CN109477835A - 侧流装置及使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于进行侧流Western印迹试验的侧流装置，方法和试剂盒。侧流装置包括：由多孔材料构成的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于施加包含固定的分析物的基材的区域，其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧边；第一储器，其包括位于芯吸垫的第一端上的多个试剂层的堆叠；第二储器，其包括位于芯吸垫的第二端上的吸收垫。

Description

侧流装置及使用方法
本申请要求2016年7月25日提交的美国临时申请62/366,496的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景
生物科学中经常使用检测固定的分析物的方法。例如，常规印迹(例如，Southern、Northern、Western、Far Western、Eastern、真空、Middle Eastern、Eastern-Western和Far-Eastern印迹等)可用于检测固定在基材或膜上或基质中(例如，在琼脂糖或丙烯酰胺中)的分析物。一般而言，这类印迹技术涉及固定待检测的分析物和使分析物接触结合试剂(例如，抗体)。印迹也通常在固定和最终检测之间包括多个洗涤步骤和/或封闭步骤。这类洗涤和封闭步骤消耗了实施者有限的时间和/或试剂，并且可以是误差和不可再现性的来源。
发明内容
本文提供了侧流装置及使用方法。
在一个实施方式中，所述装置包括：由多孔材料构成的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于施加包含固定的分析物(例如蛋白质)的基材的区域，其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧边；第一储器，其包括位于芯吸垫的第一端上的多个试剂层的堆叠；第二储器，其包括位于芯吸垫的第二端上的吸收垫。在一些实施方式中，多个试剂层中的每一层包含固定在吸收垫中的试剂。在一些实施方式中，每个试剂层包括涂覆或结合在一部分下表面上的薄阻挡层。在某些实施方式中，多个试剂层中的每一层包含在溶液中的试剂。在某些实施方式中，多个试剂层中的每一层包含密度剂。在一些实施方式中，密度剂选自下组：甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和聚乙二醇。在某些实施方式中，多个试剂层中的每一层在其中具有不同的试剂。
在多个试剂层中的每一层包含在溶液中的试剂的一些实施方式中，第一储器是圆筒或槽，其在第一端具有流体流量控制器以控制溶液从第一储器释放。在某些实施方式中，流体流量控制器是阀。在一些实施方式中，流体流量控制器是宽度在约0.5mm至约2mm范围内的狭缝。在一些实施方式中，狭缝的宽度为约0.5mm或约1mm。
在某些实施方式中，试剂层中的试剂选自下组：一抗、二抗、第一洗涤溶液和第二洗涤溶液。在一些实施方式中，多个试剂层从与芯吸垫接触的试剂层开始，包含具有一抗的第一试剂层、具有第一洗涤溶液的第二试剂层、具有二抗的第三试剂层和具有第二洗涤溶液的第四试剂层。在一些实施方式中，多个试剂层从第一储器的第一端处或附近的试剂层开始，包含具有一抗的第一试剂层、具有第一洗涤溶液的第二试剂层、具有二抗的第三试剂层和具有第二洗涤溶液的第四试剂层。在某些实施方式中，第四试剂层的厚度是第三试剂层的至少两倍。在一些实施方式中，第一储器具有包含第二洗涤溶液的第五试剂层。在某些实施方式中，第一储器中第二洗涤溶液的体积至少是二抗体积的两倍。
在多个试剂层中的每一层由吸收垫形成的实施方式中，第一试剂层的至少一部分与芯吸垫紧密接触。
在具有吸收试剂层的一些实施方式中，该装置密封在塑料外壳中。在一些实施方式中，塑料外壳包括模制的底部部分和密封于底部部分的平面盖子。在一些实施方式中，芯吸垫和储器是干燥的。在一些实施方式中，芯吸垫和第一储器中的至少一个是湿的。
在具有吸收试剂层的一些实施方式中，试剂层各自由选自下组的至少一种材料形成：棉、玻璃纤维、纤维素、纤维素纤维衍生物、烧结玻璃、烧结聚合物、烧结金属和合成聚合物。在某些实施方式中，合成聚合物选自下组：聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙烯、聚乙烯(polyethylene)、聚苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯聚合物(polyvinyl)、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、(C2-C6)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C1-C6)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰氨基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物和丙烯腈。
在一些实施方式中，基材选自下组：膜、玻璃、塑料、硅、金属和金属氧化物。在某些实施方式中，膜由至少一种选自下组的材料形成：硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙和聚砜。在一些实施方式中，塑料选自下组：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯。
还提供了进行侧流试验的方法。在第一储器由吸收试剂层组成的一些实施方式中，该方法包括：提供如上文或本文其他地方所述的侧流装置；将运行缓冲液施加于芯吸垫；将包含蛋白质(例如Western印迹)的基材施加到用于施加包含分析物的基材的区域；任选地用运行缓冲液润湿第一储器；并且允许运行缓冲液从第一储器侧流到第二储器，使得多个试剂层中的试剂在芯吸垫中依次输送并与基材上的蛋白质接触。在一些实施方式中，允许的侧流步骤包括允许试剂在流过第一储器并进入芯吸垫时沿着弯曲路径行进。
在装置被密封在塑料外壳中并且该塑料外壳包括底部部分和密封到底部部分的盖子的一些实施方式中，所述方法还包括移除盖子并将运行缓冲液和基材施加到芯吸垫上，随后将盖子放在底部部分上，以允许从第一储器到第二储器的侧流。
在第一储器由堆叠的含试剂溶液组成的一些实施方式中，该方法包括：提供如上文或本文其他地方所述的侧流装置；任选地将运行缓冲液施加于芯吸垫；将包含蛋白质(例如Western印迹)的基材施加到用于施加包含分析物的基材的区域；允许多个试剂层从第一储器侧流到第二储器，使得多个试剂在芯吸垫中依次输送并与基材上的蛋白质接触。
在一些实施方式中，所述方法还包括允许运行缓冲液或溶液从第一储器侧流到第二储器，使得来自第一试剂层的一抗与其靶蛋白(如果存在于基材上)结合，随后允许来自第二试剂层的第一洗涤溶液从基材上除去未结合的一抗。在一些实施方式中，所述方法还包括允许运行缓冲液或溶液从第一储器侧流到第二储器，使得来自第三试剂层的二抗或第二检测试剂可以接触与基材上的其靶蛋白(如果存在)结合的一抗。在一些实施方式中，所述方法还包括允许运行缓冲液或溶液从第一储器侧流到第二储器，使得来自第四试剂层的第二洗涤溶液可以将未结合的二抗从基材上除去。
在某些实施方式中，该方法还包括向第一储器施加基本均匀的压力。在一些实施方式中，该方法还包括向第一和第二储器施加基本均匀的压力。
在一些实施方式中，该方法还包括在一抗与靶蛋白(如果存在)结合后(以及任选地，二抗或第二检测试剂与一抗接触后)，去除膜并且检测一抗与靶蛋白(如果存在)的结合。
还提供了用于进行侧流的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括多个吸收垫，用于形成第一和第二储器以及芯吸垫，所有这些都在本文中进行了描述。在一些实施方式中，试剂盒包括作为被最终用户施用于吸收试剂层的溶液而提供的试剂(例如，包括标记的一抗或一抗和二抗的结合试剂、洗涤溶液和/或运行缓冲液)。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个吸收试剂层，每个吸收试剂层具有可逆地结合在其中的试剂。在某些实施方式中，将一些或所有试剂干燥到吸收试剂层上。在一些实施方式中，在一种或多种蛋白质聚集改性剂的存在下，将一些或所有试剂干燥到吸收试剂层或其部分上。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于进行侧流的运行缓冲液，并且任选地包括封闭剂(例如，牛血清白蛋白、脱脂奶粉或酪蛋白)、表面活性剂(例如，吐温20或曲通X-100)、本文所述的蛋白质聚集改性剂、大分子拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、和/或促进试剂均匀流动和/或促进对基材上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。另外的试剂可以以固体或液体形式提供在试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。
附图简要说明
图1描绘了根据一个实施方式的侧流装置的侧视图。侧流装置包括具有多个试剂层的堆叠的第一储器。每个试剂层是具有固定在其中的试剂的吸收垫。
图2A和2B描绘了根据一个实施方式的侧流装置。在图2A中，在外壳的塑料模制底部部分中示出该装置。在图2B中，在具有具备附接的盖子的塑料模制底部部分的外壳中示出该装置。图2B还显示了装置的芯吸垫上的Western印迹膜。
图3描绘了根据一个实施方式的侧流装置的第一储器，其中每个试剂层是包含在第一储器(例如圆筒)中的溶液。第一储器的第一端具有流体流量控制器(例如，阀)以控制溶液从第一储器的释放。
