CN110291400A

CN110291400A - 侧流装置

Info

Publication number: CN110291400A
Application number: CN201880008975.5A
Authority: CN
Inventors: W·斯特朗; C·T·麦基
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2038-01-23
Also published as: EP3574323A1; US20180217140A1; CN110291400B; EP3574323A4; WO2018140379A1; US10883987B2

Abstract

提供了用于进行侧流试验的侧流装置，方法和试剂盒。

Description

侧流装置

本申请要求2017年1月27日提交的美国临时申请62/451,501的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

生物科学中经常使用检测固定的分析物的方法。例如，常规印迹(例如，Southern、Northern、Western、Far Western、Eastern、真空、Middle Eastern、Eastern-Western和Far-Eastern印迹等)可用于检测固定在基材或膜上或基质中的分析物(例如，在琼脂糖或丙烯酰胺中)。一般而言，这类印迹技术涉及固定待检测的分析物和使分析物接触结合剂(例如，抗体)。印迹也通常在固定和最终检测之间包括多个洗涤步骤和/或封闭步骤。这类洗涤和封闭步骤消耗了实施者有限的时间和/或试剂，并且可以是误差和不可再现性的来源。

发明内容

本文提供了侧流试验装置及使用这类装置的方法。

在一个实施方式中，所述侧流装置包括含有多孔材料的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于接触基材(例如，Western印迹)的平面区域，所述基材包含固定的分析物(例如蛋白质)；并且其中，所述芯吸垫具有第一端，第二端和两个侧边缘；粘合到芯吸垫的第一平面的支撑层；粘合到芯吸垫的第二平面的顶层，顶层包括在空间上彼此分开的两个或更多个贮存器，其中每个贮存器的纵轴垂直于芯吸垫的侧边缘，其中每个贮存器与芯吸垫的第一端流体连通，并且其中每个贮存器包括孔，溶液通过该孔从贮存器释放；和泵，包括位于芯吸垫的第二端上的吸收垫。

在一些实施方式中，芯吸垫还包括被疏水或不可渗透的阻隔彼此分开的两个或更多个区域，所述阻隔平行于芯吸垫的侧边缘。在一些实施方式中，芯吸垫的边缘用防水材料或热封密封。在某些实施方式中，防水材料选自丙烯酸，蜡和光聚合物。

在某些实施方式中，顶层还包括第一开口，基材通过该第一开口与贮存器下游的芯吸垫的平面区域接触。在一些实施方式中，顶层还包括第二开口，泵通过该第二开口与在第一开口下游的芯吸垫的第二平面接触。在一些实施方式中，顶层包括开口，基材通过该开口与平面区域接触，并且泵通过该开口与平面区域下游的芯吸垫接触。

在一些实施方式中，孔是狭槽。在一些实施方式中，贮存器包括在侧向流动装置的宽度轴上在空间上彼此分离并且彼此相邻的两组或更多组贮存器。在一些实施方式中，每个贮存器跨越芯吸垫的宽度。在一些实施方式中，至少第一贮存器与至少第二贮存器共用壁。

在一些实施方式中，支撑层和顶层由液体不可渗透的材料形成。在某些实施方式中，液体不可渗透的材料选自聚丙烯，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯和二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯。

在一些实施方式中，分析物是蛋白质。

还提供了进行侧流试验的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供如上文或本文其他地方所述的侧流装置；可选地将运行缓冲液施加于芯吸垫；将包含蛋白质的基材(例如Western印迹)施加于平面区域以供基材的接触；从最靠近平面区域的贮存器开始，将不同的试剂溶液施加到每个贮存器上以供基材的施加；并且允许试剂溶液从贮存器侧流到泵，使得试剂溶液中的每种试剂在芯吸垫中依次运输并与基材上的蛋白质接触。

在一些实施方式中，将不同的试剂溶液依次或同时施加于贮存器。

在一些实施方式中，允许侧流的步骤包括使来自第一贮存器中的第一试剂溶液的一抗与基材上的靶蛋白(如果存在)结合，然后使来自第二贮存器中的第二试剂溶液的第一洗涤溶液从基材上除去未结合的一抗。在一些实施方式中，允许侧流的步骤还包括使来自第三贮存器中的第三试剂溶液的二抗或第二检测试剂接触与基材上的靶蛋白(如果存在)结合的一抗。在一些实施方式中，允许侧流的步骤还包括使来自第四贮存器中的第四试剂溶液的第二洗涤溶液从基材去除未结合的二抗。

在一些实施方式中，第二洗涤溶液的体积是具有二抗的第三试剂溶液的体积的至少两倍。在某些实施方式中，该方法进一步包括在一抗与靶蛋白(如果存在)结合，任选地在二抗或第二检测试剂与一抗接触后，任选地移出基材，并检测一抗与靶蛋白(如果存在)的结合。

在某些实施方式中，该方法还包括向泵施加基本均匀的压力。

还提供了用于进行侧流的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包含上述或本文其它地方所述的侧流装置。在一些实施方式中，所述试剂盒包括多个用作泵的吸收垫，所有这些都在本文中描述。在一些实施方式中，试剂盒包括以待被最终用户施用于贮存器的溶液的形式而提供的试剂(例如，包括标记的一抗或一抗和二抗的结合剂、洗涤溶液和/或运行缓冲液)。在某些实施方式中，将一些或所有试剂在与装置的每个贮存器流体连通的芯吸垫的部分中干燥到芯吸垫上。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于进行侧流的运行缓冲液，并且任选地包括封闭剂(例如，牛血清白蛋白、脱脂奶粉或酪蛋白)、表面活性剂(例如，吐温20或曲通X-100)、本文所述的蛋白质聚集改性剂、大分子拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、密度剂和/或促进试剂均匀流动和/或促进对基材上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。另外的试剂可以以固体或液体形式提供在试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。

附图说明

图1A和1B分别是根据一个实施方式的侧流装置的示意性截面侧视图和俯视图。该装置包括四个贮存器，其依次将试剂溶液运输到芯吸垫，该芯吸垫粘合到支撑件和四个贮存器。所示装置在贮存器下游的顶层中具有两个开口。

图2A和2B分别是图1A和1B所示装置的示意性截面侧视图和俯视图，其中基材和泵与芯吸垫紧密接触。通过第一开口将基材施加到芯吸垫上，并且通过第一开口下游的第二开口将泵施加到芯吸垫上。

图3A，3B和3C是根据一个实施方式的侧流装置的示意性截面侧视图和俯视图。在该实施方式中，顶层部分地覆盖芯吸垫，即，唯具有贮存器的顶层的部分覆盖并粘合到芯吸垫。在贮存器的下游，即在其上施加基材和泵的平面区域中不存在顶层。图3A显示了具有与芯吸垫紧密接触的泵和基材的装置。图3B和3C显示了没有施加到芯吸垫的泵或基材的装置。

图4是根据一个实施方式的侧流装置的示意性俯视图，该侧流装置具有多组贮存器，使得可以同时分析多个基材。所示装置具有多个基材，其与多组贮存器下游的芯吸垫紧密接触。该装置还显示带泵，其与基材下游的芯吸垫紧密接触。

图5是根据一个实施方式的侧流装置的示意性俯视图，该侧流装置具有多组贮存器，使得可以同时分析多个基材。在该实施方式中，芯吸垫包括被疏水或不可渗透的阻隔彼此分开的两个或更多个区域，所述阻隔平行于芯吸垫的侧边缘。所示装置具有多个基材，其与处于多组贮存器下游且被阻隔彼此分开的芯吸垫紧密接触。该装置还显示带泵，其与基材下游的芯吸垫紧密接触。

图6A和6B是使用图1A-2B的侧流装置并如实施例1中所述的免疫印迹结果。

具体实施方式

本文描述了侧流装置和使用这类装置的方法，其允许使用特异性结合剂(例如抗体)对固定在基材(例如Western印迹膜)或芯吸垫(例如诊断应用)上的分析物(例如蛋白质，核酸)进行高效侧流检测。本文描述的装置和方法还允许对由固定在基材上的特异性结合剂捕获的分析物进行高效侧流检测。已经发现了侧流装置和使用这种装置的方法，其将不同溶液(例如，具有一种或多种分析物的样品、特异性结合剂、运行缓冲液、洗涤溶液)依次地且免手动地递送到与其上固定有分析物或结合剂的基材紧密接触的芯吸垫。将溶液从粘合到侧流装置的芯吸垫的至少两个贮存器依次运输到芯吸垫。在一些实施方式中，本文所述装置可以装配在一次性使用装置中，从而允许经济实惠且简单的试验模式。

