CN114414339B - 一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物的方法，包括步骤一；材料选取；步骤二；样品制备；步骤三：样品1H‑NMR分析；步骤四：1H‑NMR数据处理；步骤五：代谢物鉴定与通路分析；步骤六：统计分析；步骤七：结果；本发明旨在筛选IUGR羔羊的特征性代谢物，从而全面了解IUGR引起新生羔羊的机体代谢变化。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物的方法。
背景技术
现今，国际市场上我国绵羊和山羊的饲养量、出栏量、肉产量、皮产量和绒产量均居世界第一。原产于我国太湖流域的湖羊，具有易舍饲、早熟、四季发情、一年二胎且多羔等优良性状，越来越受到市场青睐。生产中，往往由于其多胎性，易造成妊娠期营养摄取不足，导致新生羔羊出现宫内生长受限。IUGR(宫内生长受限)是胎儿在母体内发育障碍的总称，主要指新生儿的出生体重低于同孕龄平均出生体重的2个标准差或低于10％，主要表现为新生儿体重和组织器官重量轻，肌肉系统、胃肠道系统或其他组织器官形态和功能发育不完善，不仅严重影响动物的健康，也导致畜牧生产极大的损失。IUGR一直是哺乳动物常见的产科并发症之一，且多胎动物的发生概率高于单胎动物，生产中绵羊和猪的IUGR现象尤为严重。IUGR新生羔羊往往会造成自身体质较差、生命力弱，不仅增加羊场管理难度，也易引起母羊繁殖和饲料资源的浪费。针对IUGR，目前主要关注其引起的胎儿或新生儿组织器官的影响，或IUGR的早期诊断和治疗进行研究。然而，新生儿的营养代谢是一个复杂的动态系统，涉及多种物质的代谢进程，需要全景式的展现体内代谢变化，且IUGR新生羔羊与健康羔羊间的代谢区别也未见相关报道。
作为代谢组学的主要技术平台之一，一维氢谱核磁共振(1H-NMR)能够对生物的血液、尿液、乳汁等体液以及多种器官组织样本进行分析，将正常生理状态与病理状态下多种小分子代谢物的表达差异，并对物质进行分离和鉴定，进一步通过生物信息学方法，与研究中相关的外源性或内源性影响因素相结合，从而建议一定的生物学联系。1H-NMR技术可以在同一时间得到多种分子信息，不仅检测样品需要量少，且具有良好的检测重现性。现今，1H-NMR已被广泛应用于掌握生物的代谢轮廓、药物的作用机理、疾病的早期预防和诊断等多学科领域。Dessi等人综述指出新生儿的代谢异常可以通过应用该技术全景式地阐释代谢异常过程。Sanz-Cortés等人也通过1H-NMR揭示了IUGR新生儿脐静脉血浆的特征性代谢变化。尽管已有许多关于新生儿的代谢组学研究报道，但有关绵羊新生IUGR羔羊的血液代谢组尚未发现相关报道。
发明内容
为了克服以上技术问题，本发明的目的在于提供一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物的方法，旨在筛选IUGR羔羊的特征性代谢物，从而全面了解IUGR引起新生羔羊的机体代谢变化。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物方法，包括以下步骤；
步骤一；材料选取：
选取20.43±0.23月龄和体重42.29±3.78kg的2～3胎经产母羊，采集其分娩记录，以及新生活羔体重，计算所有健康新生羔羊的平均体重和标准差，以出生重低于平均体重两个标准差作为标准选择IUGR羔羊，通过对适龄母羊进行同期发情与人工授精技术，随机选取正常出生重羔羊和IUGR羔羊各7只；
步骤二；样品制备：
新生羔羊按照体重分为NBW组和IUGR组，在出生1h内采集其颈动脉血液样品，室温下3000r·min-1离心10min后，将分离的血浆样品进行分装，后贮存于-80℃冰箱待测；
血浆样品预处理：将样品在室温下解冻后，每份400μL血浆样品中加入重水200μL(含0.05％TSP)，涡旋震荡30s，4℃下12000r·min-1离心10min，最后取550μL上清液置于5mm核磁共振管，待样品充分平衡后进行下一步检测；
步骤三：样品1H-NMR分析；
将所有样品应用600MHz超导核磁共振谱仪采集数据，使用自旋回波模块，采集小分子信息，使用脉冲序列采用预饱和模块用于血浆样品中水峰的压制；
具体参数如下：检测谱宽8000Hz，扫描64次，弛豫延迟2sec，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40sec；
