KR101169701B1

KR101169701B1 - 자하거 추출물을 함유하는 세포보존제

Info

Publication number: KR101169701B1
Application number: KR1020100018122A
Authority: KR
Inventors: 이순례; 박현숙; 김경혜; 강태훈
Original assignee: (주) 아크스템
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2012-07-30
Also published as: KR20110098478A; CN102791278A; WO2011105658A1

Abstract

본 발명은 자하거 추출물을 함유하는 세포보존제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 아미노산, 무기질, 비타민, 성장인자 및 자하거(Placenta) 추출물을 함유하는 동물세포 보관 및 보호용 세포 보존제에 관한 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 세포 보존제는 세포를 안전하게 보관하는데 사용될 수 있고 줄기세포 뿐만 아니라 다양한 동물세포를 보관할 수 있다. 세포치료제로 사용하기 위한 세포의 저온 보관 이동 시에 세포 보존제로 사용될 수 있다. 또한 동물세포 배양 전 본 발명의 세포 보존제로 반응시키면 세포성장률 및 줄기세포능 향상 효과도 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 보존제는 세포 보존 및 줄기세포능 향상을 위한 보존제로서 매우 유용하다.

Description

자하거 추출물을 함유하는 세포보존제 {Cell protectants comprising placenta extracts}

본 발명은 자하거 추출물을 함유하는 세포보존제에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 아미노산, 무기질, 비타민, 성장인자 및 자하거(Placenta) 추출물을 함유하는 동물세포 보관 및 보호용 세포 보존제에 관한 것이다.

통상, 세포를 보존하는 방법으로는 -196℃의 극저온에서 동결보존하는 방법이 이용되며, 필요할 때 이 동결세포들을 급속 해동하여 생세포를 얻을 수 있다. 그러나, 이와 같은 동결?융해후의 생존율은 세포의 종류나 실험자의 숙련도에 따라 다르지만, 암 이외의 정상유용세포(normal and useful cells)의 생존율은 매우 낮다. 그리고 장기간 보존이 아닌 몇 시간 내지 수일간 세포의 이동 및 보관이 필요한 경우 이러한 동결보존 방법을 이용하기는 현실적으로 어렵다.

근래 동물 조직으로부터 분리된 세포 또는 줄기세포를 이용하여 다양한 질병의 치료에 적용하는 세포치료제 기술이 개발되고 있으며, 이에 따라 조직에서 채취된 세포 및 줄기세포의 생존능력(viability)을 시술 전까지 장시간 동안 유지할 수 있고, 보다 우수한 보존효과를 기대할 수 있는 보존제의 개발이 강하게 요구되고 있다. 현재 동물세포의 배양에 사용되는 배지들을 임시로 보존제로 사용하고 있지만, 세포의 보존 목적을 위해 특성화된 유용한 보존제에 대한 연구는 미비하다.

한편, 인간줄기세포를 배양하기 위해 동물혈청(우태아혈청)을 함유하는 배지를 이용하게 되는데 이 경우, 우태아혈청으로 배양한 세포를 동물혈청이 없는 용액으로 세척하더라도 상당량의 우태아혈청이 세포내 잔류하여 강력한 이종항원으로 작용하며 광우병 등 소의 질환의 인체 감염가능성 등으로 인해 우태아혈청으로 배양한 세포의 인체이식이 미국에서는 금지되어 있는 상황이다. 인간 골수로부터 중간엽 줄기세포의 분리를 위한 기법과 지방조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 기법은 각각 Pittenger 등(Science 284: 143-147, 1997)와 van등 (J Clin Invest. 58: 699-704, 1976)의 문헌에 개시되어 있다. 이들에서는 세포배양을 위하여 α-MEM이나 DMEM배지 및 10-20% 우태아혈청을 사용하였다. 그러나 이들 배지에 동물혈청(우태아혈청)이 이용됨으로서 인체이식에 많은 안전성 문제를 발생해 왔다.

