CZ96397A3 - Anti-fas recombinant antibodies and dna thereof - Google Patents

Description

Anti-Fas rekombinantní protilátky a jejich DNA

Otolast.-vynálezu

Předkládaný vynález se týká rekombinantních protilátek namířených proti Fas, zejméma lidským Fas, a DNA kódující takové protilátky. Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků obsahujících takové protilátky a užitečných pro léčbu autoimunitních chorob jako je revmatoidní artritida, přípravky dále volitelně obsahují inhibitor buněčného růstu. Předkládaný vynález se také týká anti-Fas komplementaritu určujících regionů (GDR) a jejich užití při tvorbě takových protilátek a DNA kódující takové CDR.

Dosavadní stav techniky

Fyziologická smrt buněk v žijících organismech se přirozeně děje událostí známou jako apoptoša, a liší se od patologické smrti buněk, t.j. nekrosy (Kerr et al., (1972), Br.J.Cancer, 26, 239 et seq.). Apoptoša je příkladem programované buněčné smrti, která se děje tehdy, jsou-li jisté buňky předem programovány k přirozeně smrti v žijícím organismu, tak jako když zmíněné buňky splnily předem určenou funkci. Apoptoša je charakterizována takovými změnami jako je zakřivení povrchu buněk, kondensace nukleárního chromatinu a fragmentace chromosomální DNA, mimo jiné. Apoptoša má důležitou úlohu v likvidaci buněk, které rozpoznávají autoantigen během procesu diferenciace T a B lymfocytů. Rozvoj takzvaných autoimunitních chorob je obecně zapříčiněn výskytem autoreaktivních lymfocytů vzešlých ze selhání apoptosy během diferenciace lymfocytů (Keiichi Nakayama et al., (1995), Mebio 12(10), 79 - 86).

Fas je molekula buněčné membrány zahrnutá v apoptose imunokompetentních buněk (Yonehara, S., et al., (1989), J. Exp. Med. 169, 1747 a dále,,- Trauth, B.C., et al., (1989),

Science 24, 301 a dále,; a Itoh, N., et al., infra)- Byly vyvinuty myší monoklonální protilátky proti Fas antigenu ( Itoh, N., et al., (1991), Cell 66, 233 - 243 a Yonehara, výše, kteří popsali monoklonální protilátku označenou CH11 specifickou pro lidský Fas). Tyto anti-lidské Fas protilátky mají apoptosu - indukující cytotoxickou aktivitu, a uvažuje se o nich jako o potenciálním terapeutickém agens pro léčbu autoimunitních chorob jako je AIDS, stejně jako nádorů (Japonská patentová publikace nepodrobená průzkumu č. Hei 2-237935 a Japonská nepodrobená průzkumu PCT publikace č.

Hei 5-503281). Ogasawara et al. (Nátuře (1993), 364, 806 - 809) popisuje, že myší anti-Fas protilátky rychle usmrcují divoký typ myší, zřetelně prostřednictvím masivní apoptosy v játrech.

Monoklonální protilátky proti lidskému Fas jsou také známy z následujících publikací; J.Exp. Med. (1989),

169,1747 - 1756; WO 91/10448; Science (1989), 245, 301 305; cell (1991), 66, 233 - 243; J.Imm. (1992), 149, 3166 3173; a Internát. Immun. (1994), 6, (12) 1849 - 1856.

revmatismu, zejména o revmatoidní artritidě, se soudí, že je důsledkem proliferace synoviocytů, který je spojen s různými imunologickými abnormalitami. Proliferace synoviocytů je typicky spojena se zánětlivou buněčnou infiltrací a erosí kostí. Erose tkáně okolo postiženého kloubu u chronické revmatoidní artritidy je jasně způsobena abnormální produkcí cytokinů zánětlivými synoviocyty. Vyšetření kloubů u pacientů s revmatismem ukazuje abnormální proliferaci synoviocytů, hyperplasii synoviálních klků, mnohovrstevné synoviocyty atd. (Daniel J. McCarty (1985) , v Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology 10. vydání, Lea & Febiger). Léky pro revmatismus nyní především zahrnují protizánětlivé léky jako jsou steroidy a imunoraodulátory. Pokud by bylo možné inhibovat abnormální proliferaci synoviocytů, bylo by jakékoliv agens užitečné v léčbě revmatismu.

Synoviocyty u revmatismu neproliferují neomezeným způsobem ((Daniel J. McCarty (1985), v Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology 10. vydáni,

Lea & Febiger), a bylo demonstrováno, že u pacientů s revmatismem se vyskytuje apoptosa synoviocytů. Fas antigen je exprivován na membráně synoviocytů a Nakajima et al., (Nakajima, T,, et al., (1995), Arthritis Rheum. 38, 485 491) a Aono et al., (Abstract of 38th Meeting of Japan Rhematisra Society (1994), str. 487, a články 1994 Meeting of Japan Cancer Society, (1994), str. 388) zkoumají, zda mohou cytotoxické anti-lidské Fas protilátky indukovat apoptosu v abnormálně proliferujících synoviocytech u pacientů s revmatismem. Tyto byly schopné indukovat vysoký stupeň apoptosy u abnormálně proliferujících synoviocytů od pacientů s revmatismem ve srovnání s kontrolou obsahující synoviocyty od pacientů s jinou chorobou než revmatismem.

Tak je anti-lidská Fas protilátka schopná selektivně indukovat apoptosu nejen lymfocytů, ale též abnormálně proliferujících synoviocytů, takže anti-lidská Fas protilátka může být užitečná jako antirevmatické agens.

Nicméně, při podání myší monoklonální protilátky lidem jako farmaceutického přípravku pro chronické podávání je vysoce pravděpodobný výskyt mnoha problémů, které jsou následkem antigenicity vycházející z myšího původu. Výskyt anafylaktického šoku je pravděpodobný, a opakovaná dávka může redukovat účinnost nebo urychlit redukci na úrovni krve atd., což je efekt, který je nežádoucí, má-li být protilátka použita v klinické praxi.

Snahy překlenout problémy spojené s myšími monoklonálními protilátkami vedly k užití rekombinantní DNA technologie tak, aby se získala chimérická protilátka, ve které je konstantní region myší protilátky nahrazen konstantním regionem korespondující lidské protilátky (Morrison, S.L., et al., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 6851 6855). V alternativním procesu humanizace myší protilátky je myší CDR přítomný ve variabilním regionu myší protilátky (Jones, P.T., et al., (1986), Nátuře, 321, 522 - 525) insertován do lidské protilátky v podstatě ekvivalentním procesem. Aby se připravila taková genetickým inženýrstvím zpracovaná protilátka je nejprve nezbytné klonovat DNA kódující jak H, tak L podjednotkové řetězce, které tvoří myší protilátku. Tyto řetězce specificky rozpoznávají cílový antigen, takže objasnění jejich sekvence odhaluje primární strukturu variabilního regionu obsahujícího CDR, a tento může pak být použit pro přípravu humanizované protilátky.

Doposud nebyl žádný popis jakékoliv části cytotoxické myší anti-lidské Fas monoklonální protilátky, nebo její DNA sekvence.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí jedné nebo více nukleotidových sekvencí kódujících variabilní regiony protilátky a dovolujících konstrukci humanizovaných protilátek specifických pro lidský Fas.

V prvním aspektu poskytuje předkládaný vynález rekombinantní protein, kde uvedený protein obsahuje alespoň jeden region korespondující s variabilním regionem imunoglobulinů, kde uvedený alespoň jeden region umožňuje uvedenému proteinu rozpoznat a specificky se navázat na antigen, kde zmíněným antigenem je Fas, a kde zmíněný protein nemá v podstatě žádnou další imunogenicitu u lidí, než má lidská protilátka.

Jiné objekty, cíle, aspekty a provedení předkládaného vynálezu budou obj asněny dále.

Popis obrázků.na_ připojených výkresech

Obrázek l je schématem konstrukce cDNA knihovny pro umožnění klonováni DNA kódující celou délku každé podjednotky CH11; a

Obrázek 2 je diagramem ukazujícím proces klonování a amplifikace DNA kódující celou délku každé podjednotky CH11.

Jak je zde použito, týká se pojem rekombinantní jakékoliv substance, která byla získána genetickým inženýrstvím, jako je-li uvedená substance bud' modifikována z původní substance, nebo exprivována odlišným způsobem nebo odlišným systémem, než je původní.

Termín protein se obecně týká jakékoliv sekvence aminokyselinových zbytků navázaných peptidovými můstky, a může zahrnovat oligopeptidy stejně jako polypeptidy a multimerní peptidy nebo polypeptidová uskupení.

Region korespondující k variabilnímu regionu imunoglobulinu má strukturu charakteristickou pro variabilní region imunoglobulinu, a může korespondovat variabilnímu regionu jak H, tak L řetězce imunoglobulinu. V preferovaném provedení mají proteiny předkládaného vynálezu alespoň dva takové regiony, jeden korespondující variabilnímu řetězci H regionu a druhý korespondující variabilnímu řetězci L regionu, kde jsou oba specifické pro lidský Fas.

Proteiny předkládaného vynálezu nemají v podstatě žádnou další imunogenicitu vzhledem k lidským protilátkám, za což vděčí skutečnosti, že část protilátky korespondující heterolognímu konstantnímu regionu není přítomna. Tak mohou mít proteiny předkládaného vynálezu variabilní region nebo regiony pocházející z myší monoklonální protilátky, ale musí být vyloučen myší konstantní region. Výsledkem je, že protein předkládaného vynálezu má pouze stejnou úroveň imunogenicity pro pacienta jako, například, lidská protilátka z alternativního zdroje díky skutečnosti, že myší variabilní regiony jsou dostatečně podobné lidským, takže jakákoliv zvýšená úroveň imunogenicity může vzejít pouze z jiné aminokyselinové sekvence, která je součásti variabilního regionu.

Variabilní regiony předkládaného vynálezu mohou být odozeny z jakéhokoliv zdroje, ze kterého je možné generovat protilátky namířené proti lidskému Fas. Ačkoliv je zdrojem nejlépe myš, jsou možné také jiné zdroje jako jsou králíci a krysy, ačkoliv tyto a vyšší zvířata se jeví být méně vhodnými.

Variabilní regiony předkládaného vynálezu mohou být přítomny v proteinu v jakékoliv vhodné konfiguraci. V nejjednouěším provedení se může protein skládat z pouze jednoho variabilního regionu, ačkoliv účinnost takových proteinů bude významně snížena. Částečně je toto způsobeno chyběním stabilizace terciální struktury, ačkoliv vazba může být stále pozorována.

Na vyšší úrovni se mohou proteiny skládat z jednoho variabilního regionu H řetězce a jednoho variabilního regionu L řetězce, které jsou spolu asociovány. Taková asociace může být prostřednictvím přímé vazby, nebo může být tvořena flexibilní peptidovou vazbou zahrnující jeden nebo více extra aminokyselinových zbytků. Takové konstrukty mají výhodu v tom, že neobsahují žádné extra peptidové sekvence, které zvyšují potenciální imunogenicitu.

Ačkoiv je u proteinů předkládaného vynálezu možné, aby měly pouze jeden variabilní region, je preferováno, aby měly alespoň dva. Navíc je preferováno, aby dva byly odvozeny od jedné určité protilátky jako je CHii, každý od H a L řetězce tak, aby přesněji imitovaly přirozenou protilátku. Z ohledem na to je žádoucí, aby variabilní sekvence byly integrálně vázány s lidskými konstantními regiony, zejména s vhodnými konstantními regiony H a L řetězců.

V předchozím provedení je preferováno, aby dva variabilní regiony byly každý odpovídající Částí většího polypeptidů a aby dva polypeptidy byly schopné asociovat za tvorby heterodimeru protilátky.

Vlastnosti protilátky nejsou pro předkládaný vynález rozhodující a mohou být jakéhokoliv vhodného typu, ve kterém protein vynálezu aktuálně koresponduje s typem protilátky. Například mohou typem být IgG, IgM, nebo IgE a typ může úplně záviset na, například, cestě podání. Ačkoliv je CHU IgM molekula, mohou být variabilní regiony vloženy do IgG konstruktů. Paktem, který jsme objevili, je, že , jestliže je použit IgM typ konstruktu, ale bez J řetězce, který vytváří pentamerickou strukturu protilátky s pěti páry lehkých a těžkých řetězců, vzroste apoptotická aktivita pětkrát nebo vícekrát.

Bude objasněno, že předkládaný vynález dále poskytuje DNA a RNA kódující jakýkoliv z výše identifikovaných proteinů, a zejména DNA. Uvedená DNA může jednoduše kodovat protein, nebo může kodovat určitý polypeptid v tom případě, je-li protein například heterodimerem.

Bude také objasněno, že DNA může být v jakékoliv vhodné formě tak, aby mohla být inkorporována do vektoru, výhodně do expresního vektoru. Může být také asociována s jakoukoliv vhodnou sekvencí, jako je leader sekvence nebo sekvence pro expresi kódovaného proteinu ve formě fušního proteinu, například.

Předkládaný vynález dále poskytuje hostitelskou buňku transformovanou vektorem jak je definován výše, a systém pro expresi proteinu vynálezu obsahující takovou hostitelskou buňku transformovanou jedním nebo více vektory obsahujícími výše uvedenou DNA. Protein vynálezu může být získán pomocí takových systémů, po kultivaci systému standartními technikami.

Jisté preferované aspekty a provedení předkládaného vynálezu nyní následují:

Genetickým inženýrstvím zpracovaný imunoglobulinový protein, který specificky váže lidský Pas, kde se imunoglobulinový protein skládá z podjednotky H řetězce a podjednotky L řetězce, kde podjednotka H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou následujícím obecným vzorcem (1):

-FRH -CDRH -FRH -CDRH -FRH -CDRH -FRH - (1)

X X 2 2-3 3 4 kde FREJ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 13 až 30 aminokyselinových residuí, CDRH^ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NG. 1, FRH₂ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 14 aminokyselinových residuí, CDRHJ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO 2, FRH_a representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 32 aminokyselinových residuí, CDRH₃ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO. 3, a FRH^ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 11 aminokyselinových residuí, kde je každá aminokyselinových sekvencí navázána na další cestou peptidové vazby;

podjednotka L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou následujícím obecným vzorcem (II):

-FRL -CDRL -FRL -CDRL -FRL -CDRL -FRL - (II)

X X 2 2 3 3 4 kde FRL^ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 23 aminokyselinových residuí, CDRL^ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO. 4, FRL₂ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 15 aminokyselinových residuí, CDRL__ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO 5, FRL₃ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 32 aminokyselinových residuí, CDRL₃ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO. 6, a FRL₄ representuje aminokyselinovou sekvenci zahrnující 10 aminokyselinových residuí, kde je každá z aminokyselinových sekvencí navázána na další cestou pept idové vázby.

Výše uvedený protein je preferován, jestliže podjednotka H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č. 1 až 116 v SEQ ID NO. 8, a/nebo podjednotka L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č. 1 až 112 v SEQ ID NO. 10.

Výše uvedený protein je preferován , jestliže podjednotka H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č. 1 až 571 v SEQ ID NO. 8, a/nebo podjednotka L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č. 1 až 219 v SEQ ID NO. 10

Vynález dále poskytuje DNA kódující podjednotku H řetězce obsahující peptid vzorce (I) jak je definován výše. Preferujeme takovou DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci representovanou nukleotidy č. 58 až 405 v SEQ IN NO. 7.

Také preferovanou je DNA, která hybridizuje s takovou DNA, sense řetězec kódující podjednotku H řetězce imunoglobulinu schopného specificky vázat lidský Fas spolu s podjednotkou L řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce (II). Je preferováno, aby taková DNA byla schopná hybridizovat při 60 až 70 °C a v 6 x SSC.

DNA kódující podjednotku L řetězce kódující aminokyselinovou sekvenci representovanou obecným vzorcem (II) je také preferována, zejméma obsahuje-li nukleotidovou sekvenci representovanou nukleotidy č. 58 až 393 v SEQ IN NO. 9. DNA, která hybridizuje s takovou DNA, a jejíž korespondující sense řetězec kódující podjednotku L řetězce imunoglobulinu, který specificky váže lidský Fas antigen spolu s podjednotkou H řetězce jak je definováno výše, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce (I) je také preferována, zejméma je-li hybridizace při 60 až 70 °C a v 6 x SSC.

Dále je preferován rekombinantní DNA vektor obsahující jakoukoliv DNA popsanou výše, zejméma rekombinantní DNA vektorů pCR3-H123 a pCR3-L103, buňky transformované takovými vektory a zejméma E.coli pCR3-H123 (FERM BP-5247) a E.coli pCR3-Ll03 (FERM BP-5248).

Preferovaná metoda pro produkci imunoglobulinového proteinu, který specificky rozpoznává lidský Fas antigen zahrnuje:

kultivaci buněk transfektovaných DNA vektorem popsaným výše za podmínek, které umožní expresi DNA kódující podjednotku L řetězce nebo H řetězce, která je obsažena ve vektoru, a získání imunoglobulinového proteinu z kultury.

Předkládaný vynález dále počítá s použitím CDR, at vázaný či nikoliv, na regiony framework (FR) jak je identifikován výše, a jeho kódující DNA, v konstrukci humanizovaných protilátek a proteinů, které selektivně vážou lidský Fas.

Nyní jsme úspěšně klonovali geny kódující každý z H, L a J řetězců IgM monoklonální protilátky proti lidskému Fas. Byla použita cDNA knihovna připravená z hybridomů produkujících protilátku a bylo možné objasnit celou nukleotidovou sekvenvci každého genu a její korespondující aminokyselinovou sekvenci, z těchto bylo možné získat ČDR sekvence H a L řetězců. Expresní vektory obsahující H, L a J řetězce byly konstruovány, a bylo shledáno, že ze supernatantu kultury získané ko-transfekcí kultivovaných zvířecích buněk těmito vektory bylo možné získat cytotoxické proteiny mající podobnou aktivitu jako protilátka proti lidskému Fas.

DNA předkládaného vynálezu může být získána nejprve přípravou póly(A)*RNA z myších hybridomních buněk produkujících monoklonální protilátku proti lidskému Fas, jako je CH11.

Póly(A)*RNA může pak být konvertována na cDNA použitím reversní transkriptasy, cDNA kódující Η, 1 a případně J řetězec protilátky může být purifikována. (Yonehara et al. {(1989), J.Exp. Med. 169, 1747 a dále) monoklonální protilátku proti lidskému Fas, která byla označena CH11, fúsí myších myelomových buněk s myšími lymfocyty po imunizaci myši Fas exprivujícími lidskými diploidními fibroblasty buněčné linie FS-7. CH11 protilátka je komerčně dostupná od Medical Biological Laboratory Co. Ltd. of Japan.

Poly(A)*RNA může být získána buď nejprve přípravou celkové RNA a pak purifikaci poly(A)’RNA z celkové RNA užitím například afinitní kolony plněné oligo(dT) celulosou, oligo(dT) latexových korálků atd., nebo může být získána přímo purifikaci poly(A)*RNA z buněčných lysátů za použití takových afinitních materiálů, které jsou popsány výše. Celková RNA může být připravena například takovými metodami jako je: ultracentrifugace v hustotním gradientu alkalické sacharosy (Doůgherty, W. G. a Hiebert, E., (1980), Virology, 101, 466 - 474); guanidin thiokyanat-fenolovou metodou; guanidin thiokyanat-trifluorocesium metodou; a fenol-SDS metodou.

Preferovaná metoda nicméně využívá guanidin thiokyanat a chlorid cesia (Chirgwin, J.M., et al., (1979), Biochemistry, 18, 5294 - 5299).

Jednořetězcová (ss) eDNA získaná užitím reversní transkriptasy jak je popsáno výše, může pak být konvertována na dvouřetězcovou (ds) eDNA. Vhodné metody pro získání ds cDNA zahrnují Sl nukleasovou metodu (Efstratiadis, A., et al. (1976), Cell, 7, 279 - 288) a Gubler - Hoffmanovu metodu (Gubler, U., aq Hoffman, B.J. (1983) Gene, 25, 263 - 269). My nicméně preferujeme využití Okayama - Bergovi metody (Okayama. H. a Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170).

Ds eDNA získaná výše může pak být integrována do klonujícího vektoru a výsledný rekombinantní vektor pak může být použit pro transformaci vhodných mikroorganismů, jako je E. coli.