步骤四：1H-NMR数据处理；
数据预处理：应用MestReNova软件对获得的1H-NMR谱进行傅立叶自动变换，之后对每个样品进行相位和基线调整，之后，对每个样品的谱图进行峰对齐，将TSP的化学位移定标(δ0.00)，通过R软件包进行自动积分，积分区间为δ0.40-8.50，以δ0.002为积分间距，去除残余的水峰(δ4.15-6.70)，最后，对谱图进行分段积分，对数据矩阵进行归一化处理，作下一步分析；
应用SIMCA-P+软件，对上述标准化处理的1H-NMR数据进行多元统计分析，包括主成分分析和偏最小二乘判别分析，并进行验证；
步骤五：代谢物鉴定与通路分析；
将上述归一化的1H-NMR数据导入ChenomxNMRSuite软件进行谱图归属，选定匹配好峰行和位移的化合物与商业数据库进行比对，确定检测的代谢物，将筛选到的NBW组与IUGR组差异代谢物在KEGG数据库进行代谢通路的检索；
步骤六：统计分析；
采用SPSS13.0软件将两组的新生羔羊体重和1H-NMR谱图检测的所有差异代谢物的峰面积平均值，进行独立样本t检验，实验结果以均值±标准误(Mean±SEM)形式表示，各表中不同字母表示表示差异显著(P<0.05)；
步骤七：结果；
通过以上检索与分析，可以获得差异代谢物，并根据数据库分析，对差异代谢物进行定性。
所述步骤三中具体参数如下：检测谱宽8000Hz，扫描64次，弛豫延迟2sec，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40sec。
本发明的有益效果。
本发明以非靶向代谢组学技术--1H-NMR检测宫内生长受限新生羔羊血浆代谢物的方法，以代谢产物反应生物体的表型，识别IUGR新生羔羊与正常羔羊血液代谢物之间存在差异，为复杂的IUGR发病机理与诊疗提供了新的方向，为进一步深入IUGR的药物治疗有效性、针对性及标志物表征奠定基础。
附图说明：
图1为NBW组和IURG组血浆样品代表性的600MHz1H-NMR图谱。A为δ0.40～4.15，B为δ6.70～8.50。
图2为NBW组(黑色圆形，●)和IUGR组(红色方形，■)组新生羔羊血浆样品的PCA得分图。
图3为两组新生羔羊血浆样品的PLS-DA分析图。A：得分图；B：排列验证图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物方法，包括以下步骤；
步骤一；材料选取：
选取(20.43±0.23)月龄和体重(42.29±3.78)kg的2～3胎经产母羊，采集其分娩记录，以及新生活羔体重，计算所有健康新生羔羊的平均体重和标准差，以出生重低于平均体重两个标准差作为标准选择IUGR羔羊，通过对适龄母羊进行同期发情与人工授精技术，随机选取正常出生重羔羊(normalbirthweight，即NBW组)和IUGR羔羊(即IUGR组)各7只；
步骤二；样品制备：
新生羔羊按照体重分为NBW组和IUGR组，在出生1h内采集其颈动脉血液样品，室温下3000r·min-1离心10min后，将分离的血浆样品进行分装，后贮存于-80℃冰箱待测；
血浆样品预处理：将样品在室温下解冻后，每份400μL血浆样品中加入重水200μL(含0.05％TSP)，涡旋震荡30s，4℃下12000r·min-1离心10min，最后取550μL上清液置于5mm核磁共振管，待样品充分平衡后进行下一步检测；
步骤三：
将所有样品应用600MHz超导核磁共振谱仪(德国布鲁克公司)采集数据，使用自旋回波模块，采集小分子信息，使用脉冲序列采用预饱和模块用于血浆样品中水峰的压制；
具体参数如下：检测谱宽8000Hz，扫描64次，弛豫延迟2sec，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40sec；
步骤四：1H-NMR数据处理；
数据预处理：应用MestReNova软件对获得的1H-NMR谱进行傅立叶自动变换，之后对每个样品进行相位和基线调整，之后，对每个样品的谱图进行峰对齐，将TSP的化学位移定标(δ0.00)，通过R软件包(http://cran.r-project.org/)进行自动积分，积分区间为δ0.40-8.50，以δ0.002为积分间距，去除残余的水峰(δ4.15-6.70)，最后，对谱图进行分段积分，对数据矩阵进行归一化处理，作下一步分析；