I.定义

术语“分析物”是指生物分子，例如，蛋白质、核酸、多糖、脂质、抗原、生长因子、半抗原等或其部分。可在表面(如膜或芯吸垫)上可逆或不可逆地固定分析物并如本文所述检测。

术语“固定的”或“嵌入的”可互换地指可逆或不可逆地固定的分子(例如，分析物或结合剂)。在一些实施方式中，可逆固定的分子以允许分子或其部分(例如，这些分子的至少25％、50％、60％、75％、80％或更多)从其固定的位置上移去而没有明显变性或聚集的方式固定。例如，使含有分子的溶液与吸收材料接触，从而吸取溶液并可逆地固定分子，由此使分子可逆地固定在吸收材料(例如吸收垫)中或吸收材料上。然后可通过从吸收材料芯吸溶液，或将溶液从吸收材料的一个区芯吸到另一个区来移去可逆固定的分子。在一些情况中，将含分子的溶液与吸收材料接触，从而吸取溶液，然后干燥含溶液的吸收材料，由此将分子可逆地固定在吸收材料上。然后可使吸收材料接触相同或不同组成的另一种溶液，从而使可逆固定的分子溶解，然后从吸收材料中芯吸溶液或将溶液从吸收材料的一个区芯吸到另一个区，由此来移去可逆固定的分子。

固定不可逆固定的分子(例如，结合剂或分析物)使得在温和条件(例如，约4-9的pH，约4～65℃的温度)下它们不被或基本不被从它们的位置上移去。示例性的不可逆固定的分子包括通过标准印迹技术(例如，电印迹)与硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜膜结合的蛋白质分析物或结合剂。其他示例性的不可逆固定的分子包括与玻璃，塑料(例如，微阵列、微流体芯片、玻璃组织学载玻片或具有孔并且孔中具有结合的蛋白质分析物的塑料微量滴定板)，颗粒，纳米颗粒或磁性颗粒结合的蛋白质分析物或结合剂。

术语“结合剂”是指特异性结合分子(如分析物)的物质。尽管抗体在本文的许多内容中描述，应当理解的是，如用户所优选，可以使用其它的结合试剂而不是抗体。本领域已知多种结合剂，包括抗体、适体、粘合素(affimer)、脂质运载蛋白(如抗运载蛋白(anticalin))、硫氧还蛋白A、胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。其他结合剂包括但不限于生物素/链霉亲和素，螯合剂，色谱树脂，亲和标签或官能化珠，纳米颗粒和磁性颗粒。

术语“特异性结合”是指分子(例如，结合剂如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比非靶标化合物高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。

术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的骨架区的多肽或其片段，其特异性结合并识别抗原，例如，特定分析物。通常，“可变区”包含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和性是至关重要的。参见Paul，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(2003)。抗体包括例如嵌合的、人的、人源化的抗体，或单链抗体。

示例性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特异性抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)′₂，Fab本身是由二硫键接合到V_H-C_H1的轻链。可在温和条件下还原F(ab′)₂以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab′)₂二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体本质上是附带有部分绞链区的Fab(参见《基础免疫学》(FundamentalImmunology)，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。

在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，约“5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。

II.装置

图1-5显示了用于检测基材上的分析物，用于检测与基材上的结合剂结合的分析物，或用于检测与芯吸垫上的结合剂结合的分析物的侧流装置的实施方式。

参照图1A-2B，侧流装置100包括芯吸垫102，该芯吸垫102具有第一端104、第二端106、两个侧边缘108，以及平面区域110，其用于接触包含待检测的固定的分析物或蛋白质(例如Western印迹，斑点印迹)的基材112(例如膜)。侧流装置100还包括支撑层114和顶层116。支撑层114粘合到芯吸垫102的第一平面118。顶层116粘合到芯吸垫102的第二平面120。因此，芯吸垫102被夹在(例如，被层压)在支撑层114和顶层116之间。顶层116部分地覆盖并粘合到芯吸垫102并且在侧流装置100使用期间防止流体蒸发。在一些实施方式中，顶层116在边缘上粘合到支撑层114。

顶层116的一端包括在空间上彼此分开的两个或更多个贮存器122。在一些实施方式中，每个贮存器的纵轴垂直于芯吸垫102的侧边缘108，使得每个贮存器垂直于侧流的方向定向。贮存器122(例如，R1，R2，R3和R4)位于平面区域110的上游的芯吸垫102的第一端104处或其附近，用于接触基材112。如本文所用，“附近”定义不超过距离芯吸垫102的第一端104的长度的10％，20％，30％，40％或50％。每个贮存器122与芯吸垫102的第一端104流体连通(即，当存在于贮存器122中时，液体可以从每个贮存器122流入芯吸垫102)。贮存器122将液体(例如，缓冲液和检测试剂)依次供应到芯吸垫102并进入平面区域110以施加基材112。芯吸垫102的平面区域110位于贮存器122的下游并且位于泵124的上游(即，在贮存器122和泵124之间)。

如图1A-3C所示，贮存器122包括一组四个贮存器。在一些实施方式中(图4和5)，贮存器包括两组或更多组贮存器440，540，贮存器在空间上彼此分开(例如，由壁或一段距离分开)，使得可以一次分析多个基材。在一些实施方式中，贮存器组440，540在侧流装置400，500的宽度轴上彼此相邻。贮存器组440，540被布置成以并排关系彼此平行地延伸。每组贮存器在功能上独立于相邻的一组贮存器。

再参见图1A-3C，每个贮存器122由垂直于液体流定向的第一壁126和第二壁128界定。每个贮存器进一步由两个端壁130界定。在某些实施方式中，贮存器共用壁。例如，第一贮存器R1的第二壁可以是第二贮存器R2的第一壁。在顶层116的制造期间，贮存器122可以是预先模制的，或者可以是单独制造的，然后直接粘合到顶层116。

贮存器122可以是任何尺寸和形状。在一些实施方式中，每个贮存器122包括长度L1，宽度W1和深度D1。在一些实施方式中，每个贮存器在至少一个维度上为至少约0.5，1.0，8.5，13.5，20cm或更多。在一些情况下，每个贮存器122的长度L1和宽度W1比深度D1大至少约2倍，3倍，5倍，10倍，100倍或更多。在一些实施方式中，每个贮存器的尺寸设计成与芯吸垫102的宽度匹配，并且具有比宽度W1大至少约3倍，4倍，5倍，6倍，8倍，10倍，13倍，17倍，20倍，27倍或更大的长度L1。每个贮存器的示例性尺寸包括但不限于宽度W1和长度L1分别为约0.5cm×0.5cm，0.5cm×1cm，0.5cm×8.5cm，1×3cm，3cm×3cm，2.5cm×约8.5cm，1cm×10cm，3cm×10cm，2cm×13.5cm，3×13.5cm，1cm×15cm，3cm×15cm，或3.5cm×20cm。如本文所用，“宽度W1”是基于流动方向并且是最短尺寸。在一些实施方式中，每个贮存器的宽度W1为3cm，长度L1为10cm。在一些情况下，每个试剂贮存器的宽度W1为1±0.5，1，2或3cm，长度L1为10±0.5cm或15±0.5cm。在一些情况下，至少一个贮存器的深度D1为约0.5cm，约1cm，约2cm或约3cm。每个贮存器122包括孔132(例如，狭槽)，溶液通过该孔从贮存器释放并进入芯吸垫102。在孔132是狭槽的实施例中，狭槽可以具有范围从约0.1mm到约5mm的宽度W2(例如，短尺寸)和范围从约0.5cm到约20cm的长度L2(例如，长尺寸)。在一些实施方式中，宽度W2为0.1mm，0.5mm，1mm，2mm，3mm，4mm或5mm。在某些实施方式中，长度L2为8.5cm，9cm，9.5cm，13.5cm，15cm或20cm。

每个贮存器122的体积可以由许多因素确定，包括但不限于贮存器122的尺寸和形状以及侧流装置100的构造。在一些实施方式中，每个贮存器的容量为至少约0.25毫升至约30毫升。在一些实施方式中，顶层116的厚度限定了贮存器的体积。在某些实施方式中，顶层116的厚度为3/8英寸或1/4英寸厚。

