等的毒害具有保护功能。王昱在《首都师范大学学报(自然科学版)》中发表的文献《油橄榄叶提取物对酒精性肝活性物质的影响》，报道了油橄榄叶提取物对乙醇导致的小鼠肝损伤的保护功能，表明了油橄榄叶提取物能够有效减轻肝组织的病理损伤，对慢性酒精性肝损伤有显著的保护作用，可作为治疗肝损伤、肝纤维化的一种具有潜在价值的药物。但是，肝损伤与FAS的发病机理不同，临床表现也不相同，为完全不同的病症。
发明内容
基于此，本发明解决的技术问题是提供油橄榄叶提取物的一种新用途。
具体的，本发明提供油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用。
优选的，油橄榄叶提取物采用热水浸提法、索氏抽提法、超声波辅助有机溶剂提取法或微波辅助有机溶剂提取法提取得到。
作为其中一种优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为防治乙醇对胚胎发育毒害方面的药物。
作为另一优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为降低乙醇所致胚胎发育形态异常的药物。
作为另一优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为对乙醇诱导的胚胎发育过程中Bcl-2基因表达下调和Bax基因表达上调具有抑制作用的药物。
优选的，所述油橄榄叶提取物的浓度为12.5～50mg/L。
本发明还提供橄榄苦苷在制备防治胎儿酒精综合征药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明油橄榄叶提取物能降低乙醇导致的斑马鱼胚胎发育的形态变化，抑制凋亡发生，对斑马鱼胚胎具有一定的保护功能，为胎儿酒精综合症的预防和治疗提供新的方法。
附图说明
图1为斑马鱼胚胎暴露于不同浓度油橄榄叶提取物(SE)后的致死率，孵化率，心率的观测结果。
图2为暴露于不同浓度油橄榄叶提取物(SE)后的斑马鱼胚胎发育形态变化。
图3为斑马鱼胚胎暴露于不同浓度乙醇后的致死率和孵化率结果。
图4为胚胎暴露于1.5％乙醇96hpf时的畸形结果；其中，A：发育正常孵化仔鱼；B：心包水肿，尾巴打结，小眼，体短的孵化仔鱼；C:心包水肿，卵黄水肿，未孵化的胚胎。
图5为不同油橄榄叶提取物降低1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎致死率结果。
图6为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎72hpf孵化率结果。
图7为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎72hpf的畸形率结果。
图8为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎96hpf的体长结果。
图9为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎96hpf的眼睛直径结果。
图10为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎55hpf的心跳结果。
图11为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼的120hpf的吖啶橙荧光染色结果。
图12为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼的120hpf的相对荧光强度结果。
图13为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼120hpf的抗凋亡基因Bcl-2表达水平结果。
图14为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼120hpf的促凋亡基因Bax表达水平结果。
具体实施方式
本发明提供油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用。
发明人研究发现，油橄榄叶提取物表现出对乙醇诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的形态学保护，其中油橄榄叶提取物对乙醇诱导斑马鱼胚胎体内促凋亡基因的表达上调及凋亡抑制基因的表达下调分别具有一定的抑制凋亡作用。
