CN109613040A - 一种基于nmr代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法 - Google Patents

一种基于nmr代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法。包括：收集鱼肌肉样品，采集每个样品的一维核磁共振氢谱，得到样品的原始谱图；对原始谱图进行数据预处理，得到二维数据矩阵，将二维数据矩阵进行多元统计分析，得到不同牛磺酸添加量影响下罗非鱼肌肉组织的小分子代谢物，通过对代谢物的鉴定及模式识别分析，获得代谢物变化规律，筛选出与糖代谢、脂质代谢和氨基酸代谢相关的生物标志物。本发明将核磁共振代谢组学技术应用于牛磺酸对罗非鱼生长影响的解析，可以快速、准确、全面获取不同牛磺酸添加量影响下罗非鱼肌肉的代谢差异，有效评价罗非鱼养殖中牛磺酸饲料添加的准确率及对罗非鱼生长影响。

Description

一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的 方法
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体涉及基于NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法。
背景技术
全球水产捕捞和养殖产量已经保持了30年的增长，尤其是水产养殖发展迅猛，导致为其提供饲料蛋白来源的鱼粉供不应求，价格上涨。因此，植物蛋白成为替代鱼粉降低水产养殖成本的一种选择，但植物蛋白中营养不平衡且存在抗营养因子，替代效果并不理想。在植物蛋白饲料中适当添加牛磺酸，能够改善植物蛋白替代对鱼类的不利影响，促进鱼体的生长和发育。然而，饲料中添加牛磺酸对不同生长阶段鱼类代谢的影响及其作用机制还不十分清楚。
牛磺酸是动物组织中最丰富的游离氨基酸，占肌肉游离氨基酸总量的53％，而肌肉组织是鱼类的主要食用部分，是其营养价值的来源，因而选取尼罗罗非鱼的肌肉组织为研究对象，利用基于NMR的代谢组学方法，从生理层面和代谢层面研究牛磺酸对鱼体生长和代谢组的影响，以揭示牛磺酸的代谢机制，能够为牛磺酸在罗非鱼饲料中的配比提供科学依据。
代谢组学是一种新兴的高通量、高灵敏度、高精确度的代谢物分析方法，通过对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析，旨在寻找涉及生理和病理变化和反应的关键代谢物，以及有影响的代谢途径，而被广泛应用于生命科学的各个领域。
尼罗罗非鱼已成为仅次于鲤鱼的世界第二大养殖鱼类，其具有生长快、产量高、个体大、肥满度高和肉味鲜美、肉质细嫩、富含不饱和脂肪酸和蛋白质等优点，同时具有耐氧低、食性杂、繁殖强、适应性强等习性特点。为了达到罗非鱼的理想生长水平和经济效益，配制营养均衡且具有成本效益的饲料是其当前产业发展的迫切需要。因此，需要有更好的方法来评价罗非鱼的营养状况以及优化其饲料配方。
发明内容
本发明是一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法。提供了肌肉组织代谢组学分析模型，这些模型构建方法简单，能够检测出不同牛磺酸水平饲喂对罗非鱼的生长影响的关键代谢物和代谢通路，可以用于评价水产动物的营养状况以及优化饲料配方。
本发明所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，包括如下步骤：
(1)分为2-5个饲喂期分别收集来不同牛磺酸水平组的饲料饲喂下罗非鱼肌肉样品；
(2)对鱼肉进行预处理；
(3)将每个样本进行核磁共振谱测定得到不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉的NMR谱；
(4)将不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉原始代谢指纹图谱预处理后得到肌肉的二维数据矩阵，所述数据预处理包括：a)采集得到的肌肉样品的代谢指纹图谱，使用MestReNova v.8.1.2软件进行预处理，完成谱峰对齐，以降低谱峰漂移的影响；b)移除余残余水峰、TSP峰、残余甲醇峰和无峰基线的波谱区域，并按谱峰对谱数据进行分段积分，降低数据的维数；c)利用概率商归一化(PQN)方法进行数据归一化，减小稀释效应的影响；最后得到每行为分析样品，每列为代谢物谱峰信息的二维数据矩阵；d)对谱峰进行代谢物归属后将二维数据矩阵进行分析，所述的分析包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的模式识别分析，绘制火山图进行多变量统计分析，找出差异代谢物和代谢通路；
