CN113390977B - 一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的方法，通过超滤离心，并选取合适的截留分子量限制范围的滤膜，去除唾液中的蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇，再以合适的比例加入甲醇等防吸附试剂，攻克了唾液中游离态T3、rT3、T4和皮质醇检测过程中存在的严重吸附问题。利用高效液相色谱串联质谱分析技术，一次同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇四种游离态激素。该方法具有高通量，操作简便，处理效率高，耗材成本低，准确度高和灵敏度高的优点，便于临床推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分析技术领域，具体而言，涉及一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的方法。
背景技术
甲状腺激素是人体重要的内分泌激素，甲状腺激素的主要功能是提高机体的新陈代谢率，增加耗氧量，促进生长发育，促进神经系统的分化和成熟。甲状腺激素包括甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、反三碘甲腺原氨酸(rT3)。甲状腺激素是评价甲状腺功能的重要标志，是甲状腺对于靶器官的主要激素，血清中甲状腺激素的总浓度是反映甲状腺的分泌状态。
皮质醇是体内重要的一种糖皮质激素，负责调节情绪，健康，维持免疫细胞和炎症，血管与血压等生理功能。临床上通过测定血清或者唾液中皮质醇的水平来评价下丘脑-垂体-肾上腺轴功能。其中唾液中皮质醇的水平与血清皮质醇的水平相关，可用来评价人体内循环系统内皮质醇的水平。临床上，采用皮质醇的水平用来对库欣综合征，肾上腺皮质功能减退等疾病进行诊断和筛查。
皮质醇也被称为压力荷尔蒙，目前的研究倾向于将压力与较高的皮质醇水平联系在一起。《临床内分泌与代谢》杂志发表的一项研究表明，皮质醇会降低TSH，从而降低甲状腺激素的产生。皮质醇抑制T4向T3的转化，导致甲状腺功能减退。皮质醇加重甲状腺功能减退症状的另一种方式是通过它对血糖的影响，皮质醇水平的高低都会引起血糖平衡紊乱，导致低血糖和高血糖，同时由研究表明低血糖与甲状腺功能减退存在相互影响。可见，皮质醇水平高低与甲状腺激素含量之间有着密切联系，非常有必要通过同时检测人体内的甲状腺激素和皮质醇含量用于临床疾病的辅助诊断和健康管理。
传统检测样本为血清，测定血清中总的或者游离浓度的激素。现有研究证明唾液中甲状腺激素和皮质醇的水平与血清皮质醇的水平具有很好的相关性，甚至有许多临床研究证实唾液是更准确的临床指标。如能采用唾液样本来同时精确检测甲状腺激素和皮质醇，由于唾液采样具有无创伤，操作简便，可以连续采样，受到蛋白的干扰较小等优点，将为临床诊断带来更多的便利。
类固醇激素部分与蛋白结合呈结合态，未结合的激素呈现游离态，其中甲状腺激素在外周血中大部分与甲状腺结合蛋白结合，发挥生理作用的主要是游离T4(FT4)和游离T3(FT3)。因此，在临床检测中，最常用的指标为T3、T4、FT3、FT4。但是由于血清和唾液中的游离态的甲状腺激素含量较低，为pg/mL水平，因此对于检测方法的灵敏度和特异性要求极高。
传统的检测方法包括免疫法、电化学法、荧光法等，但是具有特异性差，无法解决内源性和外源性的糖皮质激素的干扰问题，以及唾液中皮质醇水平较低的问题，检测准确度较低。现有方法在不断的改进中，已有研究通过HPLC-MS/MS方法检测血清中总甲状腺激素的定量分析方法。但是无法同时检测游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇，且不适用于唾液样本，限制了其应用范围。
CN107576624B公开了一种唾液中皮质醇的检测方法，通过采用复合微滤膜进行过滤处理，去除唾液中的唾液粘蛋白，但该方法并不能去除唾液中结合态的皮质醇和甲状腺激素，样本中残留的结合态激素将会影响游离态激素的检测结果，因此不能用于准确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇。
由于唾液中游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇含量非常低，目前还没有一种简便高效的检测分析方法，可以实现同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇4种游离态激素的含量。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种改进的人唾液样本中同时检测游离态甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的高效液相色谱串联质谱分析方法，通过超滤离心，完全去除唾液中的所有蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇，再加入甲醇等防吸附试剂，直接进行高效液相色谱串联质谱分析，可同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇，该方法具有高通量，操作简便，准确度高和灵敏度高的优点，便于临床推广和应用。