其中，油橄榄叶提取物可以采用本领域常用的方法进行提取得到，其提取溶剂可以为水或者常用的有机溶剂，比如醇。优选的，油橄榄叶提取物采用热水浸提法、索氏抽提法、超声波辅助有机溶剂提取法或微波辅助有机溶剂提取法提取得到。经分析，油橄榄叶提取物的主要成分为橄榄苦苷。
作为其中一种优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为防治乙醇对胚胎发育毒害方面的药物。
作为另一优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为降低乙醇所致胚胎发育形态异常的药物。
作为另一优选方案，所述防治胎儿酒精综合症药物为对乙醇诱导的胚胎发育过程中Bcl-2基因表达下调和Bax基因表达上调具有抑制作用的药物。
优选的，所述油橄榄叶提取物的浓度为12.5～50mg/L。
本发明还提供橄榄苦苷在制备防治胎儿酒精综合征药物中的应用。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1油橄榄叶提取物的制备以及对斑马鱼胚胎保护作用的形态学研究
1、油橄榄叶提取物的制备
(1)样品预处理
取油橄榄鲜叶于阴凉干燥通风处自然阴干，阴干后40℃干燥至恒重，粉碎过60目筛，粉末备用。
(2)热水浸提法
称取粉末100g，加1L纯水，55℃浸提210min，浸提后5000r/min离心10min，上清液用旋转蒸发仪浓缩至100mL，冷冻干燥得制备物HWE。
(3)索氏抽提法
称取粉末100g，加3.5L 60％乙醇，80℃索氏抽提105min，5000r/min离心10min，上清液用旋转蒸发仪浓缩至100mL，冷冻干燥得制备物SE。
(4)超声波辅助有机溶剂提取法
称取粉末100g，加2L 60％乙醇，35kHZ，150W超声波提取50min，50000r/min离心10min，上清液用旋转蒸发仪浓缩至100mL，冷冻干燥得制备物UAE。
(5)微波辅助有机溶剂提取法
称取粉末100g，加2L 80％乙醇，450w微波加热70s，5000r/min离心10min，上清液用旋转蒸发仪浓缩至100mL，冷冻干燥得制备物MAE。
2、分析测定油橄榄叶制备物中的多酚含量和成分
采用福林酚法测定制备物HWE、SE、UAE和MAE的总多酚含量。
HPLC法测定制备物HWE、SE、UAE和MAE中的5种多酚类化合物(茶多酚、儿茶素、香草醛、芦丁和橄榄苦苷)的含量。测定方法如下：称取油橄榄叶提取物0.2g，加入25mL甲醇溶解定容，过滤，滤液进样分析前用0.45μm微孔滤膜过滤。称重不同重量的5种多酚类化合物，混合，用甲醇溶解并定容制备混合对照品工作液。采用Agilent 1200型高效液相色谱系统，SinoChron ODS-BP柱(250×4.6mm，5μm)，DAD检测器，检测波长230nm，流速1.0mL/min，进样量10μL，流动相：水(A)+甲醇(B)，梯度洗脱：0～5min，30％B；5～20min，30％B～52％B；20～25min，52％B～50％B。测定结果见表1。四种油橄榄叶制备物中的主要成分是橄榄苦苷。
表1油橄榄叶提取物多酚组成和含量
HWM SE UAE MAE
总多酚含量(％) 2.09±0.37<sup>a</sup> 3.59±0.58<sup>b</sup> 3.11±0.22<sup>b</sup> 2.89±0.64<sup>b</sup>
茶多酚含量(mg/L) 7.4±1.6<sup>a</sup> 22.7±1.1<sup>b</sup> 1.5±0.6<sup>c</sup> 7.7±2.0<sup>a</sup>
儿茶素含量(mg/L) 7.1±1.2<sup>c</sup> 6.0±0.4<sup>c</sup> 6.5±0.4<sup>c</sup> 4.9±0.6<sup>c</sup>
香草醛含量(mg/L) 20.0±0.8<sup>b</sup> 4.9±1.1<sup>c</sup> 18.2±2.1<sup>b</sup> 25.3±2.9<sup>b</sup>
芦丁含量(mg/L) 12.8±2.3<sup>b</sup> 3.3±0.3<sup>c</sup> 5.4±0.9<sup>c</sup> 6.3±1.0<sup>c</sup>
橄榄苦苷含量(mg/L) 36.4±3.7<sup>d</sup> 47.2±2.0<sup>e</sup> 876.3±26.0<sup>f</sup> 302.5±19.7<sup>g</sup>
注：one-way ANOVA分析各组间差异，用a、b、c、d、e、f、g表示差异性，相同字母表示组间无差异，不同字母表示组间有差异。
3、饲养斑马鱼及收集鱼卵
