CN108414596A - 微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测端粒酶的微电极生物传感器，所述微电极具有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂丝对电极以及由带有二茂铁的巯基DNA底物链SH‑HC‑Fc修饰的金工作电极。本发明还提供上述微电极生物传感器在检测端粒酶中的应用，首先通过端粒酶产物形成一种三足DNA Walker，在Cu2+作用下，与金电极上修饰的带有二茂铁的巯基DNA底物链结合作用，用于检测端粒酶。该方法操作简单，成本低廉，使用方便，灵敏度高，优于传统的仪器分析方法，可用于肿瘤细胞中端粒酶的快速检测，在生物医学等领域中具有非常重要的应用前景。

Description

微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，具体地说，涉及一种微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用。
背景技术
端粒酶是在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，因此端粒酶在肿瘤诊断中具有重要意义。
目前，检测端粒酶的方法有很多，如比色法，表面等离子体共振，荧光，化学发光，电化学检测和电化学发光。特别地，由于电化学法具有微小化和高灵敏度的特点，越来越受到基层检测机构的青睐。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、使用方便、灵敏度高的用于检测端粒酶的微电极生物传感器，该微电极生物传感器可用于癌症诊断。
本发明的另一目的是提供上述微电极生物传感器在检测端粒酶中的应用。
本发明的构思如下：首先通过端粒酶作用形成一条DNA端粒酶产物链D-STP，与核酶链Y1和核酶链Y2配对后，形成一种三足DNA Walker结构；再在金电极上修饰一层带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc，与三足DNA Walker碱基互补配对后，在Cu2+作用下，SH-HC-Fc链被剪断，释放出带有二茂铁的DNA片段，引起电信号的增大。
为了实现本发明目的，本发明提供的用于检测端粒酶的微电极生物传感器，所述微电极具有三电极体系(购自上海仙仁仪器仪表有限公司)，包含Ag/AgCl参比电极(XR312)，铂丝对电极(XR316)以及由带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc修饰的金工作电极(XR301)。
其中，所述带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc的核酸序列为：5′-SH-CGATCCAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTGGAT CG-Fc-3′(SEQ ID NO:1)。其中，SH为巯基，Fc为二茂铁，HC是指这条链的核酸序列。
所述金工作电极的修饰方法如下：
依次用粒径0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光金电极，再依次在去离子水中超声清洗10min，无水乙醇中超声清洗10min，去离子水中超声清洗10min，然后置于piranha液中浸泡20min，用水清洗，然后在0.1M H2SO4中扫描循环伏安，在-0.3～1.55V电位下循环伏安扫描20-40次，直到得到理想的氧化还原峰；最后将10μL 2μM带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc滴在处理好的金电极表面，静置12h，即得。
本发明中，所述piranha液为98％的硫酸和30％的双氧水按7:3体积比的混合液。
本发明还提供所述微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用，包括以下步骤：
1)待测样品中端粒酶的提取；
2)端粒酶的扩展：向步骤1)所得端粒酶提取物中加入模板链引物和dNTPs，在端粒酶作用下，将特异性序列(AATCCG)n添加到端粒末端模板链上，得到一条DNA端粒酶产物链D-STP；其中，n为大于等于1的整数；
3)三足DNA Walker的制备：将上述DNA端粒酶产物链D-STP与铜核酶链Y1和铜核酶链Y2配对，形成具有三方互补结构的三足DNA Walker；其中，铜核酶链Y1和铜核酶链Y2的核苷酸序列分别为5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTCCCTAACCCTAAGGTACGGATC-3′和5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTGATCCGTACCCCCTAACCCTAA-3′(SEQ ID NO:2-3)；
4)电化学检测：向所述微电极生物传感器的金工作电极上滴加上述三足DNAWalker，在Cu2+存在下，在0～0.6V工作电位下进行循环伏安扫描，根据端粒酶浓度与电流关系获得微电极检测端粒酶工作曲线。
前述的应用，步骤1)提取端粒酶的具体操作如下：将待测细胞样本在含有10v/v％胎牛血清的DMEM培养基中培养，并将细胞置于37℃，95％空气和5％CO2的条件下培养，在细胞生长的指数期收集1×106个细胞至1.5mL离心管中，用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于100μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液中，冰上孵育30min，然后4℃，12 000rpm离心20min，将上清液转移至另一离心管中，即为端粒酶提取物。所得端粒酶提取物立即用于端粒酶测定或在-80℃冷冻保存。