应用SIMCA-P+软件(V12.0UmetricsAB，Umea,Sweden)，对上述标准化处理的1H-NMR数据进行多元统计分析，包括主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)和偏最小二乘判别分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis，PLS-DA)，并进行验证；
步骤五：代谢物鉴定与通路分析；
将上述归一化的1H-NMR数据导入ChenomxNMRSuite软件(ChenomxInc.,Edmonton,Canada)进行谱图归属，选定匹配好峰行和位移的化合物与商业数据库(http://www.hmdb.ca和http://www.bmrb.wisc.edu)进行比对，确定检测的代谢物，将筛选到的NBW组与IUGR组差异代谢物在KEGG(https://www.kegg.jp/)数据库进行代谢通路的检索；
步骤六：统计分析；
采用SPSS13.0软件将两组的新生羔羊体重和1H-NMR谱图检测的所有差异代谢物的峰面积平均值，进行独立样本t检验，实验结果以均值±标准误(Mean±SEM)形式表示，各表中不同字母表示表示差异显著(P<0.05)；
步骤七：结果；
通过以上检索与分析，可以获得差异代谢物，并根据数据库分析，对差异代谢物进行定性。
IUGR新生羔羊体重的变化
测定两组新生羔羊体重结果显示，NBW组羔羊体重为(3.25±0.14)kg，而IUGR组体重为(2.54±0.23)kg，IUGR组新生羔羊的体重比NBW组羔羊低21.85％，说明两组新生羔羊体重差异显著(P<0.05)，符合对于IUGR的定义，可以进行后续的分析。
血浆样品的1H-NMR谱图分析
7例NBW组和7例IUGR羔羊血液样品分别进行1H-NMR谱的测定，1H-NMR谱图进行手动调相、基线校正和谱峰对齐及进行定标并得到血浆样本的核磁图谱。图1为NBW组和IUGR组新生羔羊血浆样品中具有代表性的1H-NMR谱。谱图中所有信号峰包含在(δ0.40-4.15和δ6.70-8.50)，为消除残余水峰、尿素峰的影响，去掉δ4.16-6.60积分区间。其中，δ6.70-8.50的区域是相对于δ0.40-4.15的区域放大40倍以后的谱图。
根据1H-NMR化学位移谱库、公共共享数据库(KEGG、HMDB、METLIN)和组内自建数据库，对两组血浆中所含代谢物进行归属和确认，两组血浆样品中指认出32种代谢物，主要包括糖类物质(α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、乙酸盐、N-乙酰甘露糖胺、柠檬酸、异柠檬酸)、氨基酸类物质(亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、酪氨酸、N-乙酰半胱氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、苯丙氨酸、脲基丙酸、肌肽、甜菜碱、尿甘酸)和脂类物质(1-低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、3-羟丁酸、2-羟基异戊酸酯、磷酸胆碱、甲酸、肌酸、胆碱、甘油磷酸胆碱、2—异戊酸、丙酮、丙二酸)。
比较两组代谢指纹波谱图可见某些化学位移值处波峰水平有明显差异，提示两组血浆代谢产物成分有明显差异。然而，由于检测代谢物的峰值多，眼观分析并不是分析不同组之间差异的有效手段，所获取的信息非常有限，为了更加完整地揭示两组血浆样品的变化，需进一步釆用多变量统计方法对复杂的数据做了进一步的分析。
如图1所示：注：1—低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白；2—异戊酸；3—亮氨酸；4—缬氨酸；5—3-羟丁酸；6—乳酸Lactate；7—丙氨酸；8—乙酸盐；9—2-羟基异戊酸酯；10—N-乙酰甘露糖胺；11—N-乙酰半胱氨酸；12—谷氨酰胺；13—丙酮；14—脲基丙酸；15—柠檬酸；16—肌肽；17.异柠檬酸；18—肌酸；19—丙二酸；20—甘油磷酸胆碱；21—胆碱；22—磷酸胆碱；23—β-葡萄糖；24—甜菜碱；25—α-葡萄糖；26—甘氨酸；27—酪氨酸；28—1-甲基组氨酸；29—3-甲基组氨酸；30—苯丙氨酸；31—尿甘酸；32—甲酸.