이를 극복하기 위해 종래 세포배양배지에서 우태아혈청 대신에 인간혈청을 사용하는 시도가 있었으나 (Kuznetsov SA, et a., Transplantation. 2000 Dec 27;70(12):1780-7) 줄기세포의 증식능의 저하와 분화능의 감소나 골세포로의 분화가 촉진되는 등 줄기세포로의 특성소실로 인하여, 일반 세포배양용액에 인간혈청을 그대로 사용되기 어려웠다. 또한, 실제 줄기세포를 생체에 이식했을 때 그 생존력(viability)이 매우 낮고 이식된 세포가 자체의 효과를 충분히 나타내지 못하는 등 여러 제한점을 가지고 있다는 점이 문제점으로 내재되어 왔다. 이러한 성체 줄기세포의 조직 재생능을 최적화하기 위해 줄기세포 이식시의 생존율을 증대하고 이식의 효과를 최적화하고 이를 활성화하기 위한 기술에 대한 연구가 필요하지만 이 또한 아직까지 미진한 상태이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 아미노산, 무기질, 비타민, 성장인자 및 자하거 추출물을 함유하는 세포 보존제를 개발하였으며, 이는 동물혈청을 사용하지 않고 동물세포의 생존율을 높일 수 있으며 나아가 줄기세포의 줄기세포능을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 기존 동물세포 배양배지 보다 저온 보관 시 세포 생존율이 향상되고 줄기세포의 경우 세포성장률 및 줄기세포능을 향상시킬 수 있는 세포 보존제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 아미노산, 무기질, 비타민, 성장인자 및 자하거(Placenta) 추출물을 함유하는 세포 보존제를 제공한다.

본 발명의 세포 보존제는 동물세포를 이용한 어떤 실험이나 시술 또는 처치에 사용되기 전까지 사용될 세포를 저온 내지 실온에서 몇 시간 또는 수일간 보호하고 보관하기 위한 배지조성물을 말한다. 특정 세포의 배양 및 증식에 최적화되어 사용되는 일반적인 동물세포 배양배지와는 구성성분, 함량 및 사용용도가 다르며, 본 발명의 세포 보존제는 세포의 배양 및 증식에는 일부 첨가제로 이용될 수 있지만 그 자체를 이용하는 것에는 적합하지 않다. 즉, 특정세포의 배양 및 증식에는 특정 세포마다 최적화된 배지(optimized media)가 있기 때문에, 본 발명의 세포 보존제는 그 자체를 세포배양배지로 사용하기에는 적합하지 않고, 단지 세포 보존 용액으로 사용하거나 세포의 생존율 또는 성장률을 높이기 위한 목적으로 배양 시 일부 첨가하거나 세포를 미리 반응시킨 후 각 세포에 적합한 일반 배지로 배양하는 것이 적당하다.

본 발명의 세포 보존제가 사용될 수 있는 세포는 동물세포이다. 바람직하게는 줄기세포, 더욱 바람직하게는 성체줄기세포이다. 일반적으로 동물세포는 생존에 아미노산, 무기질, 비타민 등을 필요로 하며 통상적인 동물세포 배양배지는 이러한 성분들을 포함한다. 본 발명의 세포 보존제는 이러한 아미노산, 무기질, 비타민 등의 성분들을 포함하지만 특정 세포의 배양 및 증식이 목적이 아닌, 다양한 동물세포를 보존하기 위한 목적으로 사용되기 때문에 기존의 동물세포 배양용 배지와는 성분 및 그 함량을 달리한다 (표 1 내지 표 4의 성분조성표 참조).

본 발명의 실시예 1에서는, 동물세포의 예로서 지방세포를 이용하여 세포생존율 시험을 수행하였으며 72시간 동안 저온보관한 후에도 70% 이상의 생존율을 나타내었다 (도 1 참조). 또한 다른 동물세포로서 케라티노사이트 및 지방유래 줄기세포를 이용하여 세포성장율 및 줄기세포능을 시험한 결과에서도 기존의 동물 배양용 배지와 비교하여 현저한 효과를 확인하였다 (도 2 및 도 6 참조).

기존의 동물세포 배양배지는 영양성분으로 동물혈청을 첨가하게 되는데, 세포배양시 세포를 안정적으로 자라도록 도와주지만, 이를 세포보존제로 사용하여 초저온이 아닌 실온 혹은 저온에 장시간 보관할 경우 세포의 생존율이 저하되게 된다. 그러나 본 발명의 세포 보존제는 세포 배양 및 증식을 목적으로 하지 않기 때문에 혈청을 함유하지 않으며 실험 혹은 시술에 사용되기 직전까지 세포를 보관할 시에 세포 생존율을 높이는데 주된 목적이 있으므로 생존에 필요한 성분들을 더 함유하고 있다.

