CN1167115A - 抗Fas重组抗体和其DNA - Google Patents

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Abstract

一种重组蛋白质至少含有一个对应于特异于人Fas的免疫球蛋白可变区的区域并且实质上它在人体中具有的免疫性并不比人抗体高，并且可用于治疗自身免疫疾病，尤其是风湿症。

Description

抗Fas重组抗体和其DNA
本发明是有关抗Fas特别是人的Fas的重组抗体及编码所述抗体的DNA。本发明进一步涉及含有这些抗体和用于治疗包括类风湿关节炎的自身免疫疾病的药物制剂，该制剂进一步可任意地包含一种细胞生长抑制剂。本发明还涉及抗Fas互补决定区(CDR’S)和它们在制造这些抗体时的作用，以及编码这些CDR’S的DNA。
在自然发生过程中活有机体中的细胞的生理学死亡被称为细胞程序死亡(apoptosis)，它有别于细胞病理学死亡，也即坏死[c.f Kerr et al(1972).Br.J.Concer，26，239，et seq]细胞程序死亡是程序化的细胞死亡的一个例子，它是在自然发生过程中，一个活有机体中某些细胞程序性演变为死亡，如当这些细胞已经执行了一个预定功能时。细胞程序死亡的特征在于形态学的变化，象弯曲的细胞表面，浓缩的核染色质和成片段的染色体DNA和其它等等。
细胞程序死亡在T和B淋巴细胞分化过程中识别自身抗原的细胞的部署中起了一个重要作用。所谓的自身免疫疾病的开始，一般是由淋巴细胞分化过程中细胞程序死亡的失败导致的出现自身反应性淋巴细胞而引起的[见KeiichiNakayama et al，(1989)，Mebio 12(10)，79-86]。
Fas是参与免疫活性细胞的细胞程序性死亡的细胞膜分子[c.f.Yoneharra，S.et.al，(1989)，J.Exp.Med 169，1747 et seq，Trauth，B.C.，etal，(1989)，Science 24，301 et Seq.and Itoh.N.，et al，infra)]。抗人Fas抗原的鼠单克隆抗体已经产生[C.f，Itoh，N，et.al，(1991)，Cell 66，233-243和Yonehara，出处同上，公开了一个对人Fas有特异性的定名为CH11的单克隆抗体]，这些抗人Fas抗体具有诱导细胞程序性死亡的细胞毒素活性，并被建议作为自身免疫疾病如AIDS和肿瘤的潜在治疗药剂、[c.f.日本未审查专利公开号Hei2-237935和日本未审查专利PCT公开N O.Hei 5-503281]Ogasavwara et al，[Nature(1993)，364，806-809]报道了鼠抗Fas抗体快速杀死野生型鼠，证据是肝中存在大量的细胞程序性死亡。
抗人Fas的单克隆抗体也可以从下面的出版物中得知：J.Exp.Med.(1989)，169，1747-1756；WO91/10448；Science(1989)，245，301-305；cell(1991)，66，233-243；J.Imm.(1992)，149，3166-3173；Internat.Immun，(1994)，6，(12)1849-1856。
风湿症，特别是类风湿关节炎，确信是由滑膜细胞的增生，伴随着各种免疫学异常所导致的，滑膜细胞的增生典型地伴随着发炎细胞的浸润和骨的腐蚀，慢性类风湿关节料的受影响的关节周围的组织腐蚀明显地是由发炎的滑膜细胞的细胞因子的不正常产生引起的，对有风湿的病人的关节的检查发现了滑膜细胞的不正常增生，滑液绒毛的增生，多层滑液细胞，等等。[c.f.Daniel J.Mc Carty(1985)，在“关节炎和相关的症状，风湿病学的一本课本”第10版，Lea和Febiger]，风湿症的药疗法目前主要包括抗发炎的药物象甾类和免疫调节剂，如果能够抑制滑膜细胞的不正常增生，那么任何这样的试剂应该在治疗风湿上是有用的。
风湿症的滑膜细胞不是以无限制的方式增生的[c.f.Daniel J.Mc Carty(1985)，在“关节炎和相关的症状，风湿病学的一本课本”中，第10版，Lea和Febiger]。已经证明，细胞程序死亡存在于有风湿症的病人的滑膜细胞中。在滑膜细胞的膜中Fas抗原被表达，Nakajima et al[Nakajima，T.et al，(1995)Arthritis Rheum，38，485-491]和Aono et al.[日本风湿症学会第38次会议概要(1994)，P.487和日本癌症学会1994会议的文章，1994，P.388]研究了是否细胞毒素的抗人Fas抗体能够在风湿症的病人的不正常增生的滑膜细胞中诱导。与含有非风湿症疾病的病人的滑膜细胞的一个对照比较，它们能在风湿症病人的不正常增生的滑膜细胞中诱导高水平的细胞程序死亡。
所以，抗人Fas抗体能有选择地不仅在淋巴细胞而且在不正常增生的滑膜细胞中诱导，所以作为抗风湿剂，抗人Fas抗体应该是有用的。然而，由于鼠起源引起的抗原性，作为打算慢性给药的一个药学制剂对人的鼠单克隆抗体的给药很可能引起各种问题。很可能发生过敏性休克，并且重复的剂量可能减弱效能或加快血液水平的还原作用等等，如果抗体将用于临床实践，这些效果是不合乎需要的。
克服与鼠单克隆抗体关联的这些问题的努力包括为了获得嵌合抗体利用重组DNA技术，也即用对应的人抗体的不变区代替小鼠抗体的不变区，[c.f.Morrison，S.L，et al(1984)，proc.Natl.Acad.Sci.USA.81，6851-6855]。在鼠抗体人类化的一种可选择的方法中，在小鼠抗体的可变区存在的鼠CDR[c.f.Jones，P.T.，et al，(1986)，Nature，321，522-525]在一个基本相当过程中被插入人抗体中。为了制备这样一个遗传工程抗体，首先必须克隆编码组成小鼠抗体的H和L链亚基的DNA。这些链专一地识别靶抗原，所以阐明它们的序列揭露了含有CDR的可变区的一级结构，并且这能够用于使成为人抗体的制备。
目前，还没有揭露一个细胞毒素的小鼠抗人Fas单克隆抗体的CDR的任何部分，或者由此的一个DNA序列。
提供编码抗体可变区的一个或更多的核苷酸序列是本发明一个主题，并且这允许构建对人Fas特异性的人类化的抗体。
所以，首先的一个方面，本发明提供一个重组蛋白，所说的蛋白质含有对应于一个免疫球蛋白可变区的至少一个区，其中所说的至少一个区能使所说的蛋白质识别并专一地结合于一个抗原，即人Fas抗原，其中所说的蛋白质在人类病人中实际上没有比一个人抗体更高的致免疫力。
本发明其它的主题，目的，方面，和实施方案将在下面阐明。
图1是构建一个能够克隆编码CH11的每个亚基的总长度的DNA的cDNA文库的图解；
图2是一个显示克隆和扩增编码每个CH11亚基的总长度的DNA的过程的图解。
正如这里所用的，术语“重组”相关于通过遗传工程获得的任何物质，该物质的范围是从原始物质修饰而来或者是以不同于原始的一个方式或一个系统表达。
术语“蛋白质”一般相关于通过肽键连接的氨基酸残基的任何序列，可能包括寡肽和多肽和多体的肽或多肽集合。
对应于一个免疫球蛋白可变区的区域有一个免疫球蛋白可变区特征的结构，并且可能对应于一个免疫球蛋白的H链或L链的可变区。在优选的实施方案中，本发明的蛋白质有至少两个这样的区域，一个对应于H链可变区，一个对应于L链可变区，两者专一于人Fas。
由于对应于一个异源不变区的抗体部分是不存在的事实，本发明的蛋白质在一个人类病人中实际上没有比人抗体更高的致免疫力，所以，本发明的蛋白质可能有一个可变区或者起源于一个鼠单克隆抗体的区域，但是鼠不变区已经被删除。由于鼠可变区是充分相似于人的，以致于任何致免疫力的上升水平只能来自于任何其它可变区是一个部分的氨基酸序列的事实，作为一个结果，本发明的蛋白质对病人仅具有相同于例如来自一个可选择起源的人抗体的致免疫力水平。
本发明的可变区可能起源于可能产生针对人Fas抗体的任何资源，虽然最方便的是小鼠，但是其它资源，象大鼠和兔子，也是可能的，尽管这些和更高等动物趋向于不太方便。
本发明的可变区可能以任何合适的构型存在于蛋白质中，最简单的是，蛋白质可能基本上只含有一个可变区，尽管这样的蛋白质效能趋向于被大大地减弱。部分地，这是由于缺乏三级结构的稳定性，尽管仍可以观察到结合。
在一个更高的水平，蛋白质可能基本含有联合在一起的一个H链可变区和一个L链可变区。这种联合可以是直接连接，或者可以是包含一个或更多额外氨基酸残基的一个灵活的肽链形式。这些结构具有的优点是它们没有额外的肽序列产生潜在的致免疫力。
虽然本发明的蛋白质可能只有一个可变区，但更可取的是有至少两个。进一步，更可取的是两个起源于一个特殊的抗体，如CH11，每个各自来自于H和L链，从而更接近仿效一个天然抗体。在这个方面，可变序列完整地连接于人的不变区，特别是适当的来自H和L链的不变区更为合乎需要。
在上面的实施方案中，两个可变区分别为一个大的多肽的一个部分更为可取，并且两个多肽联合形成一个抗体杂二聚体。
抗体的特性对本发明不是关键的，可以是任何适当的形式，只要本发明的蛋白质确实对应于一个抗体型式。例如，型式可以是IgG，IgM或IgE，并且型式可以完全依赖于给药途径，例如，虽然CH11是一个IgM分子，但其可变区也可放入IgG结构。实际上，我们已经发现，如果利用一个IgM型结构，但没有J链，形成一个带有5个重和轻链对的五聚物抗体结构，则细胞程序死亡活性增加了五倍或更多。
更可喜的是本发明进一步提供编码任何上述鉴定的蛋白质的DNA和RNA，特别是DNA。所说的DNA可能简单编码蛋白质或者例如如果蛋白质是杂二聚的，则可能编码一个特殊的多肽。
同样可喜的是DNA可以是任何适当的形式，以致它能够插入一个载体，一个合适的表达载体。它也可以与任何其它合适的序列联合，如先导序列或表达例如融合蛋白型式的编码蛋白的序列。
本发明进一步设想了一个用上述定义的载体转化了的一个寄主细胞，和一个含有这样的一个用含有上述DNA的一个或更多的表达载体转化了的寄主细胞的表达本发明的一个蛋白质的系统。通过标准技术，在培养该系统后，从该系统能获得本发明的蛋白质。
下面是本发明某些优选的方面和实施方案：
一个遗传工程免疫球蛋白专一地与人Fas结合，其中免疫球蛋白基本上含有一个H链亚基和一个L链亚基，H链亚基含有一个氨基酸序列，以下面的通式(I)代表：
-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-                                 (I)
其中FRH1代表含有13到30个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRH1代表SEQ ID NO.1的氨基酸序列，FRH2代表含有14个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRH2代表SEQ ID NO.2的氨基酸序列，FRH3代表含有32个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRH3代表SEQ ID NO.3的氨基酸序列，FRH4代表含有11个氨基酸残基的一个氨基酸序列，每一个氨基酸序列通过一个肽键与下一个相连；L链亚基含有一个以下面的通式(II)表示的氨基酸序列：
-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-                                (II)
这里FRL1代表含有23个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRL1代表SEQ ID NO.4的氨基酸序列，FRL2代表含有15个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRL2代表SEQ ID NO.5的氨基酸序列，FRL3代表一个含有32个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL3代表SEQ ID NO.6的氨基酸序列，FRL4代表含有10个氨基酸的一个氨基酸序列，每个氨基酸序列通过一个肽键与下一个相连。
当H链亚基含有SEQ ID NO.8中氨基酸NO.1到116代表的氨基酸序列，和/或其中L链亚基含有SEQ ID NO.10中的氨基酸NO.1到112代表的氨基酸序列时，上面的蛋白质是优选的。
当H链亚基含有SEQ ID NO.8中氨基酸NO.1到571代表的氨基酸序列，和/或L链亚基含有SEQ ID NO.10中NO.1到219氨基酸代表的氨基酸序列时，上面的蛋白质更优选。
本发明进一步提供编码含有上面通式(I)定义的肽的一个H链亚基的DNA。我们喜欢这样的DNA，当它含有SEQ ID NO.7中核苷酸NO.58到405代表的核苷酸序列。
同样优选的是与这样的DNA，即编码与一个含有通式(II)的氨基酸序列的L链亚基一起的能专一地结合人Fas.的免疫球蛋白H链亚基的有意义链杂交的DNA。优选的是这样的DNA能够在60°至70℃时和在6XSSC中杂交。
编码含有通式(II)代表的氨基酸序列的L链亚基的DNA也是优选的，特别是当它含有SEQ ID NO.9中核苷酸NO.58到393代表的核苷酸序列时。与这样的DNA，它的对应的有意义链编码与上面定义的含有通式(I)的氨基酸序列的H链亚基一起专一地与人Fas抗原结合的免疫球蛋白L链亚基，杂交的DNA也是优选的，特别是其中杂交是在60°到70℃时和6XSSC中进行。
更优选的是含有上面叙述的任何DNA的一个重组DNA载体，特别是重组DNA载体PCR3-H123和PCR3-L103，用这样的载体转化了的细胞和特别是E.coli pCR3-H123(FERM BP-5247)和E.coli pCR3-L103(FERMBP-5248)。
一个生产专一地识别人Fas抗原的免疫球蛋白蛋白质的优选的方法包括：
在能够表达包含在载体中的编码免疫球蛋白H链或L链亚基的DNA的条件下培养被一个上面叙述的DNA载体转化的细胞，和从培养物中回收免疫球蛋白。
本发明进一步设想CDR’S，不管是否与上面鉴定的框架区(FR’S)连接，和编码它的DNA在有选择地结合人Fas的人类化的抗体和蛋白质的一般构建中的应用。
基本上，我们现已经成功地克隆了编码一个抗人Fas，IgM单克隆抗体中的各H、L和J链的基因。利用一个从产生抗体的杂交瘤制备的cDNA文库，有可能阐明每个基因的整个核苷酸序列和它们对应的氨基酸序列。从这些，获得H和L链的CDR序列是可能的。构建含有H、L、J链的表达载体，发现与抗人Fas抗体有相同活性的细胞毒素蛋白质是可以从用这些载体协同转染的培养的动物细胞获得的培养物上清液中获得的。
本发明的DNA可以通过首先从产生抗人Fas单克隆抗体象CH11的小鼠杂交瘤细胞制备poly(A)+RNA得到。利用一个逆转录酶并纯化编码抗体的H、L和有选择地J链的cDNA，poly(A)+RNA可以转变成cDNA。Yonehara et al.[(1989)，J Exp，Med 169，1747 et seq]通过在用表达Fas的人二倍体成纤维细胞系FS-7免疫小鼠之后融合小鼠骨髓细胞与小鼠淋巴细胞，得到一个抗人Fas单克隆抗体，命名为CH11。CH11抗体可以从日本的MedicalBiological Laboratory Co.Ltd买到。
Poly(A)+RNA可以通过首先制备总RNA，然后用一个低聚(dT)纤维素，低聚(dT)胶乳珠等填充的亲和柱，从总RNA纯化Poly(A)+RNA的方法获得，或者可以利用上面叙述的亲和物质直接从细胞溶胞产物纯化poly(A)+RNA获得。总RNA可以用这样的方法制备：碱性蔗糖密度梯度超速离心[c.f.Dougherty，W.G.和Hiebert，E.，(1980)，Virology，101，466-474]，硫氰酸胍-酚方法；硫氰酸胍-三氟化铯方法；和酚-SDS方法。然而，优选的方法是硫氰酸胍和氯化铯[c.f.Chirgwin，J.M，et al.(1979)，Biochemistry，18，5294-5299]。
用上面叙述的逆转录酶获得的单链(SS)cDNA可以转化成双链(ds)cDNA，获得dscDNA的适当方法包括S1核酸酶方法[c.f.Efstratiadis，A.，et al(1976)，cell，7，279-288]和Gubler-Hoffman方法[c.f.Gubler，U.和Hoffman，B.J.(1983)，Gene，25,263-269]。然而，优选的方法是Okayama-Berg方法[c.f.Okayama.H.和Berg，P.(1982)，Mol，cell，Biol.2,161-170]。
上面获得的dsCDNA可以整合进一个克隆载体并且所产生的重组载体可以转化到象E.Coli的适当微生物中。利用一个标准方法，象筛选重组载体编码的四环素抗性或氨苄青霉素抗性，可以筛选转化体。如果用到E.Coli，转化可能被Hanahan方法[c.f.Hanahan，D.(1983)，J.Mol.Biol.，166，557-580]影响。可选择地，重组载体可以导入通过共同暴露于氯化钙和氯化镁或氯化铷制备的感受态细胞中。如果把一个质粒用作载体，为了利于筛选，质粒含有上面提到的药物抗性基因是非常合乎需要的。蛮横力筛选是可能的，但不是优选的。虽然已经讨论了质粒，但是可使用其它克隆载体，象λ噬菌体，是可预料到的。
筛选具有所希望的DNA的转化体的方法包括如下：
(1)利用一个合成的低聚核苷酸探针筛选。
如果所希望的蛋白质的所有或部分氨基酸序列已经阐明，那么也代表所希望的蛋白质的一个短的连续的序列可以用于构建一个低聚核苷酸探针。探针编码氨基酸序列，但是，由于遗传密码的简并性，可能制备大量的探针。所以正常地筛选只能被有限数目的低聚核苷酸编码的一个氨基酸序列。通过任何四个正常碱基都能用的肌苷的替代可以进一步减少必须生产的低聚核苷酸的数目。用32p，35s或生物素适当标记探针，然后与固定在一个硝酸纤维素滤膜上的转化体中的变性的，转化的DNA杂交。通过检测探针的标记，显示出阳性菌落。
(2)聚合酶链式反应
如果所希望的蛋白质的全部或部分氨基酸序列已经阐明，那么通过上面(1)叙述的方法，可以合成对应于该氨基酸序列的分开的非连续部分的有意义或反义低聚核苷酸引物。利用模板DNA这些引物可以用于聚合酶链式反应技术[c.f.Saiki，R.K.et al，(1988)，Science，239，487-491]。这里所用的模板DNA可以是利用从产生抗人Fas抗体的象表达CH11的杂交瘤得到的mRNA的一个逆转录酶反应合成的cDNA。这样合成的DNA片段可以直接整合进入一个质粒载体，象通过利用一个商品试剂盒，或用32P，35s或生物素标记，然后用作菌落杂交或噬斑杂交的探针来获得所希望的克隆。
单克隆抗体CH11是一个免疫球蛋白M(‘IgM’)分子，一个含有H(μ链)，L链和一个J链的各五个亚基的复合物，所以，为了阐明亚基的部分氨基酸序列，亚基必须分开，这可以用象电泳、柱层折等，本领域的技术人员熟知的适当的技术进行。一旦亚基分开，为了确定至少每个亚基N末端的氨基酸序列，它们可以通过象自动蛋白质序列仪(例如，PPSQ-10，Shimadzu)进行测序。利用这一知识可以生产低聚核苷酸/引物。
编码来自上面获得的适当的转化体的抗人Fas单克隆抗体的每个亚基的DNA的收获可以通过已知的技术，象Maniatis，T.，etal[in“分子克隆实验室手册”Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1982)]述说的，进行。例如，在从已经确定拥有必须质粒的转化体中分离得到对应于载体DNA部分之后可以从质粒DNA上切下编码所希望的亚基的DNA区域。
用上面叙述中制备的，含有编码CH11重，轻和J链的DNA的质粒转化E.coli DH5α，根据存放微生物的Budapest条约的条款，在1996年2月28日，已经将所产生的三个转化体[分别命名为E.Coli pCR3-H123，E.ColipCR3-L103和E.Coli pCR3-J1123]存放在工业科学和技术部的生命科学技术研究院，并且分别指定的保藏号为FERM BP-5427，FERM BP-5428和FERM BP-5429。含有这些质粒的E.Coli DH5α可以以一个直接与不拥有这些质粒的E.Coli DH5α相比较的方法培养。通过对氨苄青霉素的抗性，可以筛选所有存放菌株。因此，利用这些存放物可以荻得本发明的DNA。这可以通过培养存放物并分离质粒，或者通过利用质粒作为模板的聚合酶链反应(PCR)进行。
无论是否合适，DNA序列一般可以通过各种本领域已知的方法进行序列分析，例如，Maxam-Gilbert化学修饰技术[c.f.Maxam，A.M和Gilbert.W.(1980)在“酶学方法”65，499-276]和利用M13噬菌体的双脱氧链终止方法[c.f.Messing.J.Vieira，J.(1982)，Gene，19，269-276]。最近几年，序列分析DNA的一个进一步的方法获得广泛接受，包括在双脱氧方法中利用荧光染料代替传统的放射性同位素。整个过程是计算机化的，包括电泳后的核苷酸序列阅读，这一过程的合适的机器是，例如：perkin-Elmer序列分析自动仪“CATALYST800”和Perkin-Elmer型373ADNA序列仪。利用这一技术使DNA核苷酸序列的测定有效而安全。
因此，从确定编码CH11的H和L链的DNA核苷酸序列，联合H和L链的N末端序列数据有可能确定CH11的H和L链的整个氨基酸序列。
构架区(FR’S)存在于免疫球蛋白的H和L链的可变区，侧接可变区并且分开CDR’S。因此，在每个可变区与CDR’S的数目相比存在有一个以上的FR。构架区也作用于可变区的三维结构，从而通过固定该区域的三级结构辅助抗原结合。通过对应用于可变区的每个FR和CDR的命名法的解释，FRH1是H链的可变区的N-末端的构架区，朝着C-末端，分别导CDRH1，FRH2，CDRH2，FRH3，CDRH3，最后是FRH4。一个同样的命名法应用于L链，所以第一个构架区命名为FRL1等等。
免疫球蛋白H和L链含有一个可变区和一个不变区。可变区由CDR’S组成，如上所述，H链和L链有三个相互联系的CDR’S并侧接四个构架(FR)区。不变区的氨基酸序列是相同的，不论它识别何种抗原，对于H和L链分别也是如此，只要免疫球蛋白类型是相同的。相反，可变区的氨基酸序列，特别是CDR’S对每个抗体都是特殊的。然而，根据许多抗体的氨基酸序列的比较研究，CDR’S的定位和连接它们的构架(FR)序列的长度在同一亚群的抗体亚基中最终是不变的[kabat，E.A.et al(1991)，在“Sequenceof proteins of immunological Interest Vol.II”U.S，健康与人服务部]，有了这些知识，通过比较我们确定的氨基酸序列和已知的氨基酸序列，可以确定CH11的CDR’S，构架区和H和L链的每个不变区的定位。
可预料的是构架区对分开CDR’S和辅助测定可变区的空间结构是重要的，但是，如果满足了这些要求之后，每个构架区的真正的大小和序列对本发明不是关键的，前提是FR’S不负责结合抗原。从而，任何适当的氨基酸序列都适用于每个FR。然而，已经发现，构架区一般是天然保守的，由于这个原因，我们一般优选保留这些区，它们与CH11中发现的区域是相同的或密切相关的(Yonehara et al，出处同上)。
