CN102680310A

CN102680310A - 一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用

Info

Publication number: CN102680310A
Application number: CN2012100750047A
Authority: CN
Inventors: 洪战英; 林泽彬; 柴逸峰; 张俊平; 张黎明; 娄子洋; 朱臻宇; 范国荣
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2012-03-20
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，传统的血浆代谢组学样品前处理为35℃下肟化2小时后70℃下衍生化1小时，工作量大且耗时效率低。本发明提供了一种微波辅助血浆肟化、衍生化的样品前处理方法，将血浆样品加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应。本发明还将该处理方法应用于气相色谱-质谱联用法分析血浆代谢组学中。本发明的方法适用于血浆样品的处理，达到样品处理要求，满足代谢组学分析需要，显著缩短前处理时间，极大提高分析效率。

Description

一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，具体涉及一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用。

背景技术

代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，通过组群指标分析，进行高通量检测和数据处理，研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化，特别是对内源代谢、遗传变异、环境变化乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响。其常用的分析技术为气相色谱-质谱联用(GC/MS)技术、液相色谱-质谱联用(LC/MS)技术和核磁共振(NMR)等。其中气-质联用在代谢组学研究中被称作代谢物分析的“黄金标准”(参见文献1：Fischer E，Sauer U.Metabolic flux profiling of Escherichiacoli mutants in central carbon metabolism using GC-MS.European Journal ofBiochemistry，2003，270(5)：880-891.参见文献2：Zimmermann D，Hartmann M，Moyer M P，et al.Metabolomics of human colon cell lines.Metabolomics，2007，3(1)：13-17.)，但采用GC/MS进行分析，大多数样品都需要在室温或升温的条件下进行衍生化处理，传统的血浆代谢组学样品前处理条件为35℃下肟化2h后再在70℃下衍生化反应1h(参见文献3：简伟雄，袁肇凯，黄献平，等.冠心病心血瘀阻证血浆代谢组学的检测分析，中国中西医结合杂志，2010，30(6)：579-584)，这不仅工作量大而且耗时、效率低。

已有文献报道微波能促进有机化学反应(参见文献4：樊兴君，尤进茂，谭干祖，等.微波促进有机化学反应研究进展，化学进展，1998，10(3)：285-295)，采用微波辅助衍生化来有效地缩短衍生化时间，但对于耗时最长的肟化反应并未缩短，仅靠微波辅助衍生化并不能完全提高效率。

目前国内外尚无文献报道在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。

本发明在微波能有效促进化学反应的前提下，尝试采用微波技术辅助肟化来进一步缩短血浆样品处理时间，从而更有效地提高效率。本发明的技术方案即同时采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理，然后结合GC/MS法进行血浆代谢组学研究。

本发明采用Box-Behnken(参见文献5：S.L.C.Ferreira，R.E.Bruns，H.S.Ferreira，et al.Box-Behnken design：An alternative for the optimization ofanalytical methods.Analytica Chimica Acta，2007，597：179-186.)设计优化法来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。具体操作为取血浆样品按如图1所示的微波辅助方法与传统方法分别处理样品，并以传统方法作为参考，同时按表1所示采用Design-Expert8.0.5b软件进行实验设计，然后对所得数据进行处理，面积归一化后，将微波辅助肟化、衍生化方法所得的数据与传统方法所得数据进行相关性分析，以相关系数为指标，对各因素进行拟合，结果如表2所示；绘制各指标与两个自变量的三维曲面图，另外两个变量取中值，如图2a-f所示。根据所得结果，采用Design-Expert8.0.5b软件得到理论的优化方案。以本发明的微波辅助方法与传统方法的相关系数为指标(越接近1越好)来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。微波技术辅助肟化技术优化条件为：加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；微波技术辅助衍生化技术优化条件为：加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应。

本发明提供了一种微波辅助血浆样品前处理方法，该方法是将血浆样品去蛋白处理后，加入肟化反应试剂，混匀，密闭，在微波能量为60～73W的条件下微波辅助肟化75～125s后；加入衍生化试剂，在微波能量为200～260W的条件下微波辅助衍生化150～210s。