특히, 본 발명의 세포 보존제는 줄기세포의 보존에 유용하게 사용될 수 있는데, 최근 많이 연구되고 있는 세포치료제와 관련하여 줄기세포의 보관 및 이동 시 사용될 수 있는 보존제로서 유용하다. 또한 본 발명의 세포 보존제를 이용하여 줄기세포를 처리하게 되면 줄기세포능 향상 효과를 얻을 수 있다. 이는 줄기세포의 처리 시 세포 사멸이 줄어들거나 세포 활성화가 일어나는 것을 의미하는 것으로, 본 발명의 세포 보존제가 줄기세포의 안정화에 매우 효과적임을 나타내는 것이다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 아미노산은 생물의 단백질을 구성하는 20가지 기초아미노산 외에 추가적으로 L-시스틴(L-Cystine) 및 L-히드로프롤린(L-hydroproline)을 포함하는 것이 바람직하다.

추가적인 아미노산으로서, 상기 L-히드로프롤린(L-hydroproline)은 환원 DNA의 산화적 공격으로부터의 방어 및 손상된 DNA의 복구, 콜라겐 생성 효과, 그리고 콜라겐 생합성과 유지 시 필수적인 아미노산인 히드록시프롤린(Hydroxyproline)과 히드록실리신(Hydroxylycine)의 히드록시(Hydroxy)기의 제공자로서 작용 콜라겐 생합성에 있어 필수적인 보조요소(cofactor)이다. 따라서 L-히드로프롤린은 세포의 활성산소를 제거하는 항산화제로서 역할과 세포사멸을 방지하는 역할을 할 것으로 예상된다.

상기 L-시스틴(L-Cystine)은 황을 함유하고 있으며 머리털이나 뿔 등의 단백질 구성성분이다. 특히 케라틴에 10% 정도 함유되어 있고 쉽게 환원되어 L-시스테인이 되기도 한다. 폴리펩타이드 고차 구조의 결정과 효소 혹은 호르몬등의 활성에 중요한 영향을 미친다. 따라서 L-시스틴은 세포의 활성에 중요한 영향을 끼치는 성분이다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 무기질은 세포성장에 필요한 일반적인 미량원소, 예컨대 칼슘, 나트륨, 칼륨, 구리, 철, 마그네슘, 아연 외에 추가적으로 지르코늄, 게르마늄 및 바나듐을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포 보존제에 함유되는 무기질 형태는 무기염의 형태일 수 있으며, 예를 들어 ZrOCl₂?8H₂O, GeO₂, 및 NaVO₃이다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 비타민은 활성산소를 억제할 수 있는 판토텐산칼슘, 콜린클로라이드, 엽산, 이노시톨, 및 아스코르빈산을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 추가적인 무기질과 비타민은 세포가 만들어 내는 독성 물질을 제거하는 역할(예를 들어, 항산화 작용)과 관련하여 기능을 수행하게 되며 세포의 대사를 활발하도록 도와주는 역할도 하여 세포의 생존율을 높이게 된다. 이러한 기능들은 본 발명의 세포 보존제에 함유된 성분들이 서로 상호작용을 함으로서 얻을 수 있는 효과로 판단된다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 성장인자는 bFGF(Basic fibroblast growth factor), EGF(Epitheilal growth factor) 및 PDGF(platelet derived growth factor)를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 성장인자들은 세포의 생존 유지에 필요하며 세포 활성화에도 영향을 준다. 본 발명의 세포 보존제는 상기 성장인자 외에 알부민과 같은 혈청대체물질을 더 포함할 수 있다.

상기 언급된 세포 보존제의 구성성분들은 전제 보존제에 대하여 아미노산 0.5 내지 20 g/L, 비타민은 0.01 내지 1.0 g/L, 무기질은 1.0 내지 100 g/L, 그리고 성장인자는 0.001 내지 0.1 mg/L의 함량으로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 자하거 추출물은 세포 보관 시 세포의 생존 유지 및 세포 보관 이후 필요에 따라 배양 시 세포 활성화의 향상을 목적으로 함유되며, 자하거 추출물 또는 자하거 가수분해물이 사용될 수 있다. 상기 세포 보존제에 함유되는 자하거 추출물 또는 자하거 가수분해물은 전제 보존제에 대하여 1 내지 20중량%, 바람직하게는 5 내지 20%로 함유될 수 있다.

