CN103585179A - 一种药物组合物及其在制备治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物组合物，其药效成分由表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）与CD34⁺造血干细胞（HSCs）组成。本发明构建了腺病毒表达载体，分别表达SDF-1、HOXB4及其融合蛋白SDF-1/HOXB4，观察表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞联合脐血CD34⁺干细胞共移植对辐射损伤小鼠的影响，结果表明表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）联合脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）共移植能促进造血重建及植入，提高移植成功率。

Description

一种药物组合物及其在制备治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种药物组合物，特别是一种治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物。

背景技术

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）移植是治疗血液病、恶性实体瘤放化疗引起的骨髓造血功能障碍以及多种缺血性贫血的有效方法之一（Borhane G;Mickie B.Transplantation of human hematopoietic repopulating cells:mechanisms of regeneration anddifferentiation using human-mouse xenografts.Current Opinion in Organ Transplantation.2008;13(1):44-52.）。但移植后HSCs归巢率低，且自我增殖能力有限，成为制约骨髓造血重建的瓶颈问题。近年来，随着人们对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的基础和临床研究进展，很多研究证实MSCs与HSCs联合移植能促进造血干细胞的植入和造血重建（Fliedner TM,Powles R,Sirohi B,et al.Radiologic and nuclear events:the METREPOLseverity of effect grading system.Blood.2008;111(12):5757-8；Isern J,Martin-Antonio B,Ghazanfari R,et al.Self-Renewing Human Bone Marrow Mesenspheres Promote HematopoieticStem Cell Expansion.LID-S2211-1247(13)00165-4[pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041[doi].Cell Rep.2013；Isern J,Martin-Antonio B,Ghazanfari R,et al.Self-Renewing Human BoneMarrow Mesenspheres Promote Hematopoietic Stem Cell Expansion.LID-S2211-1247(13)00165-4[pii]LID-10.1016/j.celrep.2013.03.041[doi].Cell Rep.2013；贾新涛,穆媛媛,贾潇潇等.人脐血CD34⁺细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统[J].第三军医大学学报,2011,33(11);1136-1140.）。MSCs作为造血微环境主要细胞成分能选择性粘附并支持HSCs增殖和迁移（Le Blanc K,Samuelsson H,Gustafsson B,et al.Transplantation of mesenchymal stemcells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells.Leukemia.2007;21(8):1733-8），在这个过程中趋化因子SDF-1及其受体CXCR4对HSCs的归巢和植入起到了重要的调节的作用，MSCs高表达的SDF-1能介导HSCs增殖和迁移，吸引其向骨髓回归定植（Broxmeyer HE,Hangoc G,Cooper S,et al.AMD3100 and CD26 modulate mobilization,engraftment,and survival ofhematopoietic stem and progenitor cells mediated by the SDF-1/CXCL12-CXCR4 axis.Ann N YAcad Sci.2007;1106:1-19.）。转录因子HOXB4对于调节HSCs自我更新与分化间的平衡起着重要作用，能够有效地增强HSCs自我更新能力（Lu SJ,Feng Q,Ivanova Y,et al.RecombinantHoxB4 Fusion Proteins Enhance Hematopoietic Differentiation of Human Embryonic Stem Cells.Stem Cells Dev.2007;16(4):547-60；Bonde S,Dowden AM,Chan KM,et al.HOXB4 but notBMP4 confers self-renewal properties to ES-derived hematopoietic progenitor cells.Transplantation.2008;86(12):1803-9；Tang Y,Chen J,Young NS.Expansion of haematopoieticstem cells from normal donors and bone marrow failure patients by recombinant hoxb4.Br JHaematol.2009;144(4):603-12.）。现有的研究结果提示通过转入融合基因的MSCs作为饲养层细胞，可以更加有效地在体外扩增脐血CD34⁺细胞，（张佩,陈婷婷,叶枫等.表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞对造血干细胞体外扩增及干性维持的作用.第三军医大学学报.2013.35（7）.589-594.）。但是HOXB4作为转录因子过高表达可能会对细胞其他生物学方面造成影响，提高HOXB4的表达水平可增强CD34⁺细胞的增殖和自我更新，与此同时也减弱了细胞的短期分化能力（钟波,叶枫,王涛等.不同活性的survivin基因启动子片段的克隆及鉴定[J].第三军医大学学报,2011,33(11):1115-1118；Bell E.Transplantation:Making space forHSCs.Nature Biotechnology.2008;8(1):4-5）。所以融合基因是否会对造血细胞自身特性或者分化能力造成影响，是否在体内还能发挥同样功能还需进一步探讨和研究。