在一些实施方式中，顶层116还包括第一开口136，基材通过该第一开口与贮存器下游的芯吸垫的平面区域接触(图1A-2B)。在某些实施方式中，顶层116还包括第二开口138，泵通过该第二开口与在第一开口136下游的芯吸垫的第二平面接触。在一些实施方式中(图3A-3C)，顶层116部分地覆盖芯吸垫，即，只有贮存器覆盖并粘合到芯吸垫上。在某些实施方式中，在贮存器的下游，即在其上施加基材和泵的平面区域中不存在顶层。在一些实施方式中，顶层116包括在贮存器下游的开口，并且开口具有足够的尺寸以适应将基材112和泵124两者施加到芯吸垫102。

泵124位于芯吸垫102的第二端106上或附近，并且与芯吸垫102紧密接触。干泵124通过从贮存器122经芯吸垫102芯吸液体而用作排水道。

芯吸垫102的平面区域110可包括图形/标记或有关使用者应该放置基材112的位置或粘合剂固定在芯吸垫中/上的位置的其它指示。或者，图形/标记可以在装置的支撑层上。

芯吸垫102具有宽度、长度和高度(例如厚度)。芯吸垫102可以是任何尺寸和形状。在某些实施方式中，芯吸垫102的至少一部分(例如，用于施加基材112的平面区域110)是平面的。在一些情况中，芯吸垫102的长度和宽度比高度(即，厚度)大至少约2倍、5倍、10倍、100倍或更多。

芯吸垫的示例性尺寸包括，但不限于，芯吸垫在至少一个维度上为至少约0.25cm、0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、10cm、12cm、15cm、20cm、25cm、30cm或更大。在一些情况下，芯吸垫102的长度为20±0.5，1，2，3，4，5，6，9或10cm(在流动方向上)，宽度为10±0.5，1，2，3，4，5，6，7，8或9cm。

芯吸垫102是吸收材料。在一些实施方式中，芯吸垫102设置成具有高溶液容量和侧流流速。在一些情况中，通过具有基本高度(例如，厚度)的芯吸垫102来提供高溶液容量和侧流流速。在一些情况中，芯吸垫102的厚度为约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或约0.2mm。在一些情况中，芯吸垫102的厚度在约0.05mm至约0.5mm之间。

在一些实施方式中，芯吸垫102还包括被疏水或不可渗透的阻隔542彼此分开的一个或更多个区域，所述阻隔平行于芯吸垫的边缘(图5)。阻隔542抑制，消除或基本上消除芯吸垫中相邻区域之间的流体连通(例如，流体流动)，并允许同时处理多个基材。疏水阻隔包括但不限于蜡阻隔，或由芯吸垫的蒸汽或液相硅烷化产生的阻隔。可以形成不可渗透的阻隔的示例性材料包括但不限于蜡，塑料，聚合物和树脂。在一些实施方式中，每个区域具有其自己的泵124。

用于形成蜡阻隔的蜡可以是在温度升高时可流动且在室温(例如，约20～25℃)下不可流动的任何蜡。示例是石蜡、微结晶蜡、热固性蜡、动物蜡(如蜂蜡、羊毛脂和牛油)、植物蜡(如大豆蜡、巴西棕榈蜡、坎台里蜡和棕榈蜡)、矿物蜡(如纯地蜡和褐煤蜡)、石油蜡和合成蜡(如烯键式聚合物、氯化萘和费-托蜡(Fischer-Tropsch wax))。除了正链烷烃和异链烷烃之外，石蜡组合物可以含有少量的环烷烃或烯烃，或两者。可用的蜡包括在约60℃至约150℃，或约75℃至约125℃的温度范围内变得可流动(即具有熔点)的蜡。表现出这种方式的蜡制剂和组合物是本领域技术人员已知的。

用于形成疏水阻隔的硅烷化试剂可以是与多孔基材或其部分发生反应的任意硅烷化试剂。例如，如果多孔基材含有纤维素，则可以使用使纤维素主链的羟基硅烷化的硅烷化试剂。示例性的硅烷化试剂包括但不限于三甲基氯硅烷，三甲基硅烷或六甲基二硅氮烷。硅烷化试剂还包括三乙氧基硅烷(R--Si(C₂HSO)₃)，其中R是例如乙烯基，甲基丙烯酰基，氨基丙基，氟代烷基或硫代乙基。其他合适的硅烷化试剂对于本领域技术人员来说是显而易见的。聚合物可与硅烷基团反应以产生不可渗透的阻隔。

可向多孔基材的一侧或两侧施加蜡或其它阻隔形成试剂(例如，硅烷化试剂或不可透过阻隔)，虽然在大多数情况中，向一侧施加将足够使得多孔基材透过、或使透过(例如，通过施加后的熔化)，多孔基材在一定程度上足以用作液体流动的阻隔。可以液体施加阻隔形成试剂。液体可以通过手动或其他装置施加。在某些情况下，将液体喷射或倒在多孔基材上。喷涂可以用喷墨打印机或类似设备完成。在一些情况下，该液体在施涂后硬化以形成不可透过和/或疏水阻隔。替代地，可以气体施加阻隔形成试剂。例如，硅烷化试剂，蜡，塑料，树脂或聚合物可以蒸汽形式施加，其凝结在多孔基材上或与多孔基材反应。替代地，可以施加固体形式的阻隔形成试剂。例如，蜡可以手动或以自动或机械方式作为固体施加。在一些情况中，掩蔽多孔基材以保护各区免于接触阻隔形成试剂，并且阻隔形成试剂与多孔基材接触。

蜡的施涂可通过手(使用常规的蜡笔(crayon)或蜡钢笔(wax pen))或通过蜡印刷机(wax printer)实现。蜡钢笔是本领域已知的且通常包括具有含有热蜡的容器、喷嘴和把手的外壳。通过倾倒外壳以使液化的蜡通过喷口来实现热蜡的施加，并且外壳配备有阀以阻止蜡在印刷线的末端流动。

蜡印刷机同样是本领域已知的且通常通过使用印刷头的热转移印刷来运行，该印刷头包括非常小的加热元件阵列，其受软件控制独立激活以对蜡进行局部加热至高于其熔点，从而将蜡释放至印刷介质。市售可得的蜡打印机的示例包括Phaser 8560DN(日本富士施乐有限公司(Fuii Xerox，Ltd.))和CALCOMP COLORMASTER PLUS热蜡转移打印机(CalComp图形有限公司(CalComp Graphics，LLC)，美国加利福尼亚州福特希尔牧场(Foothill Ranch))。蜡印刷机及其用途的描述可参见Kroon(泰克公司(Tektronix，Inc.))的美国专利号5,957,593(1999年9月28日)；Lin(施乐公司(Xerox Corporation))的美国专利号8,206,664(2012年6月26日)；Lu，Y.，等，“Rapid prototyping of paper-basedmicrofluidics with wax for low-cost，portable bioassay(用于低成本便携式生物试验的使用蜡的纸基微流体快速原型制作)”Electrophoresis 2009，30，1497-1500；以及Carrilho，E.，等，“Understanding Wax Printing：A Simple Micropatterning Processfor Paper-Based Microfluidics(理解蜡印刷机：用于纸基微流体的简单微成像过程)”Anal.Chem.，2009，81(16)，7091-7095。施涂的蜡线宽度(加热前)可变化并且在本发明中不重要，前提是该线中蜡的含量足以透过多孔基材并对多孔基材内流体的侧流形成阻隔。

在一些实施方式中，一旦施涂，即可通过将蜡加热至其熔点以上来使蜡透过多孔基材的厚度以填充孔或空隙并对水性流体流动形成侧向阻隔。在一些情况下，所施加的蜡的量将使得熔融蜡完全渗透芯吸垫的厚度，同时熔融蜡的侧流(即，在平行于片材的平坦面的方向上)最小或至少限于沿着施加的蜡线的长度基本均匀的小距离，使得由蜡阻隔界定的所得区域是已知的和受控制的。以这种方式形成阻隔也可以通过加热程度来控制，包括加热蜡的温度和继续加热的时间长度。通过常规试验和误差可以很容易地确定最佳温度和持续时间，但在大多数情况下，通过加热至高于蜡熔点至少5℃，并且在许多情况下，高于蜡熔点约5至约50℃，或高于熔点约10至约30℃，可获得可用的结果。最适当的加热时间取决于温度，温度越高所需时间越短。通常，约15秒至约20分钟(或在许多情况下为约30秒至约10分钟)的加热时间可提供有用的结果。加热可以通过常规方法实现，包括辐射加热，传导加热，对流加热，脉冲加热和微波加热。可用加热板或常规烘箱那么简单的设备来实现有效结果。

