CN101983627A

CN101983627A - 没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病干预中的应用

Info

Publication number: CN101983627A
Application number: CN 201010225162
Authority: CN
Inventors: 彭英; 龙玲; 李艺; 何蕾
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2010-07-13
Filing date: 2010-07-13
Publication date: 2011-03-09

Abstract

本发明公开了没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病干预中的应用。在动物实验研究表明，EGCG能够透过胎盘屏障，母体口服使用EGCG400mg/kg·d，即可有效地预防胎儿酒精相关性疾病，特别是能够防止酒精引起的神经损伤。EGCG毒性低，对胎儿的正常发育影响小。

Description

没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病干预中的应用

技术领域

本发明涉及没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病干预中的应用。

背景技术

胎儿酒精相关性疾病（fetal alcohol spectrum disorders，FASD）是指孕妇在孕期摄入酒精对胎儿造成的发育障碍，其表现主要以中枢神经系统发育障碍和颌面畸形为主。虽然酒精对胎儿的不良作用是广为人知的，孕妇酗酒的概率仍呈上升的趋势，由此可见酒精的胚胎毒性是一个危害社会健康的重要因素，研究预防和治疗FASD的方法已迫在眉睫。

现有的研究中，各种用于预防胎儿酒精相关性疾病的药物，多数不可食用，需要通过注射的方式给药，而少数可食用的药物，如维生素E、维生素C等，一般与食品混合，吸收效果较差，使用量大，同样不够方便。

同时，由于胎儿发育不完善，不能耐受较大的毒性。由于胎盘屏障的存在，能够进入胎儿体内的制剂并能预防胎儿酒精相关性疾病的制剂少之又少。

目前缺乏少次口服就可预防酒精引起的胚胎发育迟缓的制剂。

没食子酸表没食子酸儿茶素（(–)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%～13%，因为具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，在抗癌和心血管疾病方面担当了重要的角色。此外，它也用作肿瘤多药耐药性的逆转剂，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病预防中的应用。

在酗酒的动物母亲及其新生胎儿中有活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的聚集，因为胚胎体内的内源性抗氧化剂含量远低于成年生物的含量，胚胎比母体更容易受到酒精的损伤，因此酗酒的母体没有任何不正常表现时胎儿即可能已经出现了FASD。

在动物实验研究中发现，EGCG能够透过胎盘屏障，母体口服使用EGCG 400mg/kg·d，即可有效地预防胎儿酒精相关性疾病，特别是能够防止酒精引起的中枢神经系统发育障碍和脑损伤。EGCG毒性低，对胎儿的正常发育影响小。

附图说明

图1，不同剂量酒精对胚胎大小的影响图；

图2，各剂量酒精组Otx1、Sox2的表达水平图；

图3，EGCG对酒精引起的胚胎发育迟缓的抑制作用图；

图4，EGCG抑制酒精所致Otx1、Sox2表达水平的下调；

图5，不同处理组的ROS指标图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

1.酒精对胚胎发育的影响：

1) 对孕8天（G8）的C57BL/6J小鼠腹腔注射0、0.005、0.01、0.015、0.02ml/g的25%的乙醇，每组3只孕鼠，在G10.25取出胚胎在解剖显微镜下解剖并观察其形态，测量头长（HL）、头宽（HW）和头臀长（CRL）；另外，同样对孕8天（G8）的C57BL/6J小鼠腹腔注射0、0.005、0.01、0.015、0.02ml/g的25%的乙醇，每组3只孕鼠，在G9.25时取出胚胎并取脑组织用于RT-PCR和Western blot检测；

2) 取1μg总RNA逆转录成为cDNA，反应为37℃ 15min，85℃ 5秒。cDNA用Premix Taq进行聚合酶链式反应PCR。Otx1的引物为：正义：5’GCAGAGCGGGAATGGAAC3’（SEQ ID NO：1），反义：5’AGATGGACGAAGCAGTAGGC3’ （SEQ ID NO：2）（PCR产物239bp）；Sox2的引物为：正义：5’AACCAGCGCATGGACAGC3’（SEQ ID NO：3），反义：5’CGGACTTGACCACAGAGCC3’（SEQ ID NO：4）（PCR产物281bp）；内参β-actin引物为：正义：5’ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3’（SEQ ID NO：5），反义：5’AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3’（SEQ ID NO：6）（PCR产物517bp）。PCR反应程序：94℃ 3min，28个循环（94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec），72℃ 7min。PCR产物上样到含有SYBR Safe DNA染料（0.1μg/ml）的1.0 %琼脂糖上，在TBE中以100v的电压跑40min，用凝胶成像仪观察结果；

