DE102008012908A1

DE102008012908A1 - Methode zum anti-inflammatorischen und anti-ödematösen Schutz von explantiertem biologischen Material bis zu seiner Transplantation in Patienten

Info

Publication number: DE102008012908A1
Application number: DE102008012908A
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 2008-03-06
Filing date: 2008-03-06
Publication date: 2009-09-10
Also published as: CA2718810C; US8795956B2; JP2011527985A; WO2009109574A3; WO2009109574A2; US20110129809A1; CA2718810A1; EP2249639A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zum Schutz von Transplantaten, sowohl von Organen als auch von einzelnen Blutgefäßen, gegen entzündliche Reaktionen, die durch den mit der Explantation und Lagerung bis zur Tranplantation verbundenen operativen Eingriff ausgelöst werden. Dies wird durch Behandlung der Tranplantate via intraarterielle Applikation von Flavonolverbindungen, isnbesondere mit Quercetingglucuronid und/oder Kämpferolglucuronid, erreicht.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusätze zu Organpräservierungslösungen zum Schutz von biologischen Transplantaten aller Art (Geweben, Blutgefäßen, Organen) nach deren Explantation und während ihrer Lagerung bzw. während ihres Transports, gegen ischämisch bedingte Entzündungsreaktionen (z. B. Ödeme und/oder oxidative oder hydrolytisch bedingte Zellschäden), die durch das vorübergehende Sistieren der Durchblutung ausgelöst werden. Dies wird durch Beimischung von bestimmten Flavonoiden der Flavonolgruppe, insbesondere von Quercetinglucuronid und/oder Kämpferolglucuronid zu den betreffenden Präservierungslösungen, erreicht.
Erfindungshintergrund
Es ist bekannt, daß es nach Ischämie und Reperfusion von Organen oder auch einzelnen Blutgefäßen mit Blut durch die intraoperativ aus verletztem Gewebe oder auch aus im Prinzip gesundem, dann aber ischämisch geschädigten Gewebe unvermeidlich freigesetzten Entzündungsmediatoren zur Aktivierung von Plättchen und neutrophilen Granulozyten (PMN) kommt. Werden diese beiden Blutzellenarten gleichzeitig aktiviert, kommt es zur Synthese und Freisetzung von Plättchen-aktivierendem Faktor (PAF) und Leukotrien B₄ (LTB₄), die in selektiver und synergistischer Weise das Endothel der betreffenden Organvenulen, aber auch das des makrovenösen luminalen Endothels zur Kontraktion und Öffnung seiner Interzellularspalten aktivieren können. Dadurch wird der Ausstrom plasmatischer Komponenten (z. B. Gerinnungsfaktoren, Komplementfaktoren und Plättchen) ins jeweilige Interstitium der betroffenen Organe stark erhöht. Gleichzeitig wird durch PAF und LTB₄ die Adhäsivität der Plättchen und PMN am jeweiligen Endothel gefördert. Da adhärente Leukozyten das Endothel durch Freisetzung aggressiver Verbindungen (z. B. proteolytische Enzyme, Sauerstoffradikale, hypochlorige Säure usw.) schädigen können und aktivierte Plättchen auf der Oberfläche durch Bindung und Arrangierung der Gerinnungskaskade zu Katalysatoren einer um sich greifenden Fibrinbildung werden, kommt es an der Wand und im Lumen betroffener Blutgefäße zu entzündlichen Reaktionen, die zur Bildung von Thromben führen. Diese Entzündungsprozesse können in Organen auf stromabwärts gelegene, kleinere Blutgefäße übergreifen. Eine Folge solcher auf die Mikrozirkulation übergreifender Entzündungen ist, daß es innerhalb und in der Umgebung der kleinsten Venen (postkapillare Venulen) zu einer massenhaften Akkumulation weißer Blutkörperchen kommt, die in Organen ausgedehnte entzündliche Ödeme induzieren können. Weiterhin besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß, über die Öffnung der venulären Schranke und zahlreiche Entzündungsmediatoren vermittelt, in der Nachbarschaft liegende Arteriolen konstringieren und dadurch die lokale Durchblutung stark limitiert wird. Außerdem ergibt sich die Gefahr intravaskulärer Thrombosen.