(5)将步骤(3)的到的二维数据矩阵依次进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，得到OPLS-DA模型并对模型进行验证，若无过拟合，则所得模型能够作为不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉代谢组学分析模型；
(6)对模型数据得出的代谢物积分数据绘制火山图进行多变量统计分析，筛选p值小于0.05、相关系数大于0.7且VIP(变量投影重要性指标)前30％的代谢物为差异代谢物。
优选地，步骤(1)中，分为三个饲喂期，每个饲喂期为28天，分别收集来四种不同牛磺酸水平0％，0.4％，0.8％和1.2％的饲料饲喂下罗非鱼肌肉样品。
优选地，本发明采用400尾规格一致的鱼，分为4个实验组，每组4个水族箱，每个水族箱25尾鱼；四个实验组分别分三个饲喂期采集肌肉；所有采集的肌肉样本经液氮速冻后均保存于-80℃超低温冰箱待测。
优选地，步骤(2)中，核磁共振实验在Varian 500MHz的核磁共振谱仪上完成，实验温度设置为298K，肌肉样品选择用NOESYPR 1D脉冲序列进行检测，其中具体的实验参数为：90°脉冲宽度10μs，累加次数64次，采样点数32K，谱宽10kHz，采样时间为1.8s，弛豫延迟为4.0s，固定间隔t1为4μs，混合时间tm为120ms。采集不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉的高分辨率一维核磁共振波谱。对氢谱数据进行傅里叶变换、相位校正、基线校正和定标，得到样品的1H NMR代谢轮廓谱。
上述方法中对于建立成功的肌肉的代谢组学分析模型，可以用于不同饲喂期下牛磺酸添加组与对照组(CTRL)的鱼肌肉的代谢组学分析。
本发明还提供所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法的应用，其用于评价水产动物的营养状况以及优化饲料配方。
本发明利用基于核磁共振波谱技术的代谢组学方法解析牛磺酸对罗非鱼生长影响，对不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉样本进行检测，得到相应的代谢图谱，并对谱图进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)建模和绘制火山图，根据这些找到差异代谢物与关键代谢通路，正确解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的作用。
本发明是一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，该方法快速、准确，且筛选出牛磺酸对罗非鱼生长影响相关的生物标志物，揭示牛磺酸引起的与罗非鱼生长发育密切相关的代谢变化规律，阐明牛磺酸调节鱼类生长的分子机制，能够用于评价水产动物的营养状况以及优化饲料配方。
附图说明
图1为本发明实施例提供的在四种不同牛磺酸水平(0％，0.4％，0.8％和1.2％)的饲料饲喂下罗非鱼肌肉的一维核磁共振谱图，其中代谢物的标注信息见表2。
图2为本发明实施例提供的不同饲喂期下饲喂不同牛磺酸水平饲料的罗非鱼肌肉组织PCA得分图。(A)FD28；(B)FD56；(C)FD84。
图3为本发明实施例提供的第28天饲喂期下牛磺酸添加组(D1，D2和D3)与对照组(CTRL)的鱼肌肉OPLS-DA得分图(左)、排列检验图(中)和火山图(右)(牛磺酸信号未去除)。
图4为本发明实施例提供的第28天饲喂期下牛磺酸添加组(D1，D2和D3)与对照组(CTRL)的鱼肌肉OPLS-DA得分图(左)、排列检验图(中)和火山图(右)(去除牛磺酸信号)。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明：
1.实验饲料的配置