多元统计分析
为了建立两组间的全景比较，将1H-NMR数据进行多元统计分析，包括PCA和PLS-DA分析。
PCA分析
在多元统计分析的模式识别中，本研究首先将两组1H-NMR数据采用非监督的多维统计方法(对两组样本建模，来观测样品的总体代谢变化。PCA分析后，获得两个主成分，其中其中第一主成分(PrincipalComponent1，PC1)解释原始数据中最大量的变量，第二主成分(PrincipalComponent2，PC2)可以解释第二大变量，每一个点表示一个样本。其中，PC1和PC2解释率分别为50.29％和18.11％，即PCA总解释率为68.40％。如PCA得分图(图2)所示，NBW组和IUGR组比较结果发现两组样本点明显分离，两组的分布区域完全分开，且具有分别向左上和右下分离的趋势，代谢谱有明显区别。这说明两组间差异在羔羊血浆代谢组层面得到一定体现，提示相对于健康新生羔羊，IUGR羔羊的血液代谢谱发生了改变。为进一步放大各组间的差异，找到与IUGR发生密切相关的代谢产物，进一步采用PLS-DA。
如图2所示：
PLS-DA分析
PLS-DA在代谢组学中主要用于回归建模，相对于PCA可以获得更好的分类效果。PLS-DA是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，能够提取矩阵X(本研究中指1H-NMR数据)中的相关信息，预测变量Y(本研究中指分组信息)的值，是模型变量筛选的有效工具。本研究对1H-NMR数据进一步采用PLS-DA分析，模型的模解释度(R2Y)是84％和预测度(Q2)是64％。由其得分图(图3A)可见，两组沿t[1]轴显著分开呈现最大化分离，而NBW组与IUGR组内部样品比较集中，说明组内代谢差异较小。之后，对PLS-DA模型进行500次的排列验证(图3B)，Q2和R2的回归线分别与y轴交点在负半轴和正半轴，且Q2和R2在最右端接近，说明该试验的数据模型建立成功，即两组新生羔羊的血浆样品的代谢物存在显著差异。
如图3所示：
差异代谢物与代谢通路分析
为进一步分析NBW组与IUGR组的新生羔羊血液代谢组差异，筛选与IUGR疾病相关的差异代谢物，对1H-NMR谱图中鉴定的代谢物峰面积相对值进行均值t检验分析。通过筛选，两组间的差异表达代谢物共16个，列于表1。本研究结果显示，与健康新生羔羊对比，IUGR羔羊血浆中多个代谢物浓度发生改变，主要涉及脂代谢、氨基酸代谢、糖代谢等多条代谢通路。相较于NBW羔羊，本试验中IUGR羔羊血浆中多种脂代谢物均出现变化，主要包括低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白(LDL/VLDL)、2-羟基异戊酸、胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的表达上调，以及异戊酸的表达下调。IUGR羔羊血浆中多种氨基酸和糖类含量均显著降低，主要包括葡萄糖、乳酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、3-甲基组氨酸和N-乙酰半胱氨酸，进一步揭示IUGR胎儿机体内氨基酸来源不足或利用增加。
表11H-NMR检测的两组间有显著变化的代谢物
注：*和**分别表示两组差异在P<0.05和P<0.01水平差异显著。
人类和动物流行病学研究证实，由于胎儿在母体内出现营养失衡(营养不足/过多)或代谢紊乱，引发IUGR，会对其出生后的儿童和成年时期产生持续的影响，例如出现糖尿病、心血管疾病、神经精神疾病的发病风险。目前，临床上IUGR预断和治疗方法皆存在不足，例如确诊时间晚、准确性不高或治疗效果差等，均会对母体和胎儿造成不利影响等。因此，寻求全面掌握IUGR的发生机制，从而获得准确性高的诊断方法和治疗方式非常重要。本申请是通过应用代谢组学的1H-NMR检测平台分析IUGR新生羔羊的血液代谢组，从而探寻IUGR引发的机体内相关代谢物及其代谢通路的改变，并分析相关代谢信号通路，从而探讨其相关的发生机制。本研究结果显示，与健康新生羔羊对比，IUGR羔羊血浆中多个代谢物浓度发生改变，主要涉及脂代谢、氨基酸代谢、糖和能量代谢等多条代谢通路。
脂代谢分析