上述的微波辅助血浆样品前处理方法，其中的肟化反应试剂是甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，加入量与血浆样品的体积比为1∶2。

上述的微波辅助血浆样品前处理方法，其中的衍生化试剂是BSTFA：TMCS(N，O-双-三甲硅基三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷)＝99∶1，V/V，加入量与血浆样品的体积比为1∶2。

上述的微波辅助血浆样品前处理方法，较佳地，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化100s后；

上述的微波辅助血浆样品前处理方法，较佳地，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180s。

本发明还提供了上述微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用，如图1所示的“微波辅助方法”，具体步骤为：

A.采集动物模型组与对照组血液样品，分离血浆；

B.将血浆进行蛋白沉淀处理，并在氮气流下挥干；

C.加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；

D.加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应；

E.待样品冷却后加入内标溶液，混匀，并进样，采用GC/MS进行样品信息采集；

F.对所采集的数据进行格式转化，然后采用XCMS软件对转化后的数据进行峰校正和峰积分等前处理。采用修正80％规则来去除缺失值，及去除某一组中出现频率(非零值)低于80％质谱离子。然后筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息。为校正质谱响应，对筛选后每个样品的总峰面积进行归一化。将归一化的数据导入到SIMCA-P V11.0软件(Umetrics，Sweden)，经Par标度化后进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分析；

G.多标准评价方法(Multi-criterion Assessment，MCA)获取差异性内源代谢物。

本发明提供的新的样品前处理方法适用于血浆样品的处理，可以在达到样品处理要求，满足代谢组学分析需要的基础上，显著提高分析效率。

附图说明

图1为本发明“微波辅助方法”与“传统方法”的操作流程图。

图2中：图2a为微波辅助肟化能量与微波辅助肟化时间的三维曲面图。

图2b为微波辅助衍生化能量与微波辅助肟化能量的三维曲面图。

图2c为微波辅助衍生化时间与微波辅助肟化能量的三维曲面图。

图2d为微波辅助衍生化能量与微波辅助肟化时间的三维曲面图。

图2e为微波辅助衍生化时间与微波辅助肟化时间的三维曲面图。

图2f为微波辅助衍生化能量与微波辅助衍生化时间的三维曲面图。

图3为选择的理论所得微波辅助优化方案验证相关性曲线图。

图4为传统方法的PLS-DA得分图。

图5为传统方法获得的S-plot图。

图6为传统方法获得的VIP图。

图7为传统方法获得的含jack-knifed置信区间(CIJF_jk)载荷图。

图8为微波辅助方法的PLS-DA得分图。

图9为微波辅助方法获得的S-plot图。

图10为微波辅助方法获得的VIP图。

图11为微波辅助方法获得的含jack-knifed置信区间(CIJF_jk)载荷图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1.传统方法与本发明的“微波辅助方法”的比较

操作流程如图1所示，具体实施方法如下：

1.血样的采集

健康SD大鼠12只，体重200±10g，随机分成2组(正常组、模型组)。正常组按3.5mg/kg体重腹腔注射生理盐水，模型组按3.5mg/kg体重腹腔注射芥子气。由大鼠腹主动脉采集血液样本，3500rpm离心10min，分离上层血浆，置-20℃保存待测。

2.血样的前处理

2.1样品去蛋白处理

移取于室温下解冻后的血浆100μl，置于1.5ml EP管中，按1∶3比例(v/v)加入300μl乙腈，涡旋混合3min后，于12000rpm、4℃条件下高速离心10min，分取上清液200μl至5ml玻璃离心管中，在55℃氮气流下吹干，以备进一步样品处理。

2.2传统的肟化和衍生化方法

取2.1项下吹干的样品，加入50μl甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，混匀，密闭，35℃条件下肟化2h后，加入衍生化试剂(BSTFA∶TMCS＝99∶1，v/v)50μl，在70℃条件下衍生化反应1h，反应结束后，振荡10s，室温下放冷，加入100μl内标溶液(0.1mg/ml二十二烷的庚烷溶液)，混匀，转移至进样小瓶，待测。