虽然构架区的链的长度一般是保守的，特别是在免疫球蛋白亚型中，但是已经确定，定位于H链的N-末端的FRH1，有时可能比期望的更短，所以，在鼠IgM中，不是30个氨基酸，FRH1可能短至13个氨基酸，并且，已经确定了CH11的μ2a亚型有一个最小长度为19个氨基酸[c.f.kabat et al.ibid]。因此H链N-末端的构架区的链长可能在13和30个氨基酸之间，这个范围优选的是19到30个氨基酸并且最优选的是30个氨基酸。
一般地说，可预料的是在可变区两端的构架区(在H链的FRH1和FRH4)比真正连接CDR’S的间隙构架区(H链的FRH2和FRH3)不太重要，从而，侧接构架区可以在给定的抗体类型的标准长度上变化达大约60％，而间隙构架区只能变化大约一个氨基酸的有限范围，在有些情况下，任何长度上的变化，可能导致事实上的效能的减弱，技术熟练的人容易确立任何给出的可变区结构的必需参数，如果期望构建一个改变的序列，其中在氨基酸序列中删除一个或更多的氨基酸，那么可以用到盒子突变方法，例如[c.f.Toshimitsu，Kishimoto，“Shin-Seikagaku.Jikken Konza(新生化实验系列)II：核酸III，重组DNA技术”，pp242-251]。
任何适当的氨基酸序列都可以连结于每个可变区的C-末端，它们对抗体的抗原结合能力没有不利影响。除非形成一个前体分子，例如形成一个领导序列，一般来说，有一个C-末端序列，我们宁可它对应于适当的H或L链的一个人的不变区。
本发明的DNA可以通过任何合适的方法制备，象利用传统方法的化学合成，象磷酸三酯方法[c.f.Hun kapiller，M.，et al(1984)Nature，310，105-111；和Grantham，R.et al.(1981)Nucleic Acids Res.9，r43-r74]。氨基酸的各种密码子是已知的，它们的选择总的来说是任意的，虽然，一般优选的是根据所选择的宿主利用密码子的频率来作选择，如果利用不是直接的化学合成的一种技术，那么可以期望部分修饰所获得的序列的密码子，并且这可以通过位点特异性诱变，用以引物，掺入所期望的修饰的合成的低聚核苷酸产生影响[c.f.Mark.D.F.et al(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662-5666]。
在本发明中，特别的是DNA可以和其它DNA杂交，它可以通过本领域熟知的技术进行。例如，为了确定是否某一序列与任何其它给定序列杂交，可以用任意引物方法[c.f.Feinberg A.P和Vogelstein，B.(1983)，Anal，Biochem.，132，6-13]或缺口转移方法[Maniatis，T.，et al，(1982)在“分子克隆手册”Cold spring Harbor Laboratory，N.Y]，用例如[α-32p]dCTP标记一个或其它序列，用于杂交试验的一条DNA链被合适地吸收于，例如，一个硝酸纤维膜或尼龙膜，并通过传统方法的加热或UV照射固定在那里，在一个特殊的实施方案中，膜被浸在含有6xssc，5％(V/V)Denhardt′s溶液和0.1％(w/v)SDS的预杂交溶液中，并在55℃温育4小时以上。其它，标记链被加入预杂交溶液中使最终比活为1×106cpm/ml并60℃温育过夜。然后，用6xssc在室温下洗膜5次，每次5分钟。在进一步57℃洗膜20分钟之后，对膜进行放射自显影来确定是否发生杂交，从而与本发明的DNA杂交的DNA可以制备并分离，[Maniatis，T.et al.(1982)在“分子克隆手册”Cold spring Harbor Laboratory，NY]。
本发明的DNA的整合，从而进入一个表达载体，从而能转化原核或真核宿主细胞，这样的表达载体典型地含有参与基因表达的适当的启动子，复制位点和序列，从而使DNA在寄主细胞中表达。
合适的原核生物寄主细胞包括例如，E.Coli，和bacillus Subtilis，为了表达在这样的寄主细胞中的目的基因，可以用一个质粒载体转化这些寄主细胞，这一质粒载体含有一个起源于能与寄主相容的一个种类的复制子，并有一个复制原点和一个启动子序列象LacUV5，这些载体优选地具有能够给予被转化的细胞一个筛选表现型的序列。
E.Coli的一个适当的菌株是起源于E.coli K12的菌株JM109，适当的载体包括pBR322和pUC系列质粒，适当的启动子包括乳糖启动子(lac)和色氨酸乳糖启动子(trc)，一般地说，可喜的是本发明不限制于利用这里举例说明的寄主，载体，启动子等，并且任何合适的系统可以如所期望地被用到。
Bacillus Subtilis的一个合适优选的菌株是菌株207-25，一个优选的载体是pTUB228[c.f.Ohmura，K.，et al(1984)，J.Biochem，95.87-93]。一个合适的启动子是bacillus subtilisα-淀粉酶基因的调节序列，如果需要，编码α-淀粉酶信号的DNA序列可以连接到本发明的DNA上使能够胞外分泌。
合适的真核生物细胞寄主包括那些来自于脊椎动物，酵母等，合适的脊椎动物细胞包括，例如：猴子细胞系Cos[c.f.Gluzman，Y，(1981)，Cell，23，175182]，合适的酵母包括Saccharomyces cerevisiae和Schizosaccharomycespombe。
一般地说，脊椎动物细胞的合适的表达载体的要求包括：一个通常在所表达基因上游的启动子，一个RNA拼接位点，一个多聚腺苷酸位点，和一个转录终止序列等等。如所期望的，它可能另外含有必须的一个复制起点。一个合适的质粒是含有SV40早期启动子的PSV2dhfr[c.f.Subramani，S.，et al，(1981)，Mol.Cell.Biol.，1,854-884]。
合适的真核微生物是酵母，象S.Cerevisiae，酵母的合适的表达载体包括pAH301，pAH82和YEp51，合适的载体包括，例如，乙醇脱氨酶基因的启动子[c.f.Bennetzen.J.L和Hall，B.D.(1982)，J.Biol.Chem.，257，3018-3025]或羧肽酶YGAL10启动子[c.f.Ichikawa，K.et al(1993)，Biosci.Biotech.Biochem.57，1686-1690]。如果需要，编码羧肽酶Y的信号肽序列的DNA序列可以连接于所表达的DNA以便能够胞外分泌。
在COS细胞被用作寄主的情况中，合适的载体包括SV40复制起点，使能够自主生长，一个转录启动子，一个转录终止信号和一个RNA拼接位点，通过任何合适的方法表达载体可以用来转化细胞，象DEAE-葡聚糖方法[c.f.Luthman H和Magnusson，G.(1983)，Nucleic Acids Res.11，1295-1308]，磷酸钙-DNA协同沉淀法[c.f.Graham，F.L和Van der Eb，A.J(1973)，Virology，52，456-457]和电脉冲电泳法[c.f.Neumann，E.，et al，(1982)，EMBO J.1,841-845]，在一个优选的实施方案中，COS细胞被两个分开的表达载体共转染，一个含有编码一个包含CH11的H链的可变区的蛋白质的DNA，一个含有编码一个包含CH11的L链的可变区的蛋白质的DNA，这些载体被同时表达产生一个重组抗人Fas抗体。
用传统的方法可以培养本发明的转化体，所期望的蛋白质可以在细胞内或外表达，合适的培养基包括各种一般用到的培养基，并根据寄主的选择筛选，例如COS细胞的合适培养基包括RPMI-1640和Dulbecco′s改良的Eagle基础培养基，它补充所期望的胎牛血清(FBS)。培养温度可以是任何不明显抑制细胞蛋白质合成的适当温度，优选的范围是32℃到42℃，最优选的为37℃，特别是对哺乳动物细胞，如果是所期望的，在含有1-10％(v/v)的CO2的大气中培养较为有效。
根据蛋白质是否在细胞外或内表达，依赖考虑蛋白质的物理和化学特性，通过各种已知的分离方法可以分离和纯化本发明的转化体所表达的蛋白质。合适的专一的分离方法包括：用一般所用的蛋白质沉淀剂处理，层析的各种方法象超滤作用，分子筛层析(凝胶过滤)，吸收层析，离子交换层析，亲和层析和高效液相色谱(HPLC)，透析和由此的联合。
通过利用上述所述的方法，所期望的蛋白质可以容易地以高产量和高纯度获得。如果没有编码J链的额外质粒，在优选的实施方案中产生的抗体可能缺少J链。在这样一个例子中，我们已经明确产生的H和L链的杂二聚体有一个高于CH11五倍的细胞毒性。
本发明的蛋白质对Fas抗原的专一结合活性可以通过例如：酶连接的免疫吸附剂测定(ELISA)。在ELISA的一个特殊的实施方案中，Fas抗原被固定在一个96井平板的井底，并且测试蛋白被介导入井中，然后洗去未结合的蛋白质。在洗之后，井暴露于一个专一于象不变区的蛋白质的酶标记抗体。又一次洗细胞，检测遗留在井中的任何标记。先前已公开了编码人Fas抗原的cDNA并且介导cDNA进入动物细胞表达的方法也已知[c.f.Itoh，N.，et al(1991)，Cell，66，233-243]。用于上面ELISA的抗原可以从细胞的培养物的上清液获得，该细胞已经被含有编码一个融合蛋白的基因的表达载体转化，该融合蛋白含有人Fas抗原的细胞外区和鼠白介素3受体细胞外区域，象在Itoh(出处同上)中发现的。
本发明的蛋白质的细胞毒性是可以确定的，例如，通过在测验样品已经存在或者待加入的培养基中培养表达Fas的细胞{例如，人淋巴细胞系HPB-ALL[c.f.Morikawa，S.，et al，(1978).Int.J.Cancer.21，166-170]和Jurkat(美国型培养NO.TIB-152)}，并通过MTT测试确定存活比例[c.f.Green.L M.et al.(1984)，J.Immunological Methods.70，257-268]。
利用本发明的DNA，可以构建用人免疫球蛋白的不变区替代的嵌合鼠抗体[c.f.Morrison，S.L.，et al(1984).Proc.Natl.Acad.Sci，USA.81，6851-6855]。
同样，可以构建一个基本由H和L链可变区组成的F V部分，这是一个单链FV(scFV)[c.f.Huston，J.S.，et al.(1988)，Proc.NatlAcad.Sci.USA.85，5879 et seq]，其中H和L链通过一个弹性肽连接。
所以，根据本发明，通过构建一个含有带一个鼠的抗人Fas抗体CDR’S的人抗体的不变区的人类化抗体可以生产具备在人类的致免疫力减弱的抗Fas抗体[c.f.Jones，P.T.et al.(1986)，Nature，321，522-525]。
本发明同时涉及用于治疗上述症状的方法和治疗组合物，这样的组合物典型地含有治疗上有效量的混合了药学上可接受的载体的本发明的蛋白质。组合物可以以任何适当的方式给药，象肠胃外的，静脉注射，皮下注射或局部给药。特别是，当所治疗的症状是局部的时，优选的是尽可能接近该位点施用蛋白质。例如，严重的风湿性疼痛可能发生在主要关节处，那么蛋白质可以给药在这些位置。本发明系统给药的蛋白质特别优选的是以一种无热原地，治疗地，特别是肠胃外可接受的水溶液的形式给药。考虑到如pH，等渗性，稳定性等诸如此类的方面，该药学上可接受的蛋白质溶液的制备是本领域的技术人员所熟知的。另外，本发明的组合物可能进一步含有被认为是适当的，象细胞生长抑止剂和其它药剂的成分。
考虑了各种因素，如症状，体重，性别，和病人的饮食，任何症状的严重性，时间，合乎需要的重复治疗，和任何其它适当的临床因子，对本领域的技术人员来说，本发明蛋白质可治疗的各种症状的下药量是显而易见的。作为一个一般的指导，每天的剂量典型地应该在每公斤体重1-1000ug蛋白质的范围。
参考下面的实施例，现将更详细地解释本发明，但这些实施例是解释性的，不是对本发明的限制。任何没有特殊定义的方法，制备液和诸如此类可以在“分子克隆--实验室手册”(出处同上)中找到，所有的溶液是水状的并在无菌，去离子水中，除非另有限定。实施例1编码抗人Fas抗原的小鼠单克隆抗体CH11的可变区的DNA的克隆(1-1)制备poly(A)+-RNA
根据Chirgwim和同事(看Chirgwin，J.M.，et al.，(1979)Biochemistry 18：5294]叙述的方法，从一个生产CH11的杂交瘤制备总RNA。具体地说，在含有10％(v/v)胎牛血清(Gibco)的ASF104培养基(Ajinomoto)中培养生产CH11的杂交瘤[看Yonehara，S.，et al.，(1994)，Intemational Immunology6，1849-1856]。通过离心大约收获6.7×108细胞，丢弃上清液。所产生的细胞的片状沉淀物直接与60ml 4M的硫氰酸胍(Fluka)混合。通过一个装备了21号针头的注射器抽吸细胞悬浮液3次溶解所产生的悬浮液中的细胞，所获得的细胞溶解物被铺在一个超速离心管(13PA：Hitachi Koki)的3ml 5.7M氯化铯/0.1MEDTA溶液(pH7.5)中离心。管在一个Hitachi RPS-40T离心器(13PA tube，150,000xg 20℃，18小时)中离心沉淀RNA。沉淀的RNA溶解于水，用氯仿/1-丁醇(4∶1，v/v)萃取，然后用100％乙醇再淀淀。
接着通过常规方法从上面制备的，总的，所产生的RNA纯化poly(A)+RNA.[c.f.Maniatis，T.et al(1988)，分子克隆：“实验室手册”(第二版)Cold Spring Harborlab.7.26-7.28]。更具体地说，用100mg oligo dT纤维素(Pharmacia，7型)填充一个可处理的聚苯乙烯柱(直径0.7cm)。用含有20mM tris-HCL(pH7.6)，0.5M NaCL，1mMEDTA和0.1％(w/v)SDS的承载缓冲液(Loading buffer)平衡柱。总RNA(大约1.2mg)溶解于400μml水，65℃加热5分钟，加入400μl承载缓冲液制备双倍于上面浓度。所产生的混合物冷却至室温并加到柱上，通过柱后收集流出部分，65℃加热5分钟，再过柱。
用10ml承载缓冲液洗柱，然后进一步用含有0.1M NaCl的5ml承载缓冲液洗柱，移去非吸附物和非专一吸附物。随后，5ml洗脱缓冲液[10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA和0.05％(w/v)SDS]加到柱上以洗脱专一吸附物。所产生的洗脱液以200μl的馏分回收。合并第三和第四个200μl的洗脱液(总共400μl)，与40μl 3M乙酸钠(pH4.0)和1ml乙醇混合。所产生的混合物在-20℃贮存过夜。第二天，在离心机上离心混合物(10,000xg，4℃，10min)重新产生片状沉淀物。这一片状沉淀物用作poly(A)+RNA样品，贮存于-80℃直到需要使用。
(1-2)克隆编码可变区的DNA
通过联合逆转录(用逆转录酶-RT)的聚合酶链反应(PCR)的“RT-PCR”克隆编码小鼠抗-Fas抗原(CH11)的H链和L链可变区的CDNA片段。这些技术的联合允许专一扩增(1-1)制备的起源于CH11生产杂交瘤的poly(A)+RNA样品的所期望的序列。
从Ig-引物系列(NOvagen)筛选出两套RT-PCR反应的引物。MuIgVH5′-B和MuIgMVH3′-1用于扩增H链的一个区域，MuIgKVL5′和MuigMVL3′-1用于扩增L链的一个区。分别用H链引物套和L链引物套进行RT-PCR反应。a)逆转录酶(RT)反应
一个逆转录酶反应溶液(44μl)配制如下：混合10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，0.1mMdATP，0.1mMdGTP，0.1mMdcTP，0.1mMdTTP，1.5mMMgCl2，2.5pmol H链或L链3’-侧引物，50ng(1.1)中制备的Poly(A)+RNA和起源于莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)的20单位的逆转录酶(BIOCHE MICAL KOGYO CO.，LTD)，所产生的混合物在42℃温育1小时。
a)中制备的逆转录酶反应溶液与25pmol H链或L链5’引物，适当地与5单位的Taq DNA聚合酶(从Perkin Elmer，日本，得到的扩增Taq DNA聚合酶)混合到一个终体积为100μl的加有试剂盒的反应缓冲液(酶的缓冲液和溶液由供应商的试剂盒供应，除非另有限定)。总的，所产生的反应混合物在94℃加热2分钟，然后进行一个94℃一分钟，50℃一分钟和72℃2分钟的热循环。这个循环重复30次。然后溶液保持在72℃10分钟。用一个基因扩增仪PCR系统9600(Perkin Elmer，日本)控制所有PCR反应的反应温度。c)PCR产物的测定
用一个1.5％(w/v)琼脂糖凝胶(FMC生物产品)电泳分析b)中制备的PCR反应混合物的一部分。作为一个大约430bp的带得到PCR反应的H和L链的每个产物。通过与同时在同一块凝胶上电泳的分子量标记比较估计带的大小。d)PCR产物的克隆
用一个原始的TA克隆kit(Invitrogen)把b)中得到的每个PCR产物连接进分开的质粒载体中，更详细地说，50ng PCRII载体和4个单位的T4 DNA连接酶(两者包括在kit中)被加入一个连接反应缓冲液[6mM Tris-HCl(pH7.5)，6mM MgCl2，5mMNaCl，7mM β-巯基乙醇，0.1m MATP，2mMDTT，1mM亚精胺和0.1mg/ml小牛血清球蛋白]。连接反应缓冲液还含有筛选为含有大约10ng所期望的PCR产物的PCR反应混合物的一部分，如上面c)中凝胶电泳所估计的。所产生的混合物在14℃温育15小时。
随后，2μl连接反应混合物与50μl已经通过加入2μl 0.5Mβ-巯基乙醇制成感受态的E.Coli菌株TOP10F’(包括在kit中)混合。所产生的转化混合物放于冰上30分钟，42℃加热30秒，然后又一次放在冰上2分钟。这次之后，混合物加入500μl SOC培养基[2％(w/v)胰酶解胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.05％(w/v)NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl2，20mM葡萄糖]，产生的混合物旋转振荡培养1小时(37℃，110rpm)。所产生的培养物铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤琼脂培养基平板上[1％(w/v)胰酶解胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)NaCl，0.1％(w/v)葡萄糖，0.6％ w/v Bacto琼脂(Difco)]上，平板静止培养于37℃过夜。
氨苄青霉素抗性克隆通过这个过程产生并选择和用铂针刮下，来自挑选的克隆的细胞分别培养于含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml Lb培养基，37℃过夜。离心培养物沉淀细胞，用碱性溶菌方法[c.f.Maniatis，T.，etal出处同上]从细胞中制备质粒DNA，得到每个H和L链引物套的一个质粒，这些被命名为pVH4(含有用H链引物套扩增的片段的质粒)和pVL8(含有用L链引物套扩增的片段的质粒)。实施例2测定CH11可变区的氨基酸序列和核苷酸序列(2-1)确定CH11 H链和L链的可变区的N-末端氨基酸序列。a)制备CH11
在含有10％(v/v)小牛血清(GibCO)的ASF104培养基(Ajinomoto)中生长生产CH11的杂交瘤(实施例1)到细胞数目为2×108，然后制备液培养在50ml无血清ASF104培养基中37℃5天。这次之后，离心培养物(Tommy Seiko′S NO.4 Rotor，15,000xg，4℃，15分钟)，收集上清液用一个E-Z-Sep抗体纯化kit(Pharmacia Biotech)从培养物上清液中获得CH11。
b)对应于a)中制备的100μl上清液，纯化的CH11的一部分被加入含有10％(v/v)β-巯基乙醇和4％(w/v)SDS的10μl100mMtris-HCl缓冲液(pH6.8)中，产生的混合物在95℃加热5分钟变性。变性样品然后在一个12％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。电泳后，凝胶被浸泡在转移缓冲液[20mM Tris-硼酸(pH9.5)，10％甲醇(v/v)]并在室温振荡15分钟，然后用一个半驱动涂布器[Iwaki Glass Co.Ltd.]，在一个稳流0.2 A，4℃1小时，把凝胶上的蛋白质带转移到一个PVDF膜(Nippon Millipore Ltd.)上。这次之后，用0.1％(w/v)考马斯亮兰溶液染色PVDF膜，并用100％甲醇脱色。对应于H链和L链可看到两个主要蛋白点。切下这些蛋白质点，含有它们的凝胶在室温下干燥。
c)利用一个气相蛋白质序列分析仪(PPSQ-10；Shimadzu公司)，利用自动Edman方法[看Edman，P.，et al.，(1967)，Eur，J.Biochem，1，80 etSeq]分析b)中转移到PVDF膜上的蛋白质的氨基酸序列。从而确定了CH11的H链的可变区的N-末端氨基酸序列和L链的N-末端氨基酸序列，并分别如序列表的SEQ ID NOs 13和14所示。
(2-2)确定DNA核苷酸序列。
通过分别测序质粒pVH4和pVL8(实施例1中制备的)中的插入序列来确定编码CH11的H链和L链可变区的CDNA的总核苷酸序列。
PCRII载体有一个SP6启动子序列和一个T7启动子序列，并且它们与任何插入的cDNA侧接，从而允许利用对应于序列的低聚核苷酸引物(perkin Elmer，日本)确定pVH4和pVL8的插入序列。利用这些引物和一个染料引物循环一序列分析kit(Perkin Elmer日本)制备序列分析样品。来自质粒pVH4或pVL8的质粒DNA用作模板。使用DNA测序仪(373型，Perkin Elmer日本)确定每个cDNA插入片段的序列。如SEQ IDNO，15所示显示了H链可变区的cDNA核苷酸序列，如SEQ IDNO，16所示显示了L链可变区的CDNA核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO.13的氨基酸NOs.1到15代表的CH11的H链的N-末端氨基酸序列完全对应于SEQ ID NO 15的核苷酸NOs，32到76编码的氨基酸序列。所以，可以推理质粒pVH4含有编码CH11H链的可变区的DNA。
序列表中SEQ ID NO 14的氨基酸NO.1至21代表的CH11L链的N端氨基酸序列完全相应于SEQ ID NO.16中核苷酸NO.29至91编码的氨基酸序列。因此，可推断质粒pV18含有编码CH11L链可变区的DNA。实施例3编码完全的CH11的H链，L链和J链的DNA的克隆(3-1)制备一个CDNA文库