一方面，本发明提供一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的方法，主要包括以下步骤：
1)取唾液样本，离心；
2)取上清液置于超滤离心管，进行超滤离心；
3)收集超滤离心获得的滤液，加入内标溶液和用于防吸附的有机溶剂，涡旋混匀，进液相色谱质谱联用系统分析。
本发明经过大量研究证实，经超滤离心，可以完全去除唾液中的所有蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇，但是获得的滤液在进行高效液相色谱串联质谱分析过程中时，样本中的游离态甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇容易被耗材吸附，导致检测结果明显偏低，难以实现精确检测。
由于唾液中的游离态甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇浓度为pg/mL级别，极性较小，与血清样本的检测完全不同，检测过程中容易出现耗材吸附(如在高效液相串联质谱的高通量检测过程中，96孔板对其存在吸附)等干扰问题，为防止超滤膜对其的吸附，本发明更换了多种不同厂家的超滤膜，最后选用了Ultracel PL再生纤维素超滤膜才真正解决了吸附问题，但是96孔板对其的吸附问题却始终难以解决，即使更换为低吸附96孔板，仍然存在非常明显的吸附问题，使检测结果明显偏低。
未经超滤时，可能由于唾液样品中含有的蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇等的存在，耗材对游离态甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的吸附作用较小，但经超滤提纯后，超滤液中的游离态甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇在检测过程中很容易因吸附等问题而导致检测结果偏低。
为了解决滤液中的游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇容易被耗材吸附的问题，发明人经过大量的实验后发现，在滤液中加入大量的甲醇、乙腈或异丙醇等有机溶剂，可有效防止吸附问题；同时还可能由于甲醇等有机溶剂的加入，进一步降低了超滤液中的基质效应，使四种游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇更加稳定，显著提升检测灵敏度，从而真正实现同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇4种游离态的激素。
进一步地，所述用于防吸附的有机溶剂为选自甲醇、乙腈、异丙醇中的任意一种或两种；所述的超滤离心获得的滤液和防吸附有机溶剂的体积比例为1:1～1:5。
加入的甲醇等有机溶剂的量需达到样本本身体积的1到5倍，才能起到明显的防吸附作用。
进一步地，研究证明，甲醇的防吸附效果更好，可明显提升检测灵敏度。
进一步地，步骤2)所述的超滤离心管的规格为采用Ultracel PL再生纤维素超滤膜，滤膜截留分子量限制范围在10K-100K。
超滤法是实验室检测游离态物质的常用方法，超滤可以分离小分子物质和蛋白，其利用高压力或者离心力，从而使得游离态的小分子通过半透膜，而大分子蛋白以及与蛋白结合的小分子则留在膜上，通过选择合适规格的滤膜可以截留不同分子量的蛋白质。
合适的截留分子量的滤膜，能帮助完整去除唾液中的所有蛋白，包括与结合态激素T3、rT3、T4结合在一起的蛋白，从而进一步提升唾液中游离态激素的检测灵敏度。
进一步地，步骤2)所述的超滤离心时间为15min～1h，离心转速为2000～4000rpm，离心机的离心温度为36～38℃；步骤1)所述的离心转速为3000～4000rpm。
进一步地，步骤2)所述的超滤离心管包括内管和收集管，先将上清液置于内管，然后将内管插入收集管中，放入离心机中进行超滤离心，超滤离心获得的滤液位于收集管中；离心机启动和停止过程采用慢加速和慢减速模式，缓慢提高和降低转速。
进一步地，步骤3)所述的内标溶液含有T3-13C6、rT3-13C6、T4-13C6和Cortisol-d4。
进一步地，所述方法还包括步骤4)的质控样本结果比较和检测误差评价；所述步骤4)的质控样本的制备方法为：唾液样本通过超滤管过滤得到的滤出液，加入同体积的有机溶剂，混匀，加入含有不同浓度的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的混合标准溶液，得到含有低、中、高三个不同水平浓度的唾液基质样品作为质控样本。