疏水或不可透过阻隔的最佳宽度可根据以阻隔为边界的区域大小以及多孔基材的厚度变化，且可容易地通过常规测试确定。在大多数情况下，宽度范围为约10微米至约5毫米，约30微米至约3毫米，约100微米至约1毫米，或约200微米至约5毫米，或10毫米。

在一些实施方式中(例如，诊断测定实施方式)，芯吸垫102在一个或多个部分中(例如，在贮存器下游的一个或多个部分中)具有固定或嵌入其中的一种或多种试剂(例如，结合剂，例如抗体)。嵌入的试剂通常被嵌入或结合并干燥到芯吸垫中，使得试剂在流体流动期间保持不动或使得试剂不动，直到在侧流下与水性流体前沿接触并且在用户定义的事件下释放。这些部分可以是打印的试剂线或点。

由于存在多个孔或空隙，芯吸垫102通常具有大的表面积。大表面积可以增加芯吸垫102对一种或多种试剂或一种或多种含有试剂的溶液的负载能力。在一些实施方式中，芯吸垫102具有至少约0.001m²/g、0.02m²/g、0.1m²/g、0.5m²/g、1m²/g、10m²/g或更高的通过标准技术测得的比表面积。

在一些实施方式中，芯吸垫102可具有特定孔径，特定平均孔径或特定孔径范围。例如，芯吸垫102可包含0.1μm的孔、0.2μm的孔、0.45μm的孔，或1、2、4、5、6、7、8、10、15、20μm的孔，或大于约20μm的孔。又例如，芯吸垫102可含有平均大小0.1、0.2、0.45、1、2、4、5、6、7、8、10、15或20μm或更大的孔。再例如，芯吸垫102可含有大小范围约0.1-8μm、0.2-8μm、0.45-8μm、1-8μm、0.1-4μm、0.1-2μm、0.1-1μm、0.1-0.45μm、0.2-8μm、0.2-4μm、0.2-2μm、0.2-1μm、0.2-0.45μm、0.45-8μm、0.45-4μm、0.45-2μm、0.45-1μm的孔。一些情况中，芯吸垫102可含有小于约20μm的孔。例如，芯吸垫102可以包含其中至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的尺寸小于约20、15、10或5μm的材料。一些情况中，芯吸垫102中的孔足够大，能够容纳平均大小(例如，约1nm)的一个或多个蛋白质。例如，孔的尺寸可以是至少1nm、至少5nm，至少10、100或500nm。或者，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的尺寸可以大于1、5、10、50、100或500nm。如本文所用，孔径可按半径或直径测定。在一些情况中，芯吸垫102包含多孔聚乙烯，例如孔径为0.2至20微米，或1至12微米的多孔聚乙烯。芯吸垫102可以在垫的不同区域中具有不同的孔径。例如，芯吸垫102可具有侧流区域，该侧流区域具有不同的孔径或孔径范围。在一些实施方式中，选择孔径以控制流速。例如，较大的孔径将允许更快的流速。在一些情况下，芯吸垫(例如，玻璃纤维或纤维素)包含空隙，空隙可由材料保留的颗粒尺寸和/或流速(例如，水流动4厘米所花费的时间)限定。

在实施方式中，芯吸垫102的边缘具有防水密封件139(参见图1A，2A，3A和3B)。密封件139由防水材料或热密封件形成，以防止液体在侧流期间从边缘泄漏。可用于密封芯吸垫边缘的示例性防水材料包括但不限于丙烯酸类(例如指甲油)，蜡和光聚合物。

可对芯吸垫102进行处理或官能化以最小化非特异性试剂结合、增加侧流、增加芯吸，或者减少蛋白质聚集。例如，可处理芯吸垫102或其部分以改变受处理区域的亲水性或疏水性。在一些情况中，改变芯吸垫102的亲水性或疏水性可在芯吸垫湿时增加结合剂加载量、减少结合剂聚集或变性、产生掩蔽区(其中排除或不加载结合剂)，或引导结合剂流动。在一些情况中，芯吸垫含有如本文所述的蛋白质聚集改性剂。

芯吸垫102和泵通常由吸水材料形成，并且可以由例如天然纤维、合成纤维、玻璃纤维或其混合物制成。非限制性实例包括硝酸纤维素，棉，玻璃及其组合。包括但不限于阿尔斯通公司(Ahlstrom)、GE公司、PALL公司、密理博公司(Millipore)、萨托瑞斯公司(Sartorius)、S&S公司的供应商有许多用于诊断用途的市售材料。

泵由具有液体吸收能力的材料形成，其吸收能力显著大于芯吸垫102并且允许比通过芯吸垫102更快的流体流速。在一些实施方式中，泵由一个或多个吸收垫(例如，吸水材料)形成。

吸水材料可包括但不限于含聚合物的材料。聚合物可以是聚合物珠、聚合物膜或聚合物整料的形式。一些情况中，聚合物是纤维素。含纤维素的垫包括纸、布、织造或非织造纤维素基材。布垫包括含有天然纤维素纤维如棉或羊毛的那些。纸垫包括含有天然纤维素纤维(例如，纤维素或再生纤维素)的那些以及含有纤维素纤维衍生物的那些，所述衍生物包括但不限于：纤维素酯(例如，硝化纤维素，乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸-丙酸纤维素、乙酸-丁酸纤维素和硫酸纤维素)，和纤维素醚(例如，甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)。一些情况中，纤维素垫含有人造丝。一些情况中，垫是纸，例如各种纸。

吸水材料还可包括但不限于烧结材料。例如，吸水材料可含有烧结玻璃、烧结聚合物或烧结金属，或它们的组合。在一些情况中，通过烧结一种或多种粉状玻璃、粉状聚合物或粉状金属来形成烧结材料。其它情况中，通过烧结一种或多种玻璃、金属或聚合物纤维来形成烧结材料。其它情况中，由烧结一种或多种玻璃、聚合物或金属珠来形成烧结材料。

吸水材料还可含有但不限于一种或多种非纤维素聚合物，例如合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物。例如，材料可含有聚酯，例如聚乙交酯、聚乳酸、聚己内酯、聚己二酸乙二醇酯、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸1，3-丙二酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、一些情况中，聚合物是纺粘的，例如纺粘聚酯。

其它合成聚合物包括但不限于：尼龙、聚丙烯、聚乙烯(polyethylene)、聚苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯聚合物(polyvinyl)、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、聚丙烯酰胺、(C₂-C₆)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C₁-C₆)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C₁-C₆)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰氨基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C₁-C₆)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物、丙烯腈或前述任意物质的混合物。

基材112通常是平面形状的，并且可以是例如由硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜形成的膜。可以形成基材112的其他材料包括但不限于玻璃、塑料、硅、金属和/或金属氧化物，其是裸露的或被聚合物官能化的。可以形成基材112的塑料材料包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和/或聚碳酸酯。用于对由塑料，剥离，金属或金属氧化物形成的基材的表面进行官能化的聚合物的实例包括环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷；聚-L-赖氨酸；聚凝胺；聚乙二醇聚合物；葡聚糖聚合物；氨基丙基硅烷；羧基硅烷(caroxysilane)；水凝胶和聚合物刷；和/或例如官能化烷基硫醇、树枝状聚合物或寡核苷酸的自组装单层。

将支撑层和顶层的全部或部分粘合到芯吸垫的示例性粘合方法包括但不限于粘合剂粘合，热粘合和有机溶剂粘合，其伴或不伴有压力。在使用粘合剂的实施方式中，粘合剂的性质可能影响试验性能(即，流动特性，试剂稳定性等)并且可以针对所需试验或应用优化。在一些实施方式中，粘合剂可以是装置100的支撑层的一部分。示例性粘合剂包括但不限于喷涂粘合剂，紫外光固化粘合剂或压敏粘合剂。

在一些实施方式中，支撑层和/或顶层由液体不可渗透的材料(例如，塑料)形成，包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯，二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚丙烯，聚苯乙烯和聚碳酸酯。支撑层和/或顶层可以是例如真空或注塑或以其他方式构造的。