通过Okayama-Berg方法[Okayama.H.et al.，(1987)，Methodin enzymology 154，3-28]制备一个cDNA文库。更详细地说，来自CH11生产杂交瘤的实施例1-1(a)中制备的5μg poly(A)+RNA加入30μl的含有起源于AMV的75个单位的逆转录酶(Seikagakukogyo，co.，Ltd)的反应混合物{50mM tris-HCl[pH8.3]，6mM MgCl2，40mM Kcl，2mM dATP，2mM dGTP，2m M dC TP，2mM dTTP，2μg载体引物[3′-oligo(dT)-尾.pcDV-1]：Pharmacia}。产生的混合物在37℃温育30分钟。
这次之后，等体积的酚-氯仿(1∶1，v/v)加入反应混合物并完全混合。离心产生的混合物(10,000xg，室温，5分钟)并收集水相(这个用酚：氯仿萃取并收集水相上清液的过程在以后被称为“酚-氯仿提取”)。产生的水相中加入35μl 4M乙酸铵和140μl乙醇，产生的混合物在-70℃冷却15分钟，然后离心(10,000xg，4℃，15分钟)。用75％(v/v)乙醇溶液洗片状沉淀物，然后减压干燥。
干燥的沉淀物溶解于13μl的蒸馏水，然后加入5.6μl的终端转移酶反应混合物[140mM二甲胂酸钠，30mM Tris-HCl(pH6.8)，(Pharmacia)，0.2mMdCTP]，所产生的混合物在37℃温育5分钟。根据供应商的说明，加入终端脱氧核苷酸转移酶(21单位，Pharmacia)，反应进行5分钟。然后反应混合物进行酚-氯仿提取。然后，在收集的水相中加入20μl 4M乙酸胺和80μl乙醇，混合物在-70℃冷却15分钟，然后离心(10,000xg，4℃，15分钟)。75％(v/v)的乙醇溶液洗沉淀物，减压干燥。
以这种方法获得的DNA沉淀被溶解于30μl反应混合物[10mMTris-HCL(pH7.5)，60mM NaCl，7mM MgCl2]，30单位的限制酶HindIII加入产生的溶液。一般来说，当用到一种限制酶，但不限定缓冲液，那么所用的缓冲液是与酶一起供应来的缓冲液。在DNA被两种酶消化的情况下，用两种酶有顺序地进行消化。在第一次消化之后，沉淀DNA，重悬浮，然后用第二种酶消化。沉淀和再悬技术是本领域熟知的[c.f，Maniatis et al.出处同上]。本实施例中所用的全部限制酶和缓冲液由Takara Schuzo供应。
DNA在消化溶液中37℃消化过夜。随后，反应混合物进行酚一氯仿提取。然后，在收集的水相中加入35μl 4M乙酸铵和140μl乙醇，混合物在-70℃冷却15分钟。离心(10,000xg，4℃，15分钟)混合物，沉淀DNA，用75％(v/v)乙醇溶液洗产生的沉淀物并减压干燥。这样制备的沉淀DNA在后面的过程中被用作CDNA样品。
平行地，用限制酶PstI消化来自载体pCDL-SRα296[c.f.Takebe，Y.et al，(1989)，“JIKKENI GAKU(实验用药)”，7，pp，95-99]的质粒DNA。为了在3’-末端加Oligo dG，用dGTP和终端脱氧核苷酸转移酶(Phamacia)处理消化产物如下：
pcDL-SRα296DNA(100μg存在于50μl)加入10μl10x终端脱氧核苷酸转移酶缓冲液中[1x缓冲液：1.4M二甲胂酸钠，0.3M Tris-HCl(pH7.6)，10μl DTT(1mM)，20μl 0.1mM3H-dGTP(Dupont)和10μl终端转移酶(210IU，Pharmacia)]。混合物37℃温育40分钟，然后与等量体积的TE缓冲液饱和的酚混合。静止后，移走水相，并进行一个酚-氯仿提取。在进行了酚和酚-氯仿提取之后，用乙醇沉淀DNA并重悬于50μl TE缓冲液中。
用限制酶HindIII消化总的沉淀的DNA，在1.8％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳分离消化产物。切下凝胶上800bp的带，用GENECLEAN试剂盒(Funakoshi)根据制造商的说明，从凝胶上提取DNA，所产生的DNA溶解于100μl TE缓冲液和100μl乙醇。最后的DNA浓度为0.09μg/μl。
产生的产物具有一个DNA衔接物，其中Oligo(dG)附着于SRα启动子上(图1)。
上面制备的沉淀的，干燥的cCDNA样品溶解于10μl TE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA]。产生的溶液的一部分(1μl)被加入含0.08pmol的上面制备的DNA衔接物的反应缓冲液[10mM，Tris-HCL(pH7.5)，1mMEDTA，100mM NaCl]。产生的混合物在65℃加热5分钟，然后在42℃温育30分钟。在这次之后，在反应混合物中加入10μl 10x连接酶缓冲液[10m MATP，660mM Tris-HCl(pH7.5)，66mM MgCl2，100m MDTT]，76μl蒸馏水，1μl 10mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，BoehringerMannheim)，产生的混合物在冰上冷却10分钟。加E.Coli DNA连接酶[8.4μg当量，Pharmacia]到冷的反应混合物中，整个在12℃温育，过夜。
温育之后，在反应混合物中加入2μl核苷酸溶液(2mM dATP，2mM dCTP，2mMd GTP，2mMdTTP)，0.5μl10mMNAD，42μg当量的E.Coli DNA连接酶(pharmacia)，4.1单位的DNA聚合酶I(Pharmacia)，和5.5单位的核糖核酸酶H(Pharmacia)。产生的混合物在12℃温肓1小时，然后22℃又1小时。以这种方式制备的cDNA文库贮存于-20℃直到需要。
(3-2)PCR克隆a)制备引物
在H链的情况中，如实施例2中确定的，CH11 H链的可变区的氨基酸序列与Kabat et al[看kabat  E.A.et al，(1991)，在“Sequencesof Proteins of Immunological Interest Vol.II”，美国健康和人类服务部]制备的抗体氨基酸序列数据库比较。可以确定CH11的H链(μ链)是亚类2A。所以，一个低聚核苷酸引物这样合成了，以致它可与编码小鼠H链，亚类2a的DNA的5’-非翻译区的一部分杂交。筛选的低聚核苷酸引物有序列：5’-CTAAGGGAATTCCGCCTCTCCTCAGACACTGAA-3’(H5-1；序列表中SEQ ID NO.17)。
同时也设计的一个低聚核苷酸引物以致它能与CH11H链的3’-非翻译区的一部分杂交。这一低聚核苷酸是根据编码Goldberg，et al[看Goldberg，I.G.，et al.，(1981)，Gene 15，33-42]报道的小鼠免疫球蛋白M链不变区的DNA的核苷酸序列设计的，并且所选择的序列是5’-TTTTACTCTAGAGACCCAAGGCCTGCCTGGTTGA-3’(H3-1；序列表的SEQ ID NO.18)。
对于L链，实施例2中确定的CH11的L链的可变区的氨基酸序列与kabat和合作者(上述)制备的抗体氨基酸序列数据库比较。发现CH11的L链是亚类k2。所以，一个低聚核酸引物如此设计以致它能与编码小鼠L链，亚类K2的DNA的5’-末端非翻译区的一部分杂交。所选择的低聚核苷酸引物的序列为：5’-AAATAGGAATTCCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCC-3’(L5-1；序列表的SEQ ID NO.19)。
同时一个低聚核苷酸引物设计为将与3’非翻译区的一部分杂交。这一低聚核苷酸是根据编码以登记名MUSI GB1L1(保藏号NO，D14630)登记的小鼠免疫球蛋白K链不变区的DNA的核苷酸序列设计的，所用的序列是5’-ATGATCTCTAGAGTGGTGGCATCTCAGGACCT-3’(L3-1；序列表的SEQ ID NO.20)。
在J链的情况中，没有可变区，编码J链的DNA的序列和J链的氨基酸序列是已知的，[c.f.Cann，G.M.et al(1982).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.79，6656-6660]。根据这一发现，低聚核苷酸引物这样合成以致它能与编码J链的DNA的非翻译区的5’和3’部分杂交，这些低聚核苷酸有序列：5’-TTGCGGAATTCCTCACCTGTCCTGGGGTTATT-3’(J5-1；序列表的SEQ ID NO.21)和5’-ATTGCCTCTAGAGCCTCTAAGGACAACGACCT-3’(J3-1；序列表的SEQ ID NO.22)。
这些低聚核苷酸引物都是通过磷酰胺方法[看Mattrucci，M.D.和Caruthers.M.H，(1981)，J.Am，Chem，Soc，103，3185-3191]利用一个自动DNA合成仪380B(Perkin Elmer，日本)合成的。完成合成后，从支持物上切下每个引物并去保护，然后冰冻干燥。产生的产物溶解于蒸馏水中并贮存于-20℃直到需要。b)PCR扩增靶基因
制备PCR反应溶液[10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mMMgCl2，2.5mMdATP，2.5mMdGTP，2.5mMdCTP，2.5mMdTTP]，向100μl PCR反应溶液中加入实施例4-1中叙述的0.1μl的cDNA文库，1单位的TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer，日本)和15pmol低聚核苷酸引物(在3-2a中制备)并在94℃加热2分钟。产生的混合物进行一个94℃一分钟，55℃一分钟，72℃2分钟的热循环。这个循环重复30次。最后一次之后，溶液保持于72℃10分钟。
用于各个反应的引物的联合如下：
H5-1和H3-1(对H链)
L5-1和L3-1(对L链)；和
J5-1和J3-1(对J链)c)PCR产物的测定
在b)中的PCR反应进行之后，在H链的情况下，用0.8％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳分析一部分的反应混合物。对L和J链，用一个1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶(琼脂糖从FMC生物制品获得)。PCR反应产物对H链大约为1900bp的带，对L链为800bp的带和对J链为650bp的带。带的大小通过与在同一胶上的分子量标记比较估计。d)PCR产物的克隆。
利用一个真核生物TA克隆kit(Invitrogen)，将b)中得到的每个PCR产物连接进入一个质粒载体中。更详细地说，60ng PCR3载体(包括在kit中)和4个单位的T4 DNA连接酶加入连接酶反应缓冲液中[6mMTris-HCl(pH7.5)，6mM MgCl2，5mM NaCl，7mM β-巯基乙醇，0.1mM ATP，2m MDTT，1mM亚精胺，0.1mg/ml小牛血清球蛋白]，其中含有一部分PCR反应混合物。正如凝胶电泳所估计的，以含有大约10ng所希望的PCR产物来挑选PCR反应混合物的量。产生的混合物在14℃温育15小时。
一部分连接酶反应混合物(2μl)与50μl通过加入2μl0.5M的β-巯基乙醇制成感受态的E.Coli细胞，菌株TOP1OF′(包括在kit中)混合。产生的混合物放置冰上30分钟，42℃加热30秒，再放冰上2分钟。在混合物中加入SOC培养基(500μl，上面所述)。产生的混合物在37℃旋转振荡(110rpm)培养1小时。培养液体然后铺在含有100μg/ml的氨苄青霉素的Lb琼脂糖培养基平板上，在37℃培养过夜。用铂针挑下出现的氨苄青霉素抗性克隆，并在含有100μg/ml的氨苄青霉素的5ml Lb培养基中培养37℃过夜。离心培养物沉淀细胞，然后用碱性溶菌方法(Maniatis et al，上述)制备质粒DNA。
产生的质粒中的三个被命名为pCR3-H123(含有编码H链的cDNA的质粒)，pCR3-L103(含有编码L-链的CDNA的质粒)和pCR3-J1123(含有编码J链的CDNA的质粒)。用pCR3-H123，pCR3-L103或pCR3-J1123中的一个质粒转化E.Coli菌株DH5α(Gibco)的感受态细胞，在1996年2月28日分别以存放号FERM BP-5427，FERM BP-5428和FERM BP-5429把产生的转化体存放在工业科学和技术代理处的生命科学和技术研究院。通过已知的方法从这些菌株中容易制备编码CH11的H，L和J链的DNA。实施例4确定编码CH11H链，L链和J链的cDNA的总核苷酸序列(4-1)确定DNA的核苷酸序列：
小鼠免疫球蛋白M链含有一个含有110残基的N-末端可变区和一个邻接于可变区的含有470残基的不变区，鼠免疫球蛋白K链含有一个含有110个残基的N-末端可变区和一个邻接于可变区的含有107个残基的不变区。如实施例2中所鉴定，可以预言，编码CH11H链和L链的cDNA的完全的核苷酸序列将含有编码已知的不变区并连接于编码这些链的可变区的核苷酸序列的核苷酸序列[c.f.kabat E.A，et al.，(1991)在“Sequencesof Profeins of Immunological Interest Vol.II”，美国健康和人类服务部]。
假设编码CH11的J链的核苷酸序列与已知J链序列的相同。
根据假设的核苷酸序列，对应于被60到200bp的编码间隔分开的H，L，J链的序列，合成了长度为20个核苷酸的低聚核苷酸引物，这些引物被用于序列分析。所合成的低聚核苷酸的引物的序列如下：对于H链：
5’-TGGGGCCTCA GTGAAGATAT-3’(SHF-2；序列表中的SEQ ID NO.23)
5’-CAATGGTGGT ACTGGCTACA-3’(SHF-3；序列表中的SEQ ID NO.24)
5’-TGACATCTGA GGACTCTGCA-3’(SHF-4；序列表中的SEQ TD NO.25)
5’-TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT-3’(SHF-6；序列表中的SEQ ID NO.26)
5’-TCCTTCACCT GGAACTACCA-3’(SHF-7；序列表中的SEQ ID NO.27)
5’-TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG-3’(SHF-8；序列表中的SEQ ID NO.28)
5’-AGATCTGCAT GTGCCCATTC-3’(SHF-9；序列表中的SEQ ID NO.29)
5’-TCTAAACTCA TCTGCGAGGC-3’(SHF-10；序列表中的SEQ ID NO.30)
5’-GGTGACCATC GAGAACAAAG-3’(SHF-11；序列表中的SEQ ID NO.31)
5’-AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA-3’(SHF-12；序列表中的SEQ ID NO.32)
5’-TCCTTTGCCG ACATCTTCCT-3’(SHF-13；序列表中的SEQ ID NO.33)
5’-GTGTGTACTG TGACTCACAG-3’(SHF-15；序列表中的SEQ ID NO.34)
5’-AACTGAACCT GAGGGAGTCA-3’(SHF-16；序列表中的SEQ ID NO.35)
5’-AACTCTTGCC CCAAGAGAAG-3’(SHF-17；序列表中的SEQ ID NO.36)
5’-ATCCTGACTG TGACAGAGGA-3’(SHF-18；序列表中的SEQ ID NO.37)
5’-ACAAGTCCAC TGGTAAACCC-3’(SHF-19；序列表中的SEQ ID NO.38)
5’-AGGATATCTT CACTGAGGCC-3’(SHR-1；序列表中的SEQ ID NO.39)
5’-ATCCACTCAA GGCTCTTTCC-3’(SHR-2；序列表中的SEQ ID NO.40)
5’-ACTGCAGAGT CCTCAGATGT-3’(SHR-3；序列表中的SEQ ID NO.41)
5’-AGACGGTGAC TGAGGTTCTT-3’(SHR-4；序列表中的SEQ ID NO.42)
5’-CAGGTGAAGG AAATGGTGCT-3’(SHR-5；序列表中的SEQ ID NO.43)
5’-ATGCTCTTGG GAGACAGCAA-3’(SHR-6；序列表中的SEQ ID NO.44)
5’-CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG-3’(SHR-7；序列表中的SEQ ID NO.45)
5’-TGGCCTCGCA GATGAGTTTA-3’(SHR-8；序列表中的SEQ ID NO.46)
5’-CCTTTGTTCT CGATGGTCAC-3’(SHR-9；序列表中的SEQ ID NO.47)
5’-TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA-3’(SHR-10；序列表中的SEQ ID NO.48)
5’-ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA-3’(SHR-12；序列表中的SEQ ID NO.49)
5’-AGATCCCTGT GAGTCACAGT-3’(SHR-13，序列表中的SEQ ID NO.50)
5’-AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA-3’(SHR-14；序列表中的SEQ ID NO.51)
5’-TGAAGCCACT GCACACTGAT-3’(SHR-15；序列表中的SEQ ID NO.52)
5’-AGTTCCATTC CTCCTCTGTC-3’(SHR-16；序列表中的SEQ ID NO.53)
5’-TGTGTCAGAC ATGATCAGGG-3’(SHR-18；序列表中的SEQ ID NO.54)对于L链：
5’-TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG-3’(SLF-1；序列表中的SEQ ID NO.55)
5’-CTTGGAGATC AAGCCTCCAT-3’(SLF-2；序列表中的SEQ ID NO.56)
5’-GCTGAGGATC TGGGAGTTTA-3’(SLF-3；序列表中的SEQ ID NO.57)
5’-GATGCTGCAC CAACTGTATC-3’(SLF-4；序列表中的SEQ ID NO.58)
5’-CGACAAAATG GCGTCCTGAA-3’(SLF-5；序列表中的SEQ ID NO.59)
5’-ACGTTGACCA AGGACGAGTA-3’(SLF-6；序列表中的SEQ ID NO.60)
5’-ATCTGCAAGA GATGGAGGCT-3’(SLR-2；序列表中的SEQ ID NO.61)
5’-ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA-3’(SLR-3；序列表中的SEQ ID NO.62)
5’-CCGGAGGAAC ATGTGTACTT-3’(SLR-4；序列表中的SEQ ID NO.63)
5’-TCGTTCATAC TCGTCCTTGG-3’(SLR-6；序列表中的SEQ ID NO.64)
5’-CATCTCAGGA CCTTTGTCTC-3’(SLR-7；序列表中的SEQ ID NO.65)对于J链：
5’-CACCTGTCCT GGGGTTATTT-3’(SJF-1；序列表中的SEQ ID NO.66)
5’-AGACAAGATG AAGACCCACC-3’(SJF-2；序列表中的SEQ ID NO.67)
5’-AAGCGACCAT TCTTGCTGAC-3’(SJF-3；序列表中的SEQ ID NO.68)
5’-ATATCTCTGA TCCCACCTCC-3’(SJF-8；序列表中的SEQ ID NO.69)
5’-GAAATGCGAT CCTGTGGAAG-3’(SJF-5；序列表中的SEQ ID NO.70)
5’-CTATACCACT ATGGTCCCAC-3’(SJF-6；序列表中的SEQ ID NO.71)
5’-AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT-3’(SJF-2；序列表中的SEQ ID NO.72)
5’-TAGAGGTAAC TCGGGTACAC-3’(SJR-3；序列表中的SEQ ID NO.73)
5’-AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA-3’(SJR-8；序列表中的SEQ ID NO.74)
5’-GGTGGCAGTA ACAACCTGAT-3’(SJR-5；序列表中的SEQ ID NO.75)
5’-CATGATACCT AAGTGGGACC-3’(SJR-6；序列表中的SEQ ID NO.76)
用一个自动DNA合成仪(380B型：Perkin Elmer，日本)通过磷酰胺方法合成每个低聚核苷酸引物。用来自质粒pCR3-H123的DNA制备H链的序列分析样品。用来自质粒pCR3-L103的DNA制备L链的序列分析样品。用来自pCR3-J1123的DNA制备J链的序列分析样品，用如下的一个prism Ready反应终端循环序列分析kit(Perkin Elmer，日本)进行PCR反应。
PCR3-H123(1.5μg)和4.8pmol引物(SHF-2)在蒸馏水中混合到最后体积为16μl。这一pCR3-H123/引物混合物的一部分(9.5μl)与10.5μl的含有Taq DNA聚合酶预混合物混合。所有这些过程是根据kit的说明进行的。产生的混合物被放在一个自动反应器[催化剂：Perkin Elmer，日本)中。所用的反应循环如下：95℃30秒，50℃15秒，60℃4分钟，重复25次。
在完成反应循环之后，在产生的溶液中加入80μl蒸馏水，用酚/氯仿方法提取产生的混合物中的DNA两次。收集的水相与15μl2M乙酸钠和300μl乙醇混合，接着离心，收获沉淀。用70％乙醇溶液洗沉淀并减压干燥，然后溶解于3μl样品溶液(4μl 0.25MEDTA，100μl甲酰胺和15μl蒸馏水)。
对32个H链引物，11个L链引物，11个J链引物，测序反应在一个DNA序列分析仪[373A型：Perkin Elmer，日本)上进行分析。
为了确定CH11的H，L和J链的完全的核苷酸序列，联合和整合对每个引物获得的序列数据。在序列表的SEQ ID NOs.7，9和11分别显示了每个质粒插入的cDNA核苷酸序列。在序列表的SEQ IDNOs.8，10和12分别显示了对应于这些核苷酸序列的氨基酸序列。(4-2)CH11的H链的一级结构。