宫内生长的胎儿需要通过将获得的营养物质转化为脂肪组织，以保证出生的存活；同时，也将脂类物质转化为能量物质，为其在宫内生长代谢提供能源。以往研究也证实IUGR胎儿在宫内会出现脂肪合成出现抑制，而引发脂质代谢紊乱。
LDL和VLDL分别是机体内运输内源性甘油三酯和胆固醇的主要形式，以往研究中也曾指出IUGR胎儿的脐静脉血中LDL/VLDL浓度均高于健康新生儿，主要原因可能是由于机体内营养不足，引发体内脂质被过度动员分解。胆碱及其胆碱化合物(磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱)是哺乳动物的细胞双层膜的主要组成物质，本试验中IUGR羔羊组胆碱及其胆碱化合物含量的升高，表明细胞对其摄取减少，而堆积在血浆中，这些改变可能会引起细胞膜损伤或细胞增殖合成减慢，进一步引发某些器官生长发育受限。2-羟基异戊酸是一种有机酸，已经被证实在机内氧化应激状态下会升高，且有报道显示新生儿大高发育异常与机体内2-羟基异戊酸的异常升高有关。这也进一步提示，在IUGR新生羔羊可能会出现大脑发育异常。
氨基酸代谢分析
氨基酸是胎儿生长发育的重要营养底物，一方面用于合成蛋白质进行供能，一方面竞争性合成葡萄糖。宫内胎儿的氨基酸物质的获得主要通过胎盘和胎儿间存在氨基酸的浓度梯度，由母体通过胎盘转运至胎儿血液。以往研究显示，IUGR胎儿由于机体内营养物质不足，胎儿会优先动员自身体内氨基酸转化为能量和糖类物质，以满足自身的生长需求。
亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸属于升糖氨基酸，也被证明机体通过额外补充，能够促进胎儿宫内的葡萄糖水平。亮氨酸是机体的必须氨基酸，在蛋白质和能量代谢、缓解氧化应激以及机体免疫力等方面具有重要作用。此外，机体内的亮氨酸也能通过胰岛素依赖机制，进一步增强葡萄糖摄取能力。Fowden等人的研究也证明IUGR仔猪中亮氨酸水平显著降低。缬氨酸作为哺乳动物体内的主要的支链氨基酸之一，其通过氧化分解而产生能量的效率比非支链氨基酸高。丙氨酸是葡萄糖代谢途径中的重要调节剂，也能够作为原料通过丙酮酸转化产生能量。本试验中IUGR组的缬氨酸和丙氨酸浓度低于对照组，表明新生羔羊机体由于营养不良，过量分解氨基酸用于维持自身能力需求。作为酪胺、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素等多种蛋白质合成和能量产生的重要基质，酪氨酸在胎儿发育中调节神经系统功能，同时也在应激中具有一定作用。本研究中酪氨酸浓度的降低，说明羔羊由于IUGR，进一步阻碍了神经系统的发育。
目前，3-甲基组氨酸已经被证明与丙酸血症等多种先天性代谢病相关，且其浓度的测量也在临床中作为肌肉蛋白质分解速率的指标。以往的研究中也证实通过检测3-甲基组氨酸在羊水中的浓度，可以作为人类IUGR的产前检测指标。
糖和能量代谢分析
糖类物质是哺乳动物胎儿在宫内发育的重要营养元素。其中，葡萄糖是胎儿在宫内维持细胞能量代谢的重要原料，对胎儿的组织器官生长发育具有重要作用。胎儿宫内生长发育所需的葡萄糖主要是通过母体和胎儿两者血液中的葡萄糖浓度梯度，完成母体-胎盘-胎儿的运输。如果胎儿的生长发育过程中，通过胎盘摄取的外源性葡萄糖含量不足时，会通过内源性葡萄糖生成系统，分解自身储备的营养物质为糖原，以维持自身的葡萄糖浓度。乳酸是机体维持内环境稳态的信号分子，也是评估机体内能量平衡和组织含氧量的评价指标之一。当机体内葡萄糖含量不足时，乳酸能够由乳酸脱氢酶转化为丙酮酸，之后通过糖异生途径进一步转化为葡萄糖，为机体提供能量。本试验结果说明由于羔羊由于营养不良，已经出现体内糖代谢紊乱，且由于葡萄糖含量降低，大量的乳酸也被用于合成葡萄糖。
氧化应激代谢分析