A.示例性的检测试剂

i.结合剂

本文描述结合剂用于检测分析物。在一些情况中，结合剂是抗体(例如，一抗或二抗)。一抗可用于结合分析物。在一些情况中，一抗经标记使得能够检测一抗并因此检测分析物。在一些情况中，通过结合至标记的二级结合剂，如标记的二抗来检测一抗。在一些情况中，使用三级结合剂来检测含有分析物和一级结合剂以及二级结合剂的复合物。

可以在一种或多种试剂溶液中提供结合剂。试剂溶液可含有一种或多种如本文所述的缓冲剂，盐，密度剂或蛋白质聚集改性剂。密度剂可用于调节试剂溶液的粘度，这将调节溶液流出贮存器的速率。在每种试剂溶液中具有密度剂还可以增强例如固定在基材上的分析物和结合剂(例如抗体)之间的结合相互作用。密度剂的例子包括但不限于甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和聚乙二醇。结合剂可在溶液中储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。

还可以在芯吸垫上或芯吸垫中提供粘合剂。例如，粘合剂的线或点可以固定在贮存器下游的芯吸垫中/上(例如，在平面区域110中)。在一些实施方式中，第一结合剂是用于检测的可逆固定的标记的第一一抗(例如，一抗偶联物)，第二结合剂是用于捕获的不可逆地固定的未标记的第二一抗(例如，“测试”一抗)，并且第三结合剂是与第一一抗结合的对照抗体。对照抗体可用于评估测定有效性。在某些实施方式中，标记的第一一抗与第二一抗配对，并且两种抗体结合分析物上的不同表位，使得分析物(如果存在的话)在侧流试验期间夹在第一一抗和第二一抗之间。在一些实施方式中，将多对配对的第一和第二一抗固定在芯吸垫上，以允许多重检测样品中的分析物。

在一些情况下，与一个或多个贮存器中的流体流体连通的芯吸垫的平面区域包含在其上干燥的一种或多种结合剂剂。可以通过使芯吸垫的平面区域与水性溶液接触来重建干燥的结合剂。在一些情况中，水性重构缓冲剂可含有一种或多种再润湿试剂，包括本文所述的盐、缓冲剂或蛋白质聚集改性剂。在一些情况下，结合剂可在芯吸垫中干燥或基本干燥地储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。

ii.标记物

可通过检测与结合剂连接的标记物来检测分析物。该标记物可直接连接至结合剂(例如，通过与一抗的共价键或其它键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中，各标记物(如连接至第一结合剂的第一标记物、连接至第二结合剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记物生成的第一信号、第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中，两种或更多种结合剂标记物包含相同类型的试剂(例如第一标记物为第一荧光剂且第二标记物为第二荧光剂)。在一些实施方式中，两种或更多种结合剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。

可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物、胶体金、电化学标记物及其组合。在一些实施方式中，标记物可包括光学试剂，如生色团、荧光剂、磷光剂、化学发光剂或电化学发光剂。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，The Handbook—AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。生色团包括具有可检测吸光度的辅酶或辅因子。一些情况中，可通过检测肽键在例如220nm处的固有吸光度或280nm处的复合氨基酸吸光度来检测结合试剂。

荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子或各种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫属吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、二氢卟酚类、萘菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPY^TM和BODIPY^TM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料，DyLight染料或IRDye。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自例如英杰/分子探针公司(Invitrogen/MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市)，皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology，Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)，和Licor生物科学公司(Licor Biosciences)(内布拉斯加州林肯)的那些。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有光学试剂如荧光剂(例如第一结合剂标记有第一荧光标记物，第二结合剂标记有第二荧光标记物等)，且通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测标记有光学试剂的各结合试剂。在一些实施方式中，该第二荧光标记物淬灭第一荧光标记物生成的荧光信号。在一些实施方式中，第一和第二荧光标记物是荧光共振能量转移(FRET)对的成员。术语“荧光共振能量转移”或“FRET”是指在至少两个发色团，供体发色团和受体发色团之间的能量转移。通常在FRET中，如果供体和受体足够接近，当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体将其能量转移到受体。受体可以以不同波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。合适的FRET对(供体/受体)包括但不限于EDANS/荧光素，IAEDANS/荧光素，荧光素/四甲基罗丹明，荧光素/LC Red 640，荧光素/Cy 5，荧光素/Cy5.5，和荧光素/LC Red705。

在一些实施方式中，所有结合剂都标记有光学试剂，且带有光学试剂标记的各结合试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。

在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：²²⁵Ac、⁷²As、²¹¹At、¹¹B、¹²⁸Ba、²¹²Bi、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹⁴C、¹⁰⁹Cd、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、³H、¹⁶⁶Ho、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P、²¹²Pb、¹⁰³Pd、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁴⁷Sc、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、^99mTc、⁸⁸Y和⁹⁰Y。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有放射性同位素(例如第一结合剂标记有第一放射性同位素，第二结合剂标记有第二放射性同位素等)，且标记有放射性同位素的各结合剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如，一种结合剂可标记有γ发射子，而一种结合剂可标记有β发射子。或者，这些结合剂可标记有以不同的能量发射相同粒子(例如，α、β或γ)的放射性核素，其中不同的能量是可区分的。在一些实施方式中，所有结合剂都标记有放射性同位素，且各标记的结合剂可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。

在一些实施方式中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测结合剂。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物，或者与化学发光底物(例如，来自生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)的Clarity)联用，其产生可检测的光。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸酯联用，其产生在405nm处易测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，其产生在410nm可测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。在一些情况下，酶作用于荧光底物以产生可检测的荧光产物。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有酶(例如第一结合剂标记有第一酶，第二结合剂标记有第二酶等)，且标记有酶的各结合剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中，所有结合剂都标记有酶，且带有酶标记的各结合剂都通过检测该酶生成的产物来测得。

在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。

在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)、DNA-RNA杂交体、或人工核酸类似物(例如LNA，PNA)。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些情况下，核酸标记物是扩增的核酸(例如，通过PCR或通过等温聚合酶延伸)。在一些情况下，使用聚合酶，逆转录酶，连接酶或其他作用于核酸(例如，荧光修饰的核苷酸，生物素-核苷酸，洋地黄毒苷-核苷酸，半抗原核苷酸)的酶将一种或多种标记物掺入核酸标记物中。在一些实施方式中，将核酸标记物连接至另一种标记物(例如，核酸)以产生可检测的产物(例如，邻近连接测定法)。

在一些实施方式中，该标记物是核酸条码。如本文所用“条码”是专一限定标记的分子或标记的结合剂上结合的第二分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。条码序列的长度决定了可以对多少独特的样品进行区分。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于4⁴即256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标引不多于65,536个不同样品。本领域熟知条码技术的应用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等，“Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependentbias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码最小化序列依赖性偏置和扩增噪音)”，PNAS(2012年1月24日)；109(4)：1347-52；和Smith，AM等，“Highly-multiplexed barcode sequencing：anefficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重条码测序：一种对集中的样品平行分析的高效方法)”，Nucleic Acids Research(2010年7月)；38(13)：e142。

在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的叠氮化物和炔的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40：2004-2021(2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如带荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。

连接可检测标记物与结合剂如蛋白质(例如，抗体)的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques：Theory and Practice(《生物化学技术：理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(WavelandPress，Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland，Excited StatesofBiopolymers(《生物聚合物的激发态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；Fluorogenic Probe Design and Synthesis：A Technical Guide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman，Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)(1996)。

在一些实施方式中，两种或更多标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号在所述多种标记物缺失其一或其中多个时不会生成。例如，在一些实施方式中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示标记物(并因此指示各带标记的蛋白质)的存在。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如，Maeda等，JBiolumin Chemilumin 1989，4：140-148。

B.蛋白质聚集改性剂

本文描述了蛋白质聚集改性剂。可采用蛋白质聚集改性剂来减少或消除在试剂溶液或芯吸垫102中储存或从中递送的结合剂如蛋白质(例如，抗体)的聚集或变性。例如，蛋白聚集改性剂可用来减少或消除在试剂溶液或芯吸垫102中储存或从中递送的一抗的聚集或变性。在一些情况中，蛋白质聚集改性剂可用于促进结合剂在芯吸垫102的侧流区域110中的侧流或减少基材112上的背景。