如序列表的SEQ ID NO.15的核苷酸NOs.32到379所示的H链可变区的核苷酸序列被发现与SEQ ID NO7的核苷酸NOs.58到405相同。
当与抗体氨基酸序列[kabat E.A.et al如上述]比较，发现SEQ IDNO.8的氨基酸NOs.117到571所示的氨基酸序列与起源于小鼠IgM的H链不变区的氨基酸序列相同。
如SEQ ID NO.8的氨基酸NOs.-19到-1所示的氨基酸序列被定论为CH11的H链的一个信号序列。
如SEQ ID NO.7的核苷酸NOs.406到1770所示的核苷酸序列被发现与小鼠IgM的H链不变区的相同。
根据这些结果，总的核苷酸序列和总的氨基酸序列可以一起确立。(4-3)CH11L链的一级结构
序列表中SEQ ID NO.16的核苷酸NOs.29到364显示的L链可变区的核苷酸序列被发现与SEQ ID NO.9的核苷酸NOs.58到393的相同。
当与抗体氨基酸序列的kabat上的数据库比较时，发现SEQ ID NO.10的氨基酸NOs.113到219显示的氨基酸序列与鼠κL链不变区的氨基酸序列相同。
SEQ ID NO.10的氨基酸-19到-1显示的氨基酸序列被归结为L链的一个信号序列。
确定了SEQ ID NO.9的核苷酸NOs.394到714显示的核苷酸序列与鼠κL链不变区的完全相同。
根据这些结果，可以确定总核苷酸序列与总氨基酸序列。(4-4)CH11的J链的一级结构。
把SEQ ID NO.12的氨基酸NOs.1到137显示的氨基酸序列与抗体氨基酸序列数据库比较，发现前者与已知的小鼠J链相同。
SEQ ID NO.11的核苷酸NOs.67到477显示的核苷酸序列被发现与已知小鼠J链的相同。
SEQ ID NO.12的氨基酸NOs.-22到-1显示的氨基酸序列被归结为CH11J链的一个信号序列。
根据这些结果，可以确定总核苷酸序列与总氨基酸序列。(4-5)确定互补决定区(CDR)
通过与kabat抗体氨基酸序列数据库(上述)比较，鉴定了上述确定的CH11H链和L链可变区的每个CDR的氨基酸序列和位置，这一数据库显示在可变区的构架区的氨基酸链长度实际上在不同抗体之间是恒定的，确定亚类是相同的，氨基酸序列有一些共性。然而，存在于这样的构架区之间的CDR’S是专一于每个抗体的序列。
通过比较CH11H链可变区的氨基酸序列与小鼠μ2亚型的序列，CH11H链中的CDR显示并被氨基酸代表如下：SEQ ID NO.8的NOs.31到35(CDRH1，对应于序列表的SEQ ID NO.1)，SEQ ID NO.8的50到66(CDRH2，对应于序列表的SEQ ID NO.2)和SEQ ID NO.8的99到105(CDRH3对应于序列表的SEQ ID NO.3)。
当比较CH11 L链的可变区的氨基酸序列与小鼠k2亚型的序列，L链中的CDR显示被氨基酸NOs，代表如下：SEQ ID NO.10的24到39(CDRL1，对应于序列表的SEQ ID NO.4)，SEQ ID NO.10的55到61(CDRL2，对应于序列表的SEQID NO.5)和SEQ ID NO.10的94到102(CDRL3，对应于序列表的SEQ ID NO.6)。实施例5在COS-1细胞中表达编码每个CH11亚单位的基因。(5-1)构建表达载体
用限制酶ECORI和XbaI消化来自高表达载体pME 18S的DNA[看Hara，T.et al，(1992)，EMBO J.11，1875 et seq]。用琼脂糖凝泳电泳在0.8％琼脂糖凝胶上分离所产生的消化产物。接着电泳凝胶用溴化乙锭(0.25ug/ml)对DNA染色，从凝胶上切下一条大约3000bp的带，转移到一个加入250μl的TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液(TBE缓冲液：Tris 0.089M，硼酸盐0.089M，EDTA(pH 8.0)0.002M)的透析管中(渗透极限：12000到14000Da，Gibco)且密封管口。密封的管子被放在一个含有更多琼脂糖凝胶电泳缓冲液的水下电泳箱中，DNA从凝胶上电泳脱下(150v，15分钟)。拿出透析管，收集管中的DNA洗脱物进行酚/氯仿提取。
平行地用限制酶ECORI和xbaI消化实施例3d)中制备的并含有编码CH11H链的DNA的质粒pCR3-H123。用上面5-1叙述的琼脂糖凝胶电泳，在0.8％凝胶上分离纯化1900bp的ECORI-XbaI片段。利用DNA连接kit版本1[Takara Shuzo Co.Ltd)把cDNA片段连接于上面分离的pME18S的3kb E CORI-XbaI片段。
用限制酶ECORI和XbaI消化含有编码CH11L链的DNA的，实例例3中制备的质粒pCR3-L103。通过上面5-1叙述的，在0.8％凝胶上电泳分离纯化含有cDNA质粒插入片段的一个840bp的ECORI-XbaI片段。用DNA连接kit版本1(Takara Shuzo Co.Ltd)把这一cDNA片段连接于上面获得的pME18S的3kbECORI-XbaI片段上。
用限制酶ECORI和XbaI消化实施例3中制备的，含有编码CH11J链的DNA的质粒pCR3.J1123，通过上面5-1叙述的0.8％凝胶上电泳分离纯化含有cDNA质粒插入片段的一个640bp的ECORI-XbaI片段。用DNA连接kit版本1(Takara Shuzo Co.Ltd)把cDNA片段连接于上面得到的pME18S的3kb的ECORI-XbaI片段。
在连接反应完成之后，用每个反应混合物转化JM109 E.Coli感受态细胞(Takara Shuzo)，并以氨苄青霉素抗性菌株筛选克隆。通过碱性溶菌(Maniatis上述)从转化菌株中制备质粒DNA。用ECORI和XbaI消化所得到质粒DNA，接着通过0.8％琼脂糖凝胶电泳验证是否克隆了期望大小的DNA。
命名含有编码CH11H链的DNA的表达载体为pHEX126。命名含有编码CH11 L链的DNA的表达载体为pLEX004。含有编码CH11J链的DNA的表达载体命名为pJEX004。(5-2)在COS-1细胞中表达。
利用GTE-1仪器(Shimadzu公司)通过电穿孔用pHEX126，pLEX004和pJEX004转化COS-1细胞。更详细地说，COS-1细胞(美国型培养物收集品NO.CRL-1650)被培养于一个225cm2的培养瓶中(Sumitomo Bakelite)。在含有10％(v/v)胎牛血清(CSL)的Dulbecco′s改良Eagle′s基础培养基(‘DMEM’，Nissuipharmaceutical)中细胞生长到半汇合状态。去掉培养基，用3ml胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)37℃3分钟处理细胞两次。收集细胞，用磷酸盐缓冲(PBS，pH8.0)的缓冲液(Nissui Pharmaceutical)洗细胞两次。用PBS(-)缓冲液(8g Nacl，0.2g KCl.1.15gNa2HPO4 0.2g KH2PO4每升，Nissui seiyaku Co.)调节被洗的COS-1细胞到一个6×107细胞/ml的密度。
利用一个质粒maxiprep kit(Maxiprep DNA纯化系统：Promega)从编码所有三个CH11亚基的每个pHEX126，pLEX004和pJEX004制备DNA。用乙醇沉淀每个质粒maxiprep的一部分(20μg)，沉淀溶于20μl pBS(一)缓冲液中。以这种方式制备的DNA用于转染COS-1细胞。用超过一个质粒的，每个质粒20μg进行任何转染。
以这种方式制备的一个COS-1细胞的悬浮液(20μl，1.2×106细胞)与20μl每个样品混合，得到的混合物放在具有一个2mm电极间隔的电穿孔杯中(Shimadzu公司)。杯放于电穿孔仪器中，用两个600V-30μsec脉冲，脉冲间有1秒间隔。细胞和DNA的混合物被加至10ml含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM中，然后转移到一个细胞培养塑料盘(直径：90mM；Sumitomo Bakelite)并在37℃，7.5％CO2培养24小时。这次之后，移去培养上清液，用无血清的DMEM培养基洗细胞。加入新鲜的无血清DMEM培养基(10mls)，并在37℃，7.5％CO2连续培养24小时。然后收集培养上清液。
用下面所列的一个质粒，或质粒的联合转染COS-1细胞，在每种情况下收集培养上清液。
[A]：仅pME18S
[B]：仅pHEX126
[C]：仅pLEX004
[D]：仅pJEX004
[E]：pHEX126和pLEX004
[F]：pHEX126，pLEX004和pJEX004
实施例6
检测抗Fas抗体
用两种方法分别检测根据本发明制备的抗-Fas抗体。
(1)第一种方法是Western Blotting。在下面展示的条件下在一个SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳蛋白质样品，电泳分离了样品蛋白质(这一过程被称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或‘SDS-PAGE’)。蛋白质被转移到一个硝酸纤维素膜上，与一个专一于抗一Fas抗体的抗体反应。通过在一个照相胶片上的光照射，存在合适的底物时，抗体与目标抗Fas蛋白质的交叉反应是可检测的。
(2)第二种方法测量对Fas抗原的结合亲和力
(6-1)Western Blotting。
对5升纯净水透析培养上清液的测试样品(1ml)，然后用一个离心浓缩器(cc-101；Tomy seiko)减压干燥。得到的产物加入10μl样品缓冲液[2％(w/v)SDS(电泳级；Bio-Rad)，5％(v/v)β-巯基乙醇(Sigma)，10％(v/v)甘油，0.1％(w/v)溴酚兰]并完全混合。得到的悬浮液在100℃加热5分钟以提供一个适于电泳的样品。整个电泳样品加入SDS-PAGE凝胶的一个孔中(4到20％梯度胶，每升缓冲液组成为，Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS10gpH8.3)，在一个稳流20mA(室温1小时)下跑胶。
进行电泳之后，用一个半干印迹方法[看Towbin，H，et al.，(1979).Proc.Natl.Acad.Sci USA.76，4350 et Seq.]把蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维膜上。专门的仪器和所用的条件如下：
转移缓冲液：20mM Tris，150mM甘氨酸
            10％(v/v)甲醇
印迹仪器：由Iwaki Glass制造
操作条件：4℃，0.2A(稳流)，1小时。
如上所述制备western blotling的两个硝酸纤维膜。Western转移之后，用一个‘Sil Best kit’(Nakarai Tesuku kabushiki-kaisha)银染凝胶。
上述制备的一个Western boltting硝酸纤维膜用于H链(μ链)检测，其它的用于L链(k链)检测。用到下面的过程。
Western转移之后，把硝酸纤维膜浸在含有3％(w/v)明胶(Bio-Rad)，20mM Tris-HCl(pH7.5)和500mM Nacl的水溶液中。在室温下温和摇膜1小时，(从“Western转移之后”的叙述的过程在这里被称为“封闭”)。封闭的膜被浸在一个稀释的抗体溶液并在室温下温和摇动2小时。通过用下文被称为“TBS”的缓冲液[20mMTris-HCl(pH7.5)，500mM NaCl]10ml稀释2.5μl经过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgM抗体(μ链专一：Jackson免疫研究实验室)，或25μl过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠K链单克隆抗体(Zymed实验室)制备得到的抗体溶液。
每张硝酸纤维膜被浸在20ml含有2％(v/v)Tween20(Bio-Rad)之TBS的TTBS中并在室温下温和振摇15分钟洗涤。用20ml TTBS洗处理膜，随后滴干TTBS。用一个ECL Western Blotting检测系统(Amer Sham)检测残留在膜上的过氧化物酶活性.更详细地说，在过氧化物酶的催化活动下的一个化学反应过程中系统的底物发射光。用一个ECL微型照相机(Amer Sham)和日常胶片(667型；Polariod)在照相胶片上可以检测光照射。拍下的图片与银染胶相比较鉴定专一结合抗体的蛋白质带。
抗小鼠M链的抗体与一个大约78,000Da的蛋白质带交叉反应。这样大小的带存在于用pHEX126单个或与另一个质粒一起转染的COS-1细胞样品的上清液中。这些样品对应于实施例5的[B]，[E]和[F]。
抗小鼠K链的抗体与一带大约26,000Da的蛋白质带交叉反应。一条这样大小的带存在于用pLEX004单个或与另一个质粒一起转染的COS-1细胞样品的上清液中。这些样品对应于实施例5中的[C]，[E]和[F]。
用同样的方法通过Western boltting分析杂交瘤产生的抗体，可以看到对应于来自杂交瘤的CH11的H和L链的带与从转染的COS-1细胞获得的大小相同。(6-2)用ELISA验证Fas结合力(a)制备抗原
表达载体pME18s-mFas-AIC[看NiShimura，Y.，et al.(1995)，Mol.Immuno.，154，4395-4403]编码一个含有小鼠Fas抗原细胞外区和小鼠白介素3受体的细胞外区的融合蛋白。编码小鼠Fas抗原细胞外区的部分载体被编码人Fas抗原的细胞外区的DNA片段代替，编码含有人Fas抗原的细胞外区和小鼠白介素3受体的细胞外区的融合蛋白的新表达载体phFas-AIC2制备如下：
为了编码Fas抗原细胞外区的DNA的PCR扩增。设计合成了低聚核苷酸引物。所用的DNA模板是含有编码人Fas抗原的质粒载体pcEV4[Itoh，N.，et al，(1991)，Cell，66,233-243]。所选择的低聚核苷酸的序列如下：
5’-GGGGAATTCCAGTACGGAGTTGGGGAAGAAGCTCTTT-3’(N1；序列表的SEQ ID NO.77)和5’-GTTTCTTCTGCCTCTGTCACCAAGTTAGATCTGGA-3’(C3N；序列表的SEQ ID NO.78)。
为了编码小鼠白介素3受体的细胞外区的DNA的PCR扩增，设计合成了低聚核苷酸引物。所用的DNA模板是质粒载体pME18S-mFas-AIC(NiShimara，Y.et al.，1995，Mol Immunology，154，4395-4403)，低聚核苷酸的序列如下：
5’-TCCAGATCTAACTTGGTGACAGAGGCAGAAGAAAC-3’(N3N；序列表的SEQ ID NO.79)和5’-CCCTCTAGACGCGTCACGTGGGCATCAC-3’(CTN2；序列表的SEQ ID NO.80)。
在下面的条件下，用上面的质粒，低聚核苷酸引物和LAPCR kit(Takara Shuzo Co.td)，进行PCR反应。反应混合物组成：
质粒DNA                  20ng
低聚核苷酸引物           0.5μg(每个)
10倍浓度的LAPCA缓冲液    25μl
dNTP混合物      2 5μl
Taq聚合酶       12.5单位加入蒸馏水到最后体积为250μl；缓冲液，dNTP混合物和Taq聚合酶包括在kit中。温度条件：
样品最初在94℃加热2分钟。反应混合物然后进行一个94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟的热循环，循环重复30次，接着在72℃加热10分钟。
通过在8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(在TBE缓冲液中，100V2小时电泳)分离每个PCR反应产物。从凝胶上切下一条对应于含有编码人Fas抗原细胞外区的基因的DNA片断的大约460bp的带。同时从凝胶上切下一条对应于含有编码小鼠白介素3受体的细胞外区的基因的DNA片段的大约1300bp的带。如实施例5所述从凝胶上洗下DNA片段。
第一个PCR反应之后获得的两个DNA片段与低聚核苷酸引物C3N和N3N一起用于第2个PCR反应。每个引物与原始片段中的一个杂交。当用于一个PCR反应时，引物扩增两个多肽基因连接在同一读码框架中的一个DNA片段。第二个PCR反应在下面条件下进行：反应混合物组成：
第一个PCR产物             每次的整个量
低聚核苷酸引物            0.1μg(每个)
10倍浓度的LAPCA缓冲液     25μl
dNTP混合物                25μl
Taq聚合酶                 12.5单位蒸馏水被加入至最终体积为250μl。
热循环条件相同于前一个PCR反应。
第二个PCR的一部分反应混合物加入一个琼脂糖凝胶并电泳来证明期望的大约1700bp的PCR产物已经扩增。用乙醇沉淀剩下的反应混合物。用限制酶ECORI和XbaI消化沉淀的DNA，通过在一个1％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳分离消化产物。从凝胶上切下一条大约1700bp的带，以相同于实施例5中叙述的方法从凝胶上纯化DNA。
平行地，用限制酶ECORI和XbaI消化2μg pME 18s-m Fas-AIC DNA。在0.8％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳分离消化产物，从凝胶上切下大约3000bp的一条带。分离DNA并用一个DNA连接kit版本2(Takara Shuzo Co.Ltd)把DNA连接到1700bp的PCR产物(上面制备)上。总的反应混合物(10μl)用于转化JM109 E.Coli感受态细胞(Takara Shuzo)并作一个氨苄青霉素抗性克隆选。用传统过程培养这样一个氨苄青霉素抗性转化体，通过碱溶菌(Maniatis，上述)，从细胞中制备质粒DNA。得到的质粒命名为phFas-AIC2。
用GTE-1仪器，通过电穿孔将phFAS-AIC2 DNA转染进入COS-1细胞。更详细地说，在4个225cm2的培养瓶(SumitomoBakelite)中培养COS-1细胞。在含有10％v/v)胎牛血清(CSL)DMEM中细胞生长至半汇合态。移走培养基，用3ml胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)在37℃、3分钟处理细胞两次。收获细胞，用PBS(-)缓冲液(Missui Pharmaceutical)洗细胞两次。用PBS(-)缓冲液调节被洗的细胞至一个6×107细胞/ml的密度。
用一个质粒大量制备kit(Maxiprep DNA纯化系统；Promega)制备phFas-AIC2质粒DNA，并用乙醇沉淀200μg该质粒DNA，然后溶解在200μl PBS(-)缓冲液。
混合一部分细胞悬浮液(20μl；1.2×106细胞)和20μl质粒溶液，把得到的混合物导入一个有一个间隔2mm的电极的电穿孔杯中。杯放置于电穿孔仪器中并对样品用两个脉冲间隔为1秒的600V-30μsec脉冲。这个过程在10个样品上进行。
10个样品的细胞-DNA混合物合并，加入50ml含有10％(v/v)的胎牛血清的DMEM，得到的混合物转移至一个225cm2的细胞培养瓶[Sumitomo Bakelite)中。细胞在37℃，7.5％CO2下培养24小时。这次之后，移走培养上清液，用无血清的DMEM培养基洗细胞。在培养物中加入新鲜无血清DMEM培养基，细胞在37℃，7.5％CO2下培养24小时。这次之后收获培养上清液。
b)ELISA
用吸量器把COS-1培养上清液的等分试样(100μl)吸入96-孔免疫板[Maxi Sorb；Nunk)的孔中，并在4℃贮存过夜。这导致在孔的内表面形成了含有人Fas抗原细胞外区的一个蛋白质的固相。用含有0.05％(v/v)Tween-20(EIA级，Bio-Rad)的PBS洗每个孔，然后加入100μl含有0.5％(w/v)的牛血清球蛋白(BSA)的PBS。板放在室温下1小时以产生封闭。
用含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS洗每个孔，然后用吸量管把实施例2中制备的一个CH11(标准)和100μl实施例5中制备的稀释的试验样品溶液加入孔中。反应在室温下继续4小时。
用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS洗孔。用吸量管把一部分(100μl)过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠IgM单克隆抗体(1/2000稀释，zymed实验室)加入每个孔中，反应在室温下进行2小时。
然后进一步用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS洗孔，一部分底物溶液(100μl)(过氧化物酶底物kit ABTS；Bio-Rad)吸入每个孔中启动一个颜色反应。用一个微板读数器测量出405nm和492nm处每个孔的吸光率值，并从405nm的吸光率值减去492nm的吸光率值。这样获得的值与CH11标准比较，来估计试验样品结合含有人Fas抗原细胞外区的蛋白质的能力。
结果显示在下面表1。可以看到，用实施例5中制备的上清液[E](pHEX126和pLEX004)和[F](pHEX126，pLEX004和pJEX004)可观察到结合。
         表1样品                   OD405-OD492CH11标准                    0.445PBS                         0.104pHEX126                     0.109pLEX004                     0.135pJEX004                     0.107pHEX126+pLEX004             0.330pHEX126+pLEX004+PJEX004     0.202实施例7细胞毒性测定
通过MTT[3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2.5-二苯基2H-四唑鎓溴化物]测定方法测定实施例5中制备的每个COS-1细胞培养上清液的细胞毒性，叙述如下：