本发明使用罗非鱼饲料是由含有37％粗蛋白和6％粗脂质的基础饲料(不含牛磺酸)配置而成，其中蛋白质来源为酪蛋白和明胶(不含牛磺酸)，脂质来源为鱼油、大豆油和大豆卵磷脂，碳水化合物来源为玉米淀粉(生淀粉)，其他饲料成分为维生素预混物，矿物质预混物，维生素C，磷酸二氢钙，氯化胆碱，虾粉和微晶纤维素的近似组成。将牛磺酸(食品级，北京惠康源生物科技有限公司)以0.0％、0.4％、0.8％和1.2％的比例分别添加到基础饲料中，配制出四种含有不同牛磺酸水平的罗非鱼实验饲料，组别分别记为CTRL、D1、D2和D3。实验饲料的原料和营养水平见表1。将配制饲料所用固体原料用粉碎机粉碎后过80目筛网，根据饲料配方将所有原料加水混匀，用双螺杆机制粒机(CD4×1TS多功能催化剂成型机)制成2.5mm的颗粒饲料。饲料配制好后不经晾晒直接密封于自封袋中置于-20℃冰箱保存备用。
表1.尼罗罗非鱼饲料成分及营养水平
动物养殖实验和饲养条件
在饲养实验开始之前，为了适应饲养条件，首先用商业罗非鱼饲料在由两个圆形玻璃纤维水槽(0.85米高×1.22米上直径，1.04米下直径)和Polygeyser珠粒过滤器(美国水产养殖系统技术有限公司)组成的封闭循环系统中适应性饲养2周。之后禁食24小时，选择400尾平均初始体重为4.25±0.12g(平均值±标准差)的规格一致的罗非鱼幼鱼，随机放入16个相同的150L圆柱形水族箱中，分为4个实验组，每组4个水族箱，每个水族箱25尾鱼。四个实验组分别饲喂四种不同牛磺酸水平的实验饲料(0％，0.4％，0.8％和1.2％，记为CTRL,D1,D2和D3)。在84天的饲喂期中，光照周期为自然光照，每天在8：30和18：00投喂饲料，每次投喂至表观饱食，半小时后，吸取多余的饲料和粪便，将多余的饲料在70℃下干燥并称重以计算饲料摄取率。每天12：00测量溶解氧和水温，每周使用多参数光度计监测亚硝酸盐氮(HI83200；Hanna Instruments,Woonsocket,RI,USA)。在实验期间，水温为27.0±2.0℃，溶解氧和亚硝酸盐氮分别为：6.15mg/L±0.45mg/L和0.248±0.15mg/L。
3.样本的采集和萃取
本发明采集样本是以28天为一个周期，分别在饲养的第28天、第56天和第84天，禁食12小时后，从每个水族箱中随机挑选3尾鱼(12尾鱼/实验组)，用MS 222(甲磺酸三卡因，Sigma-Aldrich上海贸易有限公司，上海)溶液将其麻醉之后分别称重，并切断鱼前脊髓。然后，在无菌条件下使用无菌切片工具将鱼解剖，以背鳍作为中心线插入每条鱼的背线上方采集2cm宽的无皮肌肉样品。将肌肉样品用铝箔包裹，在液氮中快速冷冻，保存在-80℃下备用。
取100mg解冻后的肌肉样品与400μL甲醇和125μL去离子水混合，用匀浆机在4℃下匀浆30秒后，将匀浆转移至2.5mL管中，再向每个管中加入400μL氯仿和400μL去离子水，并将混合物涡旋60秒。在冰上静置10分钟后，将样品在10000×g和4℃条件下离心5分钟。将上层上清液转移至1.5mL试管中，冻干24小时以除去甲醇、氯仿和水。然后将鱼肌肉的冻干粉末样品溶于450μL的重水(纯度为99.9％)和150μL的磷酸钠缓冲液(90mM，pH 7.4，含0.02％TSP)的混合液中，在室温下静置5分钟，然后在6000×g和4℃条件下离心10分钟，以除去悬浮物。最后再将550μL上清液转移至5mm核磁共振管中，并在4℃下储存以备进行NMR实验。
4.核磁共振谱测定
核磁共振实验在Varian 500MHz的核磁共振谱仪上完成，实验温度设置为298K，肌肉选择NOESY 1D序列进行检测，其中具体的实验参数为：90°脉冲宽度10μs，累加次数64次，采样点数32K，谱宽10kHz，采样时间为1.8s，弛豫延迟为4.0s，固定间隔t1为4μs，混合时间tm为120ms。采集不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉的高分辨率一维核磁共振波谱。
5.核磁共振谱图的预处理
采集得到的肌肉样品的代谢指纹图谱使用MestReNova v.8.1.2软件进行预处理，完成谱峰对齐，以降低谱峰漂移的影响；移除余残余水峰、TSP峰、残余甲醇峰和无峰基线的波谱区域，并按谱峰对谱数据进行分段积分，降低数据的维数；利用概率商归一化(PQN)方法进行数据归一化，减小稀释效应的影响；最后得到每行为分析样品，每列为代谢物谱峰信息的二维数据矩阵，谱峰的代谢物归属参考KEGG、HMDB的数据库和已发表的文献资料，已归属出的代谢物信息见表2。
表2.罗非鱼肌肉组织NMR谱图代谢物归属表