Transformované buňky budou selektovány použitím standartních metod, jako je selekce podle resistence na tetracyklin nebo resistence na ampicilin, která je kódovaná rekombinantním vektorem. Při použití E.coli může být transformace dosažena metodou podle Hanahana (Hanahan, D. (1983), J.Mol. Biol., 166,

557 - 580). Alternativně může být rekombinantní vektor zaveden do kompetentních buněk připravených vystavením zároveň chloridu vápenatému a buď chloridu hořečnatému nebo chlorid rubidia.

Je-li plasmid použit jako vektor je vysoce žádoucí, aby plasmid nesl gen lékové resistence, jak bylo zmíněno výše, aby se usnadnila selekce. Selekce za použití hrubé síly je možná, ale není preferována. Ačkoliv se mluvilo a plasmidech je jasné, že mohou být použity jiné klonovaeí prostředky, jako jsou lambda fágy.

Metody pro selekci transformantů majících žádoucí DNA zahrnují následující:

(1) Vyšetření použitím syntetické oligonukleotidové proby Jestliže byla určena část nebo celá aminokyselinová sekvence požadovaného proteinu, pak může být krátká sousedící sekvence, která je také representativní pro požadovaný protein, použita pro konstrukci oligonukleotidové proby. Proba kóduje aminokyselinovou sekvenci, ale, díky degeneraci genetického kódu, existuje větší množství prob, které mohou být připraveny. Tak bude aminokyselinová sekvence obyčejně vybrána tak, aby mohla být kódována omezeným množstvím oligonukleotidů. Počet oligonukleotidů, které je nezbytné vytvořit, může dále být redukován substitucí inosinu tam, kde mohou být použity jakékoliv čtyři normální base. Proba je pak vhodně značena, například ^3i?P, ^3SS nebo biotinem, a pak je hybridizována s denaturovanou, transformovanou DNA od transformantů, které byly imobilizovány na nitrocelulosovém filtru. Pozitivní kmeny jsou ukázány detekcí značky na probě.

(2) Polymerasové řetězová reakce

Jestliže byla určena část nebo celá aminokyselinová sekvence požadovaného proteinu,pak mohou být syntetizovány sense a antisense oligonukleotidové primery korespondující k separátním nesousedícím částím aminokyselinové sekvence, tak jako v metodě popsané v (1) výše. Tyto primery pak mohou být použity v technice polymerasové řetězové reakce (Saiki, R.K., et al., (1988)

Science, 239, 487 - 491) za použití templátové DNA. Templátová DNA, která je zde použita, může být cDNA syntetizovaná reversní transkriptásovou reakcí za použití mRNA získané z hybridomů produkujících protilátku proti lidskému Pas, jako je ta exprivovaná CH11. Takto syntetizovaný DNA fragment může být buď přímo integrován do plasmidového vektoru, například použitím komerčního kitu, nebo může být značen například ³²P, ³⁵S nebo biotinem, a pak použit jako proba pro hybridizaci kolonie nebo hybridizaci plaku pro získání požadovaného klonu.

Monoklonální protilátka CH11 je molekulou imunoglobulinu M (IgM); komplexem obsahujícím pět podjednotek jak Η (μ řetězce), tak L řetězce, a jeden J řetězec. Proto aby se určila jednotlivá aminokyselinová sekvence pro podjenotku musí být podjednotka separována, což může být provedeno jakoukoliv vhodnou technikou jako je elektroforesa, chromatografie na koloně, atd., které jsou v oboru dobře známé. Pokud byla podjednotka separována, je sekvencována například použitím automatického sekvencoru proteinů (například PPSQ-10 od Shimadzu), aby se určila aminokyselinová sekvence alespoň N - konce každé podjednotky.

Oligonukleotidy/primery mohou pak být produkovány za využití této znalosti.

Získání DNA kódující každou podjednotku monoklonální protilátky proti lidskému Fas z vhodných transformantů získaných výše může být provedeno dobře známou technikou, jako je ta, kterou popisuje Maniatis, T. et al., (v Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)). Například, region DNA kódující požadovanou podjednotku může být excidován z plasmidové DNA po separaci frakce korespondující vektorové DNA z transformantů, který byl určen jako nesoucí nezbytný plasmid.

E.coli DH5a byl transformován plasmidem obsahujícím DNA kódující těžké, lehké a J řetězce CHll, připravené jak je popsáno výše, a vzniklé tři transformanty (označené E.coli pCR3-H123, E.coli pCR3-L103, E.coli pCR3-J1123) byly uskladněny v souladu s podmínkami Budapešťské smlouvy o uložení mikroorganismů v Research Institute of Life Science Technology Agency of

Industrial Science and Technology 28. února 1996 a byly jim přiděleny ukládací čísla FERM BP-5427, PERM BP-5428 a FERM BP-5429, v příslušném pořadí. E.coli DH5or obsahující tyto plasmidy může být kultivována srovnatelným způsobem jako E.coli DH5a nenesoucí tyto plasmidy. Všechny uskladněné kmeny mohou být selektovány díky jejich resistenci na ampicilin. Proto může být DNA předkládaného -vynálezu získána za použití těchto deposit. Tohoto může být dosaženo například kultivováním deposit a izolováním plasmidů, nebo užitím polymerasové řetězové reakce (PCR) za použití plasmidů jako templátů.

Tam, kde je to vhodné, mohou být DNA sekvence sekvencovány podle mnoha v oboru dobře známých metod, včetně, například, Maxam - Gilbert chemické modifikované techniky (Maxam, A.M. a Gilbert, W. (1980) v Methods in Enzymology 65, 499 - 276) a dideoxy řetězovou terminační metodou za užití M13 fágu (Messing, J. a Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269 - 276). V posledních letech další metoda sekvencování DNA dosáhla širokého uplatnění, a obsahuje použití fluorogeního barviva místo konvenčního radioizotopu v dideoxy metodě. Celý proces je komputerizován, včetně čtení nukleotidové sekvence po elektroforese. Vhodným přístrojem pro proces je například Perkin - Elmer Sequence robot CATALYST 800 a Perkin - Elmer model 373A DNA sekvencer. Užití této techniky umožňuje účinné a bezpečné určení DNA nukleotidové sekvence.

V souladu s tím je možné z takto určené nukleotidové sekvence

DNA kódující H a L řetězce CHll, v konjunkci s daty sekvence pro

N-konec H a L řetězců, určit celou aminokyselinovou sekvenci Ha

L řetězců CHll.

Regiony pracovních rámečků (FR) jsou přítomny v různých regionech H a L řetězců imunoglobulinů a slouží k obklopení a separování CDR. V souladu s tím je zde o jeden FR více ve srovnání s počtem CDR v každém variabilním regionu. framework regiony také přispívají ke trojrozměrné struktuře variabilního regionu, a tak se účastní ve vazbě antigenu stabilizací terciální struktury regionu. Jako ilustrace terminologie aplikované na každý FR a CDR ve varibilním regionu je FRH^ framework region na N-terminálním konci variabilního regionu H řetězce. Postupně směrem k C-terminálnímu konci jsou zde v příslušném pořadí CDRH^ FRH^, CDRH₂, FRH₃, CDRH₃ a nokonec FRH^. Stejná nomenklatura je použita na L řetězec, takže první ”framework region je označen FRL , atd.

X ^f

Jak H, tak L řetězce imunoglobulinů obsahují variabilní a konstantní region. Variabilní region je složen z CDR a, jak bylo posáno výše, jak H, tak L řetězce mají tři CDR propojené mezi sebou a doprovázené čtyřmi framework regiony. Aminokyselinová sekvence konstantních regionů je stejná, bez ohledu na rozpoznání antigenu, a je přesně oddělena pro H a L řetězce a tak poskytuje stejnou třídu imunoglobulinů. Oproti tomu je aminokyselinová sekvence variabilního regionu, zejméma CDR, a je typická pro každou protilátku. Nicméně, podle srovnávacích studií aminokyselinových sekvencí velkého počtu protilátek, jak umístění CDR, tak délka framework sekvencí, které je spojují, je prakticky konstantní u podjednotek protilátky stejné podskupiny (Rabat,

E.A. et al., (1991), v Sequence of Proteine of Immunological

Interes Vol. II: U.S. Department of Health and Human Services).

S touto znalostí je proto možné určit umístění CDR, framework regionů a konstantních regionů každého z H a L řetězců CH11 srovnáním určené aminokyselinové sekvence se známou aminokyselinovou sekvencí.

Bude zřejmé, že ”framework regiony jsou důležitě pro separaci

CDR a pro pomoc při sterickém určení struktury variabilních regionů, ale že, pokud jsou tyto požadavky splněny, není aktuální velikost a sekvence každého framework regionu významná pro předkládaný vynález, což je dáno tím, že FR nejsou odpovědné za vazbu antigenu.V souladu s tím může být pro každý FR použita jakákoliv vhodná aminokyselinová sekvence. Nicméně, bylo pozorováno, že framework regiony jsou všeobecně přirozeně konzervovány, a z tohoto důvodu obecně preferujeme uchování regionů, které jsou buď identické, nebo těsně korespondující k těm, které jsou nacházeny v CH11 (Yonehara et al., supra).

Ačkoliv je délka řetězce framework’¹ regionu obecně v podstatě konservovaná, zejméma uvnitř imunoglobulinových subtypů, bylo stanoveno, že FRH_x, umístěný na N-konci H řetězce může být někdy kratší, než je předpokládáno. Tak místo 30 aminokyselin může být FRH^ zkrácen u myšího IgM na 13 aminokyselin a byla stanovena minimální délka 19 aminokyselin pro μ 2a podtyp pro CHll (Kabat et al.). V souladu s tím může být délka řetězce framework regionu v N-konci H řetězce v rozsahu 13 až 30 aminokyselin. Toto rozmezí je preferovaně mezi 19 a 30 aminokyselinami a nejlépe je 30 aminokyselin.

Obecně bude jasné, že framework regiony v každém konci variabilního regionu (FRH^ a FRH^ v H řetězci) mají menší význam než vmezeřené framework regiony přímo spojující CDR (FRH₂ a FRH v H řetězci). V souladu s tím se mohou připojené framework regiony lišit o více než asi 60% od normy dané pro daný typ protilátky, zatímco vmezeřené framework regiony se mohou v délce lišit pouze v omezeném rozsahu, který je typicky pouze jedna aminokyselina. V některých případech může vést jakákoliv variace v délce k významnému snížení účinnosti a odborník bude snadno schopen stanovit potřebné parametry pro jakýkoliv konstrukt variabilního regionu.

Je-li žádoucí konstruovat pozměněnou sekvenci, ve které je deletována jakákoliv jedna nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci, pak může být použita, například, metoda kazetové mutace (Toshimitsu Kishimoto, Shin-Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemistry Experiment Series) II: Nucleic Acids III, Recombinant DNA technology, str. 242 - 251).

Jakákoliv vhodná aminokyselinová sekvence může být navázána na C-terminální konec obou variabilních regionů, pokud neovlivmí nepříznivě schopnost vazby antigenu, pokud to není z důvodu jako je tvorba prekursorové molekuly, například tvorba leader sekvence.Obecně, tam, kde je C-terminální sekvence preferujeme, aby korespondovala s lidským konstantním regionem z vhodného H nebo L řetězce.

DNA předkládaného vynálezu může být připravena jakoukoliv vhodnou metodou, jako je chemická syntesa za použití konvenčních metod, jako je fosfát - triesterová metoda ( Hunkapiller, M. et al., (1984), Nátuře, 310, 105 - 111; a Grantham, R., et al., (1981) Nucleic Acids Res. 9, r43 - r74). Různé kodony pro aminokyseliny jsou dobře známé a jejich selekce může být úplně svévolná, ačkoliv je všeobecně preferováno použít selekci založenou na frekvenci použití kodonů pro vybraného hostitele. Je-li využita jiná technika než přímá chemická syntesa, může být žádoucí částečně modifikovat kodony získané sekvence, a tohoto může být dosaženo například místně řízenou mutagenesi (Mark, D.F., et al., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662 5666) za použití syntetických oligonukleotidů s inkorporovanou požadovanou modifikací j ako* primerů.

V předkládaném vynálezu, kde je specifikováno, že DNA může hybridizovat s jinou DNA, může být toto stanoveno technikami v oboru dobře známými. Například pro stanovení, jestli jistá sekvence hybridizuje s nějakou jinou danou sekvencí, může být jedna nebo druhá sekvence označena například (<x-³²P) dCTP za použití metody náhodného primerů (Feinberg A.P. a Vogelstein, B.(1983), Anal. Biochem., 132, 6 - 13) nebo zářezovou (nick) translační metodou (Maniatis, T., et al., (1982) v Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY), například. Jeden DNA řetězec použitý v hybridizačním testu je vhodně adsorbován na, například, nitrocelulosovou membránu nebo nylonovou membránu, a na ní imobilizován zahřátím nebo UV ozářením za použití konvenčních metod. V jednom specifickém provedení může pak membrána být ponořena v prehybridizačním roztoku obsahujícím 6 x SSC, 5% (objem/ objem) Denhartův roztok a 0.1% (hmotnost/ objem) dodecy1 sulfát sodný (SDS) a inkubován při 55 °C po více než 4 hodiny. Druhý, značený řetězec je pak přidán do prehybridizačního roztoku do konečné specifické aktivity 1 x IQ⁶ cpm/ml a inkubován přes noc při 60 °C. Potom je membrána promyta v 6 x SSC při pokojové teplotě pětkrát po dobu 5 minut. Po dalším promytí při 57 °C po 20 minut je membrána podrobena autoradiografii pro určení toho, jestli hybridizace proběhla. Tak může být připravena a izolována DNA hybridizující s DNA předkládaného vynálezu (Maniatis, T., et al., (1982) v Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Integrace takto získané DNA předkládaného 'vynálezu do expresního vektoru umožňuje transformaci prokaryotních a eukaryotních hostitelských buněk. Takové expresní vektory budou typicky obsahovat vhodné promotory, replikační místa a sekvence zahrnuté v genové expresi, které umožní expresi DNA v hostitelské buňce.

Vhodné prokaryotní hostitelské buňky zahrnují, například, E.coli (Escherichia coli) a Bacilus subtilis. Aby byl exprivován požadovaný gen v takovém hostiteli, musí být hostitelské buňky transformovány plasmidovým vektorem obsahujícím replikon odvozený od druhu kompatibilního s hostitelem, který typicky má zdroj replikace a promotorovou sekvenci jako je lac ÚV5. Vektory preferovaně mají sekvence schopné udělení selekčního fenotypu transformovaným buňkám.

Vhodným kmenem E.coli je kmen JMI09 odvozený od E.coli K12. Vhodné vektory zahrnují pBR322 a pUC seríe plasmidů. Vhodné promotory zahrnují laktosový promotor (lac) a tryptofan laktosový promotor (trc). Obecně bude jasné, že předkládaný vynález není omezen na takové hostitele, vektory, promotory atd., jak jsou zde doloženy příklady a že může být použit jakýkoliv vhodný systém podle potřeby.

Vhodným preferovaným kmenem Bacillus subtilis je kmen 207-25, a preferovaným vektorem je pTUB (Ohmura, K., et al., (1984),

J.Biochem., 95, 87 - 93). Vhodným promotorem je regulační sekvence Bacillus subtilis or-amylasového genu. Je-li to žádoucí, může být DNA sekvence kódující signální peptidovou sekvenci ά-amylasy navázána na DNA předkládaného vynálezu, aby se usnadnila extracelulární sekrece.

Vhodné eukaryotické hostitelské buňky zahrnuji buňky od obratlovců, kvasinek atd. Vhodné buňky od obratlovců zahrnují, například opičí buněčnou linii COS (Gluzman, Y. (1981), Cell, 23, 175 - 182). Vhodné kvasinky zahrnují Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe.

Obecně jsou požadavky pro vhodné expresní vektory pro buňky obratlovců tyto: promotor obvykle upstream od exprivovaného genu; RNA spojovací místo; polyadenylační místo; a traskripční terminátorovau sekvenci atd. Je-li to žádoucí mohou dále obsahovat zdroj replikace. Vhodným plasmidem je pSV2dhfr obsahující SV40 promotor ( Subramani, S. et al., (1981) Mol. Cell Biol., 1, 854 - 884).

Vhodnými eukaryotickými hostiteli jsou kvasinky, jako je Saccharomyces cerevisiae, a vhodné expresní vektory pro kvasinky zahrnují pAH301, pAH82 a YEpSl. Vhodné vektory obsahují, například, promotor genu pro alkohol dehydrogenasu (Bennetzen, J.L. a Halí B.D. (1982, J.Biol. Chem., 257, 3018 - 3025) nebo karboxupeptidasa Y GAL10 protmotor (Ichikawa, K. et al., (1993),

Biosci. Biotech. Biochem, 57,1686 - 1690). Je-li ti žádoucí může být DNA sekvence kóduj ící signální peptidovou sekvenci karboxypeptidasy Y připojena na exprivovanou DNA, aby se usnadnila extracelulární sekrece.

V případě, že hostitelem je COS, zahrnují vhodné vektory SV40 zdroj replikace, umožňující autonomní růst, transkripční promotor, terminační signál transkripce a RNA spojovací místo.

Expresní vektory mohou být použity pro transformaci buněk jakoukoliv vhodnou metodou, jako je DEAE-dextranová metoda (Luthman, H., a Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1295 - 1308), fosforečan vápenatý-DNA koprecipitační metodou (Graham,

F.L. a van der Eb, A.J. (1973) Virology, 52, 456 - 457) a metodou elektroporace elektrickými pulsy (Neumann, E. et al., (1982) EMBO J. 1, 841 - 845) V preferovaném provedení jsou COS kotransfektovány dvěma separátními expresními vektory - jedním obsahujícím DNA kódující protein obsahující variabilní region H řetězce CHll a jedním obsahujícím DNA kódující protein obsahující variabilní region L řetězce CHll, a tyto vektory jsou exprivovány simultánně za vzniku rekombinantní protilátky proti lidskému Fas.

Transformanty předkládaného vynálezu mohou být kultivovány za použití konvenčních metod, kde je požadovaný protein exprivován buď intra, nebo extracelulárně. vhodná kultivační media zahrnují různá obecně užívaná media, a budou obecně vybrána podle vybraného hostitele. Například, vhodně medium pro COS buňky zahrnuje RPMI-1640 a Dulbekovo Modifikované Eaglovo Minimální esenciální medium, které může být doplněno, je-li to žádoucí, fetálním hovězím sérem (FBS). Teplota kultivace může být jakákoliv teplota, která nesnižuje významně schopnost buněk syntetizovat proteiny, a preferovaně je v rozmezí od 32 do 42 °C, zejméma pro savčí buňky. Je-li to žádoucí, může být kultivace provedena v atmosféře obsahující 1 až 10% (objem/objem) oxidu uhličitého.

Protein exprivovaný transformanty předkládaného vynálezu může být izolován a purifikován různými dobře známými metodamy separace podle toho, jestli je protein exprivován intra- nebo extra- celulárně a s ohledem na fyzikální a chemické vlastnosti proteinu. Vhodné specifické metody separace zahrnují: ošetření obecně užívaným precipitačním činidlem pro proteiny; různé metody chromatografie jako je ultrafiltrace, chromatografie na molekulární síťce (gelová filtrace), adsorpční chromatografie, iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie a vysoko21 tlaková kapalinová chromatografie (HPLC); dialýsu; a jejich kombinace

Užitím metod posaných výše může být požadovaný protein snadno získán ve značném výtěžku a vysoké čistotě. Protilátka produkovaná v preferovaném provedení může postrádat J řetězec, jestliže zde není žádný extra plasmid kódující J řetězec. V takovém případě jsme stanovili, že výsledné heterodimery H a L řetězců mají cytotoxicitu asi pětkrát vyšší než CH11.

Specifická vazebná aktivita proteinů předkládaného vynálezu k Fas antigenu může být určena, například, enzym vázanou imunosorbentní zkouškou (ELISA) V jednom specifickém provedení ELISA je Fas antigen imobilizován na dně jamek 96 jamkového plátu a testovaný protein je zaveden do jamek, kde jsou potom buňky promyty kvůli odstranění nenavázaného proteinu. Po promytí jsou buňky vystaveny enzymem značené protilátce speifické pro protein, například pro jeho konstantní region. Buňky jsou pak promyty znovu, a jakákoliv značka zbývající v jamce je detekována. cDNA kódující pro lidský Fas antigen byla dříve popsána a metoda pro zavedení cDNA do zvířecích buněk pro její expresi je také známa (Itoh, N., et al., (1991) Cell, 66, 233 - 243). Antigen pro použití ve výše uvedené ELISA metodě může být získán ze supernatantu kultury buněk, které byly transformovány expresním vektorem obsahujícím gen kódující fusní protein obsahující extracelulární region lidského Fas antigenu a extracelulární region myšího receptoru pro interleukin 3, jak popisuje itoh (výše).