상기 자하거 추출물은 HBV(hepatitis B Virus), HCV(hepatitis C virus), HIV(human immunodeficiency virus)가 음성인 것이 확인된 건강인의 태반을 원료로 하여 염산가수분해법에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로 바이러스 등의 불활성화를 위하여 101℃ 이상으로 1시간 이상, 즉 염산가열처리를 하고 약 121℃에서 60분간 고압증기멸균을 실시한다. 자하거 가수분해물은 자하거를 아세톤 처리하여 탈지한 후 불완전 가수분해물이 생성되지 않도록 펩신과 염산처리로 충분한 가수분해조작을 실시하여 제조하였다. 본 발명의 실시예에서는 자하거 추출물 및 자하거 가수분해물을 상기 방법으로 제조되어 상업적으로 시판되는 화성바이오팜 회사의 제품을 구입하여 사용하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 세포 보존제는 표 1 내지 표 4에 기재된 성분들을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들이 개발한 세포 보존제의 성분 및 함량을 표 1 내지 표 4에 기재하고 이를 “CeLLGUARD"로 명명하였다.

본 발명의 세포 보존제에 있어서, 상기 세포 보존제는 0 내지 37℃에서 보관 시 사용될 수 있으나, 바람직하게는 0 내지 10℃의 저온 보관 시, 더욱 바람직하게는 0 내지 4℃의 저온 보관 시, 가장 바람직하게는 4℃의 저온 보관 시 세포의 생존율을 높이는데 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 보존제는 세포의 증식 및 분화를 위한 기존의 줄기세포 배양배지와는 달리, 줄기세포의 줄기세포능과 세포성장률을 증가시키면서, 세포의 특성 변화에는 영향을 미치지 않는다. 본 발명의 세포 보존제와 줄기세포를 반응시킨 후 배양하게 되면 줄기세포의 성장을 촉진시키고 줄기세포능을 증대시키는 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 실시예 2~3에서는, 지방유래 간엽줄기세포를 이용하여 지방유래 간엽줄기세포의 줄기세포능 및 세포성장률을 측정하였으며 그 결과 기존의 줄기세포 배양배지와 비교하여 현저한 효과를 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 보존제는 세포치료제의 보관 및 이동에 사용함으로써 세포치료제의 치료효과를 증대시킬 수 있다. 상기 용어 ‘세포치료제’는 세포와 조직의 기능을 복원 또는 향상시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 혹은 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통해 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 신개념 의약품을 말한다. 구체적으로는 환자 자신이나 타인 또는 다른 동물의 체세포를 채취하여 증식시키거나 줄기세포를 원하는 세포로 분화시켜 치료에 이용하는 등 적용범위가 넓고, 화상이나 암, 치매 등 각종 난치성 질환의 치료에 무한한 가능성을 가지고 있다. 기술선진국인 미국에서는 수백 여건이 임상시험 중이며 우리나라에서도 관련 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.

이와 같은 세포치료제에 사용되는 채취된 세포들은 대상에 적용하는데 까지 보관 및 이동이 매우 중요하다. 동물세포, 특히 줄기세포는 조직으로부터 분리된 후 상당수가 죽거나 활성이 떨어지게 된다. 본 발명의 실시예 1에서는, 지방조직으로부터 분리된 지방세포를 기존의 지방세포 배양배지와 본 발명의 세포 보존제로 각각 72시간 동안 4℃에서 저온보관한 후 세포생존율을 측정한 결과, 지방세포 배양배지에서 50% 이하로 나타난 세포생존율이 본 발명의 세포 보존제에서는 70% 이상의 향상된 세포생존율을 보였다. 따라서 본 발명의 세포 보존제는 세포치료에 적용되는데 걸리는 시간동안 세포의 높은 생존율을 확보하는데 매우 유용하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 세포 보존제는 세포를 안전하게 보관하는데 사용될 수 있고 줄기세포 뿐만 아니라 다양한 동물세포를 보관할 수 있다. 세포치료제로 사용하기 위한 세포의 저온 보관 이동 시에 세포 보존제로 사용될 수 있다. 또한 동물세포 배양 전 본 발명의 세포 보존제로 반응시키면 세포성장률 및 줄기세포능 향상 효과도 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 보존제는 세포 보존 및 줄기세포능 향상을 위한 보존제로서 매우 유용하다.