此外，现有的研究和文献尚无对该检测方法的检测误差进行系统质量控制的体系和方法，难以保证不同批次检测结果的重现性和一致性，以及方法的可靠性进行评价，为了解决该问题，发明人尝试建立一套质量控制样本的配置方法，综合考虑到4种激素的前处理中超滤的操作和吸附的问题。
本发明通过配置含有低、中、高三个不同浓度水平的唾液基质样品作为质控样本，从而保证了每一次检测的精确度控制。同时因为采用了质控样本，帮助发明人发现了在游离态T3、rT3、T4和皮质醇检测过程中存在的较严重的吸附问题，唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇含量本身就非常低，吸附问题的存在将极大地影响唾液中4种游离态激素的检测结果。也正是在质控样本的辅助下，发明人经过大量研究，发现并证实了防吸附试剂对游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的功效，真正攻克了唾液中游离态T3、rT3、T4和皮质醇检测过程中存在的严重吸附问题，极大地提高了检测灵敏度，将为临床疾病的辅助诊断和健康管理带来更多的便利。方便该方法的推广和应用，可帮助科研人员即时发现检测中存在的问题，并使得室间结果比对研究成为可能。
进一步地，步骤3)所述的液相色谱质谱联用系统，其中的液相色谱采用梯度洗脱模式，色谱柱为C18或者苯基填料柱，流动相A为0.05-0.2体积％的甲酸水溶液，流动相B相为0.05-0.2体积％甲酸的乙腈溶液，采用梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比为60～0％：40～100％。
进一步地，所述液相色谱质谱联用系统采用的质谱为三重四极杆质谱仪，采用电喷雾离子源和正离子模式(ESI+)和多反应监测(MRM)模式进行质谱检测；所述步骤4)的质控样本结果比较和检测误差评价，通过比较质控样本的检测数值和理论靶值的偏差，评价该批次检测过程的准确度和误差，检测结果包括质控样本的T3、rT3、T4和皮质醇4种激素的实测水平。
另一方面，本发明提供了一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的检测试剂盒，所述试剂盒包含标准工作液、质控样本、内标溶液、防吸附试剂和液相色谱流动相；所述标准工作液为：含有标准浓度的游离甲状腺激素T3、rT3、T4或皮质醇中的任意一种或多种的溶液；所述质控样品为：含有低、中、高三个不同水平浓度的唾液基质样品；所述防吸附试剂为甲醇；所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为0.05-0.2体积％的甲酸水溶液，流动相B相为0.05-0.2体积％甲酸的乙腈溶液。
再一方面，本发明提供了甲醇用于制备防止唾液中的甲状腺激素被耗材吸附的防吸附试剂的用途。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过选取合适的截留分子量限制范围的滤膜，实现完全去除唾液中的所有蛋白和结合态的甲状腺激素T3、rT3、T4、皮质醇，从而提升唾液中游离态甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的检测灵敏度；
(2)通过选取最佳的防吸附试剂，及最合适的添加比例，真正攻克了唾液中游离态T3、rT3、T4和皮质醇检测过程中存在的严重吸附问题，极大地提高了检测灵敏度；
(3)同时还可能由于甲醇等有机溶剂的加入，进一步降低了超滤液中的基质效应，使四种游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇更加稳定，更容易被精确检测，显著提升检测灵敏度，从而真正实现同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇4种游离态的激素；
(4)一次检测可以同时定量唾液中游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素的水平；
(5)前处理操作简便，避免了液液提取、吹干复溶、固相萃取、衍生化等复杂操作，对操作人员的要求较低，同时节约人力和工作时间，适于高通量操作和检测方式的自动化，处理效率高，耗材成本低，将为临床疾病的辅助诊断和健康管理带来更多的便利；
(5)配备了质量控制的样本和方法，方便科研人员及时发现检测中的问题并进行纠正，方便方法的临床推广应用。
附图说明
图1为实施例1中的低浓度质控(L)样品经前处理后的液相检测色谱图，其中图1(上)为样品中游离态的甲状腺激素T3、rT3的色谱图；图1(中)为游离态的甲状腺激素T4的色谱图，图1(下)为游离态的皮质醇的色谱图。
