CN111685107A - 表没食子儿茶素没食子酸酯的应用、灌注液及其应用 - Google Patents

表没食子儿茶素没食子酸酯的应用、灌注液及其应用 Download PDF

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李书轩
李明谦
孙晓东
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    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯的应用、灌注液及其应用，具体提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用，其中，表没食子儿茶素没食子酸酯可添加到常温携氧机械灌注法的灌注液中，不仅可以对体外肝脏进行常温保存，而且还能改善体外常温保存的肝脏的脂肪变程度以及降低体外常温保存的肝脏的损伤程度。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯的应用、灌注液及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯的应用、灌注液及其应用。
背景技术
现阶段大鼠常温携氧机械灌注已经得到广泛的关注，研究结果表明使用大鼠常温携氧机械灌注相比传统的低温冷保存可以有效的延长肝脏保存的时间，提高肝脏的质量，但是针对大鼠脂肪肝大泡性脂肪变程度大于30%的大鼠肝脏，常温携氧机械灌注改善其脂肪变程度能力有限，临床上这一类肝脏被定义为边缘型供肝，弃用率极高，虽然有研究表明常温携氧机械灌注可以有效的改善猪脂肪肝脂肪变程度，提高猪脂肪肝肝脏移植后存活率，但是并没有高效的专门可用于改善脂肪肝供肝的专用灌注液。
其中，现阶段人类与猪等大型动物的常温携氧机械灌注灌注液的主要成分为添加葡萄糖，离子，氨基酸等成分的稀释自体血或红细胞，用于大鼠常温携氧机械灌注的灌注液主要为添加氨基酸，离子，肝素，激素等成分的William’s E medium。部分实验室也采用稀释的自体血。这几种灌注液有一个共同的特点就是可以在常温携氧机械灌注模拟正常生理的条件下为肝脏细胞提供必要的营养成分，供肝脏细胞正常代谢，大泡性脂肪变程度大于30%的肝脏，肝细胞功能下降，即使提供正常的营养代谢物质及生理环境仍然较难改善脂肪肝脂肪变程度。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述表没食子儿茶素没食子酸酯用于改善肝脏的脂肪变程度。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述表没食子儿茶素没食子酸酯用于降低体外常温保存的肝脏的损伤程度。
本发明实施例的另一目的在于提供一种灌注液，用于体外常温保存肝脏，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为5mmol/L~20mmol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为8mmol/L~12mmol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为10mmol/L。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的灌注液在体外常温保存肝脏中的应用。
作为本发明实施例的另一个优选方案，体外常温保存肝脏的方法为：基于常温携氧机械灌注法，并利用所述灌注液对体外肝脏进行灌注保存。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述灌注液用于降低体外常温保存的肝脏的损伤程度和/或改善肝脏的脂肪变程度。
其中，表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶多酚儿茶素中的主要活性成分。EGCG具有独特的化学结构：其B环的C3'，C4'和C5'位置有一个三羟基基团，同时在其C环的C3位置具有通过酯键连接的没食子酸基团，这样的结构使EGCG具有清除自由基并螯合过渡金属离子的生活学活性。另外，EGCG可以有效的降低肝组织中丙二醛（MDA）的含量，提高细胞抗氧化的超氧化物歧化酶（SOD）的含量，大鼠血液中甘油三脂，肝脏内脂肪含量及肝脏重量均得到了有效的改善，同时EGCG还可以有效抑制肝脏中炎症因子如IL-1β，IL-6，TNF-α，MCP-1的分泌表达。
本发明实施例提供的一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用，其基于表没食子儿茶素没食子酸酯的独特化学结构及其生理活性，将其加入到灌注液中，可专门用于改善脂肪肝供肝的脂肪变程度，同时起到减少脂肪肝供肝在灌注过程中受到的损伤。
附图说明
图1为灌注结束后不同组的灌注液中门冬氨酸氨基转移酶含量的折线对比图。
图2为灌注结束后不同组的灌注液中丙氨酸氨基转移酶含量的折线对比图。
图3为灌注结束后不同组的灌注液中乳酸脱氢酶含量的折线对比图。
图4为灌注结束后不同组的灌注液中甘油三脂含量的折线对比图。
图5为灌注结束后不同组的肝组织的油红染色对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为5mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例2
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为20mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例3
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为8mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例4
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为12mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例5