도 1은 지방세포를 지방조직으로부터 분리하여 배양하지 않고 대조군 배양배지와 본 발명의 CellGUARD 용액에서 72시간 동안 냉장보관(4℃)한 후 세포의 생존율을 비교한 결과이다.
도 2a는 지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 후 줄기세포능을 확인한 결과이다.
도 2b는 지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 후 세포성장율 확인한 결과이다.
도 3a는 지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 7일, 10일 및 14일간 반응시킨 후 세포성장률을 확인한 결과이다.
도 3b는 지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 후 표면발현 표지자를 확인한 결과이다.
도 4a와 4b는 상처유도한 마우스를 이용하여 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 간엽줄기세포의 상처치유 효과를 비교한 결과이다.
도 5는 피부조직으로부터 케라티노사이트를 분리하여 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 후 배양하여 케라티노사이트의 표면발현 표지자를 확인한 결과이다.
도 6은 피부조직으로부터 케라티노사이트를 분리하여 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 반응시킨 후 배양하여 케라티노사이트의 줄기세포능을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

제조예 1. 세포 보존제의 제조

하기 표 1의 성분비를 갖는 아미노산, 표 2의 성분비를 갖는 무기염 성분, 표 3의 성분비를 갖는 비타민, 및 표 4의 성분비를 갖는 기타성분을 조합하여 본 발명에 따른 세포 보존제를 제조하였으며, 이를 “CeLLGUARD”로 명명하였다. 그리고 대조군(control)으로서 동물세포의 배양에 사용되는 지방조직유래 간엽줄기세포의 경우에는 Invitrogen사의 DMEM/F12(1:1) 배지에 10%의 우태아혈청을 추가하여 사용하였고 피부세포인 케라티노사이트의 경우에는 LONZA사의 KGM 배지를 이용하였다.

[표 1]. 아미노산

[표 2]. 무기염 성분

[표 3]. 비타민

[표 4]. 기타성분

실시예 1. 지방세포의 생존율 비교

지방조직으로부터 분리된 지방세포를 1×10⁶으로 세포수를 계수하여 바이얼(vial)에 각각 대조군 배양배지와 본 발명의 세포 보존제(이하, “CeLLGUARD”라고 함)를 이용하여 충진하고 4℃에 보관한 후 일정시간 간격으로 살아있는 세포수를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다. 세포수 측정은 트리판 블루(trypan blue)로 염색된 세포를 헤모사이토미터(Hemocytometer)를 이용하여 현미경 하에서 실시하였다.

도 1은 지방세포를 지방조직으로부터 분리하여 배양하지 않고 대조군 배양배지와 CellGUARD 용액에서 72시간 동안 냉장보관(4℃)한 후 세포의 생존율을 시험한 것이다. 생존율 시험은 살아있는 세포를 카운팅(counting)하는 방법으로 수행되었다. 도 1에서, 지방세포는 지방세포 배양액에서 72시간 냉장보관 후 세포생존율이 45%에 불과하였으나, 본 발명의 CeLLGUARD에서는 세포생존율이 72%에 이르렀으며, 이는 대조군 배양배지에서 보관한 경우보다 세포생존율이 160% 상승한 것으로 볼 수 있다.

실시예 2. 지방유래 간엽줄기세포의 줄기세포능 확인

1) 줄기세포능 확인을 위한 CFU 분석

지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 본 발명의 CeLLGUARD를 이용하여 각각 1시간 동안 반응시키고 500개의 세포를 6웰 플레이트에 접종하여 7일 동안 배양하였다. CFU(Colony Forming Unit) 값을 측정하기 위하여, 플레이트로부터 배지를 모두 제거하고 로다민 레드(Rhodamine Red)와 나일 블루(Nile blue)가 1:1로 섞인 용액을 첨가하여 배양된 세포와 염색시약을 30분 동안 반응시켜 세포를 염색한 후 콜로니(colony)의 개수를 계수하여 그래프로 나타내었다.

도 2a는 분리된 지방유래 간엽줄기세포의 줄기세포능을 확인한 결과이다. 지방조직으로부터 추출된 세포를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 1시간 동안 반응시킨 후 CFU(Colony Froming Unit)을 이용하여 줄기세포능을 확인하였다. 도 2a에서, CFE(colony forming efficiency)는 배양액(control)에서 3%정도였으나, 본 발명의 CeLLGUARD에서는 10%로 3배 이상 우수하였다.