2.3微波辅助肟化和衍生化

取2.1项下吹干的样品，加入50μl甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，混匀，密闭，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化100s后，加入衍生化试剂(BSTFA∶TMCS＝99∶1，v/v)50μl，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180s，反应结束后，振荡10s，室温下放冷，加入100μl内标溶液(0.1mg/ml二十二烷的庚烷溶液)，混匀，转移至进样小瓶，待测。

3.代谢指纹图谱的获取

分别将2.2项下和2.3项下处理好的样品采用气相色谱-质谱联用法(GC/MS)进行测定。仪器条件为，升温程序：起始70℃保持2min后以6℃/min升至225℃并保持3min，再以10℃/min升至300℃保持7min；进样量：1μL，不分流进样；进样口温度：260℃；GC-MS传输线温度：270℃；离子源温度：150℃；电离电压：70ev；扫描方式：全扫描，50-550m/z；扫描速率：5张/s；载气为高纯氦气，流速为0.10mL/min。

4.数据处理

从GC-MS得到的原始数据(.raw)经Xconvert转换为通用数据格式(.cdf)后，进一步通过XCMS软件进行峰校正和峰积分，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵。XCMS参数除设定fwhm＝4，snthresh＝3，max＝200和profmethod＝”binlinbase”以外，其他参数均采用默认值。采用修正80％规则来去除缺失值，即去除在某一组中出现频率(非零值)低于80％的质谱离子。并筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息。为校正质谱响应，采用每个样品的总峰面积进行归一化。将归一化的数据导入到SIMCA-P V11.0软件(Umetrics，Sweden)，经过Par标度化后，进行偏最小二乘投影判别分析(PLS-DA)分析。

5.微波辅助肟化、衍生化方法的优化

由于微波辅助肟化、衍生化反应受微波能量及微波时间的影响，因此，本发明采用Box-Behnken设计优化法来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。具体操作为取QC样品先按2.1项下方法将血浆样品吹干，然后按2.2项下处理样品作为参考标准，同时按表1所示采用Design-Expert8.0.5b软件进行实验设计，然后按“4.数据处理”项下方法对所得数据进行处理，面积归一化后，将微波辅助肟化、衍生化方法所得的数据与传统方法所得数据进行相关性分析，以相关系数为指标，对各因素进行拟合，结果如表2所示；绘制各指标与两个自变量的三维曲面图，如图2所示。根据所得结果，采用Design-Expert8.0.5b软件得到理论的优化方案。

表1 Box-Behnken设计优化因素

^*MAOP：微波辅助肟化能量；MAOT：微波辅助肟化时间；MADP：微波辅助衍生化能量；MADT：微波辅助衍生化时间

表2 Box-Behnken试验设计每组因素组合的试验结果

因试验设计所采用数值为经预实验及参考相关文献获得(参见文献6：Hao Wu，Taotao Liu，Chunguang Ma，et al.GC/MS-based metabolomic approachto validate the role of urinary sarcosine and target biomarkers for human prostatecancer by microwave-assisted derivatization.Analytical and BioanalyticalChemistry，2011，401(2)：635-646.文献7.Manuel Liebeke，Ariane Wunder，Michael Lalk.A rapid microwave-assisted derivatization of bacterial metabolomesamples for gas chromatography/mass spectrometry analysis.AnalyticalBiochemistry，2010，401(2)：321-314)，故所得结果R²值相互之间较为接近，且均已较接近于1，因此，通过理论计算得到的优化方案较多，但综合考虑预实验结果、时间效益及样品的挥发性等因素，故选择最优条件为：加入50μl甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，混匀，密闭，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化100s后，加入衍生化试剂(BSTFA∶TMCS＝99∶1，V/V)50μl，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180s。对理论获得的优化条件进行验证，R²值为0.996，相关性曲线如图3所示，表明该优化条件可用。