图4A-4C分别描绘了根据一个实施方式的侧流装置的第一储器的侧视图、俯视图和仰视图，其中每个试剂层是包含在第一储器(例如槽)中的溶液。
图4C描绘了第一储器的第一端，其具有流体流量控制器(例如，狭缝)以控制溶液从第一储器的释放。
图5描绘了根据一个实施方式的侧流装置的侧视图。侧流装置包括具有多个试剂层的堆叠的第一储器。每个试剂层具有粘合或涂覆在下表面的一部分上的阻挡层。阻挡层控制溶液通过试剂层的流动。
图6A-10显示了使用图1–2B的侧流装置的免疫印迹结果。
具体实施方式
本文描述了侧流装置和使用这种装置的方法，其允许使用特异性结合试剂(例如抗体)有效地侧流检测固定在基材(例如Western印迹膜)上的蛋白质。已经发现了侧流装置和使用这种装置的方法，其将不同试剂(例如，特异性结合试剂、运行缓冲液、洗涤溶液)依次地且免手动地递送到与其上具有蛋白质的基材紧密接触的芯吸垫。在一些实施方式中，本文所述装置可以装配在单次使用外壳中，从而允许经济实惠且简单的试验模式。
I.定义
术语“分析物”是指生物分子，例如，蛋白质、核酸、多糖、脂质、抗原、生长因子、半抗原等或其部分。可在表面(如膜)上不可逆地固定分析物并检测，如本文所述。
术语“固定的”或“嵌入的”可互换地指可逆或不可逆地固定的分子(例如，结合试剂或分析物)。可逆固定的分子以允许分子或其部分(例如，这些分子的至少25％、50％、60％、75％、80％或更多)从其固定的位置上移去而没有明显变性或聚集的方式固定。例如，使含有分子的溶液与吸收材料接触，从而吸取溶液并可逆地固定分子，由此使分子可逆地固定在吸收材料(例如吸收垫)中或吸收材料上。然后可通过从吸收材料中芯吸溶液，或将溶液从吸收材料的一个区芯吸到另一个区来移去可逆固定的分子。在一些情况中，将含分子的溶液与吸收材料接触，从而吸取溶液，然后干燥含溶液的吸收材料，由此将分子可逆地固定在吸收材料上。然后可使吸收材料接触相同或不同组成的另一种溶液，从而使可逆固定的分子溶解，然后从吸收材料中芯吸溶液或将溶液从吸收材料的一个区芯吸到另一个区，由此来移去可逆固定的分子。
固定不可逆固定的分子(例如，结合试剂或分析物)使得在温和条件(例如，约4-9的pH，约4-65℃的温度)下它们不被或基本不被从它们的位置上移去。示例性的不可逆固定的分子包括通过标准印迹技术(例如，电印迹)与硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜膜结合的蛋白质分析物。其他示例性的不可逆固定的分子包括与玻璃或塑料(例如，微阵列、微流体芯片、玻璃组织学载玻片或具有孔并且孔中具有结合的蛋白质分析物的塑料微量滴定板)结合的蛋白质分析物。
术语“结合试剂”是指特异性结合分子(如分析物)的试剂。尽管抗体在本文的许多内容中描述，应当理解的是，如用户所优选，可以使用其它的结合试剂而不是抗体。本领域已知多种结合试剂，包括抗体、适体、粘合素(affimer)、脂质运载蛋白(如抗运载蛋白(anticalin))、硫氧还蛋白A、胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。
术语“特异性结合”是指分子(例如，结合试剂如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比非靶标化合物高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。
术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的骨架区的多肽或其片段，其特异性结合并识别抗原，例如，特定分析物。通常，“可变区”包含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和性是至关重要的。参见Paul，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(2003)。抗体包括例如嵌合的、人的、人源化的抗体，或单链抗体。
示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
“同种型”是由重链恒定区确定的一类抗体。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，这进而确定了同种型类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特异性抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)'2，Fab本身是由二硫键接合到VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是附带有部分绞链区的Fab(参见《基础免疫学》(FundamentalImmunology)，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。
在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。如本文中所用，术语“约”是指所列的数字以及所列数字10％范围内的任何值。因此，约“5”是指在4.5-5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
II.装置
图1、2A和2B示出了用于检测基材上的蛋白质的侧流装置100的一个实施方式。侧流装置100包括芯吸垫102，该芯吸垫102具有第一端104、第二端106、两个侧边108，以及用于施加包含待检测的固定的分析物(例如，蛋白质)的基材112(例如膜)的区域110。侧流装置100还包括位于芯吸垫102的第一端104上或第一端104处的第一储器114。第一储器114将液体(例如，缓冲液和检测试剂)供应到芯吸垫102。在一些实施方式中，第一储器114与芯吸垫102紧密接触。侧流装置100还包括第二储器116，该第二储器116位于芯吸垫102的第二端106上或附近，并与芯吸垫102紧密接触。第二储器116通过将液体从第一储器114芯吸到干燥的第二储器116而起到泵的作用。
芯吸垫102是平面吸收材料，在其上放置包含固定的分析物(例如Western印迹)的基材112。芯吸垫102可以包括图示/标志或其它针对用户应当在何处放置基材112的指示。或者，图示/标志可以在装置外壳上。在一些实施方式中，基材112放置在第一储器114下游和第二储器116上游(例如，第一储器114和第二储器116之间)的芯吸垫102上。
芯吸垫102具有宽度、长度和高度(例如厚度)。芯吸垫102可以是任何尺寸和形状。在某些实施方式中，芯吸垫102是平面的，例如，芯吸垫102可以接近或者是矩形平面。在一些情况中，芯吸垫102的长度和宽度比高度(即，厚度)大至少约2倍、5倍、10倍、100倍或更多。在一些实施方式中，芯吸垫102具有不可渗透的或基本上不可渗透的背衬。
芯吸垫的示例性尺寸包括，但不限于，芯吸垫在至少一个维度上为至少约0.25cm、0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、10cm、12cm、15cm、20cm、30cm或更大。矩形平面芯吸垫的示例性尺寸包括长度与宽度分别为约1cm x 1cm、7x 8.5cm、8.5x 13.5cm、10cm x15cm或25x 28cm的芯吸垫。示例性尺寸还包括8.5cm x 9cm、7cm x 9cm、8cm x 10.7cm、10cm x 10cm、7cm x 8.5cm、8.3cm x 7.3cm、8cm x 8cm、8.3cm x 13cm、10.8cm x 13.5cm。在一些实施方式中，芯吸垫102的长度为18cm，宽度为10cm。在一些情况中，芯吸垫102的长度为18±0.5、1、2或3cm，宽度为10±0.5、1、2或3cm。
在一些实施方式中，芯吸垫102设置成具有高溶液容量和侧流流速。在一些情况中，通过具有基本高度(例如，厚度)的芯吸垫102来提供高溶液容量和侧流流速。在一些情况中，芯吸垫102的厚度为约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或约0.2mm。在一些情况中，芯吸垫102的厚度在约0.05mm至约0.5mm之间。
第一储器114包括多个试剂层118的堆叠，每个试剂层118具有固定或嵌入其中的试剂(例如，一抗、二抗、运行缓冲液和/或洗涤缓冲液)。在一些实施方式中，多个试剂层中的每一层具有固定或嵌入其中的不同试剂。第一储器114与芯吸垫102液体连通(即，当存在于第一储器114中时，液体可以从第一储器114流到芯吸垫102)，并且被配置为将试剂依次地从多个试剂层118递送到芯吸垫102。嵌入的试剂通常被嵌入并干燥到试剂层的吸收垫中，使得它们是固定的，直到在侧流下与含水流体前沿接触并在用户定义的事件中释放。
每个试剂层118具有宽度W1，长度L1和高度H1(例如，厚度)。在某些实施方式中，每个试剂层是平面的，例如，每个试剂层可以接近或者是矩形平面。在一些情况中，每个试剂层的长度L1和宽度W1比高度(即，厚度)大至少约2倍、5倍、10倍、100倍或更多。
在图1、2A和2B所示的实施方式中，多个试剂层118中的每一层是吸收垫，并且试剂固定在吸收垫中。在某些实施方式中，多个试剂层218中的每一层均是其中具有试剂的溶液。在一些实施方式中，各溶液中含有不同的试剂。在试剂层218是溶液的实施方式中，第一储器214是圆筒(参见图3)或槽，其在第一端220处具有流体流量控制器222(例如，阀)，以控制溶液从第一储器214的释放。在一些实施方式中，第一储器还在第二端224处具有流体流量控制器(例如，阀)。