在一些情况中，作用为将蛋白质置换出气水界面并由此保护蛋白质免于变性和聚集的那些蛋白质聚集改性剂对于减少固定在芯吸垫102上的结合剂的聚集特别有效。在其他情况中，蛋白质聚集改性剂通过与结合剂结合和/或稳定结合剂而直接影响结合剂的稳定性。在其他情况中，蛋白聚集改性剂的作用为使平衡移离变性或解折叠状态并由此减少聚集。例如，在一些情况中，由于结合剂的酰胺主链和蛋白聚集改性剂之间的强烈排斥，热力学上不利于(disfavored)蛋白质聚集改性剂和结合剂之间的相互作用。因此，蛋白聚集改性剂存在时不利于结合剂的解折叠，因为解折叠将更多酰胺主链表面暴露于蛋白聚集改性剂。

蛋白质聚集改性剂可以是以下一种或多种：环糊精、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改性蛋白质、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。

环糊精可以是但不限于：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-羟基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰基β-环糊精、琥珀酰基α-环糊精、琥珀酰基β-环糊精、琥珀酰基γ-环糊精、(2，3，6-三-O-苯甲酰基)-β-环糊精、琥珀酰基-(2-羟丙基)-β-环糊精或琥珀酰基-(2-羟丙基)-γ-环糊精。环糊精也可以是含有一种或多种前述环糊精分子的环糊精聚合物。其他环糊精是本领域已知的且包括例如万维网cyclodextrin.com上描述的那些。环糊精的示例性浓度是但不限于约1mM、2mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。

非离子型表面活性剂可以是聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-聚丙二醇(polyethylene-polypropylene glycols)或聚氧乙烯-硬脂酸酯。聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯可以是聚乙烯(20)-去水山梨糖醇酯(Tween 20^TM)或聚氧乙烯(20)-去水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80^TM)。聚乙二醇-聚丙二醇可以是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如以商品名或Poloxamer^TM售卖的那些。聚氧乙烯-硬脂酸酯可以是例如以商标Myrj^TM售卖的那些。示例性的聚氧乙烯单月桂基醚包括以商标Brij^TM售卖的那些，例如Brij-35。非离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。

离子型表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。可用于本发明的阴离子型表面活性剂可以是但不限于皂，包括碱金属皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的钠、钾或铵盐，如硬脂酸钠。其他阴离子型表面活性剂包括有机胺皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的有机胺盐，如三乙醇胺硬脂酸盐。可用于本发明的阳离子型表面活性剂包括但不限于铵盐，如十八烷基氯化铵或季铵化合物，如苯扎氯铵。离子型表面活性剂可包括烷基硫酸的钠、钾或铵盐，如十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。

两性离子型表面活性剂具有与同一分子相连的阳离子和阴离子中心。例如，阳离子部分是基于伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子。阴离子部分可以是磺酸根，如CHAPS(3[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)中那样。其它阴离子基团有磺基甜菜碱类，示例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱，或甜菜碱类，例如椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。两性离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。

非去污剂磺基甜菜碱(NDSB)具有无法聚集形成胶束的短疏水性基团和磺基甜菜碱亲水性基团，因此不认为NDSB是去污剂。示例性的NDSB包括但不限于NDSB 256、NDSB221、NDSB 211、NDSB 201、NDSB 195、3-(4-叔丁基-1-吡啶并)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐，3-(苄基二甲基铵基)丙磺酸盐或二甲基乙基丙磺酸铵。NDSB的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。

多元醇是具有多个羟基官能团的化合物。一些情况中，多元醇可通过多种机理改变蛋白质的聚集或变性行为。例如，一些情况中，多元醇会通过给出热力学上不利的与蛋白主链的相互作用来使平衡移向折叠状态。或者，一些情况中，多元醇可与蛋白质的折叠状态结合并使其稳定。

多元醇可以是简单糖，例如：蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖或海藻糖。多元醇也可以是多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉或含有一种或多种本文所述简单糖的聚合物。甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物，以及它们的组合也是示例性多元醇。

有机溶剂可以是但不限于已知抑制一种或多种蛋白质的变性、解折叠或聚集的那些有机溶剂。本领域已知多种合适的有机溶剂。例如，有机溶剂可包括乙醇、丁醇、丙醇、苯酚、二甲基甲酰胺、2-甲基-2，4-戊二醇、2，3-丁二醇、1，2-丙二醇、1，6-己二醇或二甲基亚砜。

聚集改性蛋白质可以是本领域已知能抑制一种或多种蛋白质变性、解折叠或聚集的蛋白质。示例性的聚集改性蛋白质包括但不限于白蛋白、蛋白质伴侣和热休克蛋白。白蛋白是水溶性、在浓盐溶液中中度可溶并经受热变性的蛋白。示例性白蛋白包括血清白蛋白(例如牛、马或人血清白蛋白)或卵白蛋白(例如，鸡蛋白蛋白)。其他示例性聚集改性蛋白质包括酪蛋白、明胶、泛素、溶菌酶或胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。LEA蛋白包括LEA I、LEAII、LEA III、LEA IV、LEA V或非典型LEA蛋白。LEA蛋白是本领域已知的并描述于例如GoyalK.等，Biochemical Journal 288(第1部分)，151-57，(2005)。

蛋白质聚集改性剂也可以是氨基酸。在一些情况中，氨基酸可起氧化还原作用来为固定在基材112上的蛋白质维持适当的氧化电位。合适的氧化还原氨基酸包括半胱氨酸和胱氨酸。其它氨基酸通过非氧化还原方法起到减少变性或聚集的作用。例如，精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸已证明能减少蛋白质聚集。

可用其它氧化还原剂来减少蛋白质聚集。可用半胱氨酸和胱氨酸以外的氧化还原剂来优化蛋白质固定于其上的基材112中的还原电位。示例性的氧化还原剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物及其氧化衍生物，以及Cu²⁺。

蛋白质聚集改性剂还可以包括冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。在一些情况中，蛋白质聚集改性剂是离液剂，例如脲、硫脲、胍盐、氰酸盐、硫氰酸盐、三甲基铵、四甲基铵、铯、铷、硝酸盐、乙酸盐、碘化物、溴化物、三氯乙酸盐或高氯酸盐。在某些条件下，如在低浓度下，离液剂可减少蛋白质聚集。其它蛋白质聚集改性剂包括三甲基胺N-氧化物。

蛋白质聚集改性剂可以是盐。示例性盐包括但不限于盐酸、硫酸或磷酸的钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。蛋白质聚集改性剂也可以是缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、TAPSO、MES、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSO、MOPS、MOPSO或磷酸钠或磷酸钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙酸钠或乙酸钾、或硼酸钠或硼酸钾缓冲剂。

蛋白质聚集改性剂可以以任何合适浓度提供。一些情况中，以含有结合剂和蛋白质聚集改性剂的水溶液形式提供蛋白质。在这种情况下，溶液可以与芯吸层接触，并任选地干燥。水性结合剂溶液中蛋白质聚集改性剂的示例性浓度包括但不限于溶液的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、10％、20％或约25％或更多w/v。其他的示例性浓度包括但不限于约1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、300μM、500μM、750μM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM和1M。

在一些情况中，在试剂溶液中提供蛋白质聚集改性剂。含有蛋白质聚集改性剂的示例性组合物含有约0.001重量％、0.005重量％、0.01重量％、0.05重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％或约10重量％、20重量％或约25重量％的一种或多种蛋白质聚集改性剂。

蛋白质聚集改性剂可以以任何合适的组合提供。例如，在一些情况中，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种前述蛋白质聚集改性剂来减少固定于芯吸垫上的结合试剂的聚集。在一些情况中，在使芯吸垫接触结合剂溶液之前，芯吸垫含有蛋白质聚集改性剂，并且结合剂溶液含有相同或不同的蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使芯吸垫接触结合剂溶液之前，芯吸垫含有蛋白质聚集改性剂，并且结合剂溶液不含蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使芯吸垫与结合剂溶液接触之前，结合试剂溶液含有蛋白质聚集改性剂，而芯吸垫或待接触的区域不含蛋白质聚集改性剂。

方法

提供了使用本文描述的装置进行侧流试验的方法。在一个实施方式中，该方法包括使在芯吸垫102之内或之上具有固定的分析物或结合剂的基材112(例如，Western印迹)与例如，侧流缓冲液接触，所述基材112可以预先润湿提供或可以由用户预先润湿。在一些实施方式中(图1A-5)，基材112通过顶层116中的贮存器下游和泵124上游的开口面朝下放置在芯吸垫102上(例如，在贮存器和泵之间或在芯吸垫102的平面区域110中)。