图2为实施例1中的甲状腺激素T3的标准曲线。
图3为实施例1中的甲状腺激素T4的标准曲线。
图4为实施例1中的甲状腺激素rT3的标准曲线。
图5为实施例1中的皮质醇的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1样本制备、前处理和检测
以下配制基于使用固态标准品，如使用商业化购买的标准贮备溶液则需根据实际使用标准贮备液浓度调整配制方法。
一、样本制备
1、标准系列溶液的配制
1.1 4种激素的一级储备液的配制
甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇一级储备液的配制：按表1，精密称取适量的标准品，加入适量体积的甲醇，配置得到4种激素的一级储备溶液。
表1、一级储备液的配制
1.2 4种激素的二级储备液的配制
分别吸取适量体积的4种激素的一级储备液，加入适量体积的甲醇稀释成为4种激素的二级储备液，具体稀释见表2。
表2、二级储备液的配制
1.3 4种激素的三级储备液的配制
分别吸取适量体积的4种激素的二级储备液，加入适量体积的甲醇稀释成为4种激素的三级储备液，具体稀释见表3。
表3、三级储备液的配制
1.4四级储备液的配制
分别吸取适量体积的3种激素的三级储备液，加入适量体积的50％甲醇稀释成为四级储备液，具体稀释见表4。
表4、四级储备液的配制
1.5混合MIX储备液的配置
分别吸取不同浓度的4种激素的储备液，加入同一离心管中，进一步加入50％甲醇溶液稀释得到4种激素的混合mix储备液，具体见表5。
表5、混合MIX储备液的配制
1.6标准曲线工作溶液配制
采用MIX混合储备液用50％甲醇稀释得到系列标准溶液SD1～SD6；具体配制方法见表6。
表6、标准曲线工作溶液的配制
以上配制的储备液保存于-80℃冰箱中；标准曲线工作溶液分装成小份，暂时不用的部分保存于-80℃冰箱中，现用工作溶液保存于4℃冰箱中。
2、内标工作液的配制
2.1内标储备液的配制
T3-13C6、rT3-13C6、T4-13C6和Cortisol-d4的一级储备液的配制：按表7，精密称取适量的标准品，加入适量体积的甲醇，配制得到4种激素内标的一级储备溶液。
表7、4种激素内标的一级储备溶液的配制
2.2内标二级储备液的配制分别吸取适量体积的4种激素内标一级储备液，加入适量体积的50％甲醇稀释成为4种激素的二级储备液，具体稀释见表8。
表8、4种激素内标的二级储备溶液的配制
2.3内标三级储备液的配制
分别吸取适量体积的3种激素内标的二级储备液，加入适量体积的甲醇稀释成为3种激素的内标三级储备液，具体稀释见表9。
表9、3种激素内标的三级储备溶液的配制
2.4混合内标MIX储备液的配制
分别吸取不同浓度的4种激素内标的储备液，加入同一离心管中，进一步加入体积比0.1％甲酸甲醇溶液稀释得到4种激素的内标混合mix工作液，具体见表10。
表10、混合内标MIX储备液的配制
2.5内标工作液的配置
取适量的混合内标MIX储备液加入体积比0.1％甲酸甲醇溶液稀释得到内标工作液，具体配置方法见表11。
表11、内标工作液的配制
3、质控样本的配制
(1)取经过超滤管过滤的人唾液样本，混合均匀，加入相同体积的甲醇，作为本底；
(2)取100微升MIX混合储备液，加入900微升的本底，作为高浓度质控(H)；
(3)取50微升MIX混合储备液，加入950微升的本底，作为中浓度质控(M)；
(4)取10微升MIX混合储备液，加入990微升的本底，作为低浓度质控(L)。
二、样本前处理
(1)用样本采集管采集唾液样本或标准曲线工作液或质控样本1ml左右，将样本采集管置于离心机，3500rpm离心10min；
(2)从唾液采集管中取0.5mL上清液，缓慢加入到超滤离心管的内管中，并将内管插入到收集管中，其中超滤离心管为Millpore Centrifree超滤装置，配备有Ultracel PL再生纤维素超滤膜，分子量限值(NMWL)为30K；
(3)将步骤(2)组装好的超滤离心管放入到离心机的转子插槽中，离心30min，离心过程的参数为：离心机温度为37℃；离心速度为2800rpm，启动加速设置为1(慢速启动模式)，停止减速设置为1(慢速减速模式)；唾液样本从内管渗透转移到收集管中；
(4)从超滤管的收集管中取100微升滤出液，依次加入20微升内标工作液和100微升甲醇(防吸附试剂)，混合均匀，准备进行液相色谱串联质谱系统分析。
三、样本检测
进行液相色谱串联质谱分析时，液相色谱采用梯度洗脱，反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为Phenomenex Kinetex 2.6μm苯基柱(100A，3×100mm)，流速为0.6mL/min，柱温为40℃；其中流动相A相为体积比0.1％的甲酸水溶液，流动相B相为体积比0.1％甲酸的乙腈溶液，流动相A和流动相B的体积比为90～5％：10～95％。梯度程序如表12所示，甲状腺激素T3及内标的保留时间为3.46min，甲状腺激素rT3及其内标的保留时间为3.63min，甲状腺激素T4及其内标的保留时间为3.90min，皮质醇及其内标的保留时间为3.08min。