优选地，所述细胞为HeLa细胞；步骤4)所述微电极最低检测限为2-40个HeLa细胞/mL，线性范围为101-107个HeLa细胞/mL，端粒酶浓度与响应峰电流的线性方程为：ip＝67.8log N–21.7，相关性系数为0.988。其中，N为端粒酶浓度。
前述的应用，步骤2)扩展端粒酶的具体操作如下：向45μL扩展反应缓冲液中加入5μL上述端粒酶提取物，2-20μL 1mM dNTP和2-20μL 0.5μM模板链引物，混合物于10℃-37℃孵育60-120min，最后于90℃放置10min终止反应，得到DNA端粒酶产物链D-STP溶液。
所得DNA端粒酶产物链D-STP的核苷酸序列为：5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACAATCCGT CGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3′(SEQ ID NO:4)。
本发明中，扩展反应缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，63mMKCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，0.1mg/mL BSA。
本发明中，模板链引物的核苷酸序列为：5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACAATCCGT CGAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO:5)。
前述的应用，步骤3)制备三足DNA Walker的具体操作如下：以50mM HEPES缓冲液为溶剂分别配制5-50nM的铜核酶链Y1溶液和5-50nM的铜核酶链Y2溶液，然后将上述DNA端粒酶产物链D-STP溶液5-20μL与铜核酶链Y1溶液5-20μL与铜核酶链Y1溶液5-20μL和铜核酶链Y2溶液5-20μL混合，于10℃-37℃孵育60-120min，所得反应产物即为三足DNA Walker。
本发明中，所述HEPES缓冲液的配制方法为：称取5.9575g HEPES和43.83g NaCl置于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，定容至500mL，再用KOH溶液调pH值至7.0-7.3，即得。
前述的应用，步骤4)在Cu2+浓度为10nM的条件下进行电化学检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次将三足DNA Walker和电化学方法联合用于端粒酶检测中，可实现对端粒酶进行定性或定量检测。本发明通过端粒酶产物形成一种三足DNA Walker，在Cu2+作用下，与金电极上修饰的带有二茂铁的巯基DNA底物链结合作用，用于检测端粒酶。该方法操作简单，成本低廉，使用方便，灵敏度高，优于传统的仪器分析方法，可用于肿瘤细胞中端粒酶的快速检测，在生物医学等领域中具有非常重要的应用前景。
附图说明
图1为本发明三足DNA Walker制备过程示意图。其中，11为模板链引物，12为DNA端粒酶产物链D-STP，13为核酶链Y1，14为核酶链Y2，15为三足DNA Walker。
图2为本发明三足DNA Walker电化学检测端粒酶原理示意图。其中，21为带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc，22为金电极，23为带有二茂铁的DNA片段。图中圆点代表二茂铁。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1用于检测端粒酶的微电极生物传感器的制备方法
本实施例中提供的用于检测端粒酶的微电极生物传感器，所述微电极具有三电极体系(购自上海仙仁仪器仪表有限公司)，包含Ag/AgCl参比电极(XR312)，铂丝对电极(XR316)以及由带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc修饰的金工作电极(XR301)。
其中，所述带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc的核酸序列为：5′-SH-CGATCCAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTGGAT CG-Fc-3′。其中，SH为巯基，Fc为二茂铁，HC是指这条链的核酸序列。
所述金工作电极的修饰方法如下：依次用粒径0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光金电极，再依次在去离子水中超声清洗10min，无水乙醇中超声清洗10min，去离子水中超声清洗10min，然后置于piranha液中浸泡20min，用水清洗，然后在0.1M H2SO4中扫描循环伏安，在-0.3～1.55V电位下循环伏安扫描20-40次，直到得到理想的氧化还原峰；最后将10μL2μM带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc滴在处理好的金电极表面，静置12h，即得。
实施例2基于三足DNA Walker和微电极生物传感器检测端粒酶的方法