发明内容

本发明兼顾了造血微环境重建过程中“趋化识别”和“自我更新”，将配体受体结合的特异性同干细胞移植治疗促进辐射后造血重建进行组合，构建了腺病毒表达载体，分别表达SDF-1、HOXB4及其融合蛋白SDF-1/HOXB4，观察表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞联合脐血CD34⁺干细胞共移植对辐射损伤小鼠的影响，结果表明表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）联合脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）共移植能促进造血重建及植入，提高移植成功率。

一种药物组合物，其药效成分由表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）与CD34⁺造血干细胞（HSCs）组成。

所述表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）与脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）的细胞用量比为8：1。

所述CD34⁺造血干细胞来源于脐血。

上述药物组合物在制备治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物中的应用。

所述骨髓造血功能障碍疾病由辐射引起。

本发明将表达SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4基因的3个腺病毒载体分别转染正常人骨髓MSCs，将其联合脐血CD34⁺细胞经尾静脉移植到辐射损伤的NOD/SCID小鼠体内(MSCs8×10⁵个细胞/只，CD34⁺1×10⁵个细胞/只)，分别为SDF-1/MSCs+CD34⁺组(SDF-1组)、HOXB4/MSCs+CD34⁺组（HOXB4组）、SDF1-HOXB4/MSCs+CD34⁺组（S-H组），另外3组为未转染MSCs+CD34⁺组（MSC-HSC组）、单纯CD34⁺组(HSC组)、单纯辐照组（IR组）。检测移植后各组小鼠存活率、外周血象恢复、骨髓病理变化及人源CD45⁺细胞植入率。结果表明SDF-1组、HOXB4组、S-H组造血受抑较IR组轻,恢复快,存活率较IR组高（P<0.05）。以S-H组促造血恢复作用显著加强，且在移植后6周CD45⁺细胞植入率（47.43±8.89％）较其余组高。这说明表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）联合脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）共移植能促进造血重建及植入,提高移植成功率。

附图说明

图1各组小鼠移植后不同时间骨髓组织病理学观察

其中：A-F分别为IR组、HSC组、MSC-HSC组、SDF-1组、HOXB4组、S-H组移植后第14天(×400)；G-K分别为HSC组、MSC-HSC组、SDF-1组、HOXB4组、S-H组移植后第21天(×400)

图2.各组小鼠骨髓CD45⁺细胞比例

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

材料与方法

1载体及试剂

分别表达SDF-1、HOXB4及其融合蛋白SDF-1/HOXB4的pAD-SDF-1-IRES-EGFP、pAD-HOXB4-IRES-EGFP、pAD-SDF-1-(GlySer)3-HOXB4-IRES-EGFP腺病毒载体由申请人构建，可以对外发放。构建方法见“张佩,陈婷婷,叶枫等.表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞对造血干细胞体外扩增及干性维持的作用.第三军医大学学报.2013.35（7）.589-594.”

培养基DMEM+10%胎牛血清购自Invitrogen公司，MACS磁性分离试剂盒购自Miltenyi公司，FITC标记的鼠抗人CD45及对照IgG2b、IgG1购自BD公司，淋巴细胞分离液TBD公司。

1.2实验动物及标本来源

NOD/SCID雌性小鼠118只,8～10周,体重约为18～22g,购自第三军医大学实验动物中心。人脐血取自本院妇产科健康孕妇足月顺产婴儿脐带,每人采集量60～90ml。骨髓取自本院血液科门诊骨髓检查无异常患者,每人采集2～4ml。所有标本采集均获医院伦理委员会批准和患者本人及家属同意。

1.3细胞分离和培养

骨髓间充质干细胞按密度梯度离心法分离，方法见（Jung S,Panchalingam KM,Rosenberg L.et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells in defined serum-free media［J］.StemCells International.Volume 2012(2012),doi:10.1155/2012/123030.钟波,叶枫,王涛等.不同活性的survivin基因启动子片段的克隆及鉴定[J].第三军医大学学报,2011,33(11):1115-1118.培养至第3代，0.25%胰酶消化后计数备用。将人脐血标本按照骨髓密度梯度离心法进行单个核细胞分离，利用MASC磁珠系统进行CD34⁺细胞纯化，细胞过柱2次备用。（上述细胞分离和培养的详细方法见“张佩,陈婷婷,叶枫等.表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞对造血干细胞体外扩增及干性维持的作用.第三军医大学学报.2013.35（7）.589-594.”）