表12、梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 1.2 | 90 | 10 |
| 1.25 | 75 | 25 |
| 3 | 65 | 35 |
| 3.6 | 45 | 55 |
| 3.65 | 5 | 95 |
| 4.55 | 5 | 95 |
| 4.6 | 90 | 10 |
| 5.3 | 90 | 10 |
进行质谱检测时，采用三重四极杆质谱仪检测定量，仪器型号为SCIEX TripleQuad6500+，采用电喷雾离子源的正离子模式(ESI+)和多反应监测MRM模式进行质谱检测，相应的质谱检测方法设置如下表13所示，质谱参数条件如表14所示。
表13、质谱检测方法参数
| 分析物/内标 | Q1 | Q3 | 去簇电压DP | 碰撞能量CE | 碰撞室出口电压CXP |
| T4 | 777.6 | 731.7 | 135 | 37 | 14 |
| T4 3C6-1 | 783.8 | 737.8 | 137 | 33 | 13 |
| T3 | 651.9 | 605.8 | 114 | 30 | 11 |
| T3 13C6-1 | 658 | 611.8 | 113 | 29 | 12 |
| rT3 | 651.9 | 605.8 | 76 | 31 | 12 |
| rT3 13C6-1 | 657.9 | 611.7 | 117 | 31 | 12 |
| Cortisol-1 | 363.3 | 309.2 | 63 | 25 | 4 |
| Cortisol-d4 | 367.4 | 313.1 | 115 | 25 | 6 |
表14、质谱参数条件
采用三重四极杆质谱仪可通过多反应监测MRM模式的离子对，以及对应的保留时间，来进行唾液样本中游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素的检测，利用同位素的内标消除样本的基质效应，从而准确定量唾液样本中游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素的含量。
图1为低浓度质控(L)样品经前处理后，通过液相色谱分离后，4种激素在不同洗脱时间出峰，并且通过MRM模式检测到，定量其含量，其中图1(上)为样品中游离态的甲状腺激素T3、rT3的色谱图；图1(中)为游离态的甲状腺激素T4的色谱图，图1(下)为游离态的皮质醇的色谱图。
四、数据处理与分析
1、绘制标准曲线
标准曲线样品通过液相色谱分离后，4种激素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱MRM模式检测到，从而检测其含量。按照一定的标样浓度，配置待测样品进行检测，以游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素标准品浓度为横坐标，以与游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，制得标准曲线如图2-5所示，其中图2为甲状腺激素T3的标准曲线，图3为甲状腺激素T4的标准曲线，图4为甲状腺激素rT3的标准曲线，图5为皮质醇的标准曲线；标准曲线方程及相关系数如表15所示，可见在标准曲线所示的浓度范围内，线性关系良好。
表15、标准曲线回归方程及相关系数
2、准确度考察
使用质控样本中待测物与其内标峰面积比，代入建立的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素的标准曲线中，计算得到质控样本中4种游离态激素的浓度，再计算出三种浓度的质控样本的检测准确度，检测结果如表16-19所示。
表16、T3的准确度
| T3 | T3 | T3 | |
| 理论值(pg/mL) | 实测值(pg/mL) | 准确度％ | |
| 质控H | 20 | 20.06 | 103 |
| 质控M | 10 | 10.07 | 107 |
| 质控L | 2 | 2.08 | 109 |
表17、T4的准确度
| T4 | T4 | T4 | |
| 理论值(pg/mL) | 实测值(pg/mL) | 准确度％ | |
| 质控H | 20 | 20.22 | 101 |
| 质控M | 10 | 9.64 | 96.4 |
| 质控L | 2 | 1.96 | 98.0 |
表18、rT3的准确度
| rT3 | rT3 | rT3 | |
| 理论值(pg/mL) | 实测值(pg/mL) | 准确度％ | |
| 质控H | 20 | 19.52 | 97.6 |
| 质控M | 10 | 9.89 | 98.9 |