2) 세포성장률 확인

지방조직으로부터 추출된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 본 발명의 CeLLGUARD를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 후 각각을 배양접시에 단위면적(cm²)당 세포를 25개씩 접종하고 7일 동안 배양한 후, 세포를 수거하여 트리판 블루 염색을 하고 헤모사이토미터를 이용하여 현미경 하에서 세포수를 측정하였다.

도 2b는 분리된 지방유래 간엽줄기세포의 세포성장율 확인한 결과이다. 세포성장률의 확인 결과, 일반 배양배지를 처리한 대조군의 경우(control)의 세포수는 9.5×10⁴ 이고 본 발명의 CeLLGUARD를 처리한 경우 세포수는 1.5×10⁵ 로서 약 160% 더 우수하였다.

실시예 3. 지방유래 간엽줄기세포의 세포성장률과 표면발현 표지자의 확인

1) 세포수 측정

지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 대조군 배양배지와 본 발명의 CeLLGUARD로 1시간 동안 반응시킨 후 1×10⁵의 숫자로 배양접시에 접종하고 7일, 10일 및 14일에 각각 세포를 수거하여 트리판 블루로 염색하고 헤모사이토미터를 이용하여 현미경 하에서 세포수를 계수하였다.

도 3a는 지방조직으로부터 추출된 직후의 지방유래 간엽줄기세포의 세포성장률을 확인한 결과이다. 지방조직으로부터 추출된 직후의 세포를 CeLLGUARD와 대조군 배양배지로 1시간 동안 반응시킨 후 배양접시에 접종하여 7일 이후부터 성장률을 측정하였다. 도 3a에서, CeLLGUARD를 1시간 동안 반응시키고 배양한 경우 세포수가 7일째는 4만, 10일째는 11.5만, 14일째는 18만 정도로 계속 증가하였다. 특히 본 발명의 CeLLGUARD를 처리한 경우 14일째 세포수는 18만 정도로서 대조군 배양배지의 세포수 10만 정도보다 약 180% 더 우수하였다.

2) 유세포분석(Flow cytometry)

지방조직으로부터 추출된 세포를 CeLLGUARD와 배양액으로 1시간 동안 반응시킨 후 배양접시에 접종하여 7일 동안 배양된 세포를 수거하여 PBS(Phosphate Buffer Salin)로 잘 세척하고 PBA(1% Bovine Serum Albumin in PBS)로 다시 한 번 세척한 후 줄기세포 표지자인 CD29(SantaCruz, USA), CD34(Milipore, USA), CD105(Milipore, USA)의 1차 항체와 1:100으로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBA로 2차례에 걸쳐 잘 세척한 후에 FITC conjugated 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratory,. USA)로 30분간 반응시켜 CellQuest Pro Program (BD, USA)을 이용하여 분석하였다.

도 3b는 지방유래 간엽줄기세포의 표면발현 표지자를 확인한 결과이다. 세포표면 발현 표지자들을 확인하기 위하여 유세포분석(Flow cytometry analysis)을 실시한 결과, CeLLGUARD를 1시간 동안 반응시키고 배양한 경우 세포표면 표지자들이 큰 변화가 나타나지 않아 세포의 기본적인 특성은 변하지 않는 상태에서 세포 성장을 촉진시키는 것으로 판단하였다.

실시예 4. 동물모델을 이용한 줄기세포능 확인

CF1 마우스를 먼저 마취시킨 후 등의 털을 면도기를 이용하여 깨끗하게 제거하였다. 8mm 펀치(punch)를 이용하여 상처(wounding)를 형성시키고, 지방조직으로 부터 분리된 간엽줄기세포 1×10⁶개를 일반 배양배지를 이용한 대조군과 본 발명의 CeLLGUARD로 1시간 동안 각각 반응시킨 실험군으로 나누어 생쥐의 상처 부위에 뿌려 드레싱(dressing)하였다. 6일이 지난 후 상처부위를 확인하여 상처치유(healing)가 일어난 정도를 측정하였다.