在一个含有20mM HEPES(HEPES：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)，50μm 2-巯基乙醇和10％(v/v)胎牛血清(Equitec Bio)的RPMI1640培养基(Nissui Pharmaceutical)上，5％CO2，37℃培养人淋巴细胞菌株HPB-ALL[看Morikawa，S.，et al，(1978)，Int.J，Cancer，21，166-170]3天。一部分实施例5中制备的COS-1细胞培养上清液(75μl)被吸入96-孔培养板的孔中并随后加入25μl HPB-ALL细胞(调整到2×105细胞/ml)。细胞在37℃，5％CO2下培养12小时。在盘的每个孔中加入10μl 5mg/ml的MTT(sigma)水溶液，板在37℃温育4小时。温育之后，100μl含有50％(v/v)N，N-二甲基酰胺和20％(w/v)SDS的溶液加入每个孔中。用一个微板读数器(Nippon Intermed Ltd.)读出590nm和620nm处每个孔的吸光率值。从590nm的吸光率值中减去620nm的吸光率。值越高，在孔中能生长的细胞数目越大。在下面表2中给出得到的值。
           表2样品                             OD590-OD620PBS                              0.864pME18S                           0.881pHEX126(H-链)                    0.876pLEX004(L-链)                    0.887pJEX004(J-链)                    0.883pHEX126+pLEX004                  0.176pHEX126+pLEX004+PJEX004          0.242
比起那些未转染细胞，用实施例5中的单个质粒[(A)，[B]，[C]和[D])转染的COS-1细胞培养物都显出较高的值。比起没有细胞存在的空白值，用pHEX126和pLEX004([E]和[F])转染的细胞显示出低的值。从这些结果，可以发现编码CH11H链和CH11L链的DNA的共同表达产生了一个细胞毒性物质。实施例8比较抗体细胞毒性(ED50试验)
通过一个ED50试验可以估计本发明的抗体的细胞毒性。如这里所用，ED50是表达Fas抗原的细胞样品的50％被杀死的抗体的浓度。在测量ED50之前，有必要精确估计试验的抗体的浓度。(8-1)确定抗体浓度
在96孔ELISA板(NUNC)的每个孔中加入100μl抗小鼠IgM抗体溶液(0.5μg/ml于50mM Na2HCO3，pH9.6，从BIOSYS购买)，平板在4℃温育过夜。然后丢弃抗体溶液，用有0.5％Tween-20的PBS(这里称为‘PBS-T’)洗每个孔四次。
根据制造商的说明，在PBS中制备‘Super-Block’封闭缓冲液(Pierce)，在每个孔中加入100μl这种缓冲液。平板进一步在37℃温育4小时。这次之后，丢弃封闭溶液，并用PBS-T洗每个孔四次。
在平板的每个孔中加入一个每个试验的抗体制备液的100μl样品。测试样品含有CH11和实施例5的上清液[E]和[F]。稀释成不同浓度的含有小鼠IgM(Zymed)的各种标准制品被用到了。在样品被加入孔中后，平板在37℃温育4小时。这次之后，测试和标准溶液被丢弃并用PBS-T洗每个孔四次。
在每个孔中加入辣根过氧化物酶-连接的抗鼠IgM的一个样品(100μl PBS稀释1/1000倍)，随后丢弃这一溶液并用PBS-T洗每个孔四次。
在每个孔中加入从一个辣根过氧化物酶底物kit(Biorad)制备的100μl样品，平板在室温下温育30分钟。这次之后，利用一个微板读数器得到405nm和492nm处的吸光率读数。从405nm的值减去492nm的值。
通过利用标准样品的吸光率值，能建立一个标准曲线，由此能确定每个试验抗体的浓度。
然后才能估计ED50。(8-2)ED50计算
CH11的三个抗体溶液，实施例5的上清液[E](含有H和L链)和上清液[F](含有H、L和J链)，分别与HBP-ALL细胞温育。利用一个实施例7中叙述的MTT试验确定多少细胞被抗体溶液杀死。
以MTT作阴性对照，在缺乏抗体中培养的HBP-ALL的结果作阳性对照，作为上面(8-1)得到的蛋白质浓度的一个函数计算每个抗体的MTT结果，结果如表3显示。
          表3抗体                               ED50(ng/ml)CH11                                  21.2上清[E](pHEX126和pLEX004)             4.5上清[F](pHEX126，pLEX004和pJEX004)    22.9
上面结果清楚地显示了上清液[E]含有的产物惊人地拥有大约五倍于CH11或上清液[F]含有的产物的活性。似乎是上清液[F]包含的产物形成一个IgM结构，而上清液[E]包含的产物形成简单的抗体对，在这些情况下，ED50明显增强。
                    序列表(1)总的信息：
(i)申请人：
  (A)名称：Sankyo company，Limited
  (B)街道：5-1，Nihonbashi Honcho 3-chome，Chuo-ku
  (C)城市：东京
  (E)国家：日本
  (F)邮编(ZIP)：103
(G)电话：81-3-5255-7111
(ii)发明名称：重组的抗人Fas抗体
(iii)序列数目：80
(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：Floppy disk
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)
(vi)以前申请的资料：
  (A)申请号；JP Hei 8-78570
  (B)申请日：1996年4月1日(2)SEQ ID NO：1的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：5个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1  Asp Tyr Asn Met His
1              5(2)SEQ ID NO：2的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：17个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly
1              5Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
   10                  15Ser(2)SEQ ID NO：3的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：7个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1              5(2)SEQ ID NO：4的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：16个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His
1              5Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
   10                  15(2)SEQ ID NO：5的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：7个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
 1               5(2)SEQ ID NO：6的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：9个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：内部
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6  Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro
1               5Ala(2)SEQ ID NO：7的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：1773碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：双链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：从mRNA得到的cDNA
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(vi)原始来源：
  (A)生物体：Mus musculus
  (G)细胞类型：杂交瘤
  (H)细胞系：CH11
(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：1..1770
(ix)特征
  (A)名称/关键词；mat-peptide
  (B)位置：58..1770
(ix)特征；
  (A)名称/关键词：sig-peptide
  (B)位置：1..57
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC   48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19             -15                 -10                  -5GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA   96Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
          1               5                  10CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC  144Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT  192Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu30                   35                  40                  45GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC  240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn
             50                  55                  60CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC  288Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser
         65                  70                  75ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC  336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA  384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
 95                 100                 105ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GAG AGT CAG TCC TTC CCA AAT GTC TTC  432Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe110                 115                 120                 125CCC CTC GTC TCC TGC GAG AGC CCC CTG TCT GAT AAG AAT CTG GTG GCC  480Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala
            130                 135                 140ATG GGC TGC CTA GCC CGG GAC TTC CTG CCC AGC ACC ATT TCC TTC ACC  528Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr
        145                 150                 155TGG AAC TAC CAG AAC AAC ACT GAA GTC ATC CAG GGT ATC AGA ACC TTC  576Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe
    160                 165                 170CCA ACA CTG AGG ACA GGG GGC AAG TAC CTA GCC ACC TCG CAG GTG TTG    624Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu
175                 180                 185CTG TCT CCC AAG AGC ATC CTT GAA GGT TCA GAT GAA TAC CTG GTA TGC    672Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys190                 195                 200                 205AAA ATC CAC TAC GGA GGC AAA AAC AGA GAT CTG CAT GTG CCC ATT CCA    720Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro
            210                 215                 220GCT GTC GCA GAG ATG AAC CCC AAT GTA AAT GTG TTC GTC CCA CCA CGG    768Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg
        225                 230                 235GAT GGC TTC TCT GGC CCT GCA CCA CGC AAG TCT AAA CTC ATC TGC GAG    816Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu
    240                 245                 250GCC ACG AAC TTC ACT CCA AAA CCG ATC ACA GTA TCC TGG CTA AAG GAT    864Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp
255                 260                 265GGG AAG CTC GTG GAA TCT GGC TTC ACC ACA GAT CCG GTG ACC ATC GAG    912Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu270                 275                 280                 285AAC AAA GGA TCC ACA CCC CAA ACC TAC AAG GTC ATA AGC ACA CTT ACC    960Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr
            290                 295                 300ATC TCT GAA ATC GAC TGG CTG AAC CTG AAT GTG TAC ACC TGC CGT GTG   1008Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Ash Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val
        305                 310                 315GAT CAC AGG GGT CTC ACC TTC TTG AAG AAC GTG TCC TCC ACA TGT GCT   1056Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala
    320                 325                 330GCC AGT CCC TCC ACA GAC ATC CTA ACC TTC ACC ATC CCC CCC TCC TTT   1104Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe
335                 340                 345GCC GAC ATC TTC CTC AGC AAG TCC GCT AAC CTG ACC TGT CTG GTC TCA   1152Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser350                 355                 360                 365AAC CTG GCA ACC TAT GAA ACC CTG AAT ATC TCC TGG GCT TCT CAA AGT   1200Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser
            370                 375                 380GGT GAA CCA CTG GAA ACC AAA ATT AAA ATC ATG GAA AGC CAT CCC AAT   1248Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn
        385                 390                 395GGC ACC TTC AGT GCT AAG GGT GTG GCT AGT GTT TGT GTG GAA GAC TGG    1296Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp
    400                 405                 410AAT AAC AGG AAG GAA TTT GTG TGT ACT GTG ACT CAC AGG GAT CTG CCT    1344Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro
415                 420                 425TCA CCA CAG AAG AAA TTC ATC TCA AAA CCC AAT GAG GTG CAC AAA CAT    1392Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His430                 435                 440                 445CCA CCT GCT GTG TAC CTG CTG CCA CCA GCT CGT GAG CAA CTG AAC CTG    1440Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu
            450                 455                 460AGG GAG TCA GCC ACA GTC ACC TGC TTG GTG AAG GGC TTC TCT CCT GCA    1488Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala
        465                 470                 475GAC ATC AGT GTG CAG TGG CTT CAG AGA GGG CAA CTC TTG CCC CAA GAG    1536Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu
    480                 485                 490AAG TAT GTG ACC AGT GCC CCG ATG CCA GAG CCT GGG GCC CCA GGC TTC    1584Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe
495                 500                 505TAC TTT ACC CAC AGC ATC CTG ACT GTG ACA GAG GAG GAA TGG AAC TCC    1632Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser510                 515                 520                 525GGA GAG ACC TAT ACC TGT GTT GTA GGC CAC GAG GCC CTG CCA CAC CTG    1680Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu
            530                 535                 540GTG ACC GAG AGG ACC GTG GAC AAG TCC ACT GGT AAA CCC ACA CTG TAC    1728Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr
        545                 550                 555AAT GTC TCC CTG ATC ATG TCT GAC ACA GGC GGC ACC TGC TAT            1770Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr
    560                 565                 570TGA                                                                1773(2)SEQ ID NO：8的资料(i)序列特征：
(A)长度：590个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)几何结构；线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly-19             -15                 -10                  -5Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
          1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser
         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
 95                 100                 105Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe110                 115                 120                 125Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala
            130                 135                 140Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr
        145                 150                 155Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe
    160                 165                 170Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu
175                 180                 185Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys190                 195                 200                 205Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro
            210                 215                 220Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg
        225                 230                 235Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu
    240                 245                 250Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp
255                 260                 265Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu270                 275                 280                 285Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr
            290                 295                 300Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val
        305                 310                 315Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala
    320                 325                 330Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe
335                 340                 345Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser350                 355                 360                 365Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser
            370                 375                 380Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn
        385                 390                 395Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp
    400                 405                 410Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro
415                 420                 425Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His430                 435                 440                 445Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu
            450                 455                 460Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala
        465                 470                 475Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu
    480                 485                 490Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe
495                 500                 505Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser510                 515                 520                 525Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu
            530                 535                 540Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr
        545                 550                 555Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr
    560                 565                 570(2)SEQ ID NO：9的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：717碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：双链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：mRNA产生的cDNA
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(vi)原始来源：
  (A)生物体：Mus musculus
  (G)细胞类型：杂交瘤
  (H)细胞系：CH11
(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：1..714
(ix)特征
  (A)名称/关键词；mat-peptide
  (B)位置：58..7l4
(ix)特征；
  (A)名称/关键词：sig-peptide
  (B)位置：1..57
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG ATG TTC TGG ATT CCT GCT      48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-19             -15                 -10                  -5TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC      96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
          1               5                  10AGT CTT GGA CAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT     144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
 15                  20                  25GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA     192Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30                  35                  40                  45GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT     240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
             50                  55                  60GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA     288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
         65                  70                  75CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC     336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
     80                  85                  90TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG     384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
 95                 100                 105GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA     432Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro110                 115                 120                 125TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC TCA GTC GTG TGC TTC TTG     480Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
            130                 135                 140AAC AAC TTC TAC CCC AAA GAC ATC AAT GTC AAG TGG AAG ATT GAT GGC     528Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
        145                 150                 155AGT GAA CGA CAA AAT GGC GTC CTG AAC AGT TGG ACT GAT CAG GAC AGC     576Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
    160                 165                 170AAA GAC AGC ACC TAC AGC ATG AGC AGC ACC CTC ACG TTG ACC AAG GAC     624Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
175                 180                 185GAG TAT GAA CGA CAT AAC AGC TAT ACC TGT GAG GCC ACT CAC AAG ACA    672Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr190                 195                 200                 205TCA ACT TCA CCC ATT GTC AAG AGC TTC AAC AGG AAT GAG TGT            714Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            210                 215TAG                                                                717(2)SEQ ID NO：10的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：238个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-19             -15                 -10                  -5Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
          1               5                  10Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
 15                  20                  25Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30                  35                  40                  45Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
             50                  55                  60Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
         65                  70                  75Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
     80                  85                  90Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
 95                 100                 105Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro110                 115                 120                 125Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
            130                 135                 140Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
        145                 150                 155Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
    160                 165                 170Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
175                 180                 185Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr190                 195                 200                 205Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            210                 215(2)SEQ ID NO：11的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：480个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：双链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：mRNA产生的cDNA
(iii)椎测：不是
(iv)反意义：不是
(vi)原始来源：
  (A)生物体：Mus musculus
  (G)细胞类型：杂交瘤
  (H)细胞系：CH11(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：1..477(ix)特征
  (A)名称/关键词；mat-peptide
  (B)位置：67..477(ix)特征；
  (A)名称/关键词：sig-peptide
  (B)位置：1..66(xi)序列描述：SEQ ID NO：11ATG AAG ACC CAC CTG CTT CTC TGG GGA GTC CTC GCC ATT TTT GTT AAG    48Met Lys Thr His Leu Leu Leu Trp Gly Val Leu Ala Ile Phe Val Lys-22     -20                 -15                 -10GCT GTC CTT GTA ACA GGT GAC GAC GAA GCG ACC ATT CTT GCT GAC AAC    96Ala Val Leu Val Thr Gly Asp Asp Glu Ala Thr Ile Leu Ala Asp Asn
 -5                   1               5                  10AAA TGC ATG TGT ACC CGA GTT ACC TCT AGG ATC ATC CCT TCC ACC GAG   144Lys Cys Met Cys Thr Arg Val Thr Ser Arg Ile Ile Pro Ser Thr Glu