在一些实施方式中，第一储器314是具有多个试剂层318的矩形槽(参见图4A-4C)，每个试剂层318是其中具有试剂的溶液。第一储器314包括第一端320和第二端324。第一端320具有流体流量控制器322(例如，狭缝)以控制溶液从第一储器314的释放。在流体流量控制器322是狭缝的实施方式中，狭缝可以具有范围从大约0.5mm到大约2mm的宽度W2(例如，短尺寸)和范围从大约8.5cm到大约20cm的长度L2(例如，长尺寸)。在一些实施方式中，宽度W2为0.5mm、1mm或2mm。在某些实施方式中，长度L2为8.5cm，9.5cm，13.5cm或20cm。狭缝的尺寸和试剂溶液的粘度可以影响溶液离开狭缝的速率，并且可以根据用户的喜好进行调节。例如，随着宽度W2减小，溶液离开狭缝的速率也减小，这增加了装置100的总侧流处理时间。
第二端324上的流体流量控制器322和/或开口326可以用可移除的金属箔或塑料箔(例如，带)密封或覆盖。
再次参考图1–2B，在一些实施方式中，各试剂层的尺寸设计成与芯吸垫102的宽度相匹配，并且具有的宽度比长度大至少约3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、13倍、17倍、20倍、27倍或更多。
各试剂层的示例性尺寸包括，但不限于，在至少一个维度上为至少约0.25cm、0.5cm、1cm、2cm、2.5cm、3cm、3.5cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、8.5cm、9.5cm、10cm、13.5cm、20cm或更大。每个矩形平面试剂层的示例性尺寸包括但不限于长度L1和宽度W1分别为约0.5cm×8.5cm、1cm×1cm、2.5cm×约8.5cm、2×13.5cm、3×13.5cm或3.5cm×20cm。如本文所用，“长度L1”是基于流动方向并且是最短尺寸。在一些实施方式中，每个试剂层的长度L1为3cm，宽度W1为10cm。在一些情况中，每个试剂层的长度L1为1±0.5、1或2cm，宽度W1为14±0.5cm。
在一些实施方式中，每个试剂层118由吸收性多孔材料形成，并设置成具有高溶液容量。在一些情况中，通过具有基本高度(例如，厚度)的试剂层来提供高溶液容量。在一些情况中，试剂层的厚度为约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或约0.2mm。在一些情况中，试剂层的厚度在约0.05mm至约0.5mm之间。
由于存在多个孔，每个试剂层118通常具有大的表面积。大表面积可以增加试剂层对一种或多种试剂或一种或多种含有试剂的溶液的负载能力。在一些实施方式中，试剂层118具有至少约0.001m2/g、0.02m2/g、0.1m2/g、0.5m2/g、1m2/g、10m2/g或更高的通过标准技术测得的比表面积。
在一些实施方式中，每个试剂层和/或芯吸垫102可具有特定的孔径，特定的平均孔径或特定的孔径范围。例如，每个试剂层和/或芯吸垫102可包含0.1μm的孔，0.2μm的孔，0.45μm的孔，或1、2、4、5、6、7、8、10、15、20μm的孔，或大于约20μm的孔。又例如，每个试剂层和/或芯吸垫102可含有平均尺寸为0.1、0.2、0.45、1、2、4、5、6、7、8、10、15或20μm或更大的孔。再例如，每个试剂层和/或芯吸垫102可含有尺寸范围约0.1-8μm、0.2-8μm、0.45-8μm、1-8μm、0.1-4μm、0.1-2μm、0.1-1μm、0.1-0.45μm、0.2-8μm、0.2-4μm、0.2-2μm、0.2-1μm、0.2-0.45μm、0.45-8μm、0.45-4μm、0.45-2μm、0.45-1μm的孔。一些情况中，每个试剂层和/或芯吸垫102可含有尺寸小于约20μm的孔。例如，每个试剂层和/或芯吸垫102可以由其中至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的尺寸小于约20、15、10或5μm的材料组成。一些情况中，试剂层中的孔足够大，能够容纳正常大小(例如，约1nm)的一个或多个蛋白质。例如，孔的尺寸可以是至少1nm、至少5nm，至少10、100或500nm。或者，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的尺寸可以大于1、5、10、50、100或500nm。如本文所用，孔径可按半径或直径测定。在一些情况中，每个试剂层和/或芯吸垫102包含多孔聚乙烯，例如孔径为0.2至20微米，或1至12微米的多孔聚乙烯。每个试剂层和/或芯吸垫102可以在垫或层的不同区域中具有不同的孔径。例如，芯吸垫102可具有侧流区域，该侧流区域具有不同的孔径或孔径范围。
可对每个试剂层和/或芯吸垫102进行处理或官能化以最小化非特异性试剂结合、增加侧流、增加芯吸，或者减少蛋白质聚集。例如，每个试剂层和/或芯吸垫102或其部分可被处理以改变受处理区域的亲水性或疏水性。在一些情况中，改变试剂层的亲水性或疏水性可在试剂层是湿的时候增加结合试剂负载量、减少结合试剂聚集或变性、产生掩蔽区(其中排除或不负载结合试剂)，或引导结合试剂流动。在一些情况中，试剂层含有如本文所述的蛋白质聚集改性剂。
参照图5，在一些实施方式中，每个试剂层418具有涂覆或粘附在下表面的一部分上的阻挡层440，以控制试剂溶液流过侧流装置400的第一储器414。在一些实施方式中，对阻挡层440进行定位，使得从试剂层418依次流出的溶液沿着弯曲路径442到达芯吸垫402。例如，一些交替试剂层可以在除了接近第一边缘446的下表面的第一区域444之外的几乎全部下表面上具有阻挡层。另一些交替试剂层可以在除了接近第二边缘450的下表面上的第二区域448之外的几乎全部下表面上具有阻挡层440。在某些实施方式中，阻挡层440覆盖每个试剂层的下表面的宽度。在一些实施方式中，不含阻挡层的试剂层的第一和/或第二区域444、448覆盖试剂层418的宽度。在一些实施方式中，阻挡层440可延伸超过试剂层的第一边缘446或第二边缘450，使得溶液将流过不具有阻挡层的区域，而不是向下沿着在其间延伸有阻挡层的试剂层的边缘流动。薄阻挡层440可由包括但不限于塑料箔、金属箔、玻璃和/或蜡的材料形成。可以形成阻挡层440的塑料包括但不限于聚偏二氯乙烯、低密度聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和/或聚碳酸酯。可以将阻挡层440粘附到试剂层418的方法可以包括在具有或没有压力的情况下用粘合剂粘合、热粘合或有机溶剂粘合。
每个试剂层可被标记或标注以记录可逆固定的结合试剂(如一抗)的来源、组成或位置。例如，一或多个含有可逆固定的结合试剂的区域可以肉眼分辨，使得本领域技术人员能确定可逆固定的结合试剂的位置。在一些情况中，可以在试剂层的一部分上印刷、压印或以其他方式指示结合试剂的名称(例如，抗磷酸PIK3)、标识(例如，目录号)、数量，批号等。在一些情况中，标记或标注每个试剂层，使得可以辨别用于侧流印迹装置100的适当取向。
在一些实施方式中，多个试剂层118、218、318包括含有一抗(例如标记的一抗)的第一试剂层和包含第一洗涤溶液的第二试剂层。在一些实施方式中，试剂层118、218、318是不同的并且包括包含一抗的第一试剂层、包含第一洗涤溶液的第二试剂层、包含二抗或第二检测试剂的第三试剂层和包含第二洗涤溶液的第四试剂层(图1-4A)。如图1-2B中所示，第一层与芯吸垫102紧密接触。如图3和4A所示，第一层是第一储器214、314的第一端220、320处或附近的层。在一些实施方式中，多个试剂层118、218、318具有两个或更多个相同试剂的层。在具有两层相同试剂的层的这种实施方式中，第一储器114、214、314将包括两倍体积的试剂。例如，在一些实施方式中，试剂层118、218、318还包括含有第二洗涤溶液的第五试剂层，使得第一储器114、214、314包括两层或两倍体积的第二洗涤溶液。在试剂层118由吸收材料形成的实施方式中，一个或多个试剂层118可以是其他层的厚度的至少两倍。例如，具有第二洗涤溶液的第四试剂层可以是具有二抗的第三试剂层的厚度的至少两倍。
每个试剂层118、218、318还可包括密度剂。在第一储器114、214、314的每个试剂层118、218、318中具有密度剂可以将试剂保持在离散区域中以使混合最小化并且允许将试剂定时、依次地递送到芯吸垫102。密度剂的例子包括但不限于甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和聚乙二醇。
每个试剂层118、218、318还可包括一种或多种染料或指示剂，用于监测试剂从第一储器114侧流出并进入/通过芯吸垫102(例如监测进展)。
第二储器116用作侧流系统的芯吸“泵”，并包括一个或多个吸收垫。在一些实施方式中，第二储器116可以是芯吸垫102。第二储器116与芯吸垫102液体连通(即，当液体存在于芯吸垫102中时，其可以从芯吸垫102流向第二储器116)。
试剂层118、芯吸垫102和第二储器116通常由吸水材料形成，并且可以由例如天然纤维、合成纤维、玻璃纤维或其混合物制成。非限制性实例包括棉、玻璃及其组合。诸如阿尔斯通公司(Ahlstrom)、GE公司、PALL公司、密理博公司(Millipore)、萨托瑞斯公司(Sartorius)、S&S公司等供应商有许多用于诊断用途的市售材料。
吸水材料可包括但不限于含聚合物的材料。聚合物可以是聚合物珠、聚合物膜或聚合物整料的形式。一些情况中，聚合物是纤维素。含纤维素的垫包括纸、布、织造或非织造纤维素基材。布垫包括含有天然纤维素纤维如棉或羊毛的那些。纸垫包括含有天然纤维素纤维(例如，纤维素或再生纤维素)的那些以及含有纤维素纤维衍生物的那些，所述衍生物包括但不限于：纤维素酯(例如，硝化纤维素，乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸-丙酸纤维素、乙酸-丁酸纤维素和硫酸纤维素)，和纤维素醚(例如，甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)。一些情况中，纤维素垫含有人造丝。一些情况中，垫是纸，例如各种纸。