도 4a와 4b는 상처를 유도한 마우스를 이용하여 간엽줄기세포를 일반 배양배지와 반응시킨 대조군과 CeLLGUARD로 반응시킨 실험군으로 나누어 상처치유 효과를 비교하였다. 도 4a는 드레싱 6일 후 상처부위의 치유 정도를 관찰한 결과이고, 도 4b는 그 크기를 측정한 것이다. 그 결과, 대조군 배양배지와 반응시킨 간엽줄기세포를 투여한 경우보다 CeLLGUARD와 반응시킨 세포를 투여한 경우에 상처 크기(wounding area)가 더 잘 줄어들고 치유 속도(healing rate)도 더 빠른 것으로 나타났다.

실시예 5. 케라티노사이트의 표면발현 표지자의 확인

인간피부조직으로부터 케라티노사이트(Keratinocyte)를 분리하여 대조군 배양배지와 CeLLGUARD로 1시간 반응시킨 후 배양한 후, 세포를 수거하여 PBS로 잘 세척하고 PBA(1% Bovine Serum Albumin in PBS)로 다시 한 번 세척한 후 케라티노사이트(keratinocyte) 표지자인 CD24와 줄기세포 표지자인 CD29(SantaCruz, USA), CD34(Milipore, USA), CD90(Milipore, USA)의 1차 항체와 1:100으로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBA로 2차례에 걸쳐 잘 세척한 후에 FITC conjugated 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratory, USA)로 30분간 반응시켜 CellQuest Pro Program (BD, USA) 을 이용하여 분석하였다.

도 5는 케라티노사이트의 표면발현 표지자를 확인한 결과이다. 도 5에서, 케라티노사이트를 본 발명의 CeLLGUARD로 반응시키더라도 세포 표면발현 표지자에는 변화가 없는 것으로 나타나 세포의 기본적인 특성이 변하지 않았음을 알 수 있었다.

실시예 6. 케라티노사이트의 줄기세포능 확인

피부조직으로부터 분리된 케라티노사이트를 대조군 배양배지와 CeLLGUARD를 이용하여 각각 1시간 동안 반응시키고 500개의 세포를 6웰 플레이트에 접종하여 7일 동안 배양하였다. CFU 값을 측정하기 위하여 플레이트로부터 배양액을 모두 제거하고 로다민과 나일 블루가 1:1로 섞인 용액을 첨가하여 배양된 세포와 염색시약을 30분 동안 반응시켜 세포를 염색한 후 클로닝(Cloning)의 개수를 계수하여 그래프로 나타내었다.

도 6에서, 케라티노사이트의 줄기세포능을 확인한 결과, 본 발명의 CeLLGUARD에 반응시킨 케라티노사이트는 배양액(control)과 반응시킨 대조군과 비교하여 4배 이상 증가된 CFE를 나타내었으며, 이는 본 발명의 CeLLGUARD로 반응시킨 경우 줄기세포능이 현격하게 증가하는 것을 의미한다.

Claims

아미노산, 무기질, 비타민, 성장인자 및 자하거(Placenta) 추출물을 함유하며, 상기 아미노산은 생물의 단백질을 구성하는 기초아미노산 외에 L-시스틴(L-Cystine) 및 L-히드로프롤린(L-hydroproline)을 포함하고, 상기 무기질은 세포성장에 필요한 일반적인 원소 외에 지르코늄, 게르마늄 및 바나듐의 미량원소를 포함하고, 상기 비타민은 활성산소를 억제할 수 있는 판토텐산칼슘, 콜린클로라이드, 엽산, 이노시톨 및 아스코르빈산을 포함하고, 상기 성장인자는 bFGF, EGF 및 PDGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 보관 및 이동시 사용하기 위한 세포 보존제.
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제 1항에 있어서, 상기 자하거 추출물은 자하거 추출물 또는 자하거 가수분해물인 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
제 1항에 있어서, 상기 세포 보존제는 표 1에 기재된 아미노산, 표 2에 기재된 무기염 성분, 표 3에 기재된 비타민 및 표 4에 기재된 기타성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
제 1항에 있어서, 상기 세포 보존제는 0 내지 37℃의 온도에서 보관 시 세포의 생존율을 높이는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
제 1항에 있어서, 상기 세포 보존제는 줄기세포의 줄기세포능과 세포성장율을 증가시키면서, 세포의 특성 변화는 없는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.
제 1항에 있어서, 상기 세포 보존제는 세포치료제의 보관 및 이동에 사용함으로써 세포치료제의 치료효과를 증대시키는 것을 특징으로 하는 세포 보존제.