1.4实验分组设计

所有小鼠接受60Coγ射线3.5Gy全身辐照,将小鼠按照完全随机设计每组各12只分为:①SDF-1/MSCs+CD34⁺组（SDF-1组）：辐照后12小时内经尾静脉分别输入SDF-1/MSCs(8×10⁵个细胞/只)、CD34⁺细胞(1×10⁵个细胞/只)；②HOXB4/MSCs+CD34⁺组（HOXB4组）：HOXB4/MSCs(8×10⁵个细胞/只)、CD34⁺细胞(1×10⁵个细胞/只)；③SDF1-HOXB4/MSCs+CD34⁺组（S-H组）：SDF1-HOXB4/MSCs(8×10⁵个细胞/只)、CD34⁺细胞(1×10⁵个细胞/只)；④普通MSCs+CD34⁺组（MSC-HSC组）：未转染MSCs(8×10⁵个细胞/只)、CD34⁺细胞(1×10⁵个细胞/只)；⑤单纯CD34⁺组（HSC组）：CD34+细胞(1×10⁵个细胞/只)；⑥单纯辐照组（IR组）,0.3ml生理盐水。

1.5动态观察小鼠一般状况及血象、骨髓组织恢复情况

每日观察各组小鼠(n=12)外表、活动力、饮食、排粪等情况并测量体质量,记录各组存活率。于移植后第7、14、21、28天各组小鼠行断尾采血,测定白细胞、血红蛋白和血小板水平。第14、28天各组分别脱颈处死小鼠2只,行瑞氏染色观察骨髓细胞学学变化。

1.6流式细胞仪检测小鼠人源CD45⁺细胞植入率

于移植后第6周脱颈处死一只小鼠，生理盐水冲出小鼠胫骨、股骨骨髓。制备单细胞悬液，裂解红细胞后,用鼠抗人FITC标记的CD45抗体与细胞悬液避光孵育,PBS洗涤后流式检测。

1.7统计学处理

计量资料以表示,采用SPSS 21.0统计软件分析，各时间点血液指标比较采用单因素方差分析,方差齐性事后检验采用SNK方法分析，方差不齐事后检验采用Games-Howell方法分析。各组存活率比较采用卡方检验。检验水平P<0.05具有统计学意义。

2结果

1一般状况观察及小鼠存活率

各组小鼠在照射后24h均出现被毛凌乱、活动减少、拒食,以后体重逐渐下降。至照后21d时，IR组小鼠全部死亡。移植各组小鼠在移植后7～10d，活动、进食及饮水量逐渐增加,体质量开始恢复。至第14天,各组小鼠存活率差异有统计学意义(P<0.05，表1)。其中，S-H组（100％）、SDF-1组（83％）、HOXB4组（75％）与IR组（25％）小鼠存活率差异有统计学意义，并且S-H组与HSC组、MSC-HSC组差异有统计学意义（P<0.05，表2）。至第28天，各组小鼠死亡率差异仍有统计学意义(P<0.05，表1)，其中S-H组、SDF-1组、HOXB4组分别与IR组、HSC组小鼠存活率差异有统计学意义，并且S-H组与MSC-HSC组小鼠存活率差异有统计学意义（P<0.05，表2）。

表1各组小鼠存活率比较

表2各组小鼠存活率两两间比较

2.2外周血血象检测

各组小鼠外周血WBC与PLT在照射24小时后急剧下降,第7～10天进入抑制期。除IR组一直处于较低水平外，各组小鼠外周血WBC与PLT均在移植后14d左右开始回升。S-H组与SDF-1组WBC恢复较其余各组时间缩短，在21d基本恢复正常；MSC-HSC组与HOXB4组WBC则在28d基本恢复正常，而HSC组在28d尚未完全恢复正常(表3)。除S-H组在移植后第28d外周血PLT恢复正常外，其余各组小鼠在28d均未完全恢复正常（表4）。各组小鼠外周血HGB在照射后第8～12d进入抑制期。IR组一直维持在较低水平，其余各组小鼠外周血HGB在移植后第18d左右开始有所回升，除S-H组在移植后第28d恢复正常外，其余各组小鼠在28d均未完全恢复正常（表5）。

表3各组小鼠移植后不同时相点外周血WBC的比较(n=5,x±s)

表4各组小鼠移植后不同时相点外周血HGB的比较(n=5,x±s)

