CN112322578A - 一种海马胚胎稳定细胞系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海马胚胎稳定细胞系的构建方法。本发明通过对海马胚胎来源的细胞进行基本培养基、培养温度及血清含量3个关键因素的系统比较分析，获得了海马胚胎细胞系最佳培养条件，并成功建立长期稳定的海马细胞系，目前该细胞系已稳定传代至70代；该细胞系有望成为海马分子细胞水平理论与应用研究的新平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海马胚胎稳定细胞系的构建方法。
背景技术
海马属于海龙科海马属(Synagnathidae:Hippocampus)，是一类珍惜濒危的小型海洋硬骨鱼类，属于国际性保护物种。海马具有较高的药用价值和观赏价值，使其市场上供不应求。加之近几十年环境破坏、过度捕捞、疾病爆发等原因，导致目前野生海马资源受到严重威胁。尽管大规模的海马人工养殖产业在一定程度上缓解了上述困境，但随之而来的海马疾病频繁爆发，及长期人工干预导致的海马种质退化等问题日益严重。因此，亟需开发一种既能保护和保存海马种质资源，又能最大限度的降低必要研究中对海马资源需求的方法。
建立稳定的海马细胞系是一种解决上述问题的有效手段。鱼类细胞系作为一种体外培养系统，具有生长迅速、成本低、实验重复性好等诸多优点，是鱼类遗传学、发育生物学、内分泌学、毒理学、病理学及免疫学等众多研究领域的有力工具。截止目前，全世界已经建立起至少280株鱼类细胞系，并已在鱼类免疫学、毒理学、生理学及基因工程领域发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行的线纹海马胚胎稳定细胞系的构建方法，以满足海马种质资源的保护、保存，并能满足海马相关的研究需求。
本发明通过对海马原代细胞关键的培养条件—基本培养基、血清浓度及培养温度进行比较优化，最终得到一种长期稳定培养海马无限细胞系的方法。
本发明的海马胚胎稳定细胞系的构建方法，包括以下步骤：
a.原代培养：无菌条件下取原肠胚期的海马胚胎，用PBS漂洗液漂洗后切碎胚胎组织，胰蛋白酶消化细胞，然后加入原代培养液悬浮细胞，离心收集细胞沉淀然后用原代培养液重悬，细胞悬液转移至细胞培养瓶中，于28℃培养，每2天半量更换原代培养液；
b.传代培养：待原代培养的细胞铺满培养瓶底部85％，吸出培养液，用PBS漂洗液漂洗细胞，胰蛋白酶消化细胞后进行传代培养；其中，前15次传代细胞消化后添加原代培养液进行培养，15次传代以后的细胞添加传代培养液进行培养；前5次细胞传代培养以1:1-1:2分瓶传代，5次以后按1:2-1:4进行分瓶传代；
c.细胞冻存：待传代培养的细胞生长稳定后，取对数生长期的细胞，吸出培养液，用PBS溶液漂洗细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，离心获取细胞，细胞用冻存液重悬后，分装于冻存管中，经程序降温后，于液氮中长久保存；
d.细胞复苏：将冻存的细胞从液氮中取出，置于37℃水浴锅中融化，加入等体积的传代培养液，离心后细胞沉淀用传代培养液悬浮，转入细胞培养瓶中，于28℃培养。
优选，所述的原代培养液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数20％的胎牛血清、400IU/mL的青霉素、400IU/mL的链霉素、5ng/mL的碱性成纤维生长因子和10ng/mL的I型胰岛素样生长因子。
优选，所述的传代培养液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数15％-20％的胎牛血清、100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素。
优选，所述的冻存液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数20％的胎牛血清和10％的二甲基亚砜；所述的PBS漂洗液为：PBS溶液中添加终浓度为400IU/mL的青霉素和终浓度为400IU/mL的链霉素。
所述的步骤a的切碎胚胎组织，是用无菌手术刀切碎成1mm3以内的小块。
所述的步骤a的胰蛋白酶消化细胞，是用体积分数0.25％胰蛋白酶室温消化3-5分钟，至显微镜下观察不到明显的大组织团块。
所述的步骤b的胰蛋白酶消化细胞后进行传代培养，是用体积分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，当显微镜下观察到一半细胞收缩并开始变圆后，添加培养液，充分悬浮细胞后进行传代。
所述的步骤c的细胞用冻存液重悬的浓度为1×106个/mL。
所述的步骤c的程序降温，是将冻存管置于程序降温盒中，于-80℃放置24小时。
所述的海马为线纹海马(Hippocampus erectus)。
本发明的优点和积极效果如下：
1.本发明的构建方法操作简单易行，效率高，重复性强，构建的细胞系能够连续稳定传代，目前已传代70代。该构建方法可为其它海龙科鱼类相关细胞系的构建提供重要的参考价值。
2.本发明所构建的线纹海马胚胎细胞系形态为成纤维样细胞，该细胞系生长迅速，且稳定性好，可用于相关科研及应用研究，能满足对海马种质资源的保存和相关研究及应用需求。