Cytotoxicita proteinů předkládaného vynálezu může být stanovena například kultivováním buněk exprivujících Fas (například lidských lymfocytú buněčné linie HPB-ALL (Morikawa, S. et al., (1978), Int. J.Cancer, 21,166 - 170) a Jurkat (American Type Culture č. TIB - 152) v mediu , do kterého byl nebo bude přidán testovací vzorek, a určením stupně přežiti MTT zkouškou (Green, L. M., et al., (1984) J. Immunological Methods, 70, 257 268) .

Za použití DNA předkládaného vynálezu může být konstruována chimérická myší protilátka, kde je konstantní region nahrazen konstantním regionem lidského imunoglobulinu (Morrison, S.L., et al., (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 6851 - 6855).

Podobně je možné konstruovat Fv frakci složenou v podstatě pouze z variabilních regionů H a L řetězců, kde touto je jednotlivý řetězec Fv (scFv) (Huston, J.S. et al., (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879 a dále), kde jsou H a L řetězec spojeny flexibilním peptidem.

Tak, v souladu s předkládaným -vynálezem, může být produkována protilátka proti Fas, která má redukovanou imunogenicitu u lidí, konstrukcí humanizované protilátky obsahující konstantní region lidské protilátky s CDR myší protilátky proti lidskému Fas (Jones, P.T. et al., (1986) Nátuře, 321, 522 - 525}.

Předkládaný vynález také poskytuje metodu a terapeutické kompozice pro léčbu příznaků uvedených výše. Takové kompozice typicky obsahují terapeuticky efektivní množství proteinu předkládaného vynálezu ve směsi s farmaceuticky akceptovatelným nosičem. Kompozice může být podána jakýmkoliv vhodným způsobem, jako je parenterální, intravenosní, subkutánní, nebo lokální podání. Zejména tam, kde jsou léčeny lokální příznaky, je preferováno co nejbližší podání proteinu do tohoto místa. Například, vážná revmatická bolest může být pociťována na velkých kloubech, a protein může být podán v takovém místě. Systémově podaný protein tohoto vynálezu je výhodné podat ve formě apyrogeního, terapeuticky, zejméma parenterálně, akceptovatelného vodného roztoku. Příprava takového farmaceuticky akceptovatelného proteinového roztoku s ohledem na aspekty jako je pH, izotonicita, stabilita a podobně, je odborníkům dobře známa. Navíc, kompozice předkládaného vynálezu mohou zahrnovat další přísady jak je uznáno za vhodné, jako jsou retardanty buněčného růstu nebo jiné medikamenty.

Dávkovači režim pro různé příznaky léčené proteiny předkládaného vynálezu bude Odborníkům jasný, s ohledem na různé faktory, jako je celkový stav, tělesná hmotnost, pohlaví a dieta pacienta, závažnost jakýchkoliv příznaků, čas, požadavek opakované léčby, stejně jako jiné vhodné klinické faktory. Všeobecně by denní dávka měla být v rozsahu i - 1000 pg proteinu na kilogram tělesné hmotnosti.

Vynález bude nyní vysvětlen detailněji s odkazem na následující Příklady, které jsou ilustrativní, nikoliv omezující, pro předkládaný vynález. Jakékoliv metody, přípravy roztoků a podobně, které nejsou specificky definovány, mohou být nalezeny v Molecular Cloning - A Laboratory Handbook” (výše). Všechny roztoky jsou vodné a jsou vyrobeny ve sterilní, deionizované vodě, pokud není jinak specifikováno.

Příklad l

Klonování DNA kódující variabilní region myší monoklonální protilátky CH11 proti lidskému Fas antigenu (l-l) Příprava póly(A)* RNA

Celková RNA byla připravena z CHll produkujících hybridomů (získaných od Yonehara, výše) v souladu s metodou popsanou Chirgwinem a spolupracovníky (viz Chirgwin, J,M,, et al., (1979) Biochemistry 18, 5294). Specificky byl CHll produkující hybridom (viz Yonehara , S. et al., (1994) International Immunology 6,1849 - 1856) kultivován v ASF104 mediu (Ajinomoto) obsahujícím 10% (objem/objem) fetální hovězí sérum (Gibco). Přibližně 6.7 x 10® buněk bylo získáno centrifugací a supernatant byl odložen. Výsledné pelety buněk pak byly okamžitě smíchány s 60 ml 4M roztoku guanidin thiokyanatu (Fluka). Buňky ve vzniklé suspensi byly následně lysovány aspirací buněčné suspense injekční stříkačkou vybavenou jehlou číslo 21 tři krát. Takto získaný buněčný lysát byl navrstven 3 ml 5.7 M chloridu cesia/ 0.1 M roztok EDTA (pH 7.5) v ultracentrifugační tubě (13PA:Hitachi Koki) a tuba pak byla odstředěna na Hitachi RPS-40T Rotor (13PA tuba, 150000 x g při 20 °C po 18 hodin) pro preoipitaci RNA. Precipitovaná RNA byla rozpuštěna ve vodě, extrahována pomocí chloroform/l-butanol (4:1, objem/objem) a potom reprecipitována 100% etanolem.

Póly(A)* RNA byla pak purifikována z celkové, výsledné RNA připravené výše, běžnými metodami (Maniatis, T. et al., (1988) Molecular cloning: A Laboratory Manual, (2.edice), Cold Spring Barbor Lab., 7.26 - 7.28). Přesněji, polyesterová kolona pro jedno použití (průměr 0.7 cm) byla naplněna 100 mg oligo dT Celulosy (Pharmacia, Typ 7). Kolona byla ekvilibrována zaváděcím pufrem, obsahujícím 20 mM tris- chlorovodíkové kyseliny (pH 7.6), 0.5 M Chloridu sodného, l mM ethylendiamin tetraacetátu (EDTA) a 0.1% (hmotnost/ objem) dodecylsulfátu sodného (SDS). Celková RNA (přibližně 1.2 mg) pak byla rozpuštěna v celkovém objemu 400 μΐ vody zahřátím na 65 °C po 5 minut, a pak bylo do roztoku přidáno 400 μΐ zaváděcího pufru (vyrobeného ve dvakrát vyšší koncentraci). Výsledná směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a pak nalita do kolony. Frakce, která prošla kolonou byla odebrána, zahřáta na 65 °C po dalších 5 minut, a pak nalita zpět do kolony.

Kolona byla poté znovu promyta 10 ml zaváděcího pufru, a pak znovu promyta 5 ml zaváděcího pufru obsahujícího 0.1 M chlorid sodný pro odstranění neadsorbovaných látek a také nespecifických adsorbovaných látek. Následně bylo do kolony nalito 5 ml elučního pufru (10 mM tris-chlorovodíkové kyseliny (pH 7.5), 1 mM EDTA a 0.05% (hmotnost/objem) SDS), aby se vyluhoval adsorbent. Výsledný eluát byl odebrán ve frakcích o 200 μΐ. Třetí a čtvrtá 200 μΐ eluční frakce (celkem 400 μΐ) byly zkombinovány a smíchány s 40 μΐ 3 M octanu sodného (pH 4.0) a 1 ml ethanolu. Výsledná směs byla uskladněna při - 20 °C přes noc. Další den byla směs odstředěna na centrifuse (10000 x g, 4 °C po 10 minut) pro získání pelet. Tyto pelety byly užity jako poly(A)*RNA vzorky a byly uskladněny při -80 °C až do doby použití.

(1-2) Klonování DNA kódující variabilní region cDNA fragmenty pro variabilní regiony H řetězce a L řetězce myšího anti-Fas antigenu (CHll) byla klonována RŤ-PCR, která kombinue reversní transkripci (užitím reversní transkriptásy RT) s polymerasovou řetězovou reakci (PCR). Kombinace těchto technik umožňuje specifickou amplifikaci požadované sekvence z póly (A) '‘RNA vzorku odvozeného od CHll prodikujících hybridomů připravených v (1 - 1).

Dva sety primerů pro RT-PCR reakci byly vybrány z Ig-Primer Set (Novagen). MuIgV_K5'-B a MuIgMV_H3'-1 byly použity pro amplifikaci regionu H řetězce, zatímco MulgkV^s' a Mu-lgMV^/'-l byly použity pro amplifikaci regionu L řetězce. RT-PCR reakce byly provedeny za použití jak setu primerů pro H řetězec, tak setu primerů pro L řetězec.

a) Reakce s reversní transkriptasou

Reakční roztok reversní transkriptási (44 μΐ) byla provedena následovně. 10 mM tris-kyseliny chlorovodíkové (pH 8.3), 50 mM chloridu draselného, 0.1 mM dATP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dTTP, 1.5 mM chloridu hořečnatého, 2.5 pmol primeru 3'-konce H řetězce nebo L řetězce, 50 ng póly(A)*RNA připravené v (1.1) a 20 jednotek reversní transkriptasy (BIOCHEMICAL KOGYO CO., LTD) odvozené od Moloney viru myší leukemie (MMLV) bylo smícháno a výsledná směs byla inkubována při 42 °C po jednu hodinu.

b) Amplifikace pomocí PCR

Reakční roztok reversní transkriptási připravený v a) byl smíchán s 25 pmol primeru 5'-konce H řetězce nebo L řetězce, podle potřeby, s 5 jednotkami Taq DNA polymerasy (ampliTaq DNA polymerasa získaná od Perkin Elmer, Japan) do konečného objemu 100 μΐ reakčního pufru dodaného s křtem (pufr a roztok pro enzymy je dodán s kitem, není-li jinak uvedeno). Kompletní výsledná reakční směs byla zahřáta na 94 °C po 2 minuty, a pak podrobena tepelnému cyklu 94 °C po jednu minutu, 50 °C po jednu minutu a 72 °C po 2 minuty. Tento cyklus se opakoval 30 krát. Roztok pak byl udržován při 72 °C po dalších 10 minut. Amplifikační genový PCR systém 9600 (Perkin Elmer, Japan) byl použit ke kontrole reakční teploty ve všech PCR reakcích.

c) Zkouška PCR produktu

Část PCR reakční směsy připravené v b) byla analyzována gelovou elektroforesou na 1.5% (hmotnost/objem) agarosovém gelu (FMC Bioproducts)- Produkt PCR reakcí každého H a L řetězce byl získán jako proužek okolo 430 bp. Velikost proužku byla hodnocena srovnáním s markéry molekulární hmotnosti, které byly také podrobeny elektroforese na stejném gelu.

d) Klonování PCR produktu

Každý PCR produkt získaný v b) byl ligován do jednotlivých plasmidových vektorů za užití originálního TA klonujícího kitu (Invitrogen). Přesněji, 50 ng pCRII vektoru a čtyři jednotky T4 DNA ligasy (oboje obsaženo v kitu) byly přidány do pufru ligásové reakce (6 mM tris-chlorovodíková kyselina (pH 7.5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β- merkaptoethanol, 0.1 mM ATP, 2 mM dithiothreitol (DDT), 0.1 mM spermidin a 0.1 mg/kg hovězí sérový albumin). Pufr ligásové reakce také obsahoval část PCR reakční směSy, která byla vybrána tak, aby obsahovala přibližně 10 ng požadovaného PCR produktu, jak bylo určeno gelovou elektroforesou v c) výše. Výsledná směs byla inkubována při 14 °C po 15 hodin.

Potom byly 2 μΐ ligásové reakční směsy smíseny s 50 μΐ E.coli kmenu TOP10F (obsaženém v kitu), který byl před tím udělán kompetentním přidáním 2 μΐ 0.5 Μ β- merkaptoethanolu. Výsledná transformační směs byla umístěna na ledu po 30 minut, zahřáta při 42 °C po 30 sekund a znovu umístěna na ledu po dobu dalších dvou minut. Po této době bylo do směsi přidáno 500 μΐ SOC media (2% (hmotnost/ objem) tryptOn, 0.5% (hmotnost/ objem) extrakt kvasinek, 0.05% (hmotnost/ objem) chlorid sodný, 2.5 mM chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý, 20 mM glukosa) a výsledná směs byla kultivována při rotačním míchání po 1 hodinu (37 °C, 110 rpm). Výsledná kultura byla pak umístěna na pláty L-bujonového agarového media (1% (hmotnost/ objem) trypton, 0.5% (hmotnost/ objem) extrakt kvasinek, 0.5% (hmotnost/ objem) chlorid sodný, 0.1% (hmotnost/ objem) glukosa, 0.6% (hmotnost/ objem) Bacto Agar (Difco)) obsahující 100 /xg/ml ampicilinu a pláty byly kultivovány při 37 °C přes noc bez míchání.

Ampicilin resistentní kolonie generované tímto postupem byly selektovány a seškrabány platinovými hroty. Buňky z vybraných kolonií byly separátně kultivovány v 5 ml L-bujonového media obsahujícího 100 /xg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc. Kultury byly pak centrifugovány při pro peletování buněk a byla připravena plasmidová DNA z buněk za použití metody alkalické lýsy (Maniatis, T. et al., výše).Byl získán plasmid pro H a L sety primerů, a tyto byly označeny pVH4 (plasmid obsahující fragment amplifikovaný užitím setu primerů H řetězce) a pVL8 (plasmid obsahující fragment amplifikovaný užitím setu primerů L řetězce).

Příklad 2

Určení aminokyselinové sekvence a nukleotidové sekvence variabilních regionů CH11 (2 - 1) Určení N terminální aminokyselinové sekvence variabilních regionů H řetězce a L řetězce CH11

a) Příprava CH11

CH11 produkující hybridom (viz příklad 1) byl kultivován do počtu buněk 2 x 10® v ASF 104 mediu (Ajinomoto) obsahujícím 10% (objem/objem) hovězí sérum (Gibco), a tyto připravené buňky pak byly kultivovány v 50 ml sérum prostého ASF 104 meia při 37 °C po 5 dní. Po této době byla kultura centrifugována (Tommy Seiko č.4 rotor, 15000 x g, 4 °C po 15 minut) a supernatant byl odebrán. GH11 byl získán ze supernatantu kultury za použití E-Z-Sep protilátkového purifikačního kitu (Pharmacia Biotech).

b) Část purifikovaného CHll, korespondující 100 μΐ supernatantu připraveném v a), byla přidána k 10 μΐ 100 mM tris kyselina chlorovodíková pufru (pH 6.8) obsahujícího 10% (objem/objem) β-merkaptoethanol a 4% (hmotnost/objem) SDS. Výsledná směs byla denaturována zahřátím na 95 °C po 5 minut. Denaturovaný vzorek pak byl podroben elektroforese na 12% (hmotnost/objem) polyakrylamidovém gelu. Po elektroforese byl gel ponořen do transferového pufru (25 mM tris kyseliny borité (pH 9.5), 10% methanol (objem/objem) a míchán při pokojové teplotě po 15 minut. Proteinové proužky na gelu byly potom transferovány do polivinyliden difluoridové (PVDF) membrány (Nippon Millipore Ltd.) za použití přístroje pro semidrive blotting (Iwaki Glass Co., Ltd) při konstantním proudu 0.2 A při 4 °C po 1 hodinu. Po této době byla PVDF membrána barvena 0.% (hmotnost/objem) Coomassie Brilliant Blue roztokem a odbarvena 100% methanolem. Byla pozorovány pouze dvě hlavní proteinová znamení, která korespondovala H řetězci a L řetězci. Proteinová znamení byla excidována a gel, který je obsahoval, byl sušen při pokojové teplotě.

c) Aminokyselinová sekvence proteinů transferovaných do PVDF membrány v b) byla analyzována za použití sekvenceru proteinů plynné fáze (PPSQ-10, Shimadzu Corporation) za použití automatické Edmanovi metody (viz Edman, P. et al., (1967), Eur. J. Biochem. 1,80 a dále). N-terminální aminokyselinová sekvence variabilního regionu H řetězce CHll a N-terminální aminokyselinová sekvence L řetězce tak byly určeny a jsou ukázány v SEQ ID NO. 13 a 14 seznamu sekvencí, v příslušném pořadí.

(2-2) Určení DNA nukleotidové sekvence

Celková nukleotidové sekvence cDNA kódující variabilní regiony H a L řetězce CHll byla určena sekvencováním insertů v plasmidech pVH4 a pVL8 v příslušném pořadí (připravených v Příkladu 1).

pCRII vektor má SP6 promotorovou sekvenci a T7 promotorovou sekvenci a tyto obklopují insertovanou cDNA a tak umožňují určení sekvence insertů pVH4 a pVL8 pomocí oligonukleotidových primeru (Perkin Elmer, Japan) korespondujících k sekvencím. Vzorky pro sekvenční analýzu byly připraveny za pomoci těchto primerů a barvený primer cyklických-sekvenčních kitů (Perkin Elmer, Japan).

Plasmidová DNA z plasmidů pVH4 a pVL8 byla použita jako templát. Sekvence každého cDNA insertu byla určena za použití DNA sekvenceru (Model 373,Perkin Elmer, Japan). cDNA nukleotidová sekvence variabilního regionu H řetězce je ukázána jako SEQ ID NO. 15 a cDNA nukleotidová sekvence variabilního regionu L řetězce je ukázána jako SEQ ID NO.

16.

N-terminální aminokyselinová sekvence H řetězce CHll, representovaná aminokyselinami č. l až 15 SEQ ID NO. 13 v seznamu sekvencí koresponduje kompletně s aminokyselinovou sekvencí kodovanou nukleotidy č. 32 až 76 SEQ ID NO. 15. Proto bylo odvozeno, že plasmid pVH4 obsahuje DNA kódující variabilní region H řetězce CHll.

N-terminální aminokyselinová sekvence L řetězce CHll, representovaná aminokyselinami č. l až 21 SEQ ID NO. 14 v seznamu sekvencí koresponduje kompletně s aminokyselinovou sekvencí kodovanou nukleotidy č. 29 až 91 SEQ ID NO. 16. Proto bylo odvozeno, že plasmid pVL8 obsahuje DNA kódující variabilní region L řetězce CHll.

Příklad 3

Klonování DNA kódující kompletní H řetězec, L řetězec a J řetězec CHll (3-1) Příprava cDNA knihovny cDNA knihovna byla připravena metodou podle Okayama-Berga (Okayama, H. et al., (1987), Methods in Enzymology 154, 3 28). Přesněji, 5 gg póly (A) “RNA jak bylo připraveno v příkladu 1-1 (a) z CHll produkujících hybridomů bylo přidáno ke 30 gl reakční směsi (50 mM tris kyseliny chlorovodíkové (pH 8.3), 6 mM chloridu hořečnatého, 40 mM cloridu draselného, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 2 gg vektorového primeru (3-oligo(dT)-vázaný.pcDV-l)(Pharmacia) obsahující 75 jednotek reversní transkriptásy (Seikagaku Kogyo, Co. Ltd.) odvozené od viru ptačí meyloblastosy (AMV) . Výsledná směs byla inkubována při 37 °C po 30 minut.

Po této době byl do reakční směsy přidán ekvivalentní objem fenol - chloroformu (1 :1, (objem/objem)) a směs byla důkladně promíchána. Výsledná směs byla centrifugována (10000 x g, pokojová teplota, 5 minut) a byla odebrána vodná vrstva (tento postup extrakce fenol - chloroformem a odebrání vodného supernatantů je zde dále označována jako fenol - chloroformová extrakce). Do vzniklé vodné vrstvy bylo přidáno 35 gl 4 M octanu amonného a 140 gl ethanolu, a výsledná směs byla ochlazena na -70 °C po 15 minut, a pak centrifugována (1000 x g, 4 °C, 15 minut). Pelety byly promyty 75% (objem/objem) roztokem ethanolu a pak sušeny za redukovaného tlaku.

Sušený precipitát byla pak rozpuštěn ve 13 gl destilované vody a bylo přidáno 5.6 gl reakční směsy terminální transferasy (140 mM kakodylát sodný, 30 mM tris - kyseliny chlorovodíkové, (pH 6.8), 1 mM chlorid kobaltu, 0.5 mM Dtt, 0.3 gg polyadenylové kyseliny (polyA, Pharmacia), 0.2 mM dCTP) a výslená reakční směs byla inkubována při 37 °C po 5 minut. Potom byla přidána terminální deoxynukleotidyl transferasa (21 jednotek, Pharmacia) v souladu s instrukcemi dodavatele, a reakci bylo umožněno probíhat 5 minut. Reakční směs pak byla podrobena fenol - chloroformové extrakci.