斑马鱼养殖系统采用上海海圣生物设备有限公司。平时野生型斑马鱼成鱼雌雄混养，在进行实验前1-2周，将雌雄鱼分开。养殖条件为：28.5±1℃，pH6.8-7.2，电导率500-550μs，曝气灭菌循环水，光暗比14:10h，每天喂人工小薄片和新鲜丰年虾两次。实验前一天，选雌雄比1:2用隔板隔开放在交配盒黑暗过夜，第二天清晨抽走隔板，光照诱导受精。收集鱼卵，用胚胎培养液(5mM NaCl,0.17mM KCl,0.4mM CaCl2and 0.16mM MgSO4in H2O,pH6.7)洗净，2～4hpf(受精后小时)时体视显微镜(SZX10,Olympus,Japan)下挑选发育正常受精卵备用。
4、测定各形态学毒性指标
将油橄榄叶制备物SE先用微量DMSO溶解(DMSO终浓度不超过0.5％)，再用超纯水定容制成10g/L母液。分别取一定体积母液，用胚胎培养液稀释定容制成0，10mg/L，100mg/L，500mg/L，1000mg/L的SE处理液。每组挑选4hpf正常受精卵20枚置于6孔板，分别暴露于10mL的SE处理液，28±0.5℃恒温培养至96hpf。每24小时更换新鲜处理液。体视显微镜下观察记录胚胎死亡、孵化、心跳和形态变化。其结果见图1和图2。
图1为斑马鱼胚胎暴露于不同浓度油橄榄叶提取物(SE)后的致死率，孵化率，心率的观测结果；one-way ANOVA分析，与对照组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01；其中，对照V的SE浓度为0。
图2为暴露于不同浓度油橄榄叶提取物(SE)后的斑马鱼胚胎发育形态变化；其中，对照V(含0.1％DMSO)和100mg/L SE处理的胚胎发育正常，500mg/L SE处理的胚胎发育受到抑制。
从图1和图2中可以看出，斑马鱼胚胎暴露在100mg/L及以下浓度的油橄榄叶提取物SE溶液中，胚胎的死亡率，孵化率和心率与对照相比，没有差异；超过500mg/L浓度出现死亡率上升，孵化率下降，心率下降，并表现出浓度依赖性。100mg/L及以下浓度油橄榄叶提取物SE对斑马鱼胚胎发育无毒害。
5、乙醇对斑马鱼胚胎的发育毒害
用胚胎培养液配制浓度为0，1％，1.5％和2％的乙醇处理液。每组挑选2hpf正常受精卵20枚置于6孔板，分别暴露于10mL的乙醇处理液，28±0.5℃恒温培养至96hpf。每24小时更换新鲜处理液。体视显微镜下观察记录胚胎死亡、孵化和形态变化。其结果见图3和图4。
图3为斑马鱼胚胎暴露于不同浓度乙醇后的致死率和孵化率结果；one-way ANOVA分析，与对照组ck比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图3可以看出，在1％，1.5％和2％乙醇暴露斑马鱼胚胎96hpf内，随浓度增大斑马鱼胚胎的死亡率逐渐提高，孵化率逐渐降低，并表现出浓度依赖性，且2％组与对照相比表现出显著差异。
图4为胚胎暴露于1.5％乙醇96hpf时的畸形结果；其中，A：发育正常孵化仔鱼；B：心包水肿，尾巴打结，小眼，体短的孵化仔鱼；C:心包水肿，卵黄水肿，未孵化的胚胎。从图4可以看出，1.5％乙醇暴露导致斑马鱼胚胎发育至96hpf时出现心包水肿，卵黄水肿，尾巴打结，体短，小眼，不孵化。
6、油橄榄叶提取物保护作用的形态学指标测定
设置14个实验组分别为：V组(含有0.1％DMSO的对照组)，E组(1.5％乙醇)，和12组油橄榄叶提取物组，包括E+HWM12.5组(同时加有1.5％乙醇和12.5mg/L HWM)，E+HWM25组(同时加有1.5％乙醇和25mg/L HWM)，E+HWM 50组(同时加有1.5％乙醇和50mg/L HWM)，E+SE12.5组(同时加有1.5％乙醇和12.5mg/L SE)，E+SE25组(同时加有1.5％乙醇和25mg/LSE)，E+SE50组(同时加有1.5％乙醇和50mg/L SE)，E+UAE12.5组(同时加有1.5％乙醇和12.5mg/L UAE)，E+UAE25组(同时加有1.5％乙醇和25mg/L UAE)，E+UAE50组(同时加有1.5％乙醇和50mg/L UAE)，E+MAE12.5组(同时加有1.5％乙醇和12.5mg/L MAE)，E+MAE25组(同时加有1.5％乙醇和25mg/LMAE)，E+MAE50组(同时加有1.5％乙醇和50mg/L MAE)。每组选正常受精卵20枚置于六孔板，每组均加液10mL。4hpf时12组油橄榄叶提取物组加入相应浓度提取物预处理2h，至6hpf时E组和油橄榄叶提取物组分别加入乙醇。暴露至24hpf，14组均换成新鲜胚胎培养液，培养至120hpf。每24h换新鲜液体，体视显微镜下观察并记录死亡、畸形、孵化等情形，55hpf测定20s心跳，96hpf测定孵化仔鱼体长和眼睛直径。120hpf分析检测细胞凋亡。其结果见图5～图10。