吸水材料还可包括但不限于烧结材料。例如，吸水材料可含有烧结玻璃、烧结聚合物或烧结金属，或它们的组合。在一些情况中，通过烧结一种或多种粉状玻璃、粉状聚合物或粉状金属来形成烧结材料。其它情况中，通过烧结一种或多种玻璃、金属或聚合物纤维来形成烧结材料。其它情况中，由烧结一种或多种玻璃、聚合物或金属珠来形成烧结材料。
吸水材料还可含有但不限于一种或多种非纤维素聚合物，例如合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物。例如，材料可含有聚酯，例如聚乙交酯、聚乳酸、聚己内酯、聚己二酸乙二醇酯、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸1,3-丙二酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、一些情况中，聚合物是纺粘的，例如纺粘聚酯。
其它合成聚合物包括但不限于：尼龙、聚丙烯、聚乙烯(polyethylene)、聚苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯聚合物(polyvinyl)、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、聚丙烯酰胺、(C2-C6)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C1-C6)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰氨基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物、丙烯腈或前述任意物质的混合物。
在一些实施方式中，试剂层118由非吸水材料形成，其中液体通过毛细管作用流动。这种材料包括但不限于由波莱克斯技术公司(Porex Technologies Corp.)制造的高密度或超高分子量聚乙烯片材料。
在一些实施方式中，可以背衬(back)芯吸垫102，以防止在底面上流动。这可以例如通过使用与芯吸垫粘附的粘合剂背衬来实现。粘合剂的性质可能影响试验性能(即，流动特性、试剂稳定性等)，所以可以针对所需试验优化粘合剂。在一些实施方式中，粘合剂可以是装置100的模制底部部分的一部分。
基材112通常是平面形状的，并且可以是例如由硝化纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜形成的膜。可以形成基材112的其他材料包括但不限于玻璃、塑料、硅、金属和/或金属氧化物，其是裸露的或被聚合物官能化的。可以形成基材112的塑料材料包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和/或聚碳酸酯。用于对由金属或金属氧化物形成的基材的表面进行官能化的聚合物的实例包括环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷；聚-L-赖氨酸；聚凝胺；聚乙二醇聚合物；葡聚糖聚合物；氨基丙基硅烷；羧基硅烷(caroxysilane)；水凝胶和聚合物刷；和/或例如官能化烷基硫醇、树枝状聚合物或寡核苷酸的自组装单层。
吸水组件可以包含并密封在防水外壳120中。在一些实施方式中，外壳120将会是塑料或其它便宜的防水材料。外壳120可以例如是真空模塑或注塑或以其它方式构建的。在一些实施方式中，外壳120包括模制的底部部分和与底部部分配合(例如搭扣配合)的大致平面的盖子或板。图1B示出了这种外壳120的一个例子。.在该实施方式中，芯吸垫以及第一和第二储器114、116包含在模制底部部分的孔或部分中。在一些实施方式中，外壳120(例如，底部部分和/或盖子)不接触芯吸垫102。在某些实施方式中，底部部分是平面的，并且第一和第二储器114、116由模制的盖子包围。在一些实施方式中，盖子被模制成使得当盖子附接到底部部分时盖子接触第一储器114并在第一储器114上施加均匀和向下的力。在整个第一储器114上施加均匀和向下的力导致试剂层118之间的均匀接触。在某些实施方式中，盖子设置在多于一个区段中。例如，盖子可包括第一区段和第二区段。第一区段可以是可移除的，并且可以覆盖装置100的第一储器114和基材区域110。第二区段可以覆盖第二储器116，并且可以是可移除的或可以焊接到底部部分。
A.示例性的检测试剂
i.结合试剂
本文描述结合试剂用于检测分析物。在一些情况中，结合试剂是抗体(例如，一抗或二抗)。一抗可用于结合分析物。在一些情况中，一抗经标记使得能够检测一抗并因此检测分析物。在一些情况中，通过结合至标记的二级结合试剂，如标记的二抗来检测一抗。在一些情况中，使用三级结合试剂来检测含有分析物和一级结合试剂以及二级结合试剂的复合物。
可在第一储器114、214中的一个或多个试剂层118、218上或其中提供结合试剂，或可分开供应。在一些情况中，试剂层118含有一种或多种在其上干燥的结合试剂。可以通过使试剂层118与水溶液接触来重构干燥的结合试剂。在一些情况中，水性重构缓冲剂可含有一种或多种再润湿试剂，包括本文所述的盐、缓冲剂或蛋白质聚集改性剂。或者，结合试剂可以存在于溶液中，并且通过将试剂层浸入溶液中将结合试剂可逆地固定在试剂层118中。在一些情况中，结合试剂储存在试剂层118、218中(例如，在第一储器114、214中)。例如，结合试剂可以干燥储存、基本干燥储存或在试剂层中的溶液中储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长时间。在一些情况中，结合试剂和试剂层适于储存(例如，在约4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、25、30、35或37℃或更高)至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、一年或更长时间。
ii.标记物
可通过检测与结合试剂连接的标记物来检测分析物。该标记物可直接连接至结合试剂(例如，通过与一抗的共价键或其它键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中，各标记物(如连接至第一结合试剂的第一标记物、连接至第二结合试剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记物生成的第一信号、第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中，两种或更多种结合试剂标记物包含相同类型的试剂(例如作为第一标记物的第一荧光剂和作为第二标记物的第二荧光剂)。在一些实施方式中，两种或更多种结合试剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。
可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物、胶体金及其组合。在一些实施方式中，标记物可包括光学试剂，如生色团、荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，The Handbook—A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。生色团包括具有可检测吸光度的辅酶或辅因子。一些情况中，可通过检测肽键在例如220或280nm处的固有吸光度来检测结合试剂。
荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子或各种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫属吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、二氢卟酚类、萘菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自例如英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)的那些。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有光学试剂如荧光剂(例如第一结合试剂标记有第一荧光标记物，第二结合试剂标记有第二荧光标记物等)，且通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测标记有光学试剂的各结合试剂。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有光学试剂，且带有光学试剂标记的各结合试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。
在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有放射性同位素(例如第一结合试剂标记有第一放射性同位素，第二结合试剂标记有第二放射性同位素等)，且标记有放射性同位素的各结合试剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如，一种结合试剂可标记有γ发射子，而一种结合试剂可标记有β发射子。或者，这些结合试剂可标记有以不同的能量发射相同粒子(例如，α、β或γ)的放射性核素，其中不同的能量是可区分的。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有放射性同位素，且各标记的结合试剂可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。