接下来，将不同的试剂溶液施加到每个贮存器，从最靠近区域110的第一贮存器R1开始，用于接触基材112。试剂溶液可以依次或同时施加到贮存器上。试剂溶液也可以任何顺序施加到贮存器。在一个实施方式中，将四种不同的试剂溶液(例如，一抗，第一洗涤溶液，二抗或二级检测试剂和第二洗涤溶液)施加于贮存器。在具有两组或更多组贮存器的实施方式中(图4和5)，取决于固定在基材112上的分析物或结合剂，将不同或相同组的四种试剂溶液施加到每组贮存器。

在一些实施方式中，将具有标记的一抗的第一试剂溶液施加于第一贮存器R1，并将具有第一洗涤溶液的第二试剂溶液施加于第二贮存器R2。在某些实施方式中，按以下顺序将四种不同的试剂溶液施加到贮存器：将具有一抗的第一试剂溶液施加到第一贮存器R1，将具有第一洗涤溶液的第二试剂溶液施加到第二贮存器R2，将具有二抗或二级检测试剂的第三试剂溶液施加到第三贮存器R3，并将具有第二洗涤溶液的第四试剂溶液施加到第四贮存器R4。在一些实施方式中，施加到贮存器的试剂溶液具有至少两倍体积的另一种试剂溶液。例如，第四贮存器R4中的第二洗涤溶液的体积可以是第三贮存器R3中的二抗的体积的至少两倍。在一些实施方式中，省略具有第二洗涤溶液的第四试剂溶液以使第三贮存器R3中的二抗或二级检测试剂有更多时间结合一抗。

在其中基材上具有固定的结合剂的实施方式中，将具有分析物的样品施加到第一贮存器R1，将第一洗涤溶液施加到第二贮存器R2，将二级检测试剂施加到第三贮存器R3并且，如果需要，将第二洗涤溶液施加到第四贮存器R4。

在其中没有基材112并且其中结合剂固定在贮存器下游的芯吸垫102的平面区域110上的线或点中的一些实施方式中，不同溶液(例如，样品或试剂溶液)施加至至少两个贮存器。在其中一系列标记的可逆固定的第一一抗(例如，一抗偶联物)，一系列未标记的不可逆固定的第二一抗(例如，测试一抗)，和一系列不可逆固定的结合一抗的对照抗体印刷到芯吸垫102的平面区域110上的一个实施方式中，将具有一种或多种分析物和任选的对照蛋白质的样品施加到第一贮存器R1并将洗涤溶液(例如，侧流缓冲液)施加到第二贮存器R2。在其中未标记的第二一抗和对照抗体不可逆地固定在吸水垫102的平面区域110上的一些实施方式中，将检测试剂(例如，标记的一抗)施加到第三贮存器R3，并且如果需要，将第二洗涤溶液施加到第四贮存器R4。

在分析物固定在贮存器下游的芯吸垫102的平面区域110上的线或点中的实施方式中，将标记的一抗施加到第一贮存器R1并将第一洗涤溶液施加到第二贮存器R2。如果需要，将第二检测试剂施加到第三贮存器R3，并将第二洗涤溶液施加到第四贮存器R4。

然后使试剂溶液和/或样品从贮存器依次流到芯吸垫102的平面区域110上。在一些情况下，用在每个试剂溶液中的一种或多种染料或指示剂目视监测每个试剂溶液离开贮存器122和进入/通过芯吸垫102的侧流(例如，过程)。

在具有固定在基材112上的分析物的实施方式中，通过从贮存器芯吸进入芯吸垫和干泵中，携带试剂(例如，一抗，第一洗涤溶液，并且如果需要，二抗和第二洗涤溶液)依次通过侧流与其上固定有蛋白质或分析物的基材112接触来推动试剂溶液。第一试剂溶液中的一抗在芯吸垫102中传输，接触基材112上的蛋白质或分析物，并且与基材112上的目标蛋白质或分析物(如果存在)结合。在一些实施方式中，试剂溶液/侧流缓冲液从贮存器到泵的侧流还允许第二试剂溶液中的第一洗涤溶液在芯吸垫102中运输，使得未结合的一抗从基材112移除。在某些实施方式中，试剂溶液/侧流缓冲液从贮存器到泵的侧流还允许第三试剂溶液中的二抗或第二检测试剂在芯吸垫102中运输并接触与基材112上的靶蛋白(如果存在)结合的一抗。在一些实施方式中，试剂溶液/侧流缓冲液从贮存器到泵的侧流还允许第四试剂溶液中的第二洗涤溶液在芯吸垫102中运输，使得未结合的二抗从基材112移除。在一些实施方式中，施加到芯吸垫102并在芯吸垫102中运输的第二洗涤溶液的体积是施加到芯吸垫102并在芯吸垫102中运输的二抗体积的两倍。

在结合剂固定在基材112上的实施方式中，通过从贮存器芯吸到芯吸垫和干泵中，在样品和试剂(例如，第一洗涤溶液，二级检测试剂和，如果需要的话，第二洗涤液)中携带分析物(和任选的对照蛋白)来推动样品和试剂溶液在试剂溶液中依次通过侧流与基材112接触。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液、血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)、痰液或唾液、组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体，转化的细胞、干细胞、粪便或尿液。在一些实施方式中，样品包括阳性对照蛋白，用于评估测定有效性或用于使测试信号在多个不同抗体区域上标准化。

在其中结合剂固定在贮存器下游的芯吸垫的区域110上的实施方式中，通过从贮存器芯吸到芯吸垫和干泵，样品和试剂(例如，第一洗涤溶液和，如果需要，二级检测试剂和第二洗涤溶液)中携带分析物来推动样品和试剂溶液依次通过侧流与区域110接触。

在一些实施方式中，在开始侧流之前或之后并且在侧流期间，向泵施加基本均匀的压力以改善泵与芯吸垫102的接触。例如，可以将重物放置在泵的顶部上以推进(urge)泵朝向芯吸垫102。

在一些实施方式中，一旦将试剂溶液施加到贮存器上就可以将盖子放置在装置上以使蒸发最小化并且向泵124施加均匀的压力。盖子可以松散地放置在装置的顶部上，然后带盖子的装置可以放入抽屉式容器中，其滑入盒子中。在将盖子放置在装置上或盖子位置之前，可以将海绵放置在泵上以帮助向泵施加均匀的压力。该过程需要最少的用户与耗材的交互。

在具有基材的一些实施方式中，在侧流期间，通过目测或使用检测器跟踪一抗与靶蛋白的结合(以及任选的二抗或第二检测试剂与一抗的接触)。在一些实施方式中，从侧流装置100移除基材，并检测一抗与靶蛋白(如果存在)的结合。在一些实施方式中，通过使用文中所述的可检测的部分和/或标记物来目测和/或检测与靶蛋白结合的抗体。通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素、电学、光学、化学或质谱技术来检测合适的标记物和/或部分。

在其中结合剂固定在芯吸垫的平面区域110上的实施方式中，通过目测或使用检测器跟踪在侧流期间分析物(如果存在)与第一一抗和第二一抗的结合(例如，检测夹在第一和第二一抗之间分析物)。在一些实施方式中，通过使用如本文所述的可检测部分和/或标记物，可视化和/或检测分析物与第一和第二一抗的结合。

本领域已知许多吸收吸水垫材料、芯吸垫材料和抗体施用材料，可以从其中进行选择，以控制体积，以控制系统的流速，以保证均匀的流动，并且以包括从贮存器完整地递送抗体/试剂。影响试剂/抗体递送时机的其他方法，例如在芯吸垫中使用曲折路径是可能的。此外，控制侧流过程的其它实施方式可以工程设计到支撑层中，其中表面可以包含倾斜区域以使用重力延缓或加速液体的流动。

图1-3A中所示的是消耗型装置，其容纳单个微型凝胶尺寸的膜。通常用户使用被称为中型印迹的膜进行Western印迹，所述中型印迹通常是2x宽的小型膜。在其它Western印迹应用中，用户可以将小型和/或中型膜切成更小的部分，其对应于用于蛋白质电泳和转移的原始凝胶的几条泳道(例如，图4)。因此，在一些实施方式中，可消耗侧流设备可以是适应小型或中型膜的尺寸。在其它实施方式中，可将单独的脊模塑于或以其它方式存在于可以放置膜部分的耗材的基部。在芯吸垫中具有疏水或不可渗透的阻隔(图5)的实施方式中，芯吸垫中的侧流区域的尺寸可以设计成适应微型和/或中型膜或已经切成较小部分的膜。