主要步骤如下：
1、待测样品中端粒酶的提取。
将人宫颈癌细胞(HeLa)和人正常肝细胞(LO-2)在含有10v/v％胎牛血清的DMEM培养基中培养，并将细胞置于37℃，95％空气和5％CO2的条件下培养，在细胞生长的指数期收集1×106个细胞至1.5mL离心管中，用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于100μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液中，冰上孵育30min，然后4℃，12 000rpm离心20min，将上清液转移至另一离心管中，即为端粒酶提取物。所得端粒酶提取物立即用于端粒酶测定或在-80℃冷冻保存。
2、端粒酶的扩展反应：向45μL扩展反应缓冲液中加入5μL上述端粒酶提取物，2μL1mM dNTP和6.25μL 0.5μM模板链引物，混合物于37℃孵育60min，最后于90℃放置10min终止反应，得到DNA端粒酶产物链D-STP溶液。所得DNA端粒酶产物链D-STP的核苷酸序列为：
5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3′
3、三足DNA Walker的制备：以50mM HEPES缓冲液为溶剂分别配制5-50nM的铜核酶链Y1溶液和5-50nM的铜核酶链Y2溶液，然后将上述DNA端粒酶产物链D-STP溶液10μL与铜核酶链Y1溶液10μL和铜核酶链Y2溶液10μL混合，于37℃条件下孵育60min，所得反应产物即为三足DNA Walker。
其中，铜核酶链Y1和铜核酶链Y2的核苷酸序列分别为5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTCC CTAACCCTAAGGTACGGATC-3′和5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTGA TCCGTACCCCCTAACCCTAA-3′。
4、电化学检测：向所述微电极生物传感器的金工作电极上滴加上述三足DNAWalker，在10nM Cu2+作用下，在0-0.6V工作电位下进行循环伏安扫描，根据端粒酶浓度与电流关系获得微电极检测端粒酶工作曲线。
实施例3HeLa细胞的检测
通过测试一系列已知浓度的HeLa细胞标准溶液的峰值电流，以峰值电流与HeLa细胞浓度的对数值绘制工作曲线，端粒酶浓度与响应峰电流的线性方程为：ip＝67.8log N–21.7，相关性系数为0.988，其线性关系范围为101-107个HeLa细胞/mL，在S/N＝3时，计算出检测限为2个HeLa细胞/mL。单个细胞中端粒酶的活性为3.4×10-12IU。
实施例4电化学检测方法重现性的分析
本实施例测定三足DNA Walker电化学检测端粒酶的重现性，采用实施例3的方法，对于500、5000和50000个HeLa细胞，峰值电流强度的RSD(n＝3)分别为2.5％、3.6％和4.5％，说明所述三足DNA Walker电化学检测法具有良好的重现性，确保了所测实验数据的准确性。
实施例5电化学检测方法的特异性分析
本实施例测定三足DNA Walker电化学检测端粒酶的特异性。所考察的干扰细胞分别为：LO-2细胞、HEK293细胞、HaCaT细胞以及被高温处理失活的HeLa细胞。结果表明，当加入以上四种细胞时，峰值电流很小，由此可见，上述物质对端粒酶检测过程不会产生明显的干扰影响，表明所述三足DNA Walker电化学检测端粒酶的方法具有很好的特异选择性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 长沙理工大学
<120> 微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用
<130> KHP171117336.0
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatccaaag cttctttcta atacggctta ccttggatcg 40
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacttttt tccctaaccc taaggtacgg 60
atc 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacttttt tgatccgtac cccctaaccc 60
taa 63
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacaatcc gtcgagcaga gtt 53
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacaatcc gtcgagcaga gttagggtta 60
gggttagggt t 71

Claims (8)

1.用于检测端粒酶的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极具有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂丝对电极以及由带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc修饰的金工作电极；
其中，所述带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc的核酸序列为：5′-SH-CGATCCAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTGGATCG-Fc-3′。