Leiden zum Beispiel beim Menschen Organe während einer Operation oder nach Explantation unter mangelnder Blutversorgung, so finden in der Regel die zuvor beschriebenen entzündlichen Prozesse innerhalb der jeweiligen Mikrogefäßsysteme statt. Bei Bypass-Operationen, bei denen thrombotisch oder durch Gefäßwandverdickung verschlossene Organarterien durch eingenähte gesunde Gefäßsegmente (häufig aus entbehrlichen peripheren Venen, seltener aus Arterien) überbrückt werden, ergibt sich häufig als ein zusätzliches Problem, dass auch das das Endothel der transplantierten Gefäßsegmente selbst geschädigt wird. Die hohen akuten Restenosierungsraten der Grafts nach den in dieser Beziehung besonders gut untersuchten koronaren Bypass-Operationen (30–40% Restenosen schon innerhalb des ersten postoperativen Jahres!) sprechen eine deutliche Sprache, viele weitere verschließen im nachfolgenden Jahrzehnt.
Daher stellt sich die Aufgabe, Transplantate gegen die Bildung der oben beschriebenen Entzündungen zu schützen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, daß die zuvor beschriebenen Entzündungen in der Gegenwart von bestimmten Flavonoiden der Flavonolgruppe, speziell von Quercetinglucuronid und Kämpferolglucuronid, praktisch nicht auftreten bzw. dass sie reversibel gemacht werden können. Mit Hilfe dieser Erkenntnis wurde, der Effekt von Flavonolverbindungen (Quercetinglucuronid und/oder Kämpferolglucuronid) als Zusatz zu gängigen Organpräservierungslösungen getestet
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
„Transplantate” im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Gewebe, einzelne Blutgefäße, Organe oder Körperteile des menschlichen Körpers, die einem Spenderorganismus entnommen wurden zum Zwecke der Implantation in einen Akzeptororganismus. Der Akzeptororganismus kann der Spenderorganismus oder ein anderer Organismus sein.
Entzündliche Prozesse im Sinne der vorliegenden Erfindung sind durch Komponenten des Immunsystems akut oder chronisch induzierte Abwehrprozesse, bei denen es nicht nur zum Untergang von in einen Körper eingedrungenen Fremdstoffen, Fremdzellen, Fremdgeweben oder transplantierten Körperteilen, sondern auch zum Untergang körpereigener Strukturen, Zellen, Gewebe und Körperteile kommen kann. Diese direkt zellschädigenden Prozesse werden durch die Aktivität abwehrender hydrolytischer Enzyme, Oxidantien und Phagozyten des Immunsystems zuwege gebracht. Parallel entwickeln sich zellaggregatorische, thrombotische und ödematöse Prozesse, die sich im Sinne ischämischer Störungen pathogenetisch auf die betroffenen Körperregionen auswirken können. Unter gesunden, „normalen” Bedingungen kommt es in Organen nicht zu ausgreifenden entzündlichen Störungen. Die im normalen Leben unvermeidliche entzündliche Auseinandersetzung des Körpers mit seiner Umwelt z. B. im Rahmen „alltäglicher” Wundinfektionen führt zu einer physiologischen Immunabwehr, die Fremdstrukturen und/oder Krankheitserreger möglichst auf lokale Infektions- oder Läsionsgebiete beschränkt. Solche (fast schon „physiologisch” zu nennenden) Entzündungsprozesse werden durch die entzündlich induzierten Regenerations- und Heilungsprozesse bald wieder aufgehoben.
„Blutgefäße” im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle im menschlichen Organismus von Blut durchspülten Bereiche. Umfaßt sind insbesondere Herz, Venen und Venulen sowie Arterien und Arteriolen.
„Flavonolverbindungen” im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substanzen mit einer 3-Hydroxyflavonstruktur, insbesondere solche mit freien Hydroxylgruppen. Bevorzugte Flavonole sind Abkömmlinge des Quercetins und des Kämpferols. Besonders bevorzugte Flavonolverbindungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Quercetinglucuronid und Kämpferolglucuronid, insbesondere Quercetin-3-O-β-D-Glucuronid und Kämpferol-3-O-β-D-Glucuronid.
„Venulen” im Sinne der vorliegenden Erfindung sind kleinste, im Kreislaufsystem postkapillär angesiedelte Venen mit einem Querschnitt von 10–30 μm.
„Arteriolen” im Sinne der vorliegenden Erfindung sind kleinste Arterien mit einen Querschnitt von 10–50 μm.
„Innere Oberfläche” eines Transplantates im Sinne der vorliegenden Erfindung betrifft die luminale Oberfläche der Blutgefäße des Transplantates, die nach der Entnahme aus dem Spenderorganismus mit geeigneter Präservierungslösung von außen her perfundiert werden.