             15                  20                  25GAT CCT AAT GAG GAC ATT GTG GAG AGA AAT ATC CGA ATT GTT GTC CCT   192Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Val Val Pro
         30                  35                  40TTG AAC AAC AGG GAG AAT ATC TCT GAT CCC ACC TCC CCA CTG AGA AGG   240Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Arg
     45                  50                  55AAC TTT GTA TAC CAT TTG TCA GAC GTC TGT AAG AAA TGC GAT CCT GTG   288Asn Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Val Cys Lys Lys Cys Asp Pro Val
 60                  65                  70GAA GTG GAG CTG GAA GAT CAG GTT GTT ACT GCC ACC CAG AGC AAC ATC     336Glu Val Glu Leu Glu Asp Gln Val Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile75                  80                  85                  90TGC AAT GAG GAC GAT GGT GTT CCT GAG ACC TGC TAC ATG TAT GAC AGA     384Cys Asn Glu Asp Asp Gly Val Pro Glu Thr Cys Tyr Met Tyr Asp Arg
             95                 100                 105AAC AAG TGC TAT ACC ACT ATG GTC CCA CTT AGG TAT CAT GGT GAG ACC     432Asn Lys Cys Tyr Thr Thr Met Val Pro Leu Arg Tyr His Gly Glu Thr
        110                 115                 120AAA ATG GTG CAA GCA GCC TTG ACC CCC GAT TCT TGC TAC CCT GAC         477Lys Met Val Gln Ala Ala Leu Thr Pro Asp Ser Cys Tyr Pro Asp
    125                 130                 135TAG                                                                 480(2)SEQ ID NO：12的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：159个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12Met Lys Thr His Leu Leu Leu Trp Gly Val Leu Ala Ile Phe Vel Lys-22     -20                 -15                 -10Ala Val Leu Val Thr Gly Asp Asp Glu Ala Thr Ile Leu Ala Asp Asn
-5                    1               5                  10Lys Cys Met Cys Thr Arg Val Thr Ser Arg Ile Ile Pro Ser Thr Glu
             15                  20                  25Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Val Val Pro
         30                  35                  40Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Arg
     45                  50                  55Asn Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Val Cys Lys Lys Cys Asp Pro Val
 60                  65                  70Glu Val Glu Leu Glu Asp Gln Val Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile75                  80                  85                  90Cys Asn Glu Asp Asp Gly Val  Pro Glu Thr Cys Tyr Met Tyr Asp Arg
             95                  100                 105Asn Lys Cys Tyr Thr Thr Met Val Pro Leu Arg Tyr His Gly Glu Thr
        110                 115                 120Lys Met Val Gln Ala Ala Leu Thr Pro Asp Ser Cys Tyr Pro Asp
    125                 130                 135(2)SEQ ID NO：13的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：15个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：蛋白质
(v)片段类型：N-末端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13Glu Val Gla Leu Gln Gln Ser Gly1                5Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
10                  15(2)SEQ ID NO：14的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：14Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro1               5Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 10                  15Asp Gln Ala Ser Ile
         20(2)SEQ ID NO：15的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：391碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：双链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：mRNA产生的cDNA
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(vi)原始来源：
  (A)生物体：Mus musculus
  (G)细胞类型：杂交瘤
  (H)细胞系：CH11
(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：2..391
(ix)特征
  (A)名称/关键词；mat-peptide
  (B)位置：32..391(ix)特征；
  (A)名称/关键词：sig-peptide
  (B)位置：2..31(xi)序列描述：SEQ ID NO：15C CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG       46Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln-10                  -5                   1               5CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC     94Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
             10                  15                  20TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG    142Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val
         25                  30                  35AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT    190Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro
     40                  45                  50TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA    238Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr
 55                  60                  65TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC    286Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser70                  75                  80                  85CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT    334Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr
             90                  95                 100GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA GAG    382Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr val Ser Ser Glu
        105                 110                 115
                                                               391AGT CAG TCCSer Gln Ser
    120(2)SEQ ID NO：16的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：388碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：双链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：mRNA产生的cDNA
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(vi)原始来源：
  (A)生物体：Mus musculus
  (G)细胞类型：杂交瘤
  (H)细胞系：CH11
(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：2..388
(ix)特征
  (A)名称/关键词；mat-peptide
  (B)位置：29..388
(ix)特征；
  (A)名称/关键词：sig-peptide
  (B)位置：2..28
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16G ATG TTC TGG ATT CCT GCT TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA       46Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln-9              -5                   1               5AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT     94Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
         10                  15                  20TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA    142Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
     25                  30                  35CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC    190His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
 40                  45                  50AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT    238Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser55                  60                  65                  70GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG    286Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
             75                  80                  85GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG    334Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala
         90                  95                 100TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA    382Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
    105                 110                 115ACT GTA                                                            388Thr Val
120(2)SEQ ID NO：17的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：33碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT  GAA                               33
(2)SEQ ID NO：18的资料
  (i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链数：单链
    (D)几何结构；线性
  (ii)分子类型：其他核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iii)推测：不是
  (iv)反意义：不是
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：18TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG  TTGA                              34
(2)SEQ ID NO：19的资料
  (i)序列特征：
    (A)长度：33碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链数：单链
    (D)几何结构；线性
  (ii)分子类型：其他核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iii)推测：不是
  (iv)反意义：不是
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：19AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC  TCC                               33(2)SEQ ID NO：20的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC  CT                                32(2)SEQ ID NO：21的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：32碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21TTGCGGAATT  CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT                                32(2)SEQ ID NO：22的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：32个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAG CT                               32(2)SEQ ID NO：23的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23TGGGGCCTCA GTGAAGATAT           20(2)SEQ ID NO：24的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24CAATGGTGGT ACTGGCTACA                                     20(2)SEQ ID NO：25的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25TGACATCTGA GGACTCTGCA                                     20(2)SEQ ID NO：26的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT                                     20(2)SEQ ID NO：27的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27TCCTTCACCT GGAACTACCA                                     20(2)SEQ ID NO：28的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG                                     20(2)SEQ ID NO：29的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29AGATCTGCAT GTGCCCATTC                                     20(2)SEQ ID NO：30的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30TCTAAACTCA TCTGCGAGGC                                     20(2)SEQ ID NO：31的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31GGTGACCATC GAGAACAAAG                                     20(2)SEQ ID NO：32的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA                                     20(2)SEQ ID NO：33的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33TCCTTTGCCG ACATCTTCCT                                     