I

Potom bylo do odebrané vodné vrstvy přidáno 20 μΐ octanu amoného a 80 μΐ ethanolu a směs byla ochlazena na -70 °C po minut, pak centrifugována (10000 x g při 4 °C po 15 minut). Pelety byly promyty 75% (objem/objem) roztokem ethanolu a sušeny za redukovaného tlaku.

DNA precipitát získaný tímto způsobem byl rozpuštěn ve 30 μΐ reakční směsi (10 mM tris - kyseliny chlorovodíkové (pH 7.5), 60 mM chloridu sodného, 7 mM chloridu hořečnatého) a k výslednému roztoku bylo přidáno 30 jednotek restrikčního enzymu HindlII. Obecně, tam, kde je použit restrikční enzym, ale není specifikován pufr, pak je použitým pufrem pufr dodaný s enzymem. V případě, že je DNA trávena dvěma enzymy, je trávení provedeno dvěma enzymy sekvenčně. Po prvním trávení je DNA precipitována, resuspendována a trávena druhým enzymem. Precipitační techniky a techniky resuspendace j sou v oboru dobře známé (Maniatis et al., výše). Všechny restrikční enzymy a pufry v předložených příkladech byly dodány Takara Schuzo.

DNA byla trávena při 37 °C přes noc ve trávicím roztoku. Následně byla reakční směs podrobena fenol - chloroformové extrakci. Potom bylo do odebrané vodné vrstvy přidáno 35 μΐ 4 M octanu amoného a 140 μΐ ethanolu a směs byla ochlazena na -70 °C po 15 minut. Pak byla směs centrifugována (10000 x g při 4 °C po 15 minut) pro precipitaci DNA a vzniklé pelety byly promyty 75% (objem/objem) roztokem ethanolu a sušeny za redukovaného tlaku. Takto připravená precipitovaná DNA byla použita jako cDNA vzorek v následujících procedurách.

Paralelně byla trávena plasmidová DNA Vektoru pCDL-SRa296 (Takebe, Y. et al., (1989), JIKKEN IGAKU (Experimental medicine) 7, str. 95 - 99) restrikčním enzymem Pstl.

Produkt trávení byl ošetřen dGTP terminální deúxynukleotidyl transferasou (Pharmacia), aby byl přidán oligo dG na 3' terminální konec, jak je popsáno dále:

pcDL-SRa296 DNA (100 μ$, v 50 μΐ) byla přidána do 10 μ1 lOx pufru terminální deoxynukleotidyl transferasy (lx pufr: 1.4 M kakodylát sodný, 0.3 M Tris-HCl, (pH 7.6), 10 pl DTT (lmM), 20 μΐ 0.1 mM ³H-dGTP (Dupont) a 10 μΐ terminální transferasa (210 IU, Pharmacia)). Směs byla inkubována po 40 minut při 37 °C a pak smísena se stejným objemem fenolu saturovaného ŤE pufrem. Po ustátí byla odebrána vodná vrstva a byla podrobena fenol - chloroformové extrakci. Poté, co proběhla jak fenolová, tak fenol - chloroformová extrakce byla DNA precipitována za použití ethanolu a resuspendována v 50 μΐ TE pufru.

Celková precipitovaná DNA byla trávena restrikčním enzymem HindiII a produkty trávení byly separovány gelovou elektroforesou na 1.8% (hmotnost/objem) agarosovém gelu. Z gelu byl excidován proužek 800 bp, a byl extrahován z gelu za použití GENECLEAN kitu (Funakoshi) podle instrukcí výrobce. Výsledná DNA byla rozpuštěna v 100 μΐ TE pufru a bylo přidáno 100 μΐ ethanolu. Konečná koncentrace DNA byla 0.09 gg/gl.

Výsledný produkt poskytl linker-DNA, ve které byl oligo (dG) připojen na SRa promotor (Obr.l).

Precipitovaný, sušený cDNA vzorek, připravený výše, byl rozpuštěn ve 10 μΐ TE pufru (10 mM tris - kyseliny chlorovodíkové (pH 7.5), l mM EDTA). Část vzniklého roztoku (1 μΐ) byla přidána do reakčního pufru (10 mM tris kyseliny chlorovodíkové (pH 7.5), 1 mM EDTA, 100 mMchloridu sodného) obsahujícího 0.08 pmol linker-DNA připravené výše. Výsledná směs byla zahřáta na 65 °C po 5 minut a pak inkubována při 42 °C po 30 minut. Potom bylo přiána do reakční směsy 10 μΐ lOx ligasového pufru (10 mM ATP, 660 mM tris - kyseliny chlorovodíkové (pH 7.5), 66 mM chloridu hořečnatého, 100 mM DTT), 76 μΐ destilované vody a l μΐ 10 m M β-nikotinamid adenin dinukleotidu (NAD, Boehringer

Mannheim) a výsledná směs byla ochlazena na ledu po 10 minut. E.coli DNA ligasa (8.4 pg ekvivalent, Pharmacia) pak byla přidána do ochlazené reakční směsi, a tato byla potom inkubována při 12 °C přes noc.

Po této inkubaci bylo do reakční sraěsy přidáno 2 μΐ roztoku nukleotidů (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP), 0.5 pl 10 mM NAD, 42 pg ekvivalentu E.coli DNA ligasy (Pharmacia), 4.1 jednotek DNA polymerasy I (Pharmacia), a 5.5 jednotek ribonukleasy H (Pharmacia). Výsledná směs pak byla inkubována při 12 °C po jednu hodinu a pak při 22 °C po další hodinu. cDNA knihovna připravená tímto způsobem byla uskladněna při -20 °C až do okamžiku potřeby.

(3 - 2) Klonování prostřednictvím PCR

a) Příprava primeru

V případě H řetězce byla aminokyselinová sekvence variabilního regionu H řetězce CHll, jak je určena v Příkladu 2, srovnána s databásí aminokyselinových sekvencí protilátek připravenou Kabatem et al., (viz Kabat, E.A., et al., (1991) v Sequences of Proteins of Immunological Interes Vol,II, U.S. Department of Haelth and Human Serices). Bylo stanoveno, že H řetězec (μ řetězec) CH11 byl podtřídou třídy 2A. Proto byl oligonukleotidový primer syntetizován tak, aby mohl hybridizovat s částí 5- non. translatováného regionu DNA kódující myší H řetězec, podtřídu 2a. Vybraný oligonukleotidový primer měl sekvenci: 5'- CTAAGGGAATTCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA-3 (H5-1; SEQ ID N017 seznamu sekvencí).

Oligonukleotidový primer byl také projektován tak, aby mohl hybridizovat s částí 3 non-translatovaného regionu CHll H řetězce. Projektování oligonukleotidů bylo založeno na nukleotidové sekvenci DNA kódující M řetězec konstantního regionu myšího imunoglobulinu popsané Goldbergem et al.

(viz. Goldberg, I.G. et al., (1981), Gene 15, 33 - 42) a vybraná sekvence byla: 5'- TTTTACTCTA GAGACCCAAG

GCCTGCCTGGTTGA-3' (H3-1; SEQ ID NO. 18 seznamu sekvencí).

Pro L řetězec byla aminokyselinová sekvence variabilního regionu L řetězce CH11, jak je určena v Příkladu 2, srovnána s databásí aminokyselinových sekvencí protilátek připravenou Rabatem a spolupracovníky, výše. Bylo stanoveno, že L řetězec CH11 byl pódtřídou k2. Proto byl olígonukleotidový primer projektován tak, aby mohl hybridizovat s částí 5'terminálního, non-translatovaného regionu DNA kódující myší L řetězec, podtřídu k2. Vybraný olígonukleotidový primer měl sekvenci: 5'- AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3 (L5-1; SEQ ID NO.19 seznamu sekvencí).

Olígonukleotidový primer byl také projektován tak, aby mohl hybridizovat s částí 3 non-translatovaného regionu. Projektování oligonukleotidu bylo založeno na nukleotidové sekvenci DNA kódující k řetězec konstantního regionu registrovaného pod registračním jménem MUSIGB1L1 (přírůstek č. D14630) . Sekvence byla: 5'- ATGATCTCTA

GAGTGGTGGCATCTCAGGAC CT-3' (L3-1; SEQ ID NO. 20 seznamu sekvencí).

V případě J řetězce není žádný variabilní region a jak sekvence DNA kódující J řetězec, tak aminokyselinová sekvence J řetězce jsou známy (Cann, G.M. et al., (1982), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 6656 - 6660). S ohledem na tuto znalost byly oligonukleotidové primery syntetizovány tak, aby mohly hybridizovat část 5' a 3“ non-translatováných regionů DNA kódující pro J řetězec. Tyto oligonukleotidy měly sekvence:

5-TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3' (J5-1; SEQ ID NO.21 seznamu sekvencí) a 5-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACCACGAC CT-3' (J3-1; SEQ ID NO.22 seznamu sekvencí).

Tyto oligonukleotidové primery byly syntetizovány za použití automatického DNA syntetizeru 380 B (Perkin Elmer, Japan) fosfoamiditovou metodou (viz Mattrucci, M.D. a Caruthers, M.H.

(1981), J.Am. Chem. Soc.,

103, 3185

3191). Po dokončení syntesy byl každý primer odštěpen a pak sušen za zmrazeného z nosiče a zbaven chránících skupin, stavu. Výsledný produkt by rozpuštěn v destilované vodě a uskladněn při -20 °C až do okamžiku potřeby.

b) Amplifikace cílového genu PCR

PCR reakční roztok ( 10 mM tris - kyseliny chlorovodíkové (pH 8,3), 50 mM chloridu draselného, 1.5 mM chloridu hořečnatého, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dCTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dTTP) byl připraven a bylo přidáno 0.1 μΐ cDNA knihovny popsané v příkladu 4-1, 1 jednotka Taq DNA polymerasy (Perkin Elmer, Japan) a 15 pmol oligonukleotidového priměru (připraveného v 3 - 2) ke 100 μΐ PCR reakčního roztoku a ten byl zahříván při 94 °C po 2 minuty. Výsledná směs pak byla podrobena tepelným cyklům 94 °C po l minutu, 55 °C po jednu minutu a 72 °C po 2 minuty. Tento cyklus se opakoval 30 krát. Po posledním cyklu byl roztok ponechán při 72 °C po dalších 10 minut.

Kombinace primerů, jsou následující:

H5-1 a H3-1 (pro H L5-1 a L3-1 (pro I» J5-1 a J3-1 (pro J které byly použity v příslušných reakcích řetězec) řetězec), a řetězec).

c) Zkouška PCR produktů

Po provedení PCR reakce v b) byla část reakční směsy analyzována gelovou elektroforesou na 0.8% (hmotnost/objem) agarosovém gelu v případě H řetězce. Pro L a J řetězce byl použit 1.5% (hmotnost/objem) agarosový gel (agarosa byla získána od EMC Bioproducts). Produktem PCR reakce byl proužek přibližně 1900 bp pro H řetězec, 800 bp pro L řetězec a 650 bp pro J řetězec. Velikost proužků byla stanovena srovnáním s molekulární hmotností markérů, které proběhly stejným gelem.

d) Klonování PCR produktů

Každý PCR produkt získaný v b) byl ligován do plasmidového vektoru za užití originálního TA klonujícího kitu (Invitrogen). Přesněji, 60 ng pCRII vektoru (obsaženého v kitu) a čtyři jednotky T4 DNA ligasy byly přidány do ligásového reakčního pufru (6 mM tris-chlorovodiková kyselina (pH 7.5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β- merkaptoethanol, 0.1 mM ATP, 2 mM DDT, 1 mM spermidin a 0.1 mg/kg hovězí sérový albumin) obsahujícího část PCR reakční směsi. Objem PCR reakční směsi byl vybrán tak, aby obsahoval přibližně 10 ng požadovaného PCR produktu, jak bylo určeno gelovou elektroforesou. Výsledná směs byla inkubována při 14 °C po 15 hodin.

Potom byla část ligasové reakční směsi (2 μΐ) Smíšena s 50 μΐ E.coli buněk kmenu TOP10F (obsaženém v kitu), který byl před tim udělán kompetentním přidáním 2 μΐ 0.5 Μ S- merkaptoethanolu. Výsledná transformační směs byla umístěna na ledu po 30 minut, zahřáta při 42 °C po 30 sekund a znovu umístěna na ledu po dobu dalších dvou minut. SOC medium (500 μΐ, jak je popsáno výše) bylo přidáno do této směsi a výsledná směs byla kultivována při rotačním míchání po 1 hodinu (37 °C, 110 rpm). Kultivační tekutina byla pak umístěna na pláty L-buj©nového agarového media obsahující 100 ptg/ml ampicilinu a pláty byly kultivovány při 37 °C přes noc. Ampicilin resistentní kolonie které se objevily byly seškrabány platinovými hroty a kultivovány v 5 ml L-bujonového media obsahujícího 100 gg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc. Kultury byly pak centrifugovány při pro precipitací buněk, které byly použity k přípravě plasmidové DNA za použití metody alkalické lýsy.

Tři ze vzniklých plasmidů byly označeny pCR3-H123 (plasmid obsahující cDNA kódující H řetězec), pCR3-L103 (plasmid obsahující cDNA kódující L řetězec) a pCR3-J1123 (plasmid obsahující cDNA kódující J řetězec). Kompetentní buňky E.coli kmene DH5a (Gibco) byly transformovány jedním z plasmidů pCR3-H123, pCR3-L103 nebp pCR3-J1123 a výsledné transformanty byly deponovány v Research Institute of Life Science and Technology of Agency Industrial Science and Tehchnology 28.února 1996 pod depositní mi čísly FERM BP-5427, FERM BP-5428, FERM

BP-5.429 v příslušném pořadí. DNA kódující H,L a J řetězce CHll je možné z těchto kmenů snadno připravit za použití známých metod.

Příklad 4

Určení celkové nukleotidové sekvence cDNA kódující CH11 H řetězec, L řetězec a J řetězec (4 - 1) Určení nukleotidové sekvence DNA

M řetězec myšího imunoglobulinu se skládá z N-terminálního variabilního regionu obsahujícího asi 110 residuí a konstantního regionu obsahujícího asi 470 residuí připojeného na variabilní region, k řetězec myšího imunoglobulinu se skládá z N-terrainálního variabilního regionu obsahujícího asi 110 residuí a konstantního regionu obsahujícího asi 107 residuí připojeného na variabilní region. Bylo předpokládáno, že kompletní nukleotidová sekvence cDNA kódující CHli H řetězec a L řetězec by se měla skládat z nukleotidových sekvencí kódujících známé konstantní regiony řetězců, jak je uvedeno v příkladu 2 (Kabat , E.A. et al., (1991), v Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol.II U.S. Department of Health and Human Services).

nukleotidová sekvence kódující J řetězec CHll bylo předpokládáno, že je stejná jako známé sekvence j řetězce.

Na podkladě těchto předpokládaných nukleotidových sekvencí byly syntetizovány oligonukleotidové primery délky 20 nukleotidů korespondující sekvencím H,L a J řetězců, separované kódujícími intervaly 60 až 200 bp. Tyto primery byly použity pro sekvenční analýzu.

Sekvence syntetizovaných oligonukleotidových primerů byly následující:

Pro H řetězec:

37a

5’-TGGGGCCTCA GTGAAGATAT -3* (SHF-2; SEQ ID NO. 23) 5’-CAATGGTGGT ACTGGCTACA -3' (SHF-3; SEQ ID NO. 24) 5’-TGACATCTGA GGACTCTGCA -3' (SHF-4; SEQ ID NO. 25) 5’-TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT -3' (SHF-6; SEQ ID NO. 26) 5’-TCGTTCACCT GGAACTACCA -3' (SHF-7; SEQ ID NO. 27) 5’-TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG -3’ (SHF-8; SEQ ID NO. 28) 5’-AGATCTGCAT GTGCCCATTC -3' (SHF-9; SEQ ID NO. 29) 5’-TCTAAACTCA TCTGCGAGGC -3* (SHF-1O; SEQ ID NO. 30) 5’-GGTGACCATC GAGAACAAAG -3’ (SHF-11; SEQ ID NO. 31) 5’-AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA -3’ (SHF-12; SEQ ID NO. 32) 5’-TCCTTTGCCG ACATCTTCCT -3’ (SHF-13; SEQ ID NO. 33) 5’-GTGTGTACTG TGACTCACAG-3' (SHF-15; SEQ ID NO. 34> 5’-AACTGAACCT GAGGGAGTCA -3’ (SHF-16; SEQ ID NO. 35) 5’-AACTCTTGCC CCAAGAGAAG -3’ (SHF-17; SEQ ID NO. 36). 5 -ATCCTGACTG TGACAGAGGA -3' (SHF-18; SEQ ID NO. 37)

-ACAAGTCCAC TGGTAAACCC -3' (SHF-19; SEQ ID NO. 38) 5’-AGGATATCTT CACTGAGGCC -3' (SHR-1; SEQ ID NO. 39) 5’-ATCCACTCAA GGCTCTTTCC -3’ (SHR-2; SEQ ID NO. 40} 5’-ACTGCAGAGT CGTCAGATGT -3' (SHR-3; SEQ ID NO. 4l) 5’-AGACGGTGAC TGAGGTTCTT -3’ (SHR-4; SEQ ID NO. 42) 5’-CAGGTGAAGG AAATGGTGCT -3’ (SHR-5; SEQ ID NO. 43> 5’-ATGCTCTTGG GAGACAGCAA -3’ (SHR-6; SEQ ID NO. 44) 5’-CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG -3' (SHR-7; SEQ ID NO. 45) 5’-TGGCCTCGCA GATGAGTTTA-3' (SHR-8; SEQ ID NO. 46) 5’-CCTTTGTTCT CGATGGTCAC -3’ (SHR-9; SEQ ID NO. 47) 5-TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA -3' (SHR-10; SEQ ID NO. 48) 5-ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA -3' (SHR-I2; SEQ ID NO. 49) 5’-AGATCCGTGT GAGTCACAGT -3* (SHR-13; SEQ ID NO. 5θ) 5’-AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA -3’ (SHR-14; SEQ ID NO. 51) 5-TGAAGCCACT GCACACTGAT -3' (SHR-15; SEQ ID NO. 52) 5’-AGTTCCATTC CTCCTCTGTC -3' (SHR-16; SEQ ID NO. 53) 5-TGTGTCAGAC ATGATCAGGG -3' (SHR-18; SEQ ID NO. 54)

37b pro L řetězec

5’-TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG -3' (SLF-1; SEQ ID NO, 55) 5’-CTTGGAGATC AAGCCTCCAT -3’ (SLF-2; SEQ ID NO. 56) 5’-GCTGAGGATC TGGGAGTTTA -3' (SLF-3; SEQ ID NO. 57) 5’-GATGCTGCAC CAACTGTATC -3’ (SLF-4; SEQ ID NO. 58) 5’-CGACAAAATG GCGTCCTGAA -3* (SLF-5; SEQ ID NO. 59) 5’-ACGTTGACCA AGGACGAGTA -3' (SLF-6; SEQ ID NO. 60) 5’-ATCTGCAAGA GATGGAGGCT -3' (SLR-2; SEQ ID NO. 61) 5’-ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA -3' (SLR-3; SEQ ID NO. 62)

5’-CCGGAGGAAC ATGTGTACTT -3' (SLR-4; SEQ ID NO. 63) 5’-TCGTTCATAC TCGTCCTTGG -3' (SLR-6; SEQ ID NO. 64/ 5’-CATCTCAGGA CCTTTGTCTG -3’ (SLR-7; SEQ IDNO. 65) * pro J řetězec

5’-CACCTGTCCT GGGGTTATTT -3* (SJF-1; SEQ ID NO. 66) 5’-AGACAAGATG AAGACCCACC -3' (SJF-2; SEQ ID NO. 67> 5’-AAGCGACCAT TCTTGCTGAC -3' (SJF-3; SEQ ID NO. 68) 5’-ATATCTCTGA TCCCACCTCC -3’ (SJF-8; SEQ ID NO. 69) . 5’-GAAATGCGAT CCTGTGGAAG -3' (SJF-5; SEQ ID NO. 70) 5’-CTATACCACT ATGGTGCCAC -3’ (SJF-6; SEQ ID NO. 71) 5’-AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT -3’ (SJR-2; SEQ ID NO. 72} 5’-TAGAGGTAAC TCGGGTACAC -3' (SJR-3; SEQ ID NO. 73) 5’-AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA -3' (SJR-8; SEQ ID NO. 74) 5’-GGTGGCAGTA ACAACCTGAT -3’ (SJR-5; SEQ ID NO. 75) 5’-CATGATACCT AAGTGGGACC -3' (SJR-6; SEQ ID NO. 76) ’ uváděná čísla sekvencí se vztahují k seznamu sekvenci

Každý oligonukleotidový primer byl syntetizován fosfoamiditovou metodou za použití automatického DNA syntezátoru (Model 38OB: Perkin Elmer, Japan). Vzorky pro sekvenční analýzu H řetězce byly připraveny za použití DNA z plasmidu pCR3-Hl23. Vzorky pro sekvenční analýzu L řetězce byly připraveny za použití DNA z plasmidu pCR3-L103. Vzorky pro sekvenční analýzu J řetězce byly připraveny za použití DNA z plasmidu pCR3-J1123. PCR reakce byla provedena za použití Prism Ready Reaction Terminátor Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer, Japan) následovně:

pCR3-Hl23 (1.5 μ$) a 4.8 pmol primeru (SHF-2) bylo smícháno do konečného objemu 16 μΐ v destilované vodě. Část této pCR3-Hl23/primer směsi (9.5 μΐ) byla smíchána s 10.5 μΐ připravené směsi obsahující Taq DNA polymerasu. Všechny tyto postupy byly podle instrukcí v kitu. Výsledná směs byla umístěna v automatickém reaktoru (Catalyst: Perkin Elmer, Japan). Použitý reakční cyklus byl následující: 95 °C po 30 minut, 50 °C po 15 sekund a 60 °C po 4 minuty, opakováno 25 krát.