在一些实施方式中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测结合试剂。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物，或者与化学发光底物(例如，来自生物辐射实验室(Bio-RadLaboratories)的Clarity)联用，其产生可检测的光。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸酯联用，其产生在405nm处易测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，其产生在410nm可测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有酶(例如第一结合试剂标记有第一酶，第二结合试剂标记有第二酶等)，且标记有酶的各结合试剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有酶，且带有酶标记的各结合试剂都通过检测该酶生成的产物来测得。
在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
在一些实施方式中，该标记物是核酸条码。如本文所用“条码”是专一限定标记的分子或标记的结合试剂上结合的第二分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。条码序列的长度决定了可以对多少独特的样品进行区分。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于44即256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标引不多于65,536个不同样品。本领域熟知条码技术的应用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等，“Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependentbias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码最小化序列依赖性偏置和扩增噪音)”,PNAS(2012年1月24日)；109(4):1347-52；和Smith,AM等，“Highly-multiplexed barcode sequencing:anefficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重条码测序：一种对集中的样品平行分析的高效方法)”，Nucleic Acids Research(2010年7月)；38(13):e142。
在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的叠氮化物和炔的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如带荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
连接可检测标记物与结合试剂如蛋白质(例如，抗体)的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques:Theory and Practice(《生物化学技术：理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(WavelandPress,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland,Excited States ofBiopolymers(《生物聚合物的激发态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；Fluorogenic Probe Design and Synthesis:A Technical Guide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman,Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)(1996)。
在一些实施方式中，两种或更多标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号在所述多种标记物缺失其一或其中多个时不会生成。例如，在一些实施方式中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示标记物(并因此指示各带标记的蛋白质)的存在。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如，Maeda等，JBiolumin Chemilumin 1989,4:140-148。
B.蛋白质聚集改性剂
本文描述了蛋白质聚集改性剂。可采用蛋白质聚集改性剂来减少或消除在试剂层上储存或从中递送的结合试剂如蛋白质(例如，抗体)的聚集或变性。例如，蛋白聚集改性剂可用来减少或消除试剂层118、218中储存或从试剂层118、218递送的一抗的聚集或变性。在一些情况中，蛋白质聚集改性剂可用于促进结合试剂在芯吸垫102的侧流区域110中的侧流。
在一些情况中，作用为将蛋白质置换出气水界面并由此保护蛋白质免于变性和聚集的蛋白质聚集改性剂对于减少固定在试剂层上的结合试剂的聚集特别有效。在其他情况中，蛋白质聚集改性剂通过与结合试剂结合和/或稳定结合试剂而直接影响结合试剂的稳定性。在其他情况中，蛋白聚集改性剂的作用为使平衡移离变性或解折叠状态并由此减少聚集。例如，在一些情况中，由于结合试剂的酰胺主链和蛋白聚集改性剂之间的强烈排斥，热力学上不利于(disfavored)蛋白质聚集改性剂和结合试剂之间的相互作用。因此，蛋白聚集改性剂存在时不利于结合试剂的解折叠，因为解折叠将更多酰胺主链表面暴露于蛋白聚集改性剂。
蛋白质聚集改性剂可以是以下一种或多种：环糊精、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改性蛋白质、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。
环糊精可以是但不限于：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2,3,6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2,3,6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-羟基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰基β-环糊精、琥珀酰基α-环糊精、琥珀酰基β-环糊精、琥珀酰基γ-环糊精、(2,3,6-三-O-苯甲酰基)-β-环糊精、琥珀酰基-(2-羟丙基)-β-环糊精或琥珀酰基-(2-羟丙基)-γ-环糊精。环糊精也可以是含有一种或多种前述环糊精分子的环糊精聚合物。其他环糊精是本领域已知的且包括例如万维网cyclodextrin.com上描述的那些。环糊精的示例性浓度是但不限于约1mM、2mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。
非离子型表面活性剂可以是聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-聚丙二醇(polyethylene-polypropylene glycols)或聚氧乙烯-硬脂酸酯。聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯可以是聚乙烯(20)-去水山梨糖醇酯(Tween 20TM)或聚氧乙烯(20)-去水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80TM)。聚乙二醇-聚丙二醇可以是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如以商品名或PoloxamerTM售卖的那些。聚氧乙烯-硬脂酸酯可以是例如以商标MyrjTM售卖的那些。示例性的聚氧乙烯单月桂基醚包括以商标BrijTM售卖的那些，例如Brij-35。非离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。
离子型表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。可用于本发明的阴离子型表面活性剂可以是但不限于皂，包括碱金属皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的钠、钾或铵盐，如硬脂酸钠。其他阴离子型表面活性剂包括有机胺皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的有机胺盐，如三乙醇胺硬脂酸盐。可用于本发明的阳离子型表面活性剂包括但不限于铵盐，如十八烷基氯化铵或季铵化合物，如苯扎氯铵。离子型表面活性剂可包括烷基硫酸的钠、钾或铵盐，如十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。