哺乳动物因营养或其他外界因素导致体内氧化和抗氧化系统失衡，机体会产生大量活性氧自由基，而过量的自由基蓄积，导致机体无法清除时，会造成氧化应激。哺乳动物胎儿宫内生长发育不良不仅会引起糖类、脂类、氨基酸类等多种物质代谢的变化，也会引起胎儿的抗氧化能力下降。张崇志等人报道过IUGR会引发绵羊胎儿的氧化应激，影响其肝脏等组织器官的生长发育。本研究中，IUGR羔羊血浆中N-乙酰半胱氨酸含量均显著低于NBW羔羊，而IUGR组甜菜碱含量显著高于NBW组。N-乙酰半胱氨酸是L-半胱氨酸的衍生物，也是机体内形成抗氧化剂谷胱甘肽的前体，对细胞的抗氧化和抗炎症均具有重要作用。IUGR组羔羊的N-乙酰半胱氨酸降低，说明机体由于IUGR，发生氧化应激增多，而N-乙酰半胱氨酸作为“抗氧化剂”被过多的消耗。以往研究也显示通过N-乙酰半胱氨酸的处理，能够改善由脂多糖诱导的小鼠胎儿IUGR，并提高胎儿存活率。甜菜碱，又称为N,N,N-三甲基甘氨酸，是机体内的甲基化供体，而胎儿的甲基化进程等表观遗传修饰能够指导重构胚胎的正常发育。本研究中，IUGR组羔羊甜菜碱的血浆浓度显著升高，可能影响了胎儿在宫内的生长发育及胎盘分化。
基于代谢组学技术的1H-NMR检测方法能够全面的反应健康羔羊与IUGR羔羊的血液代谢轮廓。通过检测与数据的生物信息学分析结合，本申请鉴别了IUGR羔羊血液一些潜在的小分子代谢轮廓，为复杂的IUGR发病机理与诊疗提供了新的方向。该试验结果显示，IUGR羔羊的血液代谢主要涉及氨基酸、糖类、脂类物质等代谢通路。该结果有助于更好地理解IUGR发生机理，并为进一步寻找IUGR诊断标示物提供了理论基础。
Claims (2)
1.一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤一；材料选取：
选取20.43±0.23月龄和体重42.29±3.78kg的2～3胎经产母羊，采集其分娩记录，以及新生活羔体重，计算所有健康新生羔羊的平均体重和标准差，以出生重低于平均体重两个标准差作为标准选择IUGR羔羊，通过对适龄母羊进行同期发情与人工授精技术，随机选取正常出生重羔羊和IUGR羔羊各7只；
步骤二；样品制备：
新生羔羊按照体重分为NBW组和IUGR组，在出生1h内采集其颈动脉血液样品，室温下3000r·min-1离心10min后，将分离的血浆样品进行分装，后贮存于-80℃冰箱待测；
血浆样品预处理：将样品在室温下解冻后，每份400μL血浆样品中加入重水200μL，含0.05％TSP，涡旋震荡30s，4℃下12000r·min-1离心10min，最后取550μL上清液置于5mm核磁共振管，待样品充分平衡后进行下一步检测；
步骤三：
将所有样品应用600MHz超导核磁共振谱仪采集数据，使用自旋回波模块，采集小分子信息，使用脉冲序列采用预饱和模块用于血浆样品中水峰的压制；
具体参数如下：检测谱宽8000Hz，扫描64次，弛豫延迟2sec，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40sec；
步骤四：1H-NMR数据处理；
数据预处理：应用MestReNova软件对获得的1H-NMR谱进行傅立叶自动变换，之后对每个样品进行相位和基线调整，之后，对每个样品的谱图进行峰对齐，将TSP的化学位移定标，通过R软件包进行自动积分，积分区间为δ0.40-8.50，以δ0.002为积分间距，去除残余的水峰，δ4.15-6.70，最后，对谱图进行分段积分，对数据矩阵进行归一化处理，作下一步分析；
应用SIMCA-P+软件，对上述标准化处理的1H-NMR数据进行多元统计分析，包括主成分分析和偏最小二乘判别分析，并进行验证；
步骤五：代谢物鉴定与通路分析；
将上述归一化的1H-NMR数据导入ChenomxNMRSuite软件进行谱图归属，选定匹配好峰行和位移的化合物与商业数据库进行比对，确定检测的代谢物，将筛选到的NBW组与IUGR组差异代谢物在KEGG数据库进行代谢通路的检索；
步骤六：统计分析；
采用SPSS13.0软件将两组的新生羔羊体重和1H-NMR谱图检测的所有差异代谢物的峰面积平均值，进行独立样本t检验，实验结果以均值±标准误形式表示，各表中不同字母表示表示差异显著；
步骤七：结果；
通过以上检索与分析，可以获得差异代谢物，并根据数据库分析，对差异代谢物进行定性。
2.根据权利要求1所述的一种基于非靶向代谢组学检测宫内生长受限羔羊血浆代谢物方法，其特征在于，所述步骤三中具体参数如下：检测谱宽8000Hz，扫描64次，弛豫延迟2sec，采集自由感应衰减信号96次，采样间隔时间40sec。
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