3) 取15μg总蛋白100℃变性5min，加入等体积2×SDS蛋白电泳上样缓冲液，混匀上样，并加蛋白质分子量预染Marker一起电泳(200V，至溴酚蓝到达分离胶底部或进入电泳槽)；电转膜，70V，1h，可见预染Marker亦转至PVDF膜上；TBST洗膜，5min×3次；封闭液室温封闭，2h(封闭完不洗膜)；加一抗(1:1000)孵育，4℃振荡过夜；TBST洗膜，5min×6 次；加HRP标记的二抗(1:1000)，室温孵育1h；TBST洗膜，5min×6次；暗室曝光：现配发光液，将ECL试剂盒的A液和B液按1:1混合的，滴加至膜上，在暗室进行曝光。

实验数据采用Mean ± SEM表示。结果用Statistical Package for the Social Sciences（SPSS）12.0分析，数据的多重比较用one-way ANOVA，变量的相关性用Pearson分析，P <0.05表示具有显著差异。

2. EGCG对FASD的预防作用：

在预防实验中，孕鼠在G8的10:30时腹腔注射25%乙醇0.02ml/g，并在G7和G8的10:00和14:00用EGCG灌胃，剂量分别为0、100、150和200mg/kg（相当于0、200、300和400mg/kg·d），在G10.25取出胚胎在解剖显微镜下解剖并观察其形态，测量头长（HL）、头宽（HW）和头臀长（CRL）。另外，在G9.25时取出胚胎并取脑组织，按上述方法进行RT-PCR和Western blot检测。

3. 氧化应激在FASD中的作用及EGCG的作用机制：

动物分为4组，每组3只孕鼠：(1) LR（G8时0.02ml/g）+ NS（G7、8时0.02ml/g·d）；(2) EtOH （G8时0.02ml/g）+ NS (G7、8时0.02ml/g·d)；(3) EtOH（G8时0.02ml/g）+ EGCG（G7、8时400mg/kg·d）；(4) LR（G8时0.02ml/g）+ EGCG（G7、8时400mg/kg·d）。在G9.25时取胚胎脑组织用试剂盒检测H₂O₂和MDA。

结果：

1. 乙醇引起明显的胚胎发育迟滞

图1所示，在G8对孕鼠腹腔注射25%乙醇0.005、0.01、0.015和0.02ml/g，正常对照组注射LR 0.02ml/g，在G10.25时观察胚胎的形态。*P<0.05，与正常对照组相比较有明显差异。分别从5个组的3只孕鼠得到23、23、22、20和19个胚胎。ANOVA分析各酒精组的HL、HW和CRL均较正常对照组明显减小。Pearson分析得到HL、HW和CRL与酒精剂量成负相关，P<0.01。正常组的HL、HW和CRL为2.4 ± 0.04 mm、1.54 ± 0.02 mm和5.00 ± 0.06 mm，而EtOH 0.02ml/g组的HL、HW和CRL为1.86 ± 0.05 mm、1.16 ± 0.02 mm和4.12 ± 0.08 mm。图中的照片是各组胚胎的典型图片，从图中也可直观地看出各组的形态大小变化。

图2所示为正常对照组和各剂量酒精组的RT-PCR和Western blot结果及灰度分析结果。由图可见，当酒精剂量达0.015ml/g时可出现Otx1和Sox2的表达水平明显下调。Otx1和Sox2是神经系统发育的重要标志，在G8到G9.5期间它们的表达水平是逐渐增加的，用酒精处理后其出现下调，从另一方面说明了酒精引起了胚胎发育迟缓。

2. EGCG抑制乙醇所致胚胎发育迟滞

图3中的柱状图显示了各处理组的HL、HW和CRL。*P<0.05与正常对照组比较。从酒精对照组、EGCG预防组、药物对照组和正常对照组分别得到19、18、21、18、18和23个胚胎。可见注射酒精引起的胚胎发育迟缓可不同程度地由EGCG缓解，当EGCG用量达到400mg/kg·d时，胚胎的形态指标和正常对照组已无明显差异。单用EGCG 400mg/kg·d的胚胎大小和正常对照组比亦无统计学差异。用Pearson法分析使用了酒精的4个组的EGCG剂量和胚胎大小，结果HL、HW和CRL均和EGCG的剂量呈正相关。图中的照片是各组胚胎的典型图片。

图4为各处理组的RT-PCR和Western blot结果，用EGCG不同剂量时可对抗酒精引起的Otx1和Sox2下调，当EGCG剂量为400mg/kg·d时，Otx1和Sox2的表达水平已非常接近正常对照组。

3. EGCG抑制酒精引起的ROS聚集

在G8时给孕鼠腹腔注射25%EtOH 0.02ml/g，G9.25时取胚胎的脑组织检测H₂O₂和MDA浓度。酒精组的H₂O₂和MDA水平较正常对照组明显升高（P<0.05），而在G7、8时给予400mg/kg·d的EGCG的胚胎，这2项指标则没有明显的变化。单给EGCG而没有给酒精的胚胎也没有出现氧化应激指标的异常。（图5）可见，EGCG对胚胎的正常发育也无明显副作用。

EGCG作为预防性用药，通过少次口服即可成功地抑制酒精引起的胚胎发育迟缓。

Claims

1.没食子酸表没食子酸儿茶素在胎儿酒精相关性疾病干预中的应用。