Po dokončení reakčního cyklu bylo 80 μΐ sterilizované vody přidáno do výsledného roztoku a DNA ve výsledné směsi byla extrahována dvakrát fenol-chloroformovou metodou. Odebraná vodná vrstva byla smísena s 15 μΐ 2Moctanu sodného a 300 μΐ ethanolu, potom následovala centrifugace pro získání precipitátu.

Precipitát byl promyt v 70% (objem/objem) roztoku ethanolu a sušen za redukovaného tlaku, a pak rozpuštěn v 3 μΐ vzorkového roztoku (4 μΐ 0.25 M EDTA, 100 μΐ formamidu a 15 μΐ sterilizované vody).

Sekvenční reakce byly provedeny a analyzovány na DNA sekvenceru (Model 373A: Perkin Elmer, Japan) pro 32 primerů H řetězce, 11 primerů L řetězce a 11 primerů J řetězce.

Data sekvencí získaná pro každý primer byla kombinována a integrována tak, aby se určila kompletní nukleotidová sekvence

H,L a J řetězců CH11. cDNA nukleotidové sekvence každého plasmidového insertu jsou ukázány v SEQ ID NO. 7,9 a 11 seznamu sekvencí. Aminokyselinové sekvence korespondující těmto nukleotidovým sekvencím jsou ukázány SEQ ID ΝΌ. 8,10 a 12 seznamu sekvencí v příslušném pořadí.

(4 - 2)Primární struktura H řetězce CHll

Nukleotidová sekvence varibilního regionu H řetězce, ukázaná jako nukleotidy č. 32 až 379 SEQ ID NO. 15 seznamu sekvencí, byla shledána identickou s nukleotidovou sekvencí nukleotidů č. 58 až 405 SEQ ID NO. 7.

Aminokyselinová sekvence ukázaná jako aminokyseliny č. 117 až 571 SEQ ID NO. 8 byla shledána identickou s aminokyselinovou sekvencí konstantního regionu H řetězce odvozeného od myšího IgM při srovnání s databasí aminokyselinových sekvencí protilátek (Kabat E.A. et al., výše).

Aminokyselinová sekvence ukázaná aminokyselinami č. -19 až -1 SEQ ID NO. 8 byla považována za signální sekvenci H řetězce CHll.

Nukleotidová sekvence ukázaná jako nukleotidy č. 406 až 1770 SEQ ID NO. 7 byla shledána identickou se sekvencí konstantního regionu H řetězce myšího IgM.

Vzhledem k těmto výsledkům byla stanovena celková nukleotidová sekvence spolu s celkovou aminokyselinovou sekvencí.

(4-3) Primární struktura L řetězce CHll

Nukleotidová sekvence varibilního regionu L řetězce, ukázaná jako nukleotidy č. 29 až 364 SEQ ID NO. 16 seznamu sekvencí, byla shledána identickou s nukleotidovou sekvencí nukleotidů č. 58 až 393 SEQ ID NO. 9.

Aminokyselinová sekvence ukázaná jako aminokyseliny č. 113 až

219 SEQ ID NO. 10 byla shledána identickou s aminokyselinovou sekvencí konstantního regionu myšího kL řetězce při srovnání s Kabátovou databasí aminokyselinových sekvencí protilátek

Aminokyselinová sekvence ukázaná aminokyselinami č. -19 až -l SEQ ID NO. 10 byla považována za signální sekvenci pro L řetězec.

Nukleotidová sekvence ukázaná jako nukleotidy č. 394 až 714 SEQ ID NO. 9 byla shledána komplete identickou se sekvencí konstantního regionu myšího kL řetězce.

Vzhledem k těmto výsledkům byla stanovena celková nukleotidová sekvence spolu s celkovou aminokyselinovou sekvencí.

(4 - 4) Primární struktura J řetězce CH11

Aminokyselinová sekvence ukázaná jako aminokyseliny č. 1 až 137 SEQ ID NO. 12 byla byla srovnána s databasí aminokyselinové sekvence protilátek a byla shledána identickou s známým myším J řetězcem.

Nukleotidová sekvence ukázaná jako nukleotidy č. 67 až 477 SEQ ID NO. 11 byla shledána identickou se sekvencí známého myšího J řetězce.

Aminokyselinová sekvence ukázaná jako aminokyseliny č. -22 až -l SEQ ID NO. 12 byla považována za signální sekvenci pro J řetězec CH11.

Vzhledem k těmto výsledkům byla stanovena celková nukleotidová sekvence spolu s celkovou aminokyselinovou sekvencí.

(4 - 5) Určení komplementaritu určujících regionů (CDR)

Byla identifikována jak posice, tak aminokyselinová sekvence každého CDR ve variabilních regionech H řetězce a L řetězce CH11, určených jak je popsáno výše, srovnáním s Rabatovou databásí aminokyselinových sekvencí protilátek (výše). Tato database ukazuje, že délka aminokyselinového řetězce framework oblasti variailního regionu je v podstatě konstantní u různých protilátek, za předpokladu, že je podtyp stejný a za předpokladu, že aminokyselinové sekvence mají některé společné charakteristiky. Nicméně, CDR , přítomný mezi takovými dvěma framework regiony, má sekvenci specifickou pro každou protilátku

Při srovnání aminokyselinové sekvence variabilního regionu H řetězce CHll se sekvencí myšího /x2a podtypu bylo ukázáno, že CDR v H řetězci CH 11 je representován aminokyselinami č. 3.1 až 35 SEQ ID NO. 8 (CDRH_x, korespondující SEQ ID NO. 1 seznamu sekvencí), 50 až 66 SEQ ID NO. 8 (CDRH₂, korespondující SEQ ID NO. 2 seznamu sekvencí), a 99 až 105 SEQ ID NO. 8 (CDRH₃, korespondující SEQ ID NO. 3 seznamu sekvencí).

Když byla aminokyselinová sekvence variabilního regionu L řetězce CH 11 srovnána se sekvencí myšího k2 podtypu bylo ukázáno, že CDR v L řetězci CH ll je representován aminokyselinami č. 24 až 39 SEQ ID NO. 10 (CDRL_x, korespondující ŠEQ ID NO. 4 seznamu sekvencí), 55 až 61 SEQ ID NO.10 {CDRL^, korespondující SEQ ID NO. 5 seznamu sekvencí) a 94 až 102 SEQ ID NO.10 (CDRL₃, korespondující SEQ ID NO. 6 seznamu sekvencí).

Když byla aminokyselinová sekvence variabilního regionu L řetězce CH 11 srovnána se sekvencí myšího k2 podtypu bylo ukázáno, že CDR v L řetězci CH 11 je representován aminokyselinami č. 24 až 39 (CDRL_x, korespondující SEQ ID NO. 4 seznamu sekvencí), 55 až 61 (CDRL korespondující SEQ ID NO. 5 seznamu sekvencí) a 94 až 102 (CDRL₃, korespondující SEQ ID NO.

seznamu sekvencí) SEQ ID NO. 10 seznamu sekvencí.

Příklad 5

Exprese genů kódujících každou podjednotku CHll v COS-1 buňkách (5 - 1) Konstrukce expresního vektoru

DNA z vysoce expresního vektoru pME18S (viz Hara, T., et al., (1992) EMBO J., 11, 1875 a dále) byla trávena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Výsledné produkty trávení byly separovány agarosovou gelovou elektroforesou na 0.8% agarosovém gelu. Po elektroforese byl gel barven ethidium bromid (0.25 gg/ml) kvůli barvení DNA. Z gelu byl excidován proužek přibližně 3000 bp a byl transferován do diálysační tuby (mez propustnosti: 12000 až 14000 Da, Gibco) spolu s 250 μΐ TBE pufru agarosové gelové elektroforesy (TBE pufr: Tris 0.089M, boritan 0.089M, EDTA (pH 8.0) 0.002 M) a tuba byla uzavřena. Uzavřená tuba byla umístěna do ponorného typu nádrže pro elektroforesu obsahujícího pufru agarosové gelové elektroforesy a DNA byla elektroforeticky eluována z gelu (150 V, 15 minut). Potom byla dialyzační tuba vyjmuta a byl odebrán DNA eluát z tuby a podroben fenol-chloroformové extrakci

Současně byl plasmid pCR3-H123, který byl připraven v příkladu 3 d), a který obsahoval DNA kódující pro H řetězec CHll, tráven restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. 1900 bp EeoRI-Xbal fragment byl izolován a purifikován agarosovou gelovou elektroforesou na 0.8% gelu, jak je popsáno v 5 - 1 výše. Tento cDNA fragment byl ligován do 3 kb EcoRI-Xbal fragmentu pME18S, jak byl izolován výše, za použití DNA ligačního kitu verse 1 (TakaraShuzo Co.,

Ltd.).

Plasmid pCR3-L103, který byl připraven v příkladu 3, a který obsahoval DNA kódující pro L řetězec CHll, byl tráven restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. 840 bp EcoRI-Xbal fragment obsahující cDNA plasmidového insertu byl izolován a purifikován agarosovou gelovou elektroforesou na 0.8% gelu, jak je popsáno v 5 - 1 výše. Tento cDNA fragment byl ligován do 3 kb EcoRI-Xbal fragmentu pMEi8S, jak byl izolován výše, za použití DNA ligačního kitu verse 1 (TakaraShuzo Co., Ltd.).

Plasmid pCR3-J1123, který byl připraven v příkladu 3, a který obsahoval DNA kódující pro J řetězec CHll, byl tráven restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. 640 bp EcoRI-Xbal fragment obsahující cDNA plasmidového insertu byl izolován a purifikován agarosovou gelovou elektroforesou na 0.8% gelu, jak je popsáno v 5 - 1 výše. Tento cDNA fragment byl ligován do 3 kb EcoRI-Xbal fragmentu pME18S získaného výše, za použití DNA ligačního kitu verse 1 (TakaraShuzo Co., Ltd.).

Po dokončení ligačních reakcí byly JM109 E.coli kompetentní buňky (Takara Shuzo) transformovány za použití jednotlivých reakčních směsí a byly selektovány kolonie ampicilin-resistentních kmenů. Byla připravena plasmidová DNA z transformovaných kmenů za užití alkalické lýsy (Maniatis, výše). Výsledná plasmidová DNA byla trávena EcoRI a Xbal, po čemž následovala agarosová gelová elektroforesa na 0.8% gelu pro potvrzení toho, že byla klonována DNA požadovaně velikosti.

Expresní vektor obsahující DNA kódující H řetězec CHll byl označen pHEX126. Expresní vektor obsahující DNA kódující L řetězec CHll byl označen pLEX004. Expresní vektor obsahující DNA kóduj ící J řetězec CHll byl označen pJEX004.

(5 - 2) Exprese v COS-l buňkách

COS-1 buňky byly transformovány pHEX126, pLEX004 a pJEX004 elektrokorporací za použití GTE-1 přístroje (Shimadzu Corporation). Přesněji, COS-1 buňky (American Type Culture Collection č. CRL-1650) byly byly kultivovány ve 225 cm² kultivačních lahvích {Sumitorno Bakelite). Buňky byly kultivovány v semikonfluentním stavu v Dulbecco modifikovaném Eaglevu minimálním esenciálním mediu (DMEM, Nissui Pharmaceutical) obsahujícím 10% (objem/objem) fetálního hovězího séra (CSL). Medium bylo odstraněno a buňky byly ošetřeny dvakrát 3 ml trypsin-EDTA roztokem (Sigma) při 37 °C po 3 minuty. Buňky byly shromážděny, pak promyty dvakrát fosfátem pufrovaným salinickým (PBS, pH 8.0) pufrem (Nissui Pharmaceutical). Promyté COS-1 buňky byly upraveny na hustotu 6 χ 10’⁷ buněk/ml PBS (-) pufrem (8g NaCL, 0.2g KC1, 1.15g Na₌HP0₄, 0.2g KH^PO^ na litr, Nissui Seiyaku Co.).

Byla připravena DNA z jednotlivých pHEX126, pLEX004 a pJEX004 kódujících všechny tři podjednotky CHll, za použití maxiprep křtu (Maxiprep DNA purifikační systém; Promega). Část (20 pg) každého plasmidového maxiprepu byla precipitována za použití ethanolu a precipitát byl rozpuštěn ve 20 pl PBS (-) pufru. DNA připravená tímto způsobem byla použita pro transfekci COS-1 buněk.Jakákoliv transfekce, která byla provedena více než jedním plasmidem, užívala 20 pg každého plasmidu.

Suspense COS-1 buněk (20 μ1;1.2 x 10⁶ buněk) připravená tímto způsobem byla smísena s 20 pl každého vzorku, a výsledná směs byla umístěna do elektroporační kyvety (Shimadzu Corporation) mající interval elektrod 2 mm. Kyveta byla umístěna do elektroporačniho přístroje a byly aplikovány dva 600V -30 ps pulsy, s jednosekundovým intervalem mezi pulsy. Směs buněk a DNA byla přidána k 10 ml DMEM obsahujícím 10% (objem/objem) fetální hovězí sérum, pak transferována do buněčných kultivačních plastických ploten (průměr: 90 mM; Sumitomo Bakelite) a kultivována při 37 °C za 7.5% CO₂ po 24 hodin. Po této době byl odstraněn supernatant kultury a buňky byly promyty DMEM mediem bez séra. Bylo přidáno čerstvé sérum prosté DMEM medium (10 ml), a pokračovala kultivace při 37 °C za 7.5% C0₂ po 24 hodin. Potom byl odebrán supernatant kultury.

COS-1 buňky byly transfektovány za použití bud' jednoho plasmidu, nebo jejich kombinace, jak je uvedeno na seznamu níže.

V každém případě byl odebrán supernatant kultury.

(A) : pME18S pouze (B) : pHEX126 pouze (C) : pLEX004 pouze (D) : pJEX004 pouze (E) : pHEX126 a pLEX004 (F) : pHEX126, pLEX004 a pJEX004

Příklad 6

Detekce anti-Fas protilátky

Anti-Fas protilátka, která byla připravena podle předkládaného vynálezu, byla detekována separátně dvěma metodami.

(1) První metodou byl Western Blotting. Proteinový vzorek prošel SDS-polyakrylamidovým gelem za podmínek ukázaných níže, a proteiny vzorku byly separovány elektroforesou (celý proces je znám jako SDS polyakrylamidová gelová elektroforesa neboli SDS-PAGE*') . Proteiny byly transferovány do nitrocelulosové membrány a byly podrobeny reakci s protilátkou specifickou k anti-Fas protilátce. Zkřížená reakce protilátky s anti-Fas proteinem je detekovatelná, za přítomnosti vhodných substrátů, emisí světla na fotografický film.

(2) Druhá metoda měří vazebnou afinitu k Fas antigenu (6 - 1) Western Blotting

Testovaný vzorek supernatantů kultury (lml) byl dialyzován proti 5 litrům čisté vody, pak sušen za redukovaného tlaku za použití centrifugačního koncentrátoru (CC-101; Tomy Seiko). Vzniklý produkt byl přidán ke 10 gl vzorkového pufru (2% (hmotnost/objem) SDS (elektroforesová síla; Bio-Rad), 5% (objem/objem) β-merkaptoethanol (Sigma), 10% (objem/objem) glycerol, 0.1% (hmotnost/objem) bromfenolová modř) a pečlivě promíchán. Výsledná suspense byla zahřáta na 100 °C po 5 minut, aby se poskytl vzorek vhodný pro elektroforesu. Celý vzorek pro elektroforesu byl zaveden do jamky SDŠ-polyakrylamidového gelu (4 až 20% gradientovy gel, složení pufru na litr: Tris 3.0g, Glycin 14.4g, SDS lOg, pH 8.3), a gel byl podroben konstantnímu proudu 20 mA (pokojová teplota, jedna hodina).

Jakmile byla provedena elektroforesa, byly proteiny transferovány z gelu do nitrocelulosové membrány za použití semi-suché blotting metody (viz Towbin, H. et al., (1979), proč. Nati. Acad. Sci, USA 76, 4350 a dále). Jednotlivé použité přístroje a podmínky byly následující:

Transferový pufr: 20 mM Tris, 150 mM glycinu,

10% (objem/objem) methanol

Blotting vybavení: vyrobené Iwaki Glass

Operační podmínky: 4 °C, 0.2 A (konstantní proud), 1 hodina

Byly připraveny dvě nitrocelulosové membrány pro Western Blotting, jak je popsáno výše. Po Western transferu byly gely barveny za použití Silver Best Rit (Nakarai Tesuku Kabushiki-Kaisha).

Jedna ze dvou Western blotting nitrocelulosovýeh membrán připravených výše byla využita pro detekci H řetězce (μ řetězce) a druhá pro detekci L řetězce (k řetězce). Byly použity následující postupy.

Po Western transferu byly nitrocelulosové membrány ponořeny do vodného roztoku obsahujícího 3% (hmotnost/objem) želatinu (Bio-Rad), 20 mM Tris kyselinu chlorovodíkovou (pH 7.5) a 500 mM chloridu sodného. Membrány pak byly mírně třepány pří pokojové teplotě jednu hodinu (postup popsaný po po Western transferu je zde označen jako blokování). Takto blokované nitrocelulosové membrány byly ponořeny do roztoku rozpuštěných protilátek a mírně třepány při pokojové teplotě 2 hodiny. Vzniklý roztok protilátek byl připraven rozpuštěním buď 2.5 μΐ peroxidasou značené kozí anti-myší IgM protilátky (μ řetězec specifické: Jackson Imrauno Research Laboratories) nebo 25 μΐ peroxidasou značené krysí anti-myší k řetězec monoklonální protilátky (Zymed Laboratories) v 10 ml pufru (20 mM tris-kyselina chlorovodíková (pH 7.5), 500 mM chlorid sodný) zde označeného jako TBS.

Každá nitrocelulosová membrána pak byla ponořena do 20 ml

TTBS, což je TBS obsahující 2% (objem/objem) Tween 20 (Bio-Rad) a byla mírně třepána při pokojové teplotě po 15 minut. Ošetřené membrány byly promyty 20 ml TTBS, který byl poté odstraněn. Byla detekována residuální peroxidasová aktivita na nitrocelulosové membráně za použití ECL Western Blotting Detection systému (Amersham). Přesněji, substrát v tomto systému emituje světlo během chemické reakce za katalytického účinku peroxidasy. Emise světla může být zachycena na fotografickém filmu za použití ECL mini kamery (Amersham) a instantního filmu (Typ 667; Polaroid). Snímky byly srovnány se stříbrem barvenými gely pro identifikaci proteinových proužků, které specificky vážou protilátky.

Protilátky k myšímu M řetězci zkříženě reagovaly s proteinovým proužkem přibližně 78000 Da. Proužek této velikosti byl přítomen v supernatantu COS-1 vzorků buněk, které byly transfektovány pHEX126, buď samotným nebo v kombinaci s jiným plasmidem. Tyto vzorky korespondují (B), (E) a (F) Příkladu 5.