注：a峰的多重性：s,单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，双双峰；m，多重峰；
b归属：参考HMDB数据库(www.hmdb.ca)。
数据处理
将数据矩阵导入SIMCA 14.0软件进行多变量统计分析，主要包括主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的模式识别分析。主成分分析使用中心化换算(Ctr)的数据标度换算方式。偏最小二乘判别分析采用自适换算(UV)的数据标度换算方式。
从图2的PCA得分图可以看出，随着饲喂期的增加，三个牛磺酸添加组之间的重叠变得更加明显。这些结果表明，添加牛磺酸可诱导罗非鱼肌肉产生明显且不均匀的生理变化，与对照组相比，在不同的饲喂期外源牛磺酸对罗非鱼代谢产物的影响不同。基于这些结果，需要通过牛磺酸添加组和对照组之间的成对比较进一步评估代谢分析。
7.差异代谢物筛选
采用三次筛选的方法来确定有显著变化的代谢物。第一个筛选参数是OPLS-DA模型的相关系数r值，它反映了代谢物对组间差异的贡献。第二个是OPLS-DA的变量投影重要性指标VIP值，它反映了每个自变量X(代谢物)在求解因变量Y(分组信息)时的重要性。第三个是单变量统计t检验的p值，由两个不同组之间每个代谢物的相对浓度计算得到，用于评价和确定代谢物的显著变化。各代谢物的相对浓度用相应波谱范围的积分来量化。为了避免波谱重叠的影响，我们选择重叠最小的特征峰来量化相应的代谢物。在本发明实施例中，r，VIP和p值的阈值被设置为│r│>0.7，VIP占前10％，p<0.05。只有通过三重筛选，才能确定相应的代谢物作为潜在的生物标志物。
通过绘制一个增强的四维火山图被用来筛选符合上述标准的生物标记候选物。该图以-log10(p-value)与log2(fold change)为Y轴和X轴，其中p-value表示单变量统计t检验的p值，fold change表示组间相对浓度的倍数变化。│r│值和VIP值由颜色和圆圈大小来表示。│r│越大对应颜色越暖，VIP越大对应圆圈越大。
从图3的火山图中挑选p值小于0.05，相关系数大于0.7且VIP处于前30％的差异代谢物：牛磺酸。为了研究外源牛磺酸对其他代谢物的影响，避免牛磺酸的变化掩盖其他代谢物的变化，通过从数据中去除牛磺酸信号，重新建立新的OPLS-DA模型进行分析见图4。从图4的火山图中挑选p值小于0.05，相关系数大于0.7且VIP处于前30％的差异代谢物明显增多。
8.代谢通路分析
通过比对牛磺酸添加组与未添加组可以发现，依赖于饲料中牛磺酸水平和饲喂期，牛磺酸在罗非鱼肌肉中引起显著的代谢变化，尤其涉及TCA循环及糖酵解/糖原异生、氨基酸代谢、脂质代谢和核苷酸相关代谢。
9.结论
牛磺酸添加组的鱼肌肉组织中葡萄糖、甘油、脯氨酸和肌肽等19种代谢物(见表3)产生显著性变化。这些代谢物变化主要涉及糖酵解/糖异生、TCA循环，氨基酸代谢、脂质代谢与合成、核苷酸代谢、脂质过氧化和胶原蛋白合成等多种代谢途径。得出这些代谢差异主要体现在氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢等代谢途径中，具体表现在提高能量利用率和氨基酸摄取，促进蛋白质和脂质的合成，并且加速胶原蛋白生成，进一步提高肌肉质量等。实验结果揭示了牛磺酸对罗非鱼生长发育及肌肉组织代谢的积极调控。
表3.罗非鱼肌肉的不同牛磺酸添加组与对照组间比较的差异代谢物列表
表3续
注：a模型的评估参数包括R2X，R2Y和Q2。
b Fold：表示倍数变化(fold change)，数值大于1(或小于1)表示代谢物在牛磺酸添加组中相比于对照组浓度更高(或更低)。
c r：表示相关系数，数值大于0(或小于0)表示比较组之间代谢物浓度正相关或负相关。

Claims (8)

1.一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，包括如下步骤：
(1)分为2-5个饲喂期分别收集来不同牛磺酸水平组的饲料饲喂下罗非鱼肌肉样品；
(2)对鱼肉进行预处理；
(3)将每个预处理后的样本进行核磁共振谱测定得到不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉的NMR谱；