„Äußere Oberfläche” eines Transplantates im Sinne der vorliegenden Erfindung betrifft die Oberfläche des Transplantates, die dem Betrachter von außen mit bloßem Auge sichtbar ist.
Den Vorgang der Transplantation kann man in drei Phasen einteilen: In der ersten Phase wird das Transplantat den Spenderorganismus operativ entnommen. In dieser ersten Phase werden erste Reize ausgelöst, die dann im Weiteren die zu Entzündungen führenden physiologischen Kaskaden fördern können.
In der zweiten Phase befindet sich das Transplantat während seiner Lagerung in entsprechender Präservierungslösung im Zustand der Ischämie, d. h. es wird nicht mehr von Blut durchflossen, da es sich außerhalb eines versorgenden Organismus befindet. Diese zweite oder ischämische Phase ist äußerst kritisch für das weitere Verhalten des Transplantates. Läßt man den in der ersten Phase induzierten Entzündungskaskaden ihren Lauf, kann es während der ischämischen Lagerung des Transplantates zu schweren Komplikationen kommen, die den Erfolg der ganzen Transplantation in Frage stellen. Auf der anderen Seite besteht in der ischämischen Phase eine besonders einfache Möglichkeit, gezielt auf das Transplantat einzuwirken, um genau die beschriebenen, zu Entzündungen führenden Kaskadenreaktionen abzuschwächen oder sogar zu unterbinden. Dies ist das Anliegen der vorliegenden Erfindung.
In der dritten Phase wird das Transplantat dem Akzeptororganismus implantiert. Diese Phase wird auch als Reperfusionsphase bezeichnet, da das Transplantat wieder mit Blut durchströmt wird. Nach dem früheren Verständnis geradezu paradoxerweise, kommt es gerade dann, wenn das ischämisch gewesene Organ endlich wieder mit Blut perfundiert wird, oft zu den größten Schäden am Transplantat. Heute wissen wir, dass gerade dann wieder frische Granulozyten und Plättchen ihre pathogenetische kooperation beginnen können, die dann zur Öffnung der venulären Endothelschranke und den nachfolgenden entzündlichen Prozessen führt.
Diverse Flavonoidverbindungen haben sich bereits häufiger als hochwirksame Antiphlogistika erwiesen. Es wurde u. a. gefunden, daß Quercetinglucuronid die durch aktivierte Plättchen durchgeführte Synthese von PAF und LTB₄ stark hemmen und dadurch eine pathologische Öffnung der venulären Endothelschranke verhindern kann. Gleichzeitig wird dadurch, analog wie einführend beschrieben, die Aktivierung und Adhäsivität der Blutzellen an der Endotheloberfläche stark verringert.
Für eine Reihe von Flavonoidverbindungen wurde eine antiphlogistische Wirkung an Zellinien und im Tierversuch gezeigt. Allerdings war die Relevanz der Ergebnisse für den Schutz menschlicher Organe unklar.
Die vorliegende Erfindung nutzt die beschriebenen Erkenntnisse, um durch Behandlung von dem Spenderorganismus entnommenen Transplantaten mit Flavonolverbindungen, insbesondere Quercetinglucuronid und Kämpferolglucuronid, in der Phase der Ischämie bzw. der präoperativen Lagerung, die beschriebenen Entzündungsprozesse und ihre Auslöser zu unterdrücken und somit nach Implantation und Reperfusion der Transplantate im Akzeptororganismus die oben beschriebenen Komplikationen, wie Verstopfungen von frisch implantierten Bypässen und dergleichen vermeiden.
Optimiertes Protokoll zur Präservierung von Organen, die zum Transport und späterer Transplantation vorgesehen sind
Die explantierten Organe (Herzen, Lungen, Nieren etc.) werden am besten noch vor der Explantation in Situ mit optimierten, mit Heparin-antikoagulierten Präservierungslösungen bei Zimmertemperatur durchspült, denen zuvor Quercetinglucuronid bis zur Endkonzentration 100 μM zugesetzt worden ist. Nach der möglichst kompletten Auswaschung des Blutes werden die Organe in frische, analog substituierte Präservierungslösung eingelegt und auf 4°C abgekühlt. In diesem Zustand können die Organe bis zu 12 h aufbewahrt und anschließend transplantiert werden.
Als Grundlösungen empfehlen sich die folgenden 2 Lösungen, die nach unseren Erfahrungen beide etwa gleich gut geeignet sind (Konzentrationen, wenn nicht anders angemerkt, jeweils in Klammern in mM):