Protilátky k myšímu k řetězci zkříženě reagovaly s proteinovým proužkem přibližně 26000 Da. Proužek této velikosti byl přítomen v supernatantu COS-l vzorků buněk, které byly transfektovány pLEX004, buď samotným nebo v kombinaci s jiným plasmidem. Tyto vzorky korespondují (C), (E) a (F) Příkladu 5.

Protilátky produkované hybridomem byly analyzovány pomocí Western blotting za použití stejné metodologie. U proužků od hybridomů korespondujících H a L řetězci CH11 bylo pozorováno, že jsou stejné velikosti jako jsou ty, které byly získány od transfektovaných COS-l buněk.

(6 - 2) Potvrzení Fas vazebné schopnosti pomocí ELISA (a) Příprava antigenu

Expresní vektor pMEl8S-mFas-AIC (viz Nishimura, Y. et al., (1995), Mol.Immunol., 154, 4395 - 4403) kódující fusní protein, který se skládá z extracelulárního regionu myšího Fas antigenu a extracelulárního regionu myšího receptoru interleukinu 3. Část vektoru kódující extracelulární region myšího Fas antigenu byla nahrazena DNA fragmentem kódující extracelulární region lidského Fas antigenu. Tento nový expresní vektor, phFas-AIC2, kódující fusní protein, který se skládá z extracelulárního regionu lidského Fas antigenu a extracelulárního regionu myšího receptoru interleukinu 3, byl připraven jak je popsáno níže.

Oligonukleotidové primery byly projektovány a syntetizovány tak, aby umožnily PCR amplifikaci DNA kódující extracelulární region Fas antigenu. Použitým DNA templátem byl vektorpCEV4 (Itoh, N., et al., (1991), Cell, 66, 233 - 243), který obsahuje cDNA kódující pro lidský Fas antigen. Sekvence vybraných oligonukleotidů byly následující:

5- GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT-3(NI;SEQ ID NO. 77 seznamu sekvencí), a

5'- GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA-3'(C3N;SEQ ID NO. 78 seznamu sekvencí).

Oligonukleotidové primery byly projektovány a syntetizovány tak, aby umožnily PCR amplifikaci DNA kódující extracelulární region myšího receptoru pro interleukin 3. Použitým DNA templátem byl vektor pME18S-mFas-AIC (Nishimara, Y., et al., 1995, Mol. Immunology, 154, 4395 - 4403). Sekvence vybraných oligonukleotidů byly následující:

5'- TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC-3(N3N; SEQ ID NQ.79 seznamu sekvencí); a

5'- CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC-3'(CTN2; SEQ ID NO. 80 seznamu sekvencí).

PCR reakce byla provedena za použití výše uvedených plasmidů, oligonukleotidových primerů a LA PCR kitu (Takara Shuzo Co.,

Ltd.) za následujících podmínek.

Složení reakční směsi:

Plasmidová DNA 20 ng

Oligonukleotidové primery 0.5 gg (každý)

10-krát koncentrace LA PCR pufru dNTP směs

Taq polymerasa μΐ μΐ

12.5 jednotek

Byla přidána destilovaná voda, aby byl vytvořen konečný objem 250 μΐ; pufr, dNTP směs a Taq polymerasa byly obsaženy v kitu.

Teplotní podmínky:

Vzorek byl nejprve zahřátý na 94 °C po 2 minuty. Reakční směs byla potom podrobena teplotnímu cyklu 94 °C po jednu minutu, 55 °C po jednu minutu a 72 °C po dvě minuty a tento cyklus byl opakován 30-krát, po čemž následovalo zahřátí na 72 °C po dalších 10 minut.

Produkty každé PCR reakce byly separovány elektroforesou na 8% polyakrylamidovém gelu (běh v TBE pufru, při 100 V po 2 hodiny).

Z gelu byl excidován proužek přibližně 460 bp, korespondující DNA fragmentu obsahujícímu gen kódující extracelulární region lidského Fas antigenů. Z gelu byl také excidován proužek přibližně 1300 bp, korespondující DNA fragmentu obsahujícímu gen kódující extracelulární region myšího receptorů pro interleukin 3. DNA fragmenty byly eluovány z gelu jak je popsáno v Příkladu 5.

Dva DNA fragmenty získané po první PCR reakci byly dohromady použity ve druhé PCR reakci, spolu s oligonukleotidovými primery C3N a N3N. Každý primer hybridizoval na jeden z původních fragmentů. Při použití v PCR reakci primery amplifikují fragment DNA, va kterém jsou dva polypeptidy kódující geny ligovány na stejný čtecí rámeček. Druhá PCR reakce byla provedena za následujících podmínek:

Složení reakční směsi:

Produkty prvního kola PCR plný objem od každého

Oligonukleotidové primery 0.1 ^g (každý)

10-krát koncentrace LA PCR pufru 25 μΐ dNTP směs 25 μΐ

Taq polymerasa 12.5 jednotek

Byla přidána destilovaná voda, aby byl vytvořen konečný objem 250 μΐ.

Teplotní podmínky cyklu byly shodné s podmínkami použitými v předcházej ící PCR reakci.

Část reakční směsi druhé PCR reakce byla zavedena a proběhla agarosovým gelem, což potvrdilo, že byl amplifikován požadovaný PCR produkt o přibližně 1700 bp. Zbytek reakční směsi byl pak precipitován za použití ethanolu. Precipitovaná DNA byla trávena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal a produkty trávení byly separovány agarosovou gelovou elektroforesou na 1% (hmotnost/objem) agarosovém gelu. Z gelu byl excidován proužek o přibližně 1700 bp, a DNA byla purifikována z gelu stejným způsobem jako v Příkladu 5.

Současně byly 2 /ig pME18S-mFas-AIC DNA tráveny restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Produkty trávenáí byly separovány gelovou elektroforesou na 0.8% (hmotnost/objem) agarosovém gelu a z gelu byl excidován proužek o přibližně 3000 bp. DNA byla izolována a ligována na 1700 bp PCR produkt (připravený výše) za použití DNA ligačního kitu verse 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Celková reakční směs (10 μΐ) byla použita k transformaci JM109 E.coli kompetentních buněk (Takara Shuzo) a byla provedena selekce ampicilin resistentních kolonií. Jeden takový ampicilin resistentní transformant byl kultivován konvenčními postupy a byla připravena plasmidová DNA z buněk za užití alkalické lýsy (Maniatis, výše). Vzniklý plasmid byl označen phFas-AIC2.

phFAS-AIC2 DNA byla transfektována do COS-1 buněk e1ektroporací, za použití GTE-1 přístroje. Přesněji, COS-l buňky byly kultivovány ve čtyřech 225 cm² kultivačních lahvích (Sumitorno Bakelite). Buňky byly kultivovány v semikonfluentním stavu v DMEM obsahujícím 10% (objem/objem) fetální hovězí sérum (CSL). Medium bylo odstraněno a buňky byly dvakrát ošetřeny 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma) při 37 ^PC po 3 minuty. Potom byly buňky odebrány, dvakrát promyty PBS (-) pufrem (Nissui Pharmaceutical). Promyté COS-1 buňky byly upraveny PBS(-)pufrem na hustotu 6 x 10^v buněk/ml.

phFas-AIC2 plasmidové DNA byla připravena za použití plasmid mass preparation kitu (Maxiprep DNA Purification System;

Promega) a 200 //g této plasmidové DNA bylo precipitováno ethanolem a potom rozpuštěno v 200 μΐ PBS(-) pufru.

Část suspense buněk (20 μΐ; 1.2 x 10® buněk) a 20 μΐ plasmidového roztoku bylo promícháno a výsledná směs byla zavedena do elektroporační kyvety mající elektrodový interval 2 mm. Kyveta byla umístěna do elektroporačního přístroje a byly aplikovány dva 600ν-30με pulsy, s intervalem 1 sekundy mezi pulsy. Tento postup byl proveden u 10 vzorků.

Směsi buněk-DNA 10 vzorků byly kombinovány a přidány do 50 ml DMEM obsahujícího 10% (objem/objem) fetální hovězí sérum a vzniklá směs byla transferována do 225 cm² kultivačních lahví (Sumitomo Bakelite). Buňky byly kultivovány při 37 °C za 7.5% CO₂ po 24 hodin. Po této době byl odstraněn supernatant kultury a buňky byly promyty v serum-prostém DMEM mediu. Čerstvé DMEM medium bez séra (50 ml) bylo potom přidáno ke kultuře, a buňky byly kultivovány při 37 °C za 7.5% C0₂ po dalších 24 hodin. Po této době byl odebrán supernatant kultury.

(b) ELISA

Aliquoty supernatantů kultury COS-1 (100 μΐ) byly pipetovány do jamek 96-jamkové imunoplotny (Maxisorb, Nunk) a uskladněny při 4 °C přes noc. Toto vedlo k vytvoření pevné fáze proteinu, který obsahoval extracelulární region lidského Fas antigenu na vnitřním povrchu jamek. Každá jamka byla promyta PBS obsahujícím 0.05% (objem/objem) Tween-20 (EIA grade, Bio-Rad), pak bylo přidánno 100 μΐ PBS obsahujícím 0.5% (hmotnost/objem) hovězí sérový albumin (BSA). Plotna byla ponechána při pokojové teplotě po jednu hodinu pro blokující efekt.

Každá jamka byla promyta PBS obsahujícím 0.05% (objem/objem)

Tween-20 a pak byly CHll (standart) připravený v Příkladu 2, spolu s 100 μΐ ředěného roztoku testovaného vzorku připraveného v

Příkladu 5 pipetovány do jamek. Reakce probíhala při pokojové teplotě po 4 hodiny.

Jamky byly pak promyty PBS obsahujícím 0.05% (objem/objem) Tween-20. Část (100 μΐ) peroxidasou značené krysí anti myší IgM monoklonální protilátky (ředění 1/2000, Zymed Laboratories) byla pipetována do každé jamky a reakce probíhala při pokojové teplotě po 2 hodiny.

Jamky byly dále promyty PBS obsahujícím 0.05% (objem/objem) Tween-20. Část (100 μΐ) substrátového roztoku (Peroxidase substráte kit ABTS; Bio-Rad) byla pipetována do každé jamky pro iniciaci barvící reakce. Byly měřeny hodnoty absorbance každé jamky při 405 nm a 492 nm za použití čtečky mikroplotny a absorbance získaná při 492 nm byla odčítána od absorbance získané při 405 nm. Takto získané hodnoty byly srovnány s hodnotami pro CHll standarty, aby se zhodnotila schopnost testovaného vzorku vázat protein obsahující extracelulární region lidského Fas antigenu.

Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1 níže. Jak je zřejmé, byla pozorována vazba při použití supernatantu (E) (pHEX126 a pLEX004) a (F) (pHEX126, pLEX004 a pJEX004) připravených v Příkladu 5.

Tabulka 1

Vzorek

CHll standard PBS

0.445

0.104 pHEX126 pLEX004 pJEX004

0.109

0.135

0.107 pHEX126 + pLEX0Q4 pHEX126 + pLEX004 + pJEX004

0.330

0.202

Příklad 7

Zkouška cytotoxicity

Cytotoxicita každého supernatantu kultury COS-1 buněk připraveného v Příkladu 5 byla určena metodou MTT (3-(4,5-dimethylthiazon-2-yl)-2,5-diphenyl 2H-tetrazolium-bromid) zkoušky, jak je popsána níže.

Buňky lidských lymfocytů kmene HPB-ALL (viz Morikawa, S., et al-, (1978) Int.J.Cancer, 21, 166 - 170) byly kultivovány na RPMI1640 mediu (Nissui Pharmaceutical) obsahujícím 20 mM HEPES (HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonová kyselina), 50 μΜ 2-mercapthoethanolu a 10% (objem/objem) fetální hovězí sérum (Equitee Bio) při 5% C0₂ při 37 °C po 3 dny. Část (75 μΐ) supernatantů kultury COS-1 buněk připravených v Příkladu 5 byla pipetována do jamek 96-jamkové kultivační plotny a potom bylo přidáno 25 μΐ HPB-ALL buněk (upravených na 2 x 10^s buněk/ml). Buňky byly kultivovány při 37 °C za přítomnosti 5% CO₂ po 12 hodin. Do každě jamky plotny bylo přidáno 10 μΐ 5 mg/ml vodného roztoku MTT (Sigma) a plotna byla inkubována při 37 °C po 4 hodiny. Po inkubaci bylo do každě jamky přidáno 100 μΐ roztoku obsahujícího 50% (objem/objem) N,N-dimethylfarmamid a 20% (hmotnost/objem) SDS. Hodnoty absorbance pro každou jamku byly odečítány při 590 nm a 620 nm za použití čtečky mikroplotny (Nippon Intermed Ltd.). Absorbance při 620 nm byla odečítána od absorbance při 590 nm. Při vyšších hodnotách zbývalo větší množství živých buněk v jamce. Výsledné hodnoty jsou ukázány v Tabulce 2, níže.

Tabulka 2

Vzorek

PBS pME 18S pHEX126 (H řetězec) pLEX004 (L řetězec) pJEX004 (J řetězec) pHEX126 + pLEX004 pHEX126 + pLEX004 + pJEX004

0.864 0.881 0.876 0.887

0.883

0.176

0.242

Tyto kultury COS-1 buněk, které byly transfektovány jedním plasmidem v Příkladu 5 ((A) , (B), (C), a (D)) všechny vykazovaly vysoké hodnoty, srovnatelné s hodnotami netransfektovaných buněk Buňky kotransfektované pHEX126 a pLEX004 ((E) a (F)) vykazovaly nízké hodnoty srovnatelné s hodnotami prázdných, ve kterých nebyly přítomny žádné buňky. Z těchto výsledků vyplývá, že .cytotoxická substance je produkována koexpresí DNA kódující CHll H řetězec a CHll L řetězec.

Příklad 8

Srovnání cytotoxicity protilátek (ED test)

Cytotoxicita protilátek předkládaného vynálezu byla hodnocena ED_so testem. Jak je zde použito je ED_so koncentrací protilátky, při které je 50% vzorku buněk exprivujících Fas antigen usmrceno Před měřením ED_so bylo nezbytné přesně spočítat koncentraci testovaných protilátek.

(8 - 1) Určení koncentrace protilátek

Do každé jamky 96 jamkové ELISA plotny (NUNC) bylo pipetováno 100 μΐ roztoku anti-myší IgM protilátky (0.5 #g/ml v 50 mM Na₂HC0₃, pH 9.6, zakoupených u BIOSYS), a plotna byla inkubována přes noc při 4 °C. Roztok protilátek byl pak odstraněn a každá jamka byla promyta čtyři-krát PBS obsahujícím 0.5% Tween 20 (zde označeno jako PBS-T).

Super Block blokující pufr (Pierce) byl připraven v PBS, podle instrukcí výrobce a 100 μΐ tohoto pufru bylo pipetováno do každé jamky. Plotna pak byla dále inkubována po čtyři hodiny při 37 °C. Po této době byl blokující roztok odstraněn a každá jamka byla promyta čtyřikrát PBS-T.

100 μΐ každého testovaného přípravku protilátky bylo přidáno da každé jamky plotny. Testované vzorky obsahovaly CHll, a supernatanty (E) a (F) Příkladu 5. Byly použity různé standartní přípravky obsahující myší IgM (Zymed) ředěné na různé koncentrace. Po přidání vzorků do jamek byly plotny inkubovány při 37 °C po 4 hodiny. Po této době byly testované a standartní vzorky odstraněny a každá jamka byla promyta čtyřikrát PBS-T.

Vzorek křenová peroxidasa-konjugovaného anti-myšího IgM (100 μΐ ředění 1/1000 v PBS) byl přidán do každé jamky. Tento roztok byl odstraněny a každá jamka byla promyta čtyřikrát PBS-T.

100 μΐ vzorku připraveného z Horseradish Peroxidase Substráte Kit (Biored) byly přidány do každé jamky a plotna byla inkubována při pokojové teplotě po 30 minut. Po této době byla měřena absorbance při 405 a 492 nm za použití čtečky mikroplotny. Absorbance při 492 nm byla pak odečtena od absorbance při 405 nm.

Při použití hodnot absorbance pro standartní vzorky bylo možné konstruovat standartní křivku, ze které může být určena koncentrace každé testované protilátky.

Pak bylo možné hodnotit ED (8 - 2) Kalkulace ED s o

Tři roztoky protilátek, CHll, supernatant (E) (obsahující H a

L řetězec) a supernatant (F) (obsahující H,L a J řetězec) příkladu 5, v příslušném pořadí, byly inkubovány HBP-ALL· buĚkami.

MTT zkouška, popsaná v Příkladu 7, byla použita k hodnocení toho, jak mnoho buněk bylo usmrceno každým roztokem protilátek.

MTT výsledky pro každou protilátku byly kalkulovány jako funkce koncentrace proteinu, jak byla získaná v (8 - l) výše, pro určení ED_so hodnoty, kdy MTT byla brána jako negativní kontrola a výsledky pro HBP-ALL kultivované v nepřítomnosti protilátek byly brány jako positivní kontrola. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 3.

Tabulka 3

protilátka	ED5O (ng/ml)
CHll	21.2
Supernatant (E) (pHEX126 a pLEX004)	4.5
Supernatant (F) (pHEXl26, pLEX004 a pJEX004)	22.9

Výše uvedené výsledky jasně ukazují, že produkt obsahující supernatant (É) překvapivě vykazuje přibližně 5 krát vyšší aktivitu než CHll nebo produkt obsažený v supernatantů (F). Zdá se pravděpodobně, že IgM struktura je tvořena produktem obsaženým v supernatantů (F), zatímco produkt obsažený v supernatantů (E) tvoří jednoduché páry a že, za těchto okolností, je ED_sO signifikantně zvýšena.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: Sankyo Company, Limited (B) Ulice: 5 - 1, Nihonbashi Honcho 3-chome, Chuo - ku (C) Město: Tokyo {E) Země: Japonsko (F) Poštovní kod (ZIP): 103 (G) Telefon: 81-3-5255-7111 (ii) Název vynálezu: Rekombinantní protilátka proti lidskému

Fas (iii) Počet sekvenci: 80 (iv) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Releáse #1.0, verse #1.30 (EPO) (2) informace pro sekvenci č.l:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 5 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 1:

Asp Tyr Asn Met His 1 5 (2) informace pro sekvenci č.2:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 2:

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gin Lys 1 5 10

Phe Lys Ser 15 (2) informace pro sekvenci č.3:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 3: Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 (2) informace pro sekvenci č.4:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 4:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr 1 5 10

Tyr Leu His 15 (2) informace pro sekvenci č.5:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 5:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 (2) informace pro sekvenci č.6:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 6:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Pro Ala l 5 (2) informace pro sekvenci č.7:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 1773 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (O) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) ánti-sense: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (B) Typ buněk: Hybridomy (C) Buněčná linie: CH11 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: CDS (B) Umístění: 1....1770 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: mat peptid (B) Umístění: 58...1770 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: sig peptid (B) Umístění: 1....57 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 7:

ATG GGA TGG

AGC Ser

TGG ATC

TTT CTC TTC CTC CTG

TCA GGA ACT GCA GGC

48

Met -19

Gly Trp

Trp -15

Ile

Phe

Leu

Phe Leu -10

Leu

Ser Gly

Thr Ala Gly -5

GTC

CAC

TCT

GAG

GTC

CAG

CTT

CAG

CAG

TCA

GGA CCT

GAG

CTG

GTG

AAA

96

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Val

Lys

1

5

10

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

ATA

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

ACA

TTC

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

•15

20

25

ACT

GAC

TAC

AAC

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGC

CAT

GGA AAG

AGC

CTT

192

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

30

35

40

45

GAG

TGG

ATT

GGA

TAT

ATT

TAT

CCT

TAC

AAT

GGT

GGT

ACT

GGC

TAC

AAC

240

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly Tyr

Asn

50

55

60

CAG

AAG

TTC

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTT

GAC

AAT

TCC

TCC

AGC

288

Gin

Lys

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ser

Ser

65

70

75

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

CGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

80

85

90

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AGT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