3.本发明对细胞培养的3种关键因素进行优化，获得最适合海马细胞生长的培养基和FBS浓度条件为DMEM/F12+20％FBS，最佳培养温度为28℃。
4.本发明方法构建的海马细胞系为目前国际首个海马长期稳定的细胞系，为海马相关研究与应用提供了一条新的途径，具有较高的潜在研究及应用价值。
附图说明
图1a、1b分别为培养20代的海马胚胎细胞系在相差显微镜下生长状态，其中a为海马胚胎细胞传代培养4小时即可观察到细胞贴壁生长，b为海马胚胎细胞传代培养5天即可达到约95％覆盖度，图中比例尺为200μm。
图2为海马胚胎细胞系在不同培养条件下的生长曲线图，其中a为不同温度培养条件下的细胞生长曲线，b为不同基本培养基中细胞生长曲线，c为不同胎牛血清浓度下的细胞生长曲线。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
如无其他说明，以下实施例中所使用的百分比均为体积百分比。
实施例1：海马稳定胚胎细胞系的建立
1.制备PBS漂洗液和细胞培养液：
PBS漂洗液：向PBS溶液(含有8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/LKH2PO4)中加入抗生素，使其中青霉素浓度为400IU/mL，链霉素浓度为400IU/mL。
原代培养液：向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、抗生素及生长调节剂，使溶液中胎牛血清浓度20％，青霉素浓度为400IU/mL，链霉素浓度为400IU/mL，碱性成纤维生长因子浓度为5ng/mL，I型胰岛素样生长因子为10ng/mL。
传代培养液：向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、抗生素及生长调节剂，使溶液中胎牛血清浓度20％，青霉素浓度为100IU/mL，链霉素浓度为100IU/mL。
2.原代培养
活体线纹海马用75％酒精体表消毒后，于超净工作台中，无菌条件下取发育早期(原肠胚期)的线纹海马胚胎，置于PBS漂洗液中漂洗5次，吸去PBS漂洗液，用无菌刀片将海马胚胎切碎(组织块小于1mm3)，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，室温消化3-5分钟，至显微镜下观察不到明显的大的组织团块，加入原代培养液，悬浮细胞，离心后，小心吸去上清液，细胞沉淀用原代培养液重悬后，细胞悬液转移至T25细胞培养瓶中，置于28℃培养箱中培养。以后每2天半量更换培养液一次，培养20天后形成的原代细胞单层覆盖度达85％。
3.传代培养
待步骤2中原代细胞不断生长至覆盖度约85％时开始传代，具体方法如下：吸出培养液，用PBS漂洗液清洗细胞一次，然后加入1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞。显微镜下观察到约一半细胞收缩并开始变圆后，立即添加新鲜培养液，充分悬浮细胞后进行传代培养。前5次细胞传代培养以1:1-1:2分瓶传代，5次以后按1:2-1:4进行分瓶传代；传代所用培养基在前15次为原代培养液，15次以后为传代培养液。目前，该细胞系已经稳定传代至70代。
取培养20代的海马胚胎细胞系，所得到的细胞系在传代培养4小时后，即可贴壁生长(图1a)，培养到第5天细胞覆盖度可达90％左右(图1b)。
4.细胞冻存与复苏
a)冻存液的配制：冻存液包括DMEM/F12基本培养基、胎牛血清及二甲基亚砜，按照7:2:1体积比混合均匀，现配现用。
b)细胞冻存：传代培养的细胞生长稳定后，取对数生长期的细胞，吸去细胞培养液，用PBS溶液漂洗一次，再用0.25％胰蛋白酶充分消化，收集细胞悬液并于1000rmp离心5分钟获取细胞，细胞沉淀用冻存液重悬，使细胞浓度为1×106个/mL后，分装于冻存管中，冻存管再置于程序降温盒中，经-80℃程序降温24小时后，转入液氮中长久保存。
c)细胞复苏：取出上述液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴锅中，不断轻轻摇晃至冻存液完全融化；于超净台中将细胞悬液转移至15mL无菌离心管中，并加入同体积的新鲜传代培养液，1000rmp离心5分钟，小心吸去上清液；细胞沉淀再经传代培养液重悬后，转移至培养瓶中，于28℃培养箱中培养；复苏的细胞在培养7天后即可长成单层。
实施例2：海马胚胎细胞系培养条件优化
1.培养温度对海马胚胎细胞生长率的影响
对实施例1中的传代细胞培养温度为不同培养温度进行比较。
将实施例1中的传代细胞置于18℃、23℃、28℃及32℃ 4种不同温度条件下培养，其它步骤与实施例1中完全相同，比较不同培养温度条件下海马胚胎细胞系的生长率。结果显示(图2a)，在4种温度条件下，海马胚胎细胞均能存活且增殖，但不同温度条件下，增殖率存在明显差异。在23℃与28℃培养条件下，海马胚胎细胞增值较为明显，以28℃增值率最高；在18℃条件下，海马胚胎细胞虽能增殖，但增值率较低；而在32℃条件下，海马胚胎细胞虽然能够增殖，但是细胞死亡率也明显增加，且细胞死亡率随着培养天数增加而升高，总表现为前期细胞总量增殖不明显，后期死亡率超过增殖率。说明海马胚胎细胞培养的最佳培养温度为28℃，温度过高或过低都会影响细胞生长。
2.基本培养基对海马胚胎细胞生长率的影响
对实施例1中的传代细胞培养液的基本培养基替换为不同基本培养基进行比较。