2.权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述金工作电极的修饰方法如下：
依次用粒径0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光金电极，再依次在去离子水中超声清洗10min，无水乙醇中超声清洗10min，去离子水中超声清洗10min，然后置于piranha液中浸泡20min，用水清洗，然后在0.1M H2SO4中扫描循环伏安，在-0.3～1.55V电位下循环伏安扫描20-40次；最后将10μL 2μM带有二茂铁的巯基DNA底物链SH-HC-Fc滴在处理好的金电极表面，静置12h，即得；
其中，所述piranha液为98％的硫酸和30％的双氧水按7:3体积比的混合液。
3.权利要求1或2所述微电极生物传感器及其在检测端粒酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测样品中端粒酶的提取；
2)端粒酶的扩展：向步骤1)所得端粒酶提取物中加入模板链引物和dNTPs，在端粒酶作用下，将特异性序列(AATCCG)n添加到端粒末端模板链上，得到一条DNA端粒酶产物链D-STP；其中，n为大于等于1的整数；
3)三足DNA Walker的制备：将上述DNA端粒酶产物链D-STP与铜核酶链Y1和铜核酶链Y2配对，形成具有三方互补结构的三足DNA Walker；其中，铜核酶链Y1和铜核酶链Y2的核苷酸序列分别为5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTCCCTAACCCTAAGGTACGGATC-3′和5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACTTTTTTGATCCGTACCCCCTAACCCTAA-3′；
4)电化学检测：向所述微电极生物传感器的金工作电极上滴加上述三足DNA Walker，在Cu2+存在下，在0～0.6V工作电位下进行循环伏安扫描，根据端粒酶浓度与电流关系获得微电极检测端粒酶工作曲线。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)提取端粒酶的具体操作如下：将待测细胞样本在含有10v/v％胎牛血清的DMEM培养基中培养，并将细胞置于37℃，95％空气和5％CO2条件下培养，在细胞生长的指数期收集1×106个细胞至1.5mL离心管中，用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于100μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液中，冰上孵育30min，然后4℃，12 000rpm离心20min，将上清液转移至另一离心管中，即为端粒酶提取物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞为HeLa细胞；步骤4)所述微电极最低检测限为2-40个HeLa细胞/mL，线性范围为101-107个HeLa细胞/mL，端粒酶浓度与响应峰电流的线性方程为：ip＝67.8log N–21.7，相关性系数为0.988；其中，N为端粒酶浓度。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)扩展端粒酶的具体操作如下：向45μL扩展反应缓冲液中加入5μL上述端粒酶提取物，2-20μL 1mM dNTP和2-20μL 0.5μM模板链引物，混合物于10℃-37℃孵育60-120min，最后于90℃放置10min终止反应，得到DNA端粒酶产物链D-STP溶液；
其中，所述扩展反应缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，0.1mg/mL BSA；
所述模板链引物的核苷酸序列为：5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACAATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；
所得DNA端粒酶产物链D-STP的核苷酸序列为：5′-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3′。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)制备三足DNA Walker的具体操作如下：以50mM HEPES缓冲液为溶剂分别配制5-50nM的铜核酶链Y1溶液和5-50nM的铜核酶链Y2溶液，然后将上述DNA端粒酶产物链D-STP溶液5-20μL与铜核酶链Y1溶液5-20μL和铜核酶链Y2溶液5-20μL混合，于10℃-37℃孵育60-120min，所得反应产物即为三足DNA Walker；
其中，所述HEPES缓冲液的配制方法为：称取5.9575g HEPES和43.83g NaCl置于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，定容至500mL，再用KOH溶液调pH值至7.0-7.3，即得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤4)中Cu2+的浓度为10nM。
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