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为9mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例6
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为11mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例7
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为15mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例8
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为18mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实施例9
该实施例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为10mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
对比例1
该对比例提供了一种可用于常温携氧机械灌注保存体外肝脏的灌注液，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质以及表没食子儿茶素没食子酸酯。其中，营养基质可以与现有常见的灌注液相同，譬如可包括葡萄糖、氨基酸或激素等，但不限于此。另外，灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度可控制为30mmol/L。将该灌注液用于体外常温保存肝脏，可以改善肝脏的脂肪变程度以及减少肝细胞在保存过程中受到的损伤。
实验例：
将大泡性脂肪变大于30%的大鼠脂肪肝供肝分为三组，分别为灌注液中添加了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的EGCG灌注组，灌注液中无EGCG的灌注液对照组和低温冷保存组，前两组进行常温携氧机械灌注，灌注时间为3小时，灌注结束后取灌注液监测AST（门冬氨酸氨基转移酶）、ALT（丙氨酸氨基转移酶）、LDH（乳酸脱氢酶）、TG（甘油三酯）的含量，肝脏组织进行组织形态观察，组织脂肪化检测分别为HE染色及油红染色，低温冷保存组用常规的UW液体进行低温冷保存，保存3小时后取肝脏进行HE染色观察，并进行以下比较实验：
1、通过对比灌注液对照组与低温冷保存组判断常温携氧机械灌注系统构建是否成功。
2、通过对比灌注液中AST、ALT、LDH等反应肝细胞损伤的指标对比EGCG是否可以在灌注过程中减少脂肪肝肝脏的损伤。
3、通过监测灌注液中TG的含量，及对肝脏组织进行油红染色判断肝脏脂肪变类型及程度，判断EGCG是否可以有效的改善脂肪肝的脂肪变程度。
4、通过添加不同剂量的EGCG计算作为灌注液的主要添加成分，EGCG改善脂肪肝供肝的最佳剂量是多少。剂量分别为：5mM，10mM，20mM，30mM。
上述实验的结果如附图1~5所示。
其中，图1为灌注结束后，不同采样时间点不同组的灌注液中门冬氨酸氨基转移酶含量的折线对比图；图2为灌注结束后，不同采样时间点不同组的灌注液中丙氨酸氨基转移酶含量的折线对比图；图3为灌注结束后，不同采样时间点不同组的灌注液中乳酸脱氢酶含量的折线对比图。从图1~3可以看出，在灌注液中添加适量的EGCG后，可明显地减少了大鼠肝细胞在灌注过程中的损伤程度。
另外，图4为灌注结束后，不同采样时间点不同组的灌注液中甘油三脂含量的折线对比图；图5为灌注结束后，不同组的肝组织的油红染色对比图，图5中的a、b、c、d、e分别代表无EGCG的对照组，EGCG浓度为5mM的EGCG灌注组，EGCG浓度为10mM的EGCG灌注组，EGCG浓度为20mM的EGCG灌注组，EGCG浓度为30mM的EGCG灌注组。从图4和图5可以看出，往灌注液中添加适量的EGCG后，可明显地减少了大鼠肝细胞的脂肪变程度。
因此，EGCG可以作为灌注液中的添加成分起到缓解脂肪肝脏脂肪变程度的作用，其中，相比于其他组，当EGCG剂量为10mM时，对肝脏细胞的保护效果最佳。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯用于改善肝脏的脂肪变程度。
3.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯在体外常温保存肝脏中的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯用于降低体外常温保存的肝脏的损伤程度。
4.一种灌注液，用于体外常温保存肝脏，其包括用于给肝脏细胞提供营养成分的营养基质，其特征在于，所述灌注液还包括表没食子儿茶素没食子酸酯。
5.根据权利要求4所述的一种灌注液，其特征在于，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为5mmol/L~20mmol/L。
6.根据权利要求4所述的一种灌注液，其特征在于，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为8mmol/L~12mmol/L。
7.根据权利要求4~6中任一项所述的一种灌注液，其特征在于，所述灌注液中表没食子儿茶素没食子酸酯的摩尔浓度为10mmol/L。
8.一种如权利要求4~7中任一项所述的灌注液在体外常温保存肝脏中的应用。
9.根据权利要求8所述的一种灌注液在体外常温保存肝脏中的应用，其特征在于，体外常温保存肝脏的方法为：基于常温携氧机械灌注法，并利用所述灌注液对体外肝脏进行灌注保存。
10.根据权利要求8所述的一种灌注液在体外常温保存肝脏中的应用，其特征在于，所述灌注液用于降低体外常温保存的肝脏的损伤程度和/或改善肝脏的脂肪变程度。
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