| 质控L | 2 | 2.04 | 102 |
表19、皮质醇的准确度
| 皮质醇 | 皮质醇 | 皮质醇 | |
| 理论值 | 实测值 | 准确度％ | |
| 质控H | 2500 | 2500 | 100 |
| 质控M | 1250 | 1250 | 100 |
| 质控L | 250 | 252.5 | 101 |
综合以上数据，我们考察了游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇4种激素在低中高三个质控水平的准确度，结果显示本方法对4种激素的不同水平质控的准确度均小于15％，符合临床的检测要求。该质控系统全面的对实验过程进行控制，有利于日常临床检测中检测偏差和检测质量的控制，及时发现问题。
实施例2不同超滤膜对检测结果的影响
由于超滤膜对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇存在一定的吸附作用，从而影响检测结果，本实施例按实施例1的步骤完成样本制备后，取低浓度质控(L)样品按照实施例1中的样本前处理步骤进行样本前处理，其中分别采用不同的超滤膜进行超滤离心，考察不同超滤膜对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的吸附影响，每组重复3次，取平均值，检测结果如表20所示。
表20、不同超滤膜对检测结果的影响
由表20可以看出，不同超滤膜由于对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的吸附性，会严重影响检测结果的准确性，其中，Ultracel PL再生纤维素超滤膜可以较好地解决这个问题，明显提升检测结果的准确性。
实施例3超滤膜分子量限值对检测结果的影响
按实施例1的步骤完成样本制备后，取低浓度质控(L)样品按照实施例1中的样本前处理步骤进行样本前处理，其中超滤离心过程中，分别选用不同分子量限值的超滤膜进行超滤离心，前处理完成后采用实施例1中的液相色谱串联质谱条件进行检测，考察超滤膜的不同分子量限值，对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的检测准确度的影响，每组重复3次，取平均值，检测结果如表21所示。
表21、超滤膜的不同分子量限值对检测结果的影响
由表21可见，超滤膜的不同分子量限值对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的检测结果存在明显差别，导致最后的检测结果准确度也存在较大差别。
当分子量为150K时，对于游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的实测结果明显高于理论值，其原因可能是对唾液样本中的蛋白过滤去除不够充分，造成部分结合态激素未被有效去除，从而造成实测结果中包含了部分结合态激素，不仅仅都为游离态激素，因此检测结果偏高。当分子量为1K时，对于游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的实测结果稍低于理论值，其原因可能是超滤压力增大，造成检测误差增大。当分子量为10K-100K时，对于游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的实测结果准确率更高，完全符合临床检测要求，其中最优选的分子量为30K，可显著地提高检测灵敏度和准确度。
实施例4防吸附试剂的选择
本实施例按实施例1的步骤完成样本制备后，取低浓度质控(L)样品按照实施例1中的样本前处理步骤进行样本前处理，其中的防吸附试剂分别选用不同种类的有机溶剂，其中一组不加有机溶剂为对照组，考察对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的检测准确度的影响，从而考察不同有机溶剂对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的防吸附效果的影响，每组重复3次，取平均值，检测结果如表22所示。
表22、不同防吸附试剂对检测结果的影响
由表22可见，对照组存在非常明显的被吸附现象，检测结果明显低于理论值；不同有机溶剂对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的防吸附效果完全不同，其中乙醇、丙醇几乎未能起到防吸附效果，检测值明显低于理论值；甲醇、乙腈和异丙醇能够起到一定的防吸附效果，其中效果最佳的为甲醇，可明显提升对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的检测灵敏度和准确性。
同时还可能由于甲醇等有机溶剂的加入，进一步降低了超滤液中的基质效应，使四种游离态的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇更加稳定，不会相互影响，更容易被精确检测，显著提升检测灵敏度，从而真正实现同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇4种游离态的激素。