图5为不同油橄榄叶提取物降低1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎致死率结果，12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物。从图5可以看出，与E组相比较，E+油橄榄叶提取物组能显著降低乙醇导致的斑马鱼胚胎死亡，提高存活率。
图6为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎72hpf孵化率结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组(E组)比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图6可以看出，与E组相比较，E+HWM12.5，E+HWM25，E+SE50，E+MAE12.5和E+MAE25组能显著改善乙醇导致的斑马鱼胚胎孵化率下降。
图7为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎72hpf的畸形率结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图7可以看出，与E组相比较，E+HWM12.5，E+HWM25，E+HWM50，E+SE50，E+UAE12.5和E+MAE12.5组能显著降低乙醇导致的斑马鱼胚胎发育的畸形率。
图8为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎96hpf的体长结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图8可以看出，与E组相比较，E+油橄榄叶提取物组能显著改善乙醇抑制的斑马鱼胚胎孵化仔鱼生长，提高体长。
图9为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎96hpf的眼睛直径结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图9可以看出，与E组相比较，E+油橄榄叶提取物组能显著改善乙醇导致的斑马鱼胚胎孵化仔鱼小眼，提高眼睛直径大小
图10为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎55hpf的心跳结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图10可以看出，与E组相比较，E+油橄榄叶提取物组能显著改善乙醇导致的斑马鱼胚胎心跳下降，提高心跳率。
实施例2吖啶橙(AO)荧光染色分析检测斑马鱼细胞凋亡
将120hpf孵化仔鱼用7mg/L吖啶橙28.5℃黑暗染色0.5h，然后用胚胎培养液洗3次，每次5min，加入0.08％乙二醇苯醚麻醉2min，置于荧光体视显微镜下观察，拍照，并用ImageJ软件分析测定仔鱼的荧光强度。其结果见图11和图12。
图11为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼的120hpf的吖啶橙(AO)荧光染色结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物。
图12为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼的120hpf的相对荧光强度结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。
从图11和图12可以看出，对照V组仔鱼也有荧光，表明细胞凋亡是一种正常的生理代谢。而E组的荧光强度高于对照V组，表明乙醇加剧斑马鱼细胞凋亡。与E组相比较，E+油橄榄叶提取物组能显著降低乙醇导致的斑马鱼孵化仔鱼荧光强度增加，抑制凋亡加剧，使凋亡恢复到正常状态。
实施例3凋亡相关基因表达的变化研究
1、引物设计
在Genbank上查询内参β-Actin及凋亡相关基因Bax和Bcl-2的序列，利用primer5.0软件设计引物(见表2的序列)，由大连宝生物工程有限公司合成。
表2
基因 引物 序列编号 序列(5’to 3’)
β-actin 上游引物 1 TCTGGTGATGGTTGACCCA