两性离子型表面活性剂具有与同一分子相连的阳离子和阴离子中心。例如，阳离子部分是基于伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子。阴离子部分可以是磺酸根，如CHAPS(3[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)中那样。其它阴离子基团有磺基甜菜碱类，示例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱，或甜菜碱类，例如椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。两性离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
非去污剂磺基甜菜碱(NDSB)具有无法聚集形成胶束的短疏水性基团和磺基甜菜碱亲水性基团，因此不认为NDSB是去污剂。示例性的NDSB包括但不限于NDSB 256、NDSB221、NDSB 211、NDSB 201、NDSB 195、3-(4-叔丁基-1-吡啶并)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐，3-(苄基二甲基铵基)丙磺酸盐或二甲基乙基丙磺酸铵。NDSB的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
多元醇是具有多个羟基官能团的化合物。一些情况中，多元醇可通过多种机理改变蛋白质的聚集或变性行为。例如，一些情况中，多元醇会通过给出热力学上不利的与蛋白主链的相互作用来使平衡移向折叠状态。或者，一些情况中，多元醇可与蛋白质的折叠状态结合并使其稳定。
多元醇可以是简单糖，例如：蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖或海藻糖。多元醇也可以是多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉或含有一种或多种本文所述简单糖的聚合物。甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物，以及它们的组合也是示例性多元醇。
有机溶剂可以是但不限于已知抑制一种或多种蛋白质的变性、解折叠或聚集的那些有机溶剂。本领域已知多种合适的有机溶剂。例如，有机溶剂可包括乙醇、丁醇、丙醇、苯酚、二甲基甲酰胺、2-甲基-2,4-戊二醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,6-己二醇或二甲基亚砜。
聚集改性蛋白质可以是本领域已知能抑制一种或多种蛋白质变性、解折叠或聚集的蛋白质。示例性的聚集改性蛋白质包括但不限于白蛋白、蛋白质伴侣和热休克蛋白。白蛋白是水溶性、在浓盐溶液中中度可溶并经受热变性的蛋白。示例性白蛋白包括血清白蛋白(例如牛、马或人血清白蛋白)或卵白蛋白(例如，鸡蛋白蛋白)。其他示例性聚集改性蛋白质包括酪蛋白、明胶、泛素、溶菌酶或胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。LEA蛋白包括LEA I、LEAII、LEA III、LEA IV、LEA V或非典型LEA蛋白。LEA蛋白是本领域已知的并描述于例如GoyalK.等，Biochemical Journal 288(第1部分),151-57,(2005)。
蛋白质聚集改性剂也可以是氨基酸。在一些情况中，氨基酸可起氧化还原作用来为固定在基材112上的蛋白质维持适当的氧化电位。合适的氧化还原氨基酸包括半胱氨酸和胱氨酸。其它氨基酸通过非氧化还原方法起到减少变性或聚集的作用。例如，精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸已证明能减少蛋白质聚集。
可用其它氧化还原剂来减少蛋白质聚集。可用半胱氨酸和胱氨酸以外的氧化还原剂来优化蛋白质固定于其上的基材112中的还原电位。示例性的氧化还原剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物及其氧化衍生物，以及Cu2+。
蛋白质聚集改性剂还可以包括冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。在一些情况中，蛋白质聚集改性剂是离液剂，例如脲、硫脲、胍盐、氰酸盐、硫氰酸盐、三甲基铵、四甲基铵、铯、铷、硝酸盐、乙酸盐、碘化物、溴化物、三氯乙酸盐或高氯酸盐。在某些条件下，如在低浓度下，离液剂可减少蛋白质聚集。其它蛋白质聚集改性剂包括三甲基胺N-氧化物。
蛋白质聚集改性剂可以是盐。示例性盐包括但不限于盐酸、硫酸或磷酸的钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。蛋白质聚集改性剂也可以是缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、TAPSO、MES、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSO、MOPS、MOPSO或磷酸钠或磷酸钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙酸钠或乙酸钾、或硼酸钠或硼酸钾缓冲剂。
蛋白质聚集改性剂可以以任何合适浓度提供。一些情况中，以含有结合试剂和蛋白质聚集改性剂的水溶液形式提供蛋白质。在这种情况下，溶液可以与试剂层接触，并任选地干燥。水性结合试剂溶液中蛋白质聚集改性剂的示例性浓度包括但不限于溶液的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、10％、20％或约25％或更多w/v。其他的示例性浓度包括但不限于约1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、300μM、500μM、750μM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM和1M。
在一些情况中，在试剂层上提供蛋白质聚集改性剂。含有蛋白质聚集改性剂和试剂层的示例性组合物含有约0.001重量％、0.005重量％、0.01重量％、0.05重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％或约10重量％、20重量％或约25重量％的一种或多种蛋白质聚集改性剂。
蛋白质聚集改性剂可以以任何合适的组合提供。例如，在一些情况中，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种前述蛋白质聚集改性剂来减少可逆地固定于试剂层上的结合试剂的聚集。在一些情况中，在使试剂层与结合试剂溶液接触之前，试剂层含有蛋白质聚集改性剂，并且结合试剂溶液含有相同或不同的蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使试剂层与结合试剂溶液接触之前，试剂层含有蛋白质聚集改性剂，并且结合试剂溶液不含有蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使试剂层与结合试剂溶液接触之前，结合试剂溶液含有蛋白质聚集改性剂，而试剂层或待接触的区域不含蛋白质聚集改性剂。
方法
现在将描述使用图1–3和5中描绘的侧流装置进行侧流Western印迹测定的方法。该方法首先将基材112、412面朝下放置在芯吸垫102上(例如，与其紧密接触)，该芯吸垫102可以以预先润湿的形式提供或者可以由使用者用例如运行缓冲液预先润湿。在一些实施方式中，基材112、412放置在第一储器114、214、314、414下游和第二储器116、416上游(例如，在第一储器和第二储器之间)的芯吸垫102、402上。
然后通过在芯吸垫102、402的第一端104、404上堆叠一个或多个试剂层118、218、318、418(例如，一抗、第一洗涤溶液、二抗或第二检测试剂、第二洗涤溶液)来形成第一储器114、214、314、414。在试剂层由吸收材料形成的实施方式中(图1-2B、5)，试剂层118、418干燥堆叠或者以用含试剂溶液或运行缓冲液预先润湿(用户或供应商操作)的形式堆叠(例如，用于具有干燥嵌入试剂的试剂层)。在试剂层118、418干燥堆叠的实施方式中，在堆叠干燥试剂层118、418之后，可以将运行缓冲液施加到第一储器114、414。在试剂层218、318是溶液的实施方式中(图3和4A)，将溶液堆叠在容器中(例如，在圆筒或槽中)。在一些实施方式中，试剂层118、218、318、418的堆叠开始于与芯吸垫102、402接触的层(图1-2B)或与芯吸垫102、402最接近(图3-4A)的层，包括具有标记的一抗的第一试剂层和具有第一洗涤溶液的第二试剂层。在某些实施方式中，试剂层118、218、318、418的堆叠按以下顺序形成：具有一抗的第一试剂层，具有第一洗涤溶液的第二试剂层，具有二抗或第二检测试剂的第三试剂层和具有第二清洗溶液的第四试剂层。在一些实施方式中，试剂层的堆叠包括两层或更多层相同试剂的层(或体积的两倍)。在一些实施方式中，包括具有第二洗涤溶液(例如，第二洗涤溶液的第二层)的第五试剂层，使得第一储器具有两倍于第二洗涤溶液的体积。在一些实施方式中，省略具有第二洗涤溶液的试剂层以使二抗或第二检测试剂有更多时间结合一抗。
在具有固定在吸收试剂层118、418中的试剂的实施方式中，为了引发试剂从第一储器114、414到芯吸垫102、402的依次流动，将运行缓冲液施加到第一储器114、414中的吸收试剂层118、418。或者，允许预润湿的试剂层中的液体流入芯吸垫102、402。在试剂层218、318呈溶液形式的实施方式中(图3–4C)，允许溶液从第一储器214、314依次地流到芯吸垫102的第一端104上或者流到芯吸垫102的第一端104上的一个或多个干燥或预先润湿的吸收垫中。