将实施例1中的传代细胞培养液中的基本培养基替换成DMEM与L15两种不同营养成分和渗透压的常用海洋鱼类培养基，其它步骤与实施例1中完全相同，对比3种常用基本培养基对海马胚胎细胞的生长率影响。结果显示(图2b)，海马胚胎细胞在L15与DMEM/F12中均能正常生长，但DMEM/F12中的细胞增殖率略高。而在DMEM培养基中细胞接种1d后即可观察到明显细胞形态异常，并观察到部分细胞死亡，且随着培养继续，死亡率逐渐升高，培养到到第3天细胞基本全部死亡。因此，L15与DMEM/F12均可作为海马胚胎细胞培养的基本培养基，而最佳基本培养基为DMEM/F12。
3.不同血清浓度对海马胚胎细胞生长影响
对实施例1中的传代培养液添加不同浓度的胎牛血清，比较对海马胚胎细胞生长的影响。
将实施例1中的传代培养液中的胎牛血清浓度替换成5％、10％、15％及25％，其它步骤与实施例1中完全相同，对比在5种不同胎牛血清浓度下海马胚胎细胞的生长率。结果显示(图2c)，在不同胎牛血清浓度下，海马胚胎细胞均能生长，但是不同浓度下，细胞增殖率存在显著差别。海马胚胎细胞在10％-25％胎牛血清中均表现出较高增殖率，其中以15％及20％胎牛血清中表现出最高增殖率；在5％胎牛血清中海马胚胎细胞虽然也能保持增殖，但增殖率相对偏低。因此，海马胚胎细胞培养过程中，15％与20％胎牛血清均可作为最适合的血清浓度。
Claims (10)
1.一种海马胚胎稳定细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.原代培养：无菌条件下取原肠胚期的海马胚胎，用PBS漂洗液漂洗后切碎胚胎组织，胰蛋白酶消化细胞，然后加入原代培养液悬浮细胞，离心收集细胞沉淀然后用原代培养液重悬，细胞悬液转移至细胞培养瓶中，于28℃培养，每2天半量更换原代培养液；
b.传代培养：待原代培养的细胞铺满培养瓶底部85％，吸出培养液，用PBS漂洗液漂洗细胞，胰蛋白酶消化细胞后进行传代培养；其中，前15次传代细胞消化后添加原代培养液进行培养，15次传代以后的细胞添加传代培养液进行培养；前5次细胞传代培养以1:1-1:2分瓶传代，5次以后按1:2-1:4进行分瓶传代；
c.细胞冻存：待传代培养的细胞生长稳定后，取对数生长期的细胞，吸出培养液，用PBS溶液漂洗细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞悬液，离心获取细胞，细胞用冻存液重悬后，分装于冻存管中，经程序降温后，于液氮中长久保存；
d.细胞复苏：将冻存的细胞从液氮中取出，置于37℃水浴锅中融化，加入等体积的传代培养液，离心后细胞沉淀用传代培养液悬浮，转入细胞培养瓶中，于28℃培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原代培养液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数20％的胎牛血清、400IU/mL的青霉素、400IU/mL的链霉素、5ng/mL的碱性成纤维生长因子和10ng/mL的I型胰岛素样生长因子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的传代培养液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数15％-20％的胎牛血清、100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的冻存液为：DMEM/F12基本培养基中添加终浓度为体积分数20％的胎牛血清和10％的二甲基亚砜；所述的PBS漂洗液为：PBS溶液中添加终浓度为400IU/mL的青霉素和终浓度为400IU/mL的链霉素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的切碎胚胎组织，是用无菌手术刀切碎成1mm3以内的小块。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的胰蛋白酶消化细胞，是用体积分数0.25％胰蛋白酶室温消化3-5分钟，至显微镜下观察不到明显的大组织团块。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b的胰蛋白酶消化细胞后进行传代培养，是用体积分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，当显微镜下观察到一半细胞收缩并开始变圆后，添加培养液，充分悬浮细胞后进行传代。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的细胞用冻存液重悬的浓度为1×106个/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c的程序降温，是将冻存管置于程序降温盒中，于-80℃放置24小时。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的海马为线纹海马。
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| 张卓然: "《培养细胞学与细胞培养技术》", 31 August 2004 * |
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