实施例5样本滤液和甲醇的体积比对检测结果的影响
本实施例按实施例1的步骤完成样本制备后，取低浓度质控(L)样品按照实施例1中的样本前处理步骤进行样本前处理，其中的防吸附试剂为甲醇，滤液和甲醇的体积比分别为1:0.5、1:1、1:3、1:5、1:7，考察样本滤液和甲醇的不同体积比，对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的检测准确度的影响，从而考察样本滤液和甲醇的不同体积比，对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的防吸附效果的影响，每组重复3次，取平均值，检测结果如表23所示。
表23、滤液和甲醇的不同体积比对检测结果的影响
由表23可见，样本滤液和甲醇的不同体积比，对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇的防吸附效果存在显著影响，当滤液和甲醇的体积比为1:0.1和1:0.5时，几乎未起到任何防吸附的效果；而当滤液和甲醇的体积比达到1:1，防吸附效果和提高检测灵敏度的效果非常明显；当滤液和甲醇体积比在1:1到1:5范围内时，都能对唾液样本中的游离态的甲状腺激素T3，T4、rT3和皮质醇达到较理想的防吸附效果，检测准确度较高；但当滤液和甲醇的体积比达到1:7时，防吸附效果却出现下降，这可能是由于甲醇比例过高，使检测误差增大，难以对低含量的游离激素实现准确检测。因此滤液和甲醇的体积比应在1:1到1:5范围内，才能发挥最佳的防吸附作用。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (7)
1.一种同时测定唾液中游离甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取唾液样本，离心；
2)取上清液置于超滤离心管，进行超滤离心；
3)收集超滤离心获得的滤液，加入内标溶液和用于防吸附的有机溶剂，涡旋混匀，进液相色谱质谱联用系统分析；
所述用于防吸附的有机溶剂为选自甲醇、乙腈、异丙醇中的任意一种或两种；所述的超滤离心获得的滤液和防吸附有机溶剂的体积比例为1:1～1:5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的超滤离心管采用Ultracel PL再生纤维素超滤膜，滤膜截留分子量限制范围在10K-100K。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的超滤离心时间为15min～1h，离心转速为2000～4000rpm，离心机的离心温度为36～38℃；步骤1)所述的离心转速为3000～4000rpm。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的超滤离心管包括内管和收集管，先将上清液置于内管，然后将内管插入收集管中，放入离心机中进行超滤离心，超滤离心获得的滤液位于收集管中；离心机启动和停止过程采用慢加速和慢减速模式，缓慢提高和降低转速。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的内标溶液含有T3-13C6、rT3-13C6、T4-13C6和Cortisol-d4；所述方法还包括步骤4)的质控样本结果比较和检测误差评价；所述步骤4)的质控样本的制备方法为：唾液样本通过超滤得到的滤出液，向其中加入等体积的有机溶剂，混匀，以此混合溶液为基质，加入含有不同浓度的甲状腺激素T3、rT3、T4和皮质醇的混合标准溶液，得到含有低、中、高三个不同水平浓度的唾液基质样品作为质控样本。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的液相色谱质谱联用系统，其中的液相色谱采用梯度洗脱模式，色谱柱为C18或者苯基填料柱，流动相A为0.05-0.2体积％的甲酸水溶液，流动相B相为0.05-0.2体积％甲酸的乙腈溶液，采用梯度洗脱模式，流动相A和流动相B的体积比为60～0％：40～100％。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用系统采用的质谱为三重四极杆质谱仪，采用电喷雾离子源和正离子模式(ESI+)和多反应监测(MRM)模式进行质谱检测；所述步骤4)的质控样本结果比较和检测误差评价，通过比较质控样本的检测数值和理论靶值的偏差，评价该批次检测过程的准确度和误差，检测结果包括质控样本的T3、rT3、T4和皮质醇4种激素的实测水平。
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