在第一储器214的第一端220上具有阀222的实施方式中，阀222打开以允许溶液离开第一储器214(图3)。在某些实施方式中，允许溶液从第一储器314的第一端320上的狭缝322流出(图4A-4C)。在第一储器314的第一端320上具有狭缝322的实施方式中，先用可移除的金属箔或塑料箔(例如，带)密封狭缝，然后用试剂溶液填充第一储器314，之后移除箔以引发溶液从第一储器314中流出。在第一储器314在第二(顶部)端324上具有可逆密封的开口324的实施方式中，通过在去除覆盖狭缝322的箔之前或同时移除或刺穿密封件(例如金属或塑料密封件)来引发溶液的流动。
通过从第一储器114、414芯吸到干燥的第二储器116、416来拉动运行缓冲液或溶液，所述运行缓冲液或溶液携带试剂(例如，一抗，第一洗涤溶液，并且如果需要，二抗和第二洗涤溶液)并且这些试剂依次通过侧流与基材112、412接触，基材112、412上固定有蛋白质。在一些实施方式中(图5)，当试剂流过第一储器414并进入芯吸垫402时，试剂沿着弯曲的路径442流动。第一试剂层中的一抗在芯吸垫102、402中传输，接触基材112、412上的蛋白质，并且如果存在的话，与基材112、412上的靶蛋白结合。在一些实施方式中，运行缓冲液/溶液从第一储器114、214、314、414侧流到第二储器116、416还使得第二试剂层中的第一洗涤溶液可以在芯吸垫102、402中传送，使得未结合的一抗从基材112、412移除。在某些实施方式中，运行缓冲液/溶液从第一储器114、214、314、414侧流到第二储器116、416还使得第三试剂层中的二抗或第二检测试剂可以在芯吸垫102、402中传送，并与基材112、412上与其靶蛋白(如果存在)结合的一抗接触。在一些实施方式中，运行缓冲液/溶液从第一储器114、214、314、414侧流到第二储器116、416还使得第四试剂层中的第二洗涤溶液可以在芯吸垫102、402中传送，使得未结合的二抗从基材112移除。在一些实施方式中，施加到芯吸垫102、402并在芯吸垫102、402中传送的第二洗涤溶液的体积是施加到芯吸垫102、402并在芯吸垫102、402中传送的二抗体积的两倍。
在一些实施方式中，在开始侧流之后和/或在侧流期间，将基本均匀的压力施加到第一储器114、314、414，并且任选地施加到第二储器116、416，以改善第一储器或第一储器和第二储器与芯吸垫102、402的接触。例如，重物可以放置在一个或两个储器的顶部上，以朝向芯吸垫102、402推动一个或两个储器。
在一些实施方式中，在侧流期间，通过目测或使用检测器跟踪一抗与靶蛋白的结合(以及任选的二抗或第二检测试剂与一抗的接触)。在一些实施方式中，从侧流装置移除基材112、412，并检测一抗与靶蛋白(如果存在)的结合。在一些实施方式中，通过使用文中所述的可检测的部分和/或标记物来目测和/或检测与靶蛋白结合的抗体。通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素、电学、光学、化学或质谱技术来检测合适的标记物和/或部分。
通常，如果装置在外壳中供应，一旦将试剂层施加到芯吸垫102上，盖子或遮盖物将被放回到装置上以使蒸发最小化并且向第一和第二储器114、116施加均匀的压力。盖子可以搭扣配合到外壳的底座上以施加均匀的压力，或者盖子可以松散地放置在底座的顶部上，然后带有盖子的底座可以放入抽屉式容器中，该抽屉式容器滑入箱体中。在连接盖子或放置盖子之前，可以将海绵放置在第一和第二储器上，以帮助向储器施加均匀的压力。整个过程需要最少的用户与耗材的交互。
本领域已知许多吸收性吸水垫材料、芯吸垫材料和抗体应用材料，可以从其中进行选择，以控制体积，以控制系统的流速，以保证均匀的流动，并且以确保抗体/试剂从第一储器的完全递送。影响试剂/抗体递送时间的其它方法也是可行的，诸如在芯吸垫中使用曲折的路径或控制具有固定的抗体的吸收垫的接触面积，从而控制抗体去除的速率。此外，控制侧流过程的其它实施方式可以工程设计到塑料外壳中，其中表面可以包含倾斜区域以使用重力延缓或加速液体的流动。
图2A和2B示出的是保持单个微型凝胶尺寸的膜的可消耗装置。通常用户使用被称为中型印迹的膜进行Western印迹，所述中型印迹通常是2x宽的小型膜。在其它Western印迹应用中，用户可以将小型和/或中型膜切成更小的部分，其对应于用于蛋白质电泳和转移的原始凝胶的几条泳道。因此，在一些实施方式中，可消耗侧流装置100可以是适应小型或中型膜的尺寸。在其它实施方式中，可将单独的脊模塑于或以其它方式存在于可以放置膜部分的耗材的基部。在这后一种设置中，可以将装载有不同抗体的较小的第一储器放置在各部分的头部，以促进在相同装置中以不同抗体对膜的各部分进行Western印迹探测。
在该Western印迹侧流装置的其它实施方式中，可以将抗体混合并负载到第一储器的第一试剂层中，以促进在单个样品中靶标的多重检测。
IV.试剂盒
提供了用于根据本文描述的方法进行侧流Western印迹测定的试剂盒。还提供了包含如本文所述的装置的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括第一储器和第二储器，第一储器包括位于芯吸垫的第一端上的多个试剂层的堆叠，第二储器包括位于芯吸垫的第二端上的吸收垫，所有这些在本文中都进行了描述。在一些实施方式中，试剂盒包含液体形式的试剂(例如，包括标记的一抗或一抗和二抗的结合试剂，洗涤溶液和/或运行缓冲液)。在一些实施方式中，试剂盒包含一个或多个吸收试剂层，每个试剂层具有可逆地结合在其中的试剂。在某些实施方式中，将一些或所有试剂干燥到吸收试剂层上。在一些实施方式中，在一种或多种蛋白质聚集改性剂的存在下，将一些或所有试剂干燥到吸收试剂层或其部分上。在一些实施方式中，试剂作为溶液提供，由最终用户施加到吸收试剂层上。在一些情况中，各试剂的溶液可以具有不同的密度以使不同试剂的混合最小化。在一些实施方式中，可以提供US 6641517中描述的漂浮物以与圆筒或槽一起使用，从而最大程度地降低试剂的混合，同时堆叠具有不同密度的溶液。图4中示出了漂浮物326的示例性实施方式。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括具有两个、四个或更多个象限的塑料托盘，供使用者在形成试剂层118的堆叠之前将试剂溶液施加到吸收垫上。
在一些实施方式中，试剂盒包含运行缓冲液和/或封闭剂(例如，牛血清白蛋白和/或脱脂奶粉)、表面活性剂(例如，吐温20或曲通X-100)、如本文所述的蛋白质聚集改性剂、拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、和/或促进试剂均匀流动和/或促进对基材上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。另外的试剂可以作为固体(例如粉末)或液体形式(例如作为溶液)提供在试剂盒中。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。
IV.实施例
这些实施例说明了如图1–2B中所示并且如本文所述的侧流装置用于进行Western印迹测定。
实施例1——使用不同稀释度的二抗从HEK293细胞裂解物中检测微管蛋白和GAPDH
将冻干的HEK293蛋白裂解物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)的PrecisionAb对照裂解物VLY001)在含有40mM DTT的1X Laemmli样品缓冲液中重构，并通过在100℃加热5分钟使其变性。将一系列裂解物的两倍稀释液(20ug至0.04ug)负载到4-20％TGX微型凝胶(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories))上，并在250V下电泳25分钟。使用Transblot Turbo装置和预装的转移包将各凝胶转移至PVDF膜，使用1.3A×7min的设定。转移后，将膜在1X PBS缓冲液中快速漂洗，然后置于含有1％酪蛋白、1X PBS缓冲液、0.1％吐温20的侧流缓冲液中，并置于摇动器上10分钟以封闭。当膜在侧流缓冲液中孵育时，通过将各5μl的兔抗微管蛋白多克隆Ab(细胞信号技术公司(Cell signaling Technologies)#2148)和兔抗GAPDH mAb(细胞信号技术公司(Cell Signaling Technologies)#5174)抗体混合到5ml侧流缓冲液中来制备一抗。在侧流缓冲液中以三种不同的稀释度(1:1000，1:5000和1:10000)制备二抗(山羊抗兔IgG-HRP抗体偶联物，细胞信号技术公司(CellSignaling Technologies)#7074)。使用具有4个～2.5×10cm的室的单独托盘用抗体和洗涤溶液润湿试剂层。将以下溶液移液至室中：将4.5ml一抗移液至室1，将4.5ml侧流缓冲液移液至室2(洗涤1)，将4.5ml二抗移液至室3，将27ml侧流缓冲液移液至包含30层TransblotTurbo垫材料的堆叠的室4(洗涤2)。将一张印迹纸加入室1至3中的每个室中以完全吸收溶液，从而可逆地将试剂固定在印迹纸中。