1. UW-solution („University of Wisconsin-solution”). K Laktobionat (100), NaKH₂PO₄ (25), MgSO₄ (5), Glutathion (3), Raffinose (30, Allopurinol (1), Adenosin (5), Penicillin (200 U), Insulin (40U), Dexamethason (16 mg), Hydroxyethylstärke (5 g%), Na (30), K (120). Der pH wird auf 7,4 eingestellt, die Osmolarität ergibt sich zu 320–330 mOsmol/l.
2. Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung („Bretschneider-Lösung”) NaCl (15), KCl (9), MgCl₂ (4), Mannitol (30), Histidin (180), Histin/HCl (18), Tryptophan (2), K-Ketoglutarat (1). Der pH wird auf 7,1 eingestellt, die Osmolarität ergibt sich zu 300 mOsmol/l.

Vor der Anwendung wird diesen Lösungen 100-fach konzentrierte, auf pH 7,4 eingestellte wässrige Stammlösung von Quercetinglukuronid bis zur Endkonzentration 100 μM zugesetzt. Diese Stammlösung des Flavonoids ist im eingefrorenen Zustand bei –80°C mindestens 6 Monate haltbar.
Präservierungsprotokoll für Meerschweinchen-Herzen
Weibliche Meerschweinchen (250–330 g) wurden als Herzspender eingesetzt. Nach Dekapitierung der Tiere wurden ihre Herzen explantiert und in eine Langendorff Apparatur eingebracht (Eigenkonstruktion). Die Perfusion unter Normalbedingungen erfolgte retrograd über die Aorta unter einem konstanten Druck von 60 mm Hg für 3 min (Modus 1). Zur Perfusion wurde 37°C-warmer Krebs-Henseleit-Bicabonatpuffer (KHM) ohne Zusatz von Quercetiglukuronid (QG) verwendet, der vor Verwendung mit Carbogen begast wurde. Nach Kanülierung des linken Vorhofs wurde auf den Arbeitsmodus umgeschaltet (Modus 2) mit einer Preload von 10 mmHg und einem afterload von 60 mmHg. Nach 2-minütiger perfusion wurden die Basisfunktionen registriert, im Einzelnen: Aortenfluß, Koronarfluß, Auswurfsleistung, Herzfrequenz, systolisches Druckmaximum, arterieller Mitteldruck, sowie das Produkt aus Herzfrequenz und systolischem Druckmaximum. Danach erfolgte Umschaltung in den Modus 1, und die Herzen wurden – eingeteilt in 2 Gruppen- ohne bzw. mit Zusatz von 100 μM QG mit nun eingesetzter, 4°C-kalter HTK-Lösung (= kardioprotektive Lösung nach Bretschneider)- bis zum jeweils eingetretenen Herzstillstand weiter perfundiert, und dann im selben Perfusionsmedium (jeweils 30 ml) bei 4°C für einen Zeitraum von 8 h im Dunkeln aufbewahrt. Danach wurden die Herzen erneut in die Langendorff-Apparatur eingebracht und unter Normalbedingungen im Modus 1 perfundiert. Schließlich wurde wieder in den Arbeitsmodus umgeschaltet und die oben definierten Leistungsdaten auch unter diesen Bedingungen gemessen. Ergebnis: Alle erfassten Werte lagen in den während ihrer 8-stündigen Ischämie mit QG-Zusatz präservierten Herzen um 25–35% über dem der Vergleichsherzen (kein Zusatz von QG zur HTK-Lösung).

Claims

Verfahren zum Schutz von Transplantaten vor der Bildung von Entzündungen in Blutgefäßen, dadurch gekennzeichnet, daß die entnommenen Transplantate mit Flavonolverbindungen, insbesondere Quercetinglucuronid und/oder Kämpferolglucuronid behandelt werden, bevor sie wieder in einen Akzeptororganismus implantiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Quercetinglucuronid und/oder Kämpferolglucuronid als Inhaltsstoff einer Lösung oder Suspension eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Blutgefäße des Transplantat mit der Lösung oder Suspension gespült werden, so daß die innere Oberfläche des Transplantates mit der Lösung der Suspension in Berührung ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Transplantat derart in die Flüssigkeit oder Suspension eingebracht wird, daß die innere und äußere Oberfläche des Transplantates mit der Lösung oder Suspension in Berührung ist.