在侧流装置的其他实施方式中，可以将多种抗体混合并且加载到一个或多个贮存器中以促进对单一样品中靶标的多重检测。

IV.试剂盒

提供了用于根据本文描述的方法进行侧流试验的试剂盒。还提供了包含如本文所述的侧流装置的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含液体形式的试剂(例如，包括标记的一抗或一抗和二抗，洗涤溶液，和/或侧流缓冲液的结合剂)(例如，试剂溶液)，所述试剂通过终端用户施加至所述装置。在一些实施方式中，以浓缩形式提供溶液，例如5x或10x，其在使用前稀释。在一些实施方式中，试剂以固体形式提供，其在使用前用液体，例如，缓冲液重建。

在一些实施方式中，试剂盒包含封闭剂(例如，牛血清白蛋白和/或脱脂奶粉)、表面活性剂(例如，吐温20或曲通X-100)、如本文所述的蛋白质聚集改性剂、拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、用于控制粘度和流体流速的密度剂、和/或促进试剂均匀流动和/或促进对基材上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。另外的试剂可以作为固体(例如粉末)或液体形式(例如作为溶液)提供在试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。

IV.实施例

实施例1-从HeLa细胞裂解物中检测ERK1/2和β-联蛋白

该实施例说明了如图1A-2B中所示并且如本文所述的侧流装置用于进行Western印迹测定。

热层压(图6A)或压敏粘合剂(图6B)用于产生测试中使用的侧流层压材料。使用Scotch热层压袋(3M#TP3854-20)制造热密封装置，并且在第二种情况下使用透明聚丙烯片材保护器和压敏粘合剂(Lohmann GL187)。将开口切入袋/保护器的顶部片材中以形成用于引入试剂(priAb，Wash1，secAb，Wash2)，待探测的膜和侧流装置的干泵/排出口的接入点。对于贮存器，狭缝为1-4mm和9cm长，膜位置为9cm×8cm开口，并且泵为4.5×9cm开口。通过用丙烯酸聚合物(指甲油)涂抹几毫米的薄区域，沿着外边缘密封玻璃纤维芯吸垫(10cm×26cm)，以封闭玻璃纤维在这些区域中的空隙并防止流体流出芯吸垫的边缘。然后将密封的芯吸垫插入袋或保护袋中并与顶面上的开口对齐。在第一种情况下，将具有对准的芯吸垫的Scotch袋送入热层压装置中，以将袋的顶部和底部薄片在芯吸材料周围或芯吸材料上热密封；加热也将玻璃纤维粘合到袋上。在第二种情况下，将压敏粘合剂施加到顶部和底部塑料片保护材料上，然后将这些粘合剂施加到芯吸材料的顶面和底面上，包住它。对于贮存器，将矩形通孔切成3/8英寸的丙烯酸片，并将该丙烯酸块粘合到顶部塑料片上。

为了进行印迹处理，将一叠滤纸放在泵位置，通过填充贮存器并让溶液芯吸到泵上用侧流(LF)缓冲液(10mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.4，1％酪蛋白，0.1％吐温20)湿润吸湿垫，然后将膜以蛋白质面朝下装入膜区。将兔一抗(细胞信号技术公司(Cell SignalingTechnology))在LF缓冲液中以1∶1000稀释并加载(3ml)至R1中。然后将3ml LF缓冲液加载到R2，将3ml二抗山羊抗兔IgG-HRP(Bio-Rad STAR-208P)加载到R3并将12ml LF缓冲液加载到R4。约4小时后，移去膜，在水中洗涤2×3分钟，用Clarity化学发光底物(伯乐公司(Bio-Rad))检测。使用ChemiDoc MP成像仪(伯乐公司)对印迹进行成像，曝光时间为60秒。图6A和6B中的图像显示了对分析物的均匀和灵敏的检测。

结果显示本文所述的侧流装置可依次递送Western印迹试剂(例如，特异性结合剂、运行缓冲液、洗涤溶液)并且无需用户干预芯吸垫上的印迹。

本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims

1.一种侧流装置，其包括：

包含多孔材料的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于接触包含固定的分析物的基材的平面区域；并且

其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧边缘；

粘合到所述芯吸垫的第一平面的支撑层；

粘合到所述芯吸垫的第二平面的顶层，顶层包括在空间上彼此分开的两个或更多个贮存器，其中每个贮存器的纵轴垂直于所述芯吸垫的侧边缘，其中每个贮存器与所述芯吸垫的第一端流体连通，并且其中每个贮存器包括孔，溶液通过该孔从贮存器释放；和

泵，包括位于接触所述芯吸垫的第二端的吸收垫。

2.如权利要求1所述的装置，其中所述孔是狭槽。

3.如权利要求1或2所述的装置，其中所述贮存器包括在侧流装置的宽度轴上在空间上彼此分离并且彼此相邻的两组或更多组贮存器。

4.如权利要求3所述的装置，其中所述芯吸垫还包括被疏水或不可渗透的屏障彼此分开的两个或更多个区域，所述屏障平行于芯吸垫的侧边缘。

5.如权利要求1-4中任一项所述的装置，其中所述顶层还包括第一开口，基材通过所述第一开口与贮存器下游的芯吸垫的平面区域接触。

6.如权利要求5所述的装置，其中所述顶层还包括第二开口，泵通过该第二开口与在第一开口下游的芯吸垫的第二平面接触。

7.如权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述顶层包括开口，基材通过该开口与平面区域接触，并且泵通过该开口与平面区域下游的芯吸垫接触。

8.如权利要求1-7中任一项所述的装置，其中所述支撑层和所述顶层由液体不可渗透的材料形成。

9.如权利要求8所述的装置，其中所述液体不可渗透的材料选自聚丙烯，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯和二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯。

10.如权利要求1-9中任一项所述的装置，其中所述芯吸垫的边缘用防水材料或热封密封。

11.如权利要求10所述的装置，其中所述防水材料选自丙烯酸，蜡和光聚合物。

12.如权利要求1-11中任一项所述的装置，其中每个贮存器跨越所述芯吸垫的宽度。

13.如权利要求1-12中任一项所述的装置，其中至少第一贮存器与至少第二贮存器共用壁。

14.如权利要求1-13中任一项所述的装置，其中所述分析物是蛋白质。

15.一种用于侧流的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-14中任一项所述的装置。

16.一种进行侧流试验的方法，所述方法包括：

提供如权利要求1-14中任一项所述的装置；

任选地将侧流缓冲液施加至所述芯吸垫；

将包含蛋白质的基材施加至所述芯吸垫的平面区域；

从最靠近平面区域的贮存器开始，将不同的试剂溶液施加到每个贮存器上以施加基材；并且

使试剂溶液从贮存器侧流到泵，使得试剂溶液中的每种试剂在芯吸垫中依次运输并与基材上的蛋白质接触。

17.如权利要求16所述的方法，其中使发生侧流的步骤包括使来自第一贮存器中的第一试剂溶液的一抗与基材上如果存在的靶蛋白结合，然后使来自第二贮存器中的第二试剂溶液的第一洗涤溶液从基材上除去未结合的一抗。

18.如权利要求17所述的方法，其中使发生侧流的步骤还包括使来自第三贮存器中的第三试剂溶液的二抗或第二检测试剂接触与基材上如果存在的靶蛋白结合的一抗。

19.如权利要求18所述的方法，其中使发生侧流的步骤还包括使来自第四贮存器中的第四试剂溶液的第二洗涤溶液从基材上除去未结合的二抗。

20.如权利要求19所述的方法，其中第二洗涤溶液的体积是具有二抗的第三试剂溶液的体积的至少两倍。

21.如权利要求16-20任一项所述的方法，还包括将基本均匀的压力施加到泵。

22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，还包括在所述一抗与如果存在的靶蛋白结合后，以及任选地，二抗或二级检测试剂与一抗接触后，任选地去除基材，并检测所述一抗与如果存在的所述靶蛋白的结合。

23.如权利要求16-22中任一项所述的方法，其中将不同试剂溶液依次施加至贮存器。

24.如权利要求16-22中任一项所述的方法，其中将不同试剂溶液同时施加至贮存器。