印迹检测如下进行。将纸芯吸垫(GE医疗公司(GE Healthcare)的1CHR纸)切成8.7cm×18.7cm，并放入真空模塑托盘的底部，如图2A所示。将9层约4cm×9.5cm的厚印迹纸(Bio-Rad)置于芯吸垫的一端上以用作泵。用3.5ml侧流缓冲液润湿纸芯并滚动以除去气泡。将膜从封闭中取出并倒置(抗原侧朝下)到芯吸垫上，其中低分子量蛋白质最靠近泵；通过滚动去除气泡。分别含有吸收的一抗、洗涤1的溶液、二抗和洗涤2的溶液的印迹纸各层层叠叠在与泵相对的芯吸垫的端部上，其中一抗层接触芯吸垫(即，一抗层是试剂层堆叠中的第一层(或底层))。将与芯吸垫相似尺寸的海绵置于抗体/缓冲液储器堆叠和泵的顶部上。将塑料盖放置在海绵的顶部上，并使用长尾夹将盖子夹在底部托盘上。使用单独的装置测试三种不同稀释度的二抗中的每一种。将装置在室温下保持在水平表面上不受干扰。5小时后，从装置中取出膜并在1X PBS中洗涤1x 5分钟。然后根据说明书使用Clarity化学发光底物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories))进行检测。图6A、6B和6C分别是对应于二抗的1:1000、1:5000和1:10000稀释度的三个印迹膜的图像。使用Bio-Rad的ChemidocMP成像仪从印迹的8秒曝光中获取图像。图像显示在二抗的所有三种稀释度下均检测到两种靶抗原。
实施例2——在PVDF和硝化纤维素膜上检测HEK293裂解物中的PCNA抗原
条件如实施例1中所述。一抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的小鼠抗PCNA mAb(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#VMA00018)。二抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#STAR207P)。使用ChemidocMP成像仪从0.7秒曝光拍摄印迹图像(参见图7A和7B)。图像显示在两种类型的膜材料上在多种稀释度下检测到靶抗原，PVDF显示出比硝化纤维素更好的灵敏度。
实施例3——在PVDF膜上检测HEK293裂解物中的GSK3a/b抗原
条件如实施例1中所述。一抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的小鼠抗GSK3a/bmAb(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#VMA00342)。二抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#STAR207P)。使用ChemidocMP成像仪从印迹的2秒曝光拍摄如图8所示的图像。该图像显示在多个稀释度下检测到靶抗原。
实施例4——在PVDF膜上检测HEK293裂解物中的PARP抗原
条件如实施例1中所述。一抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的小鼠抗PARP mAb(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#VMA00016)。二抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#STAR207P)。使用ChemidocMP成像仪从印迹的6秒曝光拍摄如图9所示的图像。该图像显示在多个稀释度下检测到靶抗原。
实施例5——在PVDF膜上检测HEK293裂解物中的hRAS抗原
条件如实施例1中所述。一抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的小鼠抗hRAS(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#VMA00040)。二抗是在侧流缓冲液中以1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物(生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)，#STAR207P)。使用ChemidocMP成像仪从印迹的12秒曝光拍摄如图10所示的图像。该图像显示在多个稀释度下检测到靶抗原。
实施例1-5说明本文所述的侧流装置可依次递送Western印迹试剂(例如，特异性结合试剂、运行缓冲液、洗涤溶液)，并且无需用户干预芯吸垫上的印迹。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

Claims (25)

1.一种侧流装置，其包括：
由多孔材料构成的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于施加包含固定的分析物的基材的区域；
其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧边；
第一储器，其包括位于芯吸垫的第一端上的多个试剂层的堆叠；
第二储器，其包括位于芯吸垫的第二端上的吸收垫。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多个试剂层中的每一层包含固定在吸收垫中的试剂。
3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述多个试剂层中的每一层在其中具有不同的试剂。
4.如权利要求2或3所述的装置，其特征在于，所述试剂选自下组：一抗、二抗、第一洗涤溶液和第二洗涤溶液。
5.如权利要求1-4中任一项所述的装置，其特征在于，所述多个试剂层从与芯吸垫接触的试剂层开始，包括具有一抗的第一试剂层、具有第一洗涤溶液的第二试剂层、具有二抗的第三试剂层和具有第二洗涤溶液的第四试剂层。
6.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述第四试剂层的厚度是所述第三试剂层的至少两倍。
7.如权利要求5或6所述的装置，还包括包含第二洗涤溶液的第五试剂层。
8.如权利要求4-7中任一项所述的装置，其特征在于，所述第二洗涤溶液的体积是二抗体积的至少两倍。
9.如权利要求1-8中任一项所述的装置，其特征在于，所述多个试剂层中的每一层由吸收垫形成，并且第一试剂层的至少一部分与芯吸垫紧密接触。
10.如权利要求1-9中任一项所述的装置，其特征在于，所述分析物是蛋白质。
11.如权利要求1-10中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置密封在塑料外壳中。
12.如权利要求11所述的装置，其特征在于，所述塑料外壳包括模制的底部部分以及密封于所述底部部分的平面盖子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和储器是干燥的。
14.如权利要求1-12中任一项所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述第一储器中的至少一个是湿润的。
15.如权利要求1-14中任一项所述的装置，其特征在于，所述试剂层各自由选自下组的至少一种吸收材料形成：棉、玻璃纤维、纤维素、纤维素纤维衍生物、烧结玻璃、烧结聚合物、烧结金属和合成聚合物。
16.如权利要求15所述的装置，其特征在于，所述合成聚合物选自下组：聚丙烯酰胺、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、二乙烯基苯、乙烯聚合物、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、(C2-C6)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C1-C6)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰氨基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物和丙烯腈。
17.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述试剂层中的每一层还包括在下表面的一部分上的阻挡层。
18.一种用于侧流的试剂盒，所述试剂盒包含：
如权利要求1-17中任一项所述的装置。
19.一种进行侧流试验的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-17中任一项所述的装置；
将运行缓冲液施加到芯吸垫；
将包含蛋白质的基材施加到用于施加包含分析物的基材的区域；
任选地，用运行缓冲液润湿第一储器；和
使运行缓冲液从第一储器侧流到第二储器，使得多个试剂层中的试剂依次在芯吸垫中传送并与基材上的蛋白质接触。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，使发生侧流的步骤包括使来自第一试剂层的一抗与基材上如果存在的其靶蛋白结合，然后使来自第二试剂层的第一洗涤溶液从基材上除去未结合的一抗。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，使发生侧流的步骤还包括使来自第三试剂层的二抗或第二检测试剂接触与基材上如果存在的其靶蛋白结合的一抗。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，使发生侧流的步骤还包括使来自第四试剂层的第二洗涤溶液从基材上除去未结合的二抗。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其还包括将基本均匀的压力施加到第一储器和第二储器。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其还包括在所述一抗与如果存在的所述靶蛋白结合后(以及任选地，所述二抗或第二检测试剂与所述一抗接触后)，去除基材，并检测所述一抗与如果存在的所述靶蛋白的结合。
25.如权利要求19-24中任一项所述的方法，其特征在于，使发生侧流的步骤包括使试剂在流过第一储器并进入芯吸垫时沿着弯曲路径行进。
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