6.获取差异性内源代谢物

6.1采用传统方法获取差异性内源代谢物

将正常组和模型组处理后的数据进行PLS-DA分析，其得分图如图4所示，其S-plot图如图5所示，S-polt显示变量和模型之间的协方差和相关系数，能够减少潜在生物标志物选择时假阳性的产生，对于重要代谢物的筛选十分有用，根据离原点越远的离子对分类有更大的区分能力，即可能是差异性内源代谢物。同时，为了减少假阳性的出现，采用代谢物的VIP值大于1如图6所示，且其jack-knifed置信区间值不跨越零值，如图7所示，等多标准评价方法(MCA)来筛选获取差异性内源代谢物。最终得如表3所示的差异性内源代谢物11种，并采用GC/MS仪自带的NIST质谱数据库对差异性内源代谢物进行匹配与归属。

表3 传统方法获取的差异性内源代谢物

^*表示与微波辅助方法获取的差异性内源代谢物一致

6.2采用微波辅助方法获取差异性内源代谢物

将正常组和模型组处理后的数据进行PLS-DA分析，其得分图如图8所示，其S-plot图如图9所示，采用如6.1项下所述MCA来筛选获取差异性内源代谢物(VIP值如图10所示，且其jack-knifed置信区间值图，如图11所示)。最终得如表4所示的差异性内源代谢物9种，并采用GC/MS仪自带的NIST质谱数据库对差异性内源代谢物进行匹配与归属。

表4微波辅助方法获取的差异性内源代谢物

^*表示与传统方法获取的差异性内源代谢物一致

7.两种方法获取的差异性内源代谢物比较

通过对比表3及表4可知，采用微波辅助方法获取的差异性内源代谢物有8个与采用传统方法获取的内源代谢物一致，其相似度达73％，从两种方法获得的总离子流图及上述方法的分析均表明，本发明能在肟化上能提高72倍的效率，在衍生化上则能提高20倍的效率，总的在样品前处理时间上提高将近39倍，具有很显著的时间效益，因此本发明结合气相-质谱联用法能更好地提高分析效率，实现快速高通量分析，为代谢组学的研究提供了强有力的技术改进和支持。

Claims

1.一种微波辅助血浆样品前处理方法，该方法是将血浆样品去蛋白处理后，加入肟化反应试剂，在微波能量为60～73W的条件下微波辅助肟化75～125秒后，加入衍生化试剂，在微波能量为200～260W的条件下微波辅助衍生化150～210秒。

2.根据权利要求1所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，其中的肟化反应试剂是15mg/ml的甲氧胺吡啶溶液，加入量与血浆样品的体积比为1∶2。

3.根据权利要求1所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，其中的衍生化试剂是N，O-双-三甲硅基三氟乙酰胺∶三甲基氯硅烷为99∶1，V/V，加入量与血浆样品的体积比为1∶2。

4.根据权利要求1、2或3所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化100秒。

5.根据权利要求1、2或3所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180秒。

6.一种如权利要求1所述的微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用。

7.根据权利要求6所述的微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用，具体步骤如下：

A.采集动物模型组与对照组血液样品，分离血浆；

B.将血浆进行蛋白沉淀处理，并在氮气流下挥干；

C.加入肟化反应试剂，在微波能量为60～73W的条件下微波辅助肟化75～125秒；

D.加入衍生化试剂，在微波能量为200～260W的条件下微波辅助衍生化150～210秒；

F.对所采集的数据进行格式转化，然后采用XCMS软件对转化后的数据进行峰校正和峰积分等前处理，采用修正80％规则来去除缺失值，及去除某一组中出现频率低于80％质谱离子，然后筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息，为校正质谱响应，对筛选后每个样品的总峰面积进行归一化，将归一化的数据导入到SIMCA-P V11.0软件，经Par标度化后进行PLS-DA分析；

G.多标准评价方法获取差异性内源代谢物。