20(2)SEQ ID NO：34的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34GTGTGTACTG TGACTCACAG                                     20(2)SEQ ID NO：35的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35AACTGAACCT GAGGGAGTCA                                     20(2)SEQ ID NO：36的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36AACTCTTGCC CCAAGAGAAG(2)SEQ ID NO：37的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37ATCCTGACTG  TGACAGAGGA                                    20(2)SEQ ID NO：38的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38ACAAGTCCAC  TGGTAAACCC                                    20(2)SEQ ID NO：39的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39AGGATATCTT CACTGAGGCC                                     20(2)SEQ ID NO：40的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40ATCCACTCAA GGCTCTTTCC                                     20SEQ ID NO:41的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41ACTGCAGAGT CCTCAGATGT(2)SEQ ID NO：42的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42AGACGGTGAC TGAGGTTCTT                                     20(2)SEQ ID NO：43的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43CAGGTGAAGG AAATGGTGCT                                     20(2)SEQ ID NO：44的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44ATGCTCTTGG GAGACAGCAA                                     20(2)SEQ ID NO：45的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG                                     20(2)SEQ ID NO：46的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46TGGCCTCGCA GATGAGTTTA                                     20(2)SEQ ID NO：47的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47CCTTTGTTCT CGATGGTCAC                                     20(2)SEQ ID NO：48的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA                                     20(2)SEQ ID NO：49的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA                                     20(2)SEQ ID NO：50的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50AGATCCCTGT GAGTCACAGT                                     20(2)SEQ ID NO：51的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA                                     202)SEQ ID NO：52的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID  NO：52TGAAGCCACT GCACACTGAT                                     20(2)SEQ ID NO：53的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：53AGTTCCATTC CTCCTCTGTC                                     20(2)SEQ ID NO：54的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54TGTGTCAGAC ATGATCAGGG                                     20(2)SEQ ID NO：55的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG                                     20(2)SEQ ID NO：56的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56CTTGGAGATC AAGCCTCCAT                                     20(2)SEQ ID NO：57的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57GCTGAGGATC TGGGAGTTTA                                     20(2)SEQ ID NO：58的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58GATGCTGCAC CAACTGTATC                                     20(2)SEQ ID NO：59的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59CGACAAAATG GCGTCCTGAA                                     20(2)SEQ ID NO：60的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：60ACGTTGACCA AGGACGAGTA                                     20(2)SEQ ID NO：61的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61ATCTGCAAGA GATGGAGGCT                                     20(2)SEQ ID NO：62的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA                                     20(2)SEQ ID NO：63的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63CCGGAGGAAC ATGTGTACTT                                     20(2)SEQ ID NO：64的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64TCGTTCATAC TCGTCCTTGG                                     20(2)SEQ ID NO：65的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：65CATCTCAGGA CCTTTGTCTC                                     20(2)SEQ ID NO：66的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID  NO：66CACCTGTCCT GGGGTTATTT                                     20(2)SEQ ID NO：67的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：67AGACAAGATG AAGACCCACC                                     20(2)SEQ ID NO：68的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：68AAGCGACCAT TCTTGCTGAC                                     20(2)SEQ ID NO：69的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构：线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：69ATATCTCTGA TCCCACCTCC                                     20(2)SEQ ID NO：70的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：70GAAATGCGAT CCTGTGGAAG                                     20(2)SEQ ID NO：71的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71CTATACCACT ATGGTCCCAC                                     20(2)SEQ ID NO：72的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT                                     20(2)SEQ ID NO：73的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73TAGAGGTAAC TCGGGTACAC                                     20(2)SEQ ID NO：74的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA                                     20(2)SEQ ID NO：75的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75GGTGGCAGTA ACAACCTGAT                                     20(2)SEQ ID NO：76的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：20碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76CATGATACCT AAGTGGGACC                                     20(2)SEQ ID NO：77的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：37碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT                             37(2)SEQ ID NO：78的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：35碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA                            35(2)SEQ ID NO：79的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：35碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC                            35(2)SEQ ID NO：80的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：28碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链数：单链
  (D)几何结构；线性
(ii)分子类型：其他核酸
  (A)描述：/desc＝“合成DNA”
(iii)推测：不是
(iv)反意义：不是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC    28

Claims (40)

1、一种重组蛋白质，所述蛋白质含有至少一个对应于免疫球蛋白可变区的区域，其中所述至少一个区域能使所述蛋白质识别并且特异性地结合到一个抗原上，所述抗原是人Fas，并且其中所述蛋白质实质上在人患者中并不比人抗体具更高的免疫原性。
2、根据权利要求1所述蛋白质，它基本上仅由一种所述区域组成。
3、根据权利要求1所述蛋白质，它基本上由两种所述区域组成，其中区域之一对应于H链可变区，另一种对应于L链可变区。
4、根据权利要求3所述蛋白质，其中所述区域是由可伸缩肽键连接的。
5、根据权利要求1所述蛋白质，具有至少两种所述区域，所述区域来源于单一单克隆抗体。
6、根据权利要求5所述蛋白质，其中所述区域通过整合与人不变区结合。
7、根据权利要求6所述蛋白质，其中所述区域对应于一个重链可变区或者对应于一个轻链可变区，并且独自分别与重链不变区或轻链不变区结合。
8、根据权利要求5所述蛋白质，其中所述区域中每个区域分别是较大多肽的一部分，并且所述两个多肽结合形成一种抗体杂二聚体。
9、编码权利要求1所述蛋白质的DNA。
10、编码权利要求1所述蛋白质的RNA。
11、含有权利要求9所述DNA的载体。
12、含有权利要求9所述DNA的表达载体。
13、用含有权利要求9所述DNA的表达载体转化的一种宿主细胞。
14、一种遗传工程手段得到的免疫球蛋白，它特异性地结合到人Fas上，其中免疫球蛋白基本上由重链亚单位和轻链亚单位组成，所述重链亚单位含有由下列通式(I)代表的氨基酸序列：-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-                    (I)其中FRH1代表含有13-30个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRH1代表SEQ ID NO.1的氨基酸序列，FRH2代表含有14个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRH2代表SEQ ID NO.2的氨基酸序列，FRH3代表含有32个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRH3代表SEQID NO.3的氨基酸序列，FRH4代表含有11个氨基酸残基的氨基酸序列，所述的每一个氨基酸序列借助于一个肽键与下一个氨基酸序列相连接；
所述轻链亚单位含有由下列通式(II)代表的一个氨基酸序列：-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-                 (II)其中FRL1代表含有23个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL1代表SEQ ID NO.4的氨基酸序列，FRL2代表含有15个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL2代表SEQ ID NO.5的氨基酸序列，FRL3代表含有32个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL3代表SEQ ID NO.6的氨基酸序列，并且FRL4代表含有10个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述的每一个氨基酸序列借助于一个肽键与下一个氨基酸序列连接。
15、根据权利要求14所述蛋白质，其中重链亚单位含有由SEQ ID NO.8中的NO.1-116氨基酸代表的氨基酸序列。
16、根据权利要求14所述蛋白质，其中轻链亚单位含有SEQ IDNO.10中的NO.1-112位氨基酸代表的氨基酸序列。
17、根据权利要求14所述蛋白质，其中重链亚单位含有由SEQ ID NO.8中的NO.1-571位氨基酸代表的氨基酸序列。
18、根据权利要求14所述蛋白质，其中轻链亚单位包括由SEQ ID NO.10中NO.1-219位氨基酸代表的氨基酸序列。
19、编码通式(I)的肽的DNA：-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-                  (I)其中FRH1代表含有13-30个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRH1代表SEQ ID NO.1的氨基酸序列，FRH2代表含有14个氨基酸残基的一个氨基酸序列，CDRH2代表SEQ ID NO.2的氨基酸序列，FRH3代表含有32个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRH3代表SEQID NO.3的氨基酸序列，FRH4代表含有11个氨基酸残基的氨基酸序列，所述的每一个氨基酸序列借助于一个肽键与相邻的序列连接。
20、根据权利要求19所述DNA，它含有由SEQ ID NO.7中NO.58-405位核苷酸代表的核苷酸序列。
21、与权利要求20的DNA杂交的DNA，对应于所述杂交DNA的一条有意义链编码一个免疫球蛋白重链亚单位，该亚单位能与含有权利要求14中定义的通式(II)的氨基酸序列的轻链亚单位一起特异性地结合人Fas。
22、根据权利要求21所述的杂交DNA，它在60-70℃温度及6XSSC中进行杂交。
23、编码含有通式(II)代表的氨基酸序列的轻链亚单位的DNA：-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-                  (II)其中FRL1代表含有23个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL1代表SEQ ID NO.4的氨基酸序列，FRL2代表含有15个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL2代表SEQ ID NO.5的氨基酸序列，FRL3代表含有32个氨基酸残基的氨基酸序列，CDRL3代表SEQ ID NO.6的氨基酸序列，以及FRL4代表含有10个氨基酸残基的氨基酸序列所述的每一种氨基酸序列借助于一个肽键与下一个序列连接。
24、根据权利要求23所述DNA，它含有由SEQ ID NO.9中NO.58-393位核苷酸代表的核苷酸序列。
25、与权利要求24所述DNA杂交的DNA，对应于所述杂交DNA的一条有意义链编码一种免疫球蛋白轻链亚单位，所述亚单位能与含有权利要求14中定义的通式(I)的氨基酸序列的重链亚单位一起特异性地结合人Fas。
26、根据权利要求25所述杂交DNA，所述杂交是在60-70℃以及6XSSC中进行的。
27、含有权利要求19所述DNA的重组DNA载体。
28、含有权利要求23所述DNA的重组DNA载体。
29、选自于由pCR3-H123和pCR3-L103的组中的重组DNA载体。
30、由权利要求27的载体转化的细胞。
31、由权利要求28的载体转化的细胞。
32、由权利要求29的载体转化的细胞。
33、大肠杆菌pCR3-H123(FERM BP-5247)。
34、大肠杆菌pCR3-L103(FERM BP-5248)。
35、一种生产免疫球蛋白的方法，其中所述蛋白质特异性地识别人的Fas抗原，包括：
在能够使编码免疫球蛋白重链或轻链亚单位的并且存在于载体中的DNA表达的条件下培养由含有选自于下列组的DNA：权利要求9，权利要求27，权利要求28和权利要求29的DNA的载体DNA转化的细胞，并且
从培养物中回收免疫球蛋白。
36、选自于CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3一组CDR’s和权利要求14定义的其组合的应用，用于构建人性化的抗体。
37、编码选自于CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3一组的CDR’s及其权利要求14中定义的组合的DNA的应用，用于构建编码人性化的抗体DNA。
38、权利要求5所述蛋白质，其中所述区域或者等同于或者密切对应于CH11中发现的区域。
39、用于治疗自身免疫疾病的方法，包括给所需要治疗的病人施用治疗有效量的权利要求1所述蛋白质以及药物学可接受载体的混合物。
40、权利要求39所述方法，其中所述自身免疫病是风湿症。
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