CAA

GGA

384

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

ACC

TCA

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GAG

AGT

CAG

TCC

TTC

CCA

AAT

GTC

TTC

432

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Glu

Ser

Gin

Ser

Phe

Pro

Asn

Val

Phe

110

115

120

125

CCC

CTC

GTC

TCC

TGC

GAG

AGC

CCC

CTG

TCT

GAT

AAG

AAT

CTG

GTG

GCC

480

Pro

Leu

Val

Ser

Cys

Glu

Ser

Pro

Leu

Ser

Asp

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

130

135

140

ATG

GGC

TGC

CTA

GCC

OGG

GAC

TTC

CTG

CCC

AGC

ACC

ATT

TCC

TTC

ACC

528

Met

Gly

Cys

Leu

Ala

Arg Asp

Phe

Leu

Pro

Ser

Thr

Ile

Ser

Phe

Thr

145

150

155

TGG

AAC

TAC

CAG

AAC

AAC

ACT

GAA

GTC

ATC

CAG

GGT

ATC

AGA

ACC

TTC

576

Trp

Asn

Tyr

Gin

Asn

Asn

Thr

Glu

Val

Ile

Gin

Gly

Ile

Arg

Thr

Phe

FP-9709/76244

,

160

165

170

CCA

ACA

CTG

AGG

ACA

GGG

GGC

AAG

TAC

CTA

GCC

ACC

TCG

CAG

GTG

TTG

624

Pro

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Gly

Lys

Tyr

Leu

Ala

Thr

Ser

Gin

Val

Leu

•

175

180

185

CTG

TCT

CCC

AAG

AGC

ATC

CTT

GAA

GGT

TCA

GAT

GAA

TAC

CTG

GTA

TGC

672

-

Leu

Ser

Pro

Lys

Ser

Ile

Leu

Glu

Gly

Ser

Asp

Glu Tyr

Leu

Val

Cys

190

195

200

205

AAA

ATC

CAC

TAC

GGA

GGC

AAA

AAC

AGA

GAT

CTG

CAT

GTG

CCC

ATT

CCA

720

Lys

Ile

His

Tyr

Gly

Gly

Lys

Asn

Arg Asp

Leu

His

Val

Pro

Ile

Pro

210

215

220

GCT

GTC

GCA

GAG

ATG

AAC

CCC

AAT

GTA

AAT

GTG

TTC

GTC

CCA

CCA

CGG

768

-

Ala

Val

Ala

Glu

Met

Asn

Pro

Asn

Val

Asn

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

225

230

235

GAT

GGC

TTC

TCT

GGC

CCT

GCA

CCA

CGC

AAG

TCT

AAA

CTC

ATC

TGC

GAG

816

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Pro

Ala

Pro

Arg Lys

Ser

Lys

Leu

Ile

Cys

Glu

240

245

250

GCC

ACG

AAC

TTC

ACT

CCA

AAA

CCG

ATC

ACA

GTA

TCC

TGG

CTA

AAG

GAT

864

Ala

Thr

Asn

Phe

Thr

Pro

Lys

Pro

Ile

Thr

Val

Ser

Trp

Leu

Lys

Asp

255

260

265

GGG

AAG

CTC

GTG

GAA

TCT

GGC

TTC

ACC

ACA

GAT

CCG

GTG

ACC

ATC

GAG

912

Gly

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Val

Thr

Ile

Glu

«

270

275

280

285

AAC

AAA

GGA

TCC

ACA

CCC

CAA

ACC

TAC

AAG

GTC

ATA

AGC

ACA

CTT

ACC

960

Asn

Lys

Gly

Ser

Thr

Pro

Gin

Thr

Tyr

Lys

Val

Ile

Ser

Thr

Leu

Thr

290

295

300

ATC

TCT

GAA

ATC

GAC

TGG

CTG

AAC

CTG

AAT

GTG

TAC

ACC

TGC

CGT

GTG

1008

Ile

Ser

Glu

Ile

Asp

Trp

Leu

Asn

Leu

Asn

Val

Tyr

Thr

Cys

Arg

Val

305

310

315

GAT

CAC

AGG

GGT

CTC

ACC

TTC

TTG

AAG

AAC

GTG

TCC

TCC

ACA

TGT

GCT

1056

Asp

His

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Leu

Lys

Asn

Val

Ser

Ser

Thr

Cys

Ala

320

325

330

GCC

AGT

CCC

TCC

ACA

GAC

ATC

CTA

ACC

TTC

ACC ATC

CCC

CCC

TCC

TTT

1104

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Asp

Ile

Leu

Thr

Phe

Thr

Ile

Pro

Pro

Ser

Phe

33S

340

345

-

GCC

GAC

ATC

TTC

CTC

AGC

AAG

TCC

GCT

AAC

CTG

ACC

TGT

CTG

GTC

TCA

1152

Ala

Asp

Ile

Phe

Leu

Ser

Lys

Ser

Ala

Asn

Leu

Thř

Cys

Leu

Val

Ser

350

355

360

365

AAC

CTG

GCA

ACC

TAT

GAA

ACC

CTG

AAT

ATC

TCC

TGG

GCT

TCT

CAA

AGT

1200

Asn

Leu

Ala

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Asn

Ile

Ser

Trp

Ala

Ser

Gin

Ser

370

375

380

GGT

GAA

CCA

CTG

GAA

ACC

AAA

ATT

AAA

ATC

ATG

GAA

AGC

CAT

CCC

AAT

1248

Gly

Glu

Pro

Leu

Glu

Thr

Lys

Ile

Lys

Ile

Met

Glu

Ser

His

Pro

Asn

385 390 395

GGC Gly

ACC TTC

AGT GCT AAG Ser Ala Lys

GGT Gly

GTG GCT AGT GTT TGT GTG GAA GAC TGG

1296

Thr

Phe 400

Val 405

Ala Ser

Val

Cys Val Glu 410

Asp Trp

AAT

AAC

AGG

AAG

GAA

TTT

GTG

TGT

ACT

GTG

ACT

CAC

AGG

GAT

CTG

CCT

1344

Asn

Asn

Arg

Lys

Glu

Phe

Val

Cys

Thr

Val

Thr

His

Arg Asp

Leu

Pro

415

420

425

TCA

CCA

CAG

AAG

AAA

TTC

ATC

TCA

AAA

CCC

AAT

GAG

GTG

CAC

AAA

CAT

1392

Ser

Pro

Gin

Lys

Lys

Phe

Ile

Ser

Lys

Pro

Asn

Glu

Val

His

Lys

His

43 0

435

440

445

CCA

CCT

GCT

GTG

TAC

CTG

CTG

CCA

CCA

GCT

CGT

GAG

CAA

CTG

AAC

CTG

1440

Pro

Pro

Ala

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

450

455

460

AGG

GAG

TCA

GCC

ACA

GTC

ACC

TGC

TTG

GTG

AAG

GGC

TTC

TCT

CCT

GCA

1488

Arg

Glu

Ser

Ala

Thr

Val

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

465

470

475

GAC

ATC

AGT

GTG

CAG

TGG

CTT

CAG

AGA

GGG

CAA

CTC

TTG

CCC

CAA

GAG

1536

Asp

Ile

Ser

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Arg

Gly

Gin

Leu

Leu

Pro

Gin

Glu

480

485

490

AAG

TAT

GTG

ACC

AGT

GCC

CCG

ATG

CCA

GAG

CCT

GGG

GCC

CCA

GGC

TTC

1584

Lys

Tyr

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gly

Ala

Pro

Gly

Phe

495

500

505

TAC

TTT

ACC

CAC

AGC

ATC

CTG

ACT

GTG

ACA

GAG

GAG

GAA

TGG

AAC

TCC

1632

Tyr

Phe

Thr

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Ser

510

515

520

525

GGA

GAG

ACC

TAT

ACC

TGT

GTT

GTA

GGC

CAC

GAG

GCC

CTG

CCA

CAC

CTG

1680

Gly

Glu

Thr

Tyr

Thr

Cys

Val

Val

Gly

His

Glu

Ala

Leu

Pro

His

Leu

530

535

540

GTG

ACC

GAG

AGG

ACC

GTG

GAC

AAG

TCC

ACT

GGT

AAA

CCC

ACA

CTG

TAC

1728

Val

Thr

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

545

550

555

AAT

GTC

TCC

CTG

ATC

ATG

TCT

GAC

ACA

GGC

GGC

ACC

TGC

TAT

1770

Asn

Val

Ser

Leu

Ile

Met

Ser

Asp

Thr

Gly

Gly

Thr

Cys

Tyr

560

565

570

1773

(2) informace pro sekvenci č.8:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 590 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 8:

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

	-19	-15	-10	-5
	Val His Ser	Glu Val Gin 1	Leu Gin Gin Ser 5	Gly Pro Glu Leu Val Lys 10
	Pro Gly Ala 15	Ser Val Lys	Ile Ser Cys Lys 20	Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 25
	Thr Asp Tyr 30	Asn Met His 35	Trp Val Lys Gin	Ser His Gly Lys Ser Leu 40 45
	Glu Trp Ile	Gly Tyr Ile 50	Tyr Pro Tyr Asn 55	Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 60
	Gin Lys Phe	Lys Ser Lys 65	Ala Thr Leu Thr 70	Val Asp Asn Ser Ser Ser 75
	Thr Ala Tyr 80	Met Glu Léu	Arg Ser Leu Thr 85	Ser Glu Asp Ser Ala Val 90
	Tyr Tyr Cys 95	Ala Arg Ser	Tyr Tyr Ala Met 100	Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105
	Thr Ser Val 110	Thr Val Ser 115	Ser Glu Ser Gin	Ser Phe Pro Asn Val Phe 120 125
	Pro Leu Val	Ser Cys Glu 130	Ser Pro Leu Ser 135	Asp Lys Asn Leu Val Ala 140
	Met Gly Cys	Leu Ala Arg 145	Asp Phe Leu Pro 150	Ser Thr Ile Ser Phe Thr 155
-	Trp Asn Tyr 160	Gin Asn Asn	Thr Glu Vál Ile 165	Gin Gly Ile Arg Thr Phe 170
	Pro Thr Leu 175	Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu 180	Ala Thr Ser Gin Val Leu 185
	Leu Ser Pro 190	Lys Ser Ile 195	Leu Glu Gly Ser	Asp Glu Tyr Leu Val Cys 200 205
	Lys Ile His	Tyr Gly Gly 210	Lys Asn Arg Asp 215	Leu His Val Pro Ilé Pro 220
	Ala Val Ala	Glu Met Asn 225	Pro Asn Val Asn 230	Val Phe Val Pro Pro Arg 235
	Asp Gly Phe 240	Ser Gly Pro	Ala Pro Arg Lys 245	Ser Lys Leu Ile Cys Glu 250
	Ala Thr Asn 255	Phe Thr Pro	Lys Pro Ile Thr 260	Val Ser Trp Leu Lys Asp 265
	Gly Lys Leu 270	Val Glu Ser 275	Gly Phe Thr Thr	Asp Pro Val Thr Ile Glu 280 285
	Asn Lys Gly	Ser Thr Pro 290	Gin Thr Tyr Lys 295	Val Ile Ser Thr Leu Thr 300

F

-	Ile Ser	Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg	Val
305	310	315
	Asp His	Arg Gly Leu Thr Phe Leu	Lys Asn Val Ser Ser	Thr Cys	Ala
		320 325	330
	Ala Ser	Pro Ser Thr Asp Ile Leu	Thr Phe Thr Ile Pro	Pro Ser	Phe
	335	340	345
	Ala Asp	Ile Phe Leu Ser Lys Ser	Ala Asn Leu Thr Cys	Leu Val	Ser
	350	355	360		365
	Asn Leu	Ala Thr Tyr Glu Thr Leu	Asn Ile Ser Trp Ala	Ser Gin	Ser
		370	375	380
•	Gly Glu	Pro Leu Glu Thr Lys Ile	Lys Ile Met Glu Ser	His Pro	Asn
		385	390	395
	Gly Thr	Phe Ser Ala Lys Gly Val	Ala Ser Val Cys Val	Glu Asp	Trp
		400 405	410
	Asn Asn	Arg Lys Glu Phe Val Cys	Thr Val Thr His Arg	Asp Leu	Pro
	415	420	425
	Ser Pro	Gin Lys Lys Phe Ile Ser	Lys Pro Asn Glu Val	His Lys	His
	430	435	440		445
	Pro Pro	Ala Val Tyr Leu Leu Pro	Pro Ala Arg Glu Gin	Leu Asn	Leu
		450	455	460
	Arg Glu	Ser Ala Thr Val Thr Cys	Leu Val Lys Gly Phe	Ser Pro	Ala
		465	470	475
	Asp Ile	Ser Val Gin Trp Leu Gin	Arg Gly Gin Leu Leu	Pro Gin	Glu
		480 485	490
	Lys Tyr	Val Thr Ser Ala Pro Met	Pro Glu Pro Gly Ala	Pro Gly	Phe
	495	500	505
	Tyr Phe	Thr His Ser Ile Leu Thr	Val Thr Glu Glu Glu	Trp Asn	Ser
	510	515	520		525
	Gly Glu	Thr Týr Thr Cys Val Val	Gly His Glu Ala Leu	Pro His	Leu
•		530	535	540
	Val Thr	Glu Arg Thr Val Asp Lys	Ser Thr Gly Lys Pro	Thr Leu	Tyr
•		545	550	555
	Asn Val	Ser Leu Ile Met Ser Asp	Thr Gly Gly Thr Cys Tyr

560 565 570 (2) informace pro sekvenci č.9:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 717 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: cDNA k rnRNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(V)	Původní zdroj: (A) Organismus: Mus musculus (B) Typ buněk: Hybridomy (C) Buněčná linie: CHll
(ix)	Vlastnosti: (A) Jmeno/klíč: CDS (B) Umístění: 1....714
(ix)	Vlastnosti: (A) Jmeno/klíč: mat peptid (B) Umístění: 58...714
(ix)	Vlastnosti: (A) Jmeno/klíč: sig peptid (B) Umístění: 1_____57
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 9:

ATG Met -19

AAG TTC CCT GTT

AGG CTG TTC Arg Leu Leu

GTC CTC ATC TTC TCG ATT CCT GCT Val Leu Met Phe Trp lle Pro Ala

48

Lys

Leu

Pro

Val -15

-10

-5

TCC

AGC

AGT

GAT

GTT

GTC

ATC

ACC

CAA

AGT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCT

GTC

96

Ser

Ser

Ser

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

1

5

10

AGT

CTT

GGA

GAT

CAA

GCC

TCC

ATC

TCT

TCC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

CTT

144

Ser

Leu

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser

lle

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

Leu

15

20

25

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TCG

TAC

CTC

CAG

AAG

CCA

192

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

30

35

40

45

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CTC

CTC

ATC

TAC

AAA

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

TCT

240

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

lle

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

50

55

60

GGG

GTC

CCA

GAC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCA

GGG

ACA

GAT

TTC

ACA

288

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

CTC

AAG

ATC

AGC

AGA

GTC

GAG

GCT

GAG

GAT

CTC

GGA

GTT

TAT

TTC

TCC

336

Leu

Lys

lle

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe

Cys

80

85

90

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTC

384

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly Gly Gly

Thr

Lys

Leu

100 105

GAA ATC AAA Glu Ile Lys 110

CGG GCT Arg Ala

GAT Asp 115

GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA

432

Ala Ala

Pro

Thr

Val Ser Ile Phe Pro Pro

120

125

-

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

AGA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

TTC

TTG

480

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

ir

130

135

140

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

GAT

GGC

528

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

145

150

155

AGT

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

GAC

AGC

576

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

AAA

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG ACC

AAG

GAC

624

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met:

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

AAG

ACA

672

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

205

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

714

Ser

Thr

Ser

Pro

Ue

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

210 215

TAG (2) informace pro sekvenci č.10:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 238 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 10:

Met -19

Lys

Leu

Pro

Val -15

Arg

Leu

Leu

Val

Leu -10

Met

Phe

Trp

Ile

Pro -5

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Ser

Leu 15

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Lys

Ser

Leu

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

His

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Val Pro	Asp 65	Arg	Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 70	Thr	Asp Phe Thr 75
Leu Lys Ile	Ser	Arg	Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val	Tyr Phe Cys
80			85	90
Ser Gin Ser	Thr	His	Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly	Thr Lys Leu
95			100 105
Glu Ile Lys	Arg	Ala	Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser	Ile	Phe Pro Pro
110			115 120		12S
Ser Ser Glu	Gin	Leu	Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val	Val	Cys Phe Leu
		130	135		140
Asn Asn Phe	Tyr	Pro	Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp	Lys	Ile Asp Gly
	145		150		155
Ser Glu Arg	Gin	Asn	Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr	Asp	Gin Asp Ser
160			165	170
Lys Asp Ser	Thr	Tyr	Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr	Leu	Thr Lys Asp
175			180 185
Glu Tyr Glu	Arg	His	Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala	Thr	His Lys Thr
190			195 200		205
Sér Thr Ser	Pro	Ile	Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn	Glu	Cys
		210	215

sekvenci č.ll:

(2) informace pro (i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 480 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (B) Typ buněk: Hybridomy (C) Buněčná linie: CH11 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klič: CDS (B) Umístění: 1....447 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: mat peptid (B) Umístění: 67...477 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: sig peptid (B) Umístěni: 1....66 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 11:

ATG AAG ACC Met Lys Thr

CAC His

CTG CTT Leu Leu

CTC TGG GGA GTC CTC GCC

ATT TTT GTT AAG

48

Leu

Trp -15

Gly

Val Leu Ala

Ile -10

Phe Val

Lys

-22

-20

GCT

GTC

CTT

GTA

ACA

GGT

GAC

GAC

GAA

GCG

ACC

ATT

CTT

GCT

GAC

AAC

96

Ala

Val

Leu

Val

Thr

Gly Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Ile

Leu

Ala

Asp

Asn

-5

.1

5

10

AAA

TGC

ATG

TGT

ACC

CGA

GTT

ACC

TCT

AGG

ATC

ATC

CCT

TCC

ACC

GAG

144

Lys

Cys

Met

Cys

Thr

Arg

Val

Thr

Ser

Arg

Ile

Ile

Pro

Ser

Thr Glu

15

20

25

GAT

CCT

AAT

GAG

GAC

ATT

GTG

GAG

AGA

AAT

ATC

CGA

ATT

GTT

GTC

CCT

192

Asp

Pro

Asn

Glu

Asp

Ile

Val

Glu

Arg

Asn

Ile

Arg

Ile

Val

Val

Pro

30

35

40

TTG

AAC

AAC

AGG

GAG

AAT

ATC

TCT

GAT

CCC

ACC

TCC

CCA

CTG

AGA

AGG

240

Leu

Asn

Asn

Arg

Glu

Asn

Ile

Ser

Asp

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Arg

Arg

45

50

55

AAC

TTT

GTA

TAC

CAT

TTG

TCA

GAC

GTC

TGT

AAG

AAA

TGC

GAT

CCT

GTG

288

Asn

Phe

Val

Tyr

His

Leu

Ser

Asp

Val

Cys

Lys

Lys

Cys

Asp

Pro

Val

60

65

70

GAA

GTG

GAG

CTG

GAA

GAT

CAG

GTT

GTT

ACT

GCC

ACC

CAG

AGC

AAC

ATC

336

Glu

Val

Glu

Leu

Glu

Asp

Gin

Val

Val

Thr

Ala

Thr

Gin

Ser

Asn

Ile

75

80

85

90

TGC

AAT

GAG

GAC

GAT

GGT

GTT

CCT

GAG

ACC

TGC

TAC

ATG

TAT

GAC

AGA

384

Cys

Asn

Glu

Asp

Asp

Gly

Val

Pro

Glu

Thr

Cys Tyr

Met

Tyr

Asp

Arg

95

100

105

AAC

AAG

TGC

TAT

ACC

ACT

ATG

GTC

CCA

CTT

AGG

TAT

CAT

GGT

GAG

ACC

432

Asn

Lys

Cys

Tyr

Thr

Thr

Met

Val

Pro

Leu

Arg

Tyr

His

Gly

Glu

Thr

110

115

120

AAA

ATG

GTG

CAA

GCA

GCC

TTG

ACC

CCC

GAT

TCT

TGC

TAC

CCT

GAC

477

Lys

Met

Val

Gin

Ala

Ala

Leu

Thr

Pro

Asp

Ser

Cys

Tyr

Pro

Asp

125

130

135

TAG

480 (2) informace pro sekvenci č.12:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 159 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 12:

Met -22

Lys

Thr -20

His

Leu

Leu

Leu

Trp Gly -15

Val

Leu

Ala

Ile -10

Phe

Val

Lys

Ala

Val -5

Leu

Val

Thr

Gly Asp 1

Asp

Glu

Ala

Thr 5

Ile

Leu

Ala

Asp

Asn 10

Lys

cys

Met

Cys

Thr 15

Arg

Val

Thr

Ser

Arg 20

Ile

Ile

Pro

Ser

Thr 25

Glu

Asp

Pro

Asn

Glu 30

Asp

Ile

Val

Glu

Arg 35

Asn

Ile

Arg

Ile

Val 40

Val

Pro

Leu

Asn

Asn 45

Arg

Glu

Asn

Ile

Ser 50

Asp

Pro

Thr

Ser

Pro 55

Leu

Arg Arg

Asn

Phe eo

Val

Tyr

His

Leu

Ser 65

Asp

Val

cys

Lys

Lys 70

Cys

Asp

Pro

Val

Glu 75

Val

Glu

Leu

Glu

Asp 80

Gin

Vál

Val

Thr

Ala 85

Thr

Gin

Ser

Asn

Ile 90

Cys

Asn

Glu

Asp

Asp 95

Gly

Val

Pro

Glu

Thr 100

Cys

Tyr

Met

Tyr Asp Arg 105

Asn

Lys

Cys

Tyr 110

Thr

Thr

Met

Val

Pro 115

Leu

Arg

Tyr

His

Gly 120

Glu

Thr

Lys

Met

Val 125

Gin

Ala

Ala

Leu

Thr 130

Pro

Asp

Ser

Cys

Tyr 135

Pro

Asp

(2) informace pro sekvenci č.13:

Ί1 (i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: protein
(v)	Typ fragmentu: N-terminální
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 13: Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly	Pro Glu Leu Val Lys Pro
	1 5	10

Gly (2) informace pro sekvenci č.14:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (v) Typ fragmentu: vnitřní (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 14:

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Léu Pro Val Ser 1 5 10

Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile

20 (2) informace pro sekvenci č.15:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 391 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvoj itý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (B) Typ buněk: Hybridomy (C) Buněčná linie: CH11 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: CDS (B) Umístění: 2....391 (ix) Vlastnosti:

{A) Jmeno/klíč: mat pept id (B) Umístění: 32...391 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: sig peptid (B) Umístění: 2. . . .31 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 15:

C CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG 46

Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Glu Val Gin Leu Gin

-10 “5 1 5

CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC 94

Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser

15 20

TGC Cys

AAG Lys

GCT TCT GGA

TAC ACA

TTC Phe

ACT GAC Thr Asp 30

TAC AAC ATG CAC TGG GTG

142

Ala

Ser Gly 25

Tyr

Thr

Tyr Asn Met

His 35

Trp

Val

AAG

CAG

AGC

CAT GGA

AAG

AGC

CTT

GAG TGG

ATT GGA TAT

ATT

TAT

CCT

190

Lys

Gin

Ser

His Gly

Lys

Ser

Leu

Glu Trp

Ile Gly Tyr

Ile

Tyr

Pro

40

45

50

TAC

AAT

GGT

GGT ACT

GGC

TAC

AAC

CAG AAG

TTC AAG AGC

AAG

GCC

ACA

238

Tyr

Asn

Gly Gly Thr

Gly

Tyr

Asn

Gin Lys

Phe Lys Ser

Lys

Ala

Thr

55

60

65

TTG

ACT

GTT

GAC AAT

TCC

TCC

AGC

ACA GCC

TAC ATG GAG

CTC

CGC

AGC

286

Leu

Thr

Val

Asp Asn

Ser

Ser

Ser

Thr Ala

Tyr Met Glu

Leu

Arg

Ser

70

75

80

85

«

334

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA AGA

AGT

TAC

TAT

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala Arg

Ser

Tyr

Tyr

90

95

100

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

CAA

GGA

ACC

TCA

GTC

ACC GTC

TCC

TCA

GAG

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr Val

Ser

Ser

Glu

105

110

115

382

AGT CAG TCC Ser Gin Ser

120

391 (2) informace pro sekvenci č.16:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 388 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (B) Typ buněk: Hybridomy (C) Buněčná linie: CHll (ix) Vlastnosti:

Ί4 (A) Jmeno/klíč: CDS (B) Umístění: 2.... .388 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: mat peptid (B) Umístění: 29...388 (ix) Vlastnosti:

(A) Jmeno/klíč: sig peptid (B) Umístění: 2....28 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 16:

G ATG TTC TGG ATT CCT GCT TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA 46

Met Phe Trp Xle Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin

-9 -5 1 5

AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC	AGT CTT GGA GAT CAA	GCC TCC ATC TCT	94
Ser Pro Leu Ser	Leu	Pro	Val	Ser Leu 15	Gly Asp Gin	Ala	Ser lle 20	Ser
	10
TGC	AGA TCT AGT	AAG	AGC	CTT	GTA CAC	AGT AAT GGA	AAC	ACC TAT	TTA	142
Cys	Arg Ser Ser 25	Lys	Ser	Leu	Val His 30	Ser.Asn Gly	Asn 35	Thr Tyr	Leu
CAT	TGG TAC CTG	CAG	AAG	CCA	GGC CAG	TCT CCA AAG	CTC	CTG ATC	TAC	190
His	Trp Tyr Leu 40	Gin	Lys	Pro 45	Gly Gin	Ser Pro Lys 50	Leu	Leu lle	Tyr
AAA	GTT TCC AAC	CGA	TTT	TCT	GGG GTC	CCA GAC AGG	TTC	AGT GGC	AGT	238
Lys 55	Val Ser Asn	Arg	Phe 60	Ser	Gly Val	Pro Asp Arg 65	Phe	Ser Gly	Ser 70
GGA	TCA GGG ACA	GAT	TTC	ACA	CTC AAG	ATC AGC AGA	GTG	GAG GCT	GAG	286
Gly	Ser Gly Thr	Asp 75	Phe	Thr	Leu Lys	lle Ser Arg 80	Val	Glu Ala 85	Glu
GAT	CTG GGA GTT	TAT	TTC	TGC	TCT CAA	AGT ACA CAT	GTT	CCT CCG	GCG	334
Asp	Leu Gly Val 90	Tyr	Phe	Cys	Ser Gin 95	Ser Thr His	Val	Pro Pro 100	Ala
TTC	GGT GGA GGC	ACC	AAG	CTG	GAA ATC	AAA CGG GCT	GAT	GCT GCA	CCA	382
Phe	Gly Gly Gly 105	Thr	Lys	Leu	Glu lle 110	Lys Arg Ala	Asp 115	Ala Ala	Pro

ACT GTA Thr Val

120

388

Ί5 (2) informace pro sekvenci č.17:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 33 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (ix) Popis sekvence: SEQ ID No: 17:

CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA (2) informace pro sekvenci č.18 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 34 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (ix) Popis sekvence: SEQ ID No: 18:

TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG TTGA (2) informace pro sekvenci č.19 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 33 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (ix) Popis sekvence: SEQ ID No: 19:

AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC 33 (2) informace pro sekvenci č-.-20 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 32 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 20:

ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT 32 (2) informace pro sekvenci č.2l :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 32 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /děse = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popiš sekvence: SEQ ID No: 21:

TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT 32 (2) informace pro sekvenci č.22 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 32 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 22:

ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAG CT 32 (2) informace pro sekvenci č.23 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA” (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 23:

TGGGGCCTCA GTGAAGATAT 20 (2) informace pro sekvenci č.24 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc - syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 24:

CAATGGTGGT ACTGGCTACA 20 (2) informace pro sekvenci č.25 : / (it Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 25:

TGACATCTGA GGACTCTGCA (2) informace pro sekvenci č.26 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (G) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 26:

TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT (2) informace pro sekvenci č.27 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /děse = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 27:

TGCTTCACGT GGAACTACCA (2) informace pro sekvenci č.28 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 28:

TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG 20 (2) informace pro sekvenci č.29 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 29:

AGATCTGCAT GTGCCCATTC 20 (2) informace pro sekvenci č.30 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 30:

TCTAAACTCA TCTGCGAGGC 20 (2) informace pro sekvenci č.31 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc ·= syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 31:

GGTGACCATC GAGAACAAAG 20 (2) informace pro sekvenci č.32 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 32:

AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA 20 (2) informace pro sekvenci č.33 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 33:

TCCTTTGCCG ACATCTTCCT 20 (2) informace pro sekvenci č.34 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 34: GTGTGTACTG TGACTCACAG

(2) informace pro sekvenci č.35 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc * syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 35:

AACTGAACCT GAGGGAGTCA 20 (2) informace pro sekvenci č.36 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 36:

AACTCTTGCC CCAAGAGAAG 20 (2) informace pro sekvenci č.37 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 37:

ATCCTGACTG TGACAGAGGA 20 (2) informace pro sekvenci č.38 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 38:

ACAAGTCCAC TGGTAAACCC 20 (2) informace pro sekvenci č.39 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 39:

AGGATATCTT CACTGAGGCC 20 (2) informace pro sekvenci č.40 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 40:

ATCCAGTCAA GGCTCTTTCC 20 (2) informace pro sekvenci č.4l :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 41: ACTGCAGAGT CCTCAGATGT

(2) informace pro sekvenci č.42 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 42:

AGACGGTGAC TGAGGTTCTT 20 (2) informace pro sekvenci č.43 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 43:

CAGGTGAAGG AAATGGTGCT 20 (2) informace pro sekvenci č.44 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 44:

ATGCTCTTGG GAGACAGCAA 20 (2) informace pro sekvenci č.45 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 45:

CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG 20 (2) informace pro sekvenci č.46 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 46:

TGGCCTCGCA GATGAGTTTA 20 (2) informace pro sekvenci č.47 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 47:

CCTTTGTTCT CGATGGTCAC 20 (2) informace pro sekvenci č.48 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 48:

TGTGGAGGAC AGGTTCTTCA 20 (2) informace pro sekvenci č.49 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc *= syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	,ant i - sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 49: ACTTTGAGAA GCCGAGGAGA	20
informace pro sekvenci č.50 :
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A)	délka: 20 párů basí
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	typ řetězce: jednoduchý
(D)	topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence; SEQ ID No: 50: AGATCCCTGT GAGTCACAGT	20

(2) informace pro sekvenci č.5l :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 51:

AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA 20 (2) informace pro sekvenci č.52 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basi (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA” (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 52:

TGAAGCCACT GCACACTGAT 20 (2) informace pro sekvenci č.53 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA

(iii) Hypotetická: ne
(iv)	an t i-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 53: AGTTCCATTC CTCCTCTGTC	20

(2) informace pro sekvenci č.54 :

(i) Sekvenční charakterištiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 54:

TGTGTCAGAC ATGATCAGGG 20 (2) informace pro sekvenci č.5 5 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc - syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 55:

TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG 20 (2) informace pro sekvenci Č.56 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (G) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 56:

CTTGGAGATC AAGCCTCCAT 20 (2) informace pro sekvenci č. 57 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne
(xi) Popis sekvence: SEQ ID No: GCTGAGGATC TGGGAGTTTA	57:
informace pro sekvenci č.58 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 58:

GATGCTGCAC CAACTGTATC 20 (2) informace pro sekvenci č.59 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 59:

CGACAAAATG GCGTCCTGAA 20 (2) informace pro sekvenci Č.60 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

(A) (iii) (iv)	Popis: /desc = Hypotetická: ne anti-sense: ne	syntetická DNA
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 60: ACGTTGACCA AGGACGAGTA	20

(2) informace pro sekvenci č.61 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 61:

ATCTGCAAGA GATGGAGGCT 20 (2) informace pro sekvenci č.62 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 62:

ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA 20 (2) informace pro sekvenci č.63 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická	DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ id No: CCGGAGGAAC ATGTGTACTT	63:	20
(2) informace pro sekvenci č.64 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 64:

TCGTTCATAC TCGTCCTTGG 20 (2) informace pro sekvenci č.65 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotet i cká: ne (ivj anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 65:

CATCTCAGGA CCTTTGTCTC 20 (2) informace pro sekvenci č.66 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc - syntetická DNA
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 66: CACCTGTCCT GGGGTTATTT	20

(2) informace pro sekvenci č.67 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 67:

AGACAAGATG AAGACCCACC 2 0 (2) informace pro sekvenci č.68 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 68:

AAGCGACGAT TCTTGCTGAC 20 (2) informace pro sekvenci č.69 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 69:

ATATCTCTGA TCCCACCTCC 20 (2) informace pro sekvenci č.70 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 70:

GAAÁTGCGAT CCTGTGGAAG 20 (2) informace pro sekvenci č.7l :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc - syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) ant i-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 71:

CTATACCACT ATGGTCCCAC 20 (2) informace pro sekvenci č.72 :

rf (i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 72:

AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT 20 (2) informace pro sekvenci č. 73 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne {iv) aht i-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 73:

TAGAGGTAAC TCGGGTACAC 20 (2) informace pro sekvenci č.74 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární

100 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc ~ syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 74:

AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA 20 20 (2) informace pro sekvenci č.75 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	Popis: /desc = syntetická	DNA”
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	anti-sense: ne
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: GGTGGCAGTA ACAACCTGAT	75:	20

(2) informace pro sekvenci č.76 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 20 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne

101 (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 76:

CATGATACCT AAGTGGGACC 20

informace pro sekvenci č.77 :
(i) Sekvenční charakteristiky: (A) délka: 37 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A) (iii) (iv)	Popis: /desc = syntetická Hypotetická: ne anti-sense: ne	DNA
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID No: 77: GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT GTT

(2) informace pro sekvenci č.78 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 35 párů basi (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 78:

GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA (2) informace pro sekvenci č.79 :

102 (i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 35 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (iii) Hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 79:

TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC (2) informace pro sekvenci č.80 :

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 28 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /desc = syntetická DNA (ii|) ^ypo^e^ic^: pe (j.v) anti-sense: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 80: CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC

FIG 1.

SV40polyA

TTTTTTT-Cl·^

Hind IIIV*/ J --_-^AAAAAA

_Apf SV40polyA

FIG.2·

DESIGN PRIMERS ΤΟ FLANK GENE OF INTEREST

SP Sfructural gene | PCR amplificafion of cDNA L Chain J chain

H chain c DNA

I Ligafion into.pCRB

Claims (35)

1. Rekombinantní protein obsahující alespoň jeden region korespondující variabilnímu regionu imunoglobulinu, kde tento alespoň jeden region umožňuje proteinu rozpoznat a specificky vázat antigen, kde antigenem je lidský Fas, a kde protein nemá v podstatě vyšší imunogenicitu u lidských pacientů než lidská protilátka.

2. Protein podle nároku 1, který se skládá v podstatě z pouze jednoho variabilního regionu.

3. Protein podle nároku 1, který se skládá v podstatě ze dvou variabilních regionů, jednoho variabilního regionu korespondujícího s variabilním regionem H řetězce a druhého s variabilním regionem L řetězce.

4. Protein podle nároku 1 nebo 3, kde jsou variabilní regiony spojeny flexibilní peptidovou vazbou.

5. Protein podle nároků 1,3 nebo 4, který má alespoň dva variabilní regiony, kde jsou variabilní regiony odvozeny od jedné monoklonální protilátky.

6. Protein podle nároku 5, kde jsou variabilní regiony integrálně navázány na lidské konstantní regiony.

7. Protein podle nároku 5 nebo 6, ve kterém variabilní regiony korespondují buď variabilnímu regionu H řetězce, nebo variabilnímu regionu L řetězce, a jsou jednotlivě vázány na konstantní region H řetězce nebo konstantní region L řetězce, podle příslušnosti.

104

8. Protein podle jakéhokoliv z nároků 5 až 7, ve kterém jsou variabilní regiony každý příslušnou částí většího polypeptidů a dva polypeptidy asociují za tvorby heterodimeru protilátky.

9. Protein podle jakéhokoliv z nároků 5 až 8, kde jsou variabilní regiony buď identické, nebo těsně korespondují s variabilními regiony CHll.

10. Genetickým inženýrstvím zpracovaný imunoglobulinový protein, který se specificky váže na lidský Fas, kde se imunoglobulinový protein skládá z podjednotky H řetězce a podjednotky L řetězce, kde se podjednotka H řetězce skládá z aminokyselinové sekvence representované následujícím obecným vzorcem (I) :

-FRH -CDRH -FRH -CDRH -FRH -CDRH -FRH - (I)

X X 2 2 3 3 4 kde FRH^ representuje araiiioky sel inovou sekvenci obsahující 13 až 30 aminokyselinových residuí, CDRH_x representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.l, FRH₂ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 14 aminokyselinových residuí, CDRH₂ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.2, FRH₃ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 32 aminokyselinových residuí, CDRH₃ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.3, a FRH₄ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 11 aminokyselinových residuí, kde každá aminokyselinová sekvence je navázána na druhou prostřednictvím peptidové vazby.

kde se uvedená podjednotka L řetězce skládá z aminokyselinové sekvence representované následujícím obecným vzorcem (II):

-FRL -CDRL -FRL -CDRL -FRL -CDRL -FRL - (II)

1 1 2 2 3 3 4 kde FRL^ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 23 aminokyselinových residuí, CDRL_i representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.4, FRL₂ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 15 aminokyselinových residuí, CDRL₂ representuje

105 aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO. 5, FRL₃ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 32 aminokyselinových residuí, CDRL₃ representuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.6, a FRL₄ representuje aminokyselinovou sekvenci obsahující 10 aminokyselinových residuí, kde každá aminokyselinová sekvence je navázána na druhou prostřednictvím peptidové vazby.

11. Protein podle nároku 10, kde podjednotka H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č.l až 116 SEQ ID NO. 8.

12. Protein podle nároku 10 nebo ll, kde podjednotka L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č.l až 112 SEQ ID NO. 10.

13. Protein podle nároku 11 nebo 12, kde podjednotka H řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č.l až 571 SEQ ID NO. 8.

14. Protein podle nároku 11, 12 nebo 13, kde podjednotka L řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou aminokyselinami č.l až 219 SEQ ID NO. 10.

15. RNA kódující protein podle jakéhokoliv z předchozích nároků.

16. DNA kódující protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 14.

17. DNA kódující peptid vzorce (I) jak je definován v nároku 10.

18. DNA podle nároku 17, která obsahuje nukleotidovou sekvenci representovanou nukleotidy č. 58 až 405 SEQ ID NO.7.

19. DNA, která hybridizuje s DNA podle nároku 18, kde sense řetězec koresponduje k hybridizující DNA kódující podjednotku H řetězce imunoglobuliniys^ópnou specifické vazby na lidský Fas spolu s podjednotkou L řetězce, obsahující aminokyselinovou sekvenci obecného vzorce (II), jak je definována v nároku 10.

106

20. Hybridizující DNA podle nároku 19, která hybridizuje při 60 až 70 °C a v 6 x SSC.

21. DNA kódující pro podjednotku L řetězce, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci representovanou obecným vzorce (II), jak je definován v nároku 10.

22. DNA podle nároku 21, která obsahuje nukleotidovou sekvenci representovanou nukleotidy č. 58 až 393 SEQ ID NO.9.

23. DNA, která hybridizuje s DNA podle nároku 22, kde sense řetězec koresponduje k hybridizující DNA kódující podjednotku L řetězce imunoglobulinu schopnou specifické vazby na lidský Fas spolu spodjednotkou H řetězce, obsahující aminokyselinovou sekvencí obecného vzorce (I), jak je definována v nároku 10.

24. Hybridizující DNA podle nároku 23, která hybridizuje při 60 až 70 °C a v 6 x SSC.

25. Vektor obsahující DNA podle jakéhokoliv z nároků 16 až 24.

26. Vektor podle nároku 25, který je expresním vektorem.

27. Vektor vybraný z pCR3-H123 a pCR3-L103.

28. Hostitelská buňka transformovaná expresním vektorem podle jakéhokoliv z nároků 25 až 27.

29. E.COli pCR3-H123 (FERM BP-5247).

30. E.COli pCR3-L103 (FERM BP-5248).

31. Způsob produkce imunoglobulinového proteinu který specificky rozpoznává lidský Fas antigen, který obsahuje kultivaci buněk podle jakéhokoliv z nároků 28 až 30 za podmínek, které umožňují expresi DNA kódující podjednotku H řetězce nebo L řetězce

107 obsaženou ve vektoru-^ a odběr imunoglobul inového proteinu z kultury.

32. Použití CDR vybraných ze CDRH_x, CDRH^, CDRH₃ a CDRL_x, CDRL^ CDRL₃, jak je definováno v nároku 10, a jejich kombinaci, v konstrukci humanizovaných protilátek.

33. Použití DNA kódující CDR vybrané z CDRH_x, CDRH^, CDRH₃ a CDRL_x, CDRL₂, CDRL₃, jak je definováno v nároku 10, a jejich kombinací, v konstrukci DNA kódující humanizované protilátky.

34. Použití proteinu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 14 v přípravě léčiva pro léčbu autoimunitních chorob.

35. Použití podle nároku 34, ve kterém je autoimunitní chorobou revmatismus.