(4)将不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉原始代谢指纹图谱预处理后得到肌肉的二维数据矩阵，所述数据预处理包括：a)采集得到的肌肉样品的代谢指纹图谱，使用软件进行预处理，完成谱峰对齐，以降低谱峰漂移的影响；b)移除余残余水峰、TSP峰、残余甲醇峰和无峰基线的波谱区域，并按谱峰对谱数据进行分段积分，降低数据的维数；c)利用概率商归一化方法进行数据归一化，减小稀释效应的影响；最后得到每行为分析样品，每列为代谢物谱峰信息的二维数据矩阵；d)对谱峰进行代谢物归属后将二维数据矩阵进行分析，所述的分析包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的模式识别分析，绘制火山图进行多变量统计分析，找出差异代谢物和代谢通路；
(5)将步骤(3)的到的二维数据矩阵依次进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)后，得到OPLS-DA模型并对模型进行验证，若无过拟合，则所得模型能够作为不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉代谢组学分析模型；
(6)对模型数据得出的代谢物积分数据绘制火山图进行多变量统计分析，筛选p值小于0.05、相关系数大于0.7且变量投影重要性指标(VIP)前30％的代谢物为差异代谢物。
2.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，其特征是：步骤(1)中，分为三个饲喂期，每个饲喂期为28天，分别收集来四种不同牛磺酸水平0％，0.4％，0.8％和1.2％的饲料饲喂下罗非鱼肌肉样品。
3.如权利要求2所述的基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，其特征是：采用400尾规格一致的鱼，分为4个实验组，每组4个水族箱，每个水族箱25尾鱼；四个实验组分别分三个饲喂期采集肌肉；所有采集的肌肉样本经液氮速冻后均保存于-80℃超低温冰箱待测。
4.如权利要求1所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，其特征是：步骤(2)的预处理为，取100mg解冻后的肌肉样品与400μL甲醇和125μL去离子水混合，用匀浆机在4℃下匀浆30秒后，将匀浆转移至2.5mL管中，再向每个管中加入400μL氯仿和400μL去离子水，并将混合物涡旋60秒。在冰上静置10分钟后，将样品在10000×g和4℃条件下离心5分钟；将上层上清液转移至1.5mL试管中，冻干24小时以除去甲醇、氯仿和水；然后将鱼肌肉的冻干粉末样品溶于450μL的重水和150μL的磷酸钠缓冲液的混合液中，在室温下静置5分钟，然后在6000×g和4℃条件下离心10分钟，以除去悬浮物；最后再将550μL上清液转移至5mm核磁共振管中，并在4℃下储存以备进行NMR实验。
5.如权利要求1所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，其特征是：步骤(3)中，核磁共振实验在Varian 500MHz的核磁共振谱仪上完成，实验温度设置为298K，肌肉样品选择用NOESYPR 1D脉冲序列进行检测，其中具体的实验参数为：90°脉冲宽度10μs，累加次数64次，采样点数32K，谱宽10kHz，采样时间为1.8s，弛豫延迟为4.0s，固定间隔t1为4μs，混合时间tm为120ms。采集不同饲喂期饲料中添加不同剂量的牛磺酸罗非鱼肌肉的高分辨率一维核磁共振波谱。对氢谱数据进行傅里叶变换、相位校正、基线校正和定标，得到样品的1H NMR代谢轮廓谱。
6.如权利要求1所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法，其特征是：步骤(4)d中，主成分分析使用中心化换算的数据标度换算方式；偏最小二乘判别分析采用自适换算的数据标度换算方式。
7.如权利要求1所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法的应用，用于评价水产动物的营养状况。
8.如权利要求1所述的一种基于NMR代谢组学技术解析牛磺酸对罗非鱼生长影响的方法的应用，用于优化饲料配方。
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