下游引物 2 GGTGAAGCTGTAGCCACGCT
Bcl-2 上游引物 3 TCACTCAGTTCAGACCCTCAT
下游引物 4 ACGCTTTCCACGCACAT
Bax 上游引物 5 GGCTATTTCAACCAGGGTTCC
下游引物 6 TGCGAATCACCAATGCTGT
2、提取总RNA和合成cDNA
14个实验组：V组，E组，E+HWM12.5组，E+HWM 25组，E+HWM 50组，E+SE12.5组，E+SE25组，E+SE 50组，E+UAE 12.5组，E+UAE 25组，E+UAE 50组，E+MAE 12.5组，E+MAE 25组和E+MAE 50组，每组取20个120hpf仔鱼用PBS冲洗两遍，收集至玻璃匀浆器，加入350mL TRK裂解液匀浆，按照试剂盒E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit1说明书提取。然后用biophotometer蛋白核酸测定仪以及1％琼脂糖凝胶电泳检测浓度及纯度。再使用MMLV反转录酶将其反转录为cDNA；合成的cDNA用PCR方法检测基因的表达，从而确定其质量。
3、实时定量PCR检测
以所得逆转录产物为模板，在25μL反应体系中进行实时定量PCR扩增：2.5mmol/LdNTP 2.5μL、10×PCR buffer 2.5μL、25mmoL/L MgCl2 1.5μL、Taq 1U、SybergreenⅠ0.25×、上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL、cDNA 1.0μL，加水至总体积为25.0μL。每个样品设3个重复，设ddH2O作为模板的空白对照。实时定量PCR反应条件：95℃5min；循环参数：95℃10s，54℃30s，72℃20s，共35个循环；最后延伸72℃5min。数据分析采用2-△△CT方法分析基因表达相对变化，其结果见图13和图14。
图13为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼120hpf的抗凋亡基因Bcl-2表达水平结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图13可以看出，E组斑马鱼胚胎Bcl-2的表达与V对照组比较显著降低，而在油橄榄叶提取物的保护作用下，E+油橄榄叶提取物组的表达水平与E组相比又显著回升，说明油橄榄叶提取物对乙醇诱导的斑马鱼胚胎发育过程中Bcl-2表达下调有明显抑制作用。
图14为不同油橄榄叶提取物改善1.5％乙醇处理斑马鱼胚胎/仔鱼120hpf的促凋亡基因Bax表达水平结果；12.5，25和50分别代表油橄榄叶提取物浓度，单位为mg/L；HWM：热水浸提法制备的油橄榄叶提取物；SE：索氏抽提法制备的油橄榄叶提取物；UAE：超声辅助制备的油橄榄叶提取物；MAE：微波辅助制备的油橄榄叶提取物；one-way ANOVA分析，与乙醇组比较显著性差异用星号表示，*p<0.05；**p<0.01。从图14可以看出，E组斑马鱼胚胎Bax的表达与V对照组比较显著升高，而在油橄榄叶提取物的保护作用下，E+油橄榄叶提取物组的实验结果与E组相比又显著下降，说明油橄榄叶提取物对乙醇诱导的斑马鱼胚胎发育过程中Bax表达上调有明显抑制作用。
Figure IDA0001894719170000011
Figure IDA0001894719170000021

Claims (4)

1.油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，所述油橄榄叶提取物采用热水浸提法、索氏抽提法、超声波辅助有机溶剂提取法或微波辅助有机溶剂提取法提取得到；所述油橄榄叶提取物的浓度为12.5～50mg/L。
2.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，其特征在于：所述防治胎儿酒精综合症药物为防治乙醇对胚胎发育毒害方面的药物。
3.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，其特征在于：所述防治胎儿酒精综合症药物为降低乙醇所致胚胎发育形态异常的药物。
4.根据权利要求1所述的油橄榄叶提取物在制备防治胎儿酒精综合症药物中的应用，其特征在于：所述防治胎儿酒精综合症药物为对乙醇诱导的胚胎发育过程中Bcl-2基因表达下调和Bax基因表达上调具有抑制作用的药物。
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