表5各组小鼠移植后不同时相点外周血PLT的比较(n=5,x±s)

——：动物死亡未检测到数据；a,vs正常组,P<0.05；b，vsIR组,P<0.05;

2.3骨髓组织病理学观察

移植后第14天，IR组骨髓片为油状外观，呈多部位增生减低，造血细胞明显减少，分类以髓系为主，骨髓小粒呈空架状粗网结构，细胞稀少（图1A）；其余各组均有不同程度造血恢复,骨髓有核细胞增生活跃、比例增加,SDF-1组、HOXB4组和S-H组恢复程度较好,骨小梁周围可见梭形基质细胞排列,以S-H组最为明显(图1B-F)。至移植后第21天,HSC组、MSC-HSC组、SDF-1组及HOXB4组均尚未完全恢复正常,有效造血面积低于S-H组(图1G-J);而S-H组骨髓增生明显活跃,有核细胞呈簇状密布于骨髓腔内,形成多个新生造血灶,巨核细胞大量可见(图1K)。

2.4小鼠体内人特异性CD45⁺细胞检测

移植后第6周SDF-1组、HOXB4组及S-H组CD45⁺细胞百分率明显高于HSC组、MSC-HSC组，并且S-H组（47.43±8.89％）高于SDF-1组、HOXB4组(表6，图2)。

表6各组小鼠骨髓CD45⁺细胞比例

结论

在本申请用SDF-1、HOXB4和SDF-1/HOXB4融合蛋白的腺病毒表达载体转染正常人骨髓MSCs，将其联合脐血CD34⁺干细胞经尾静脉共移植到辐射损伤的小鼠体内,然后对比观察对辐照损伤小鼠造血重建的影响。结果表明,移植后第14天,S-H组、SDF-1组、HOXB4组与IR组小鼠存活率差异有统计学意义，并且S-H组与HSC组、MSC-HSC组差异有统计学意义（P<0.05，表2）。移植后第28天，S-H组、SDF-1组、HOXB4组分别与IR组、HSC组小鼠存活率差异具有统计学意义，并且S-H组与MSC-HSC组小鼠存活率差异有统计学意义（P<0.05，表2）。表明S-H组、SDF-1组、HOXB4组能增加辐照小鼠的存活率，且比HSC组小鼠存活率高，而S-H组小鼠存活率比MSC-HSC组高。除IR组一直处于较低水平外，各组小鼠外周血WBC与PLT均在移植后14d左右开始回升。其中S-H组与SDF-1组WBC恢复较其他各组快，S-H在21d基本恢复正常,MSC-HSC组与HOXB4组WBC则在28d基本恢复正常，而HSC组在28d尚未完全恢复正常。其中S-H组在移植后第28d外周血PLT恢复正常，其余各组小鼠在28d均未完全恢复正常。各组小鼠外周血HGB在移植后第18d左右开始有所回升，其中S-H组在移植后第28d恢复正常，其余各组小鼠在28d均未完全恢复正常。结合骨髓变化提示,S-H组、SDF-1组、HOXB4组小鼠外周血象受抑及骨髓组织受损程度减轻,恢复较快,尤以S-H组最明显。S-H组可能有助于临床移植后受体血象及骨髓象恢复,这提示我们所设计的SDF-1/HOXB4融合蛋白与CD34⁺干细胞对促进患者造血功能的恢复有协同作用。

CD45⁺细胞为人源性造血细胞特有标记,可区别于鼠源性细胞作为检测造血细胞植入的重要指标。我们在移植后第6周流式检测骨髓CD45⁺细胞百分率,S-H组小鼠骨髓中CD45⁺细胞百分率明显高于其余各组（47.43±8.89％）,提示S-H组在移植后对造血细胞植入具有促进作用,引导造血干细胞在小鼠体内向骨髓归巢。

综上所述,本实验结果证实表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）联合脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）共移植能促进造血重建及植入,提高移植成功率。

Claims (5)

1.一种药物组合物，其药效成分由表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）与CD34⁺造血干细胞（HSCs）组成。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述表达SDF-1/HOXB4融合基因的间充质干细胞（MSCs）与脐血CD34⁺造血干细胞（HSCs）的细胞用量比为8：1。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，所述CD34⁺造血干细胞来源于脐血。

4.权利要求1至3任一所述的药物组合物在制备治疗骨髓造血功能障碍疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述骨髓造血功能障碍疾病由辐射引起。

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