KR20200143459A - 항-보체 성분 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-보체 성분 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20200143459A
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다쿠 후쿠자와
겐타 하라야
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노리유키 다카하시
마사루 무라오카
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 항-C1s 항체 및 항-C1r 항체와 같은 항-보체 성분 항체, 및 그를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 항체를 포함하는 약학 제형, 및 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 항-C1s 항체 및 항-C1r 항체의 결합 특이성 및 C1q 대체 기능을 평가한다. 상기 항체들에 대해, 시간 의존성 보체 중화 기능, 및 천연 및 절두된 C1s 또는 C1r 단백질에 대한 결합도 또한 나타내었다.

Description

항-보체 성분 항체 및 사용 방법
본 발명은 항-C1s 항체 및 항-C1r 항체와 같은 항-보체 성분 항체, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
C1 복합체는 고전적인 경로 연쇄반응(cascade)의 핵심 억제제로서 기능하는 거대 단백질 복합체이다. C1 복합체는 3개의 성분, C1q, C1r 및 C1s로 이루어지며, 이들은 각각 1:2:2의 몰비로 존재한다(비특허문헌 1). 상기 고전적 경로는, C1 복합체가 항체들에 의해 결합되는 표적에 결합할 때 개시된다. 6개의 구형 머리를 갖는 C1q는 Fc 영역과의 결합력(avidity) 상호작용에 의해 항체에 대한 C1 복합체의 결합을 매개한다. 일단 표적에 단단하게 결합되면, C1 복합체 내의 C1r은 자동활성화되고 효소적으로 활성이 된다. 이어서, 활성화된 C1r은 C1 복합체 내의 전효소 C1s를 절단하고 활성화시킨다(비특허문헌 2). 이어서, 활성 C1s는 그의 기질들인 보체 성분 C2 및 C4를 각각 C2a/C2b 및 C4a/C4b 단편으로 절단한다. 이에 의해, 표적 표면 상에서, C4b2a의 조립체인 C3 전환효소가 유도되고, 이것은 C3을 절단하여 C3b를 생성한다. C3b는 이어서 C5를 절단하여 말단 막 공격 복합체, C5b, C6, C7, C8 및 C9의 생성을 개시하며, 이들 복합체는 기공 형성을 통해 표적을 용해시킨다.
C1s 및 C1r 단백질은 둘 다 동일한 도메인 구성, 곧 CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2-세린 프로테아제를 갖는다(비특허문헌 3). CUB1-EGF-CUB2 도메인은 C1r과 C1s 사이의 상호작용을 매개하여 C1r2s2 사량체를 생성하고(비특허문헌 4), 또한 C1r2s2와 C1q 사이의 상호작용을 매개한다(비특허문헌 5). 대조적으로, C1r 및 C1s의 CCP1-CCP2-세린 프로테아제 도메인은 그들 각각의 기질의 단백질분해성 절단을 담당한다(비특허문헌 6, 비특허문헌 7). C1r2s2 사량체는 상기 사량체의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 6개 결합 부위를 통해 C1q중의 6개 줄기와 상호작용한다(비특허문헌 5).
적절하게 기능하는 보체 시스템은 숙주를 병원체로부터 지키지만, 고전적 경로의 조절장애 또는 부적절한 활성화는 다양한 보체-매개 질병들, 예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 베체트(Behcet)병, 수포성 천포창(Bullous Pemphigus, BP), 면역 혈소판감소증 자반병(ITP) 등을 야기하나, 이로 한정되지는 않는다. 그러므로, 고전적 경로의 과도하거나 제어되지 않는 활성화의 억제는 상기 질병을 갖는 환자에게 임상적 이점을 제공할 수 있다.
C1s의 베타 도메인에 결합하는 항체인 HI532는 C1r2s2와 C1q의 상호작용을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다(비특허문헌 8). 그러나, 상기 항체는 인간 혈청의 용혈 활성을 완전히 중화시킬 수 없었으며, 혈청을 항체와 함께 24 시간 배양한 후에도 활성의 30%가 남아 있었다.
항체는 혈장에서 안정하고, 그 표적에 대해 매우 특이적이며, 일반적으로 우수한 약동학적 프로필을 나타내기 때문에 매우 매력적인 약제이다. 그러나, 그들의 큰 분자 크기로 인해, 치료 항체의 투여량은 통상적으로 높다. 매우 풍부하게 존재하는 표적의 경우, 항체의 필요한 치료 용량은 훨씬 더 높다. 결과적으로, 항체 약동학, 약력학 및 항원 결합 특성을 개선하는 방법이 치료 항체와 연관된 투여량 및 높은 생산비용을 감소시키는 매력적인 방법이다.
pH-의존성 방식으로 항원에 결합하는 항체(본 명세서 이하에서 "pH-의존성 항체" 또는 "pH-의존성-결합 항체"로도 지칭됨)는 단일 항체 분자가 다수의 항원 분자들을 중화시킬 수 있게 하는 것으로 보고되었다(비특허문헌 9, 특허문헌 1). 상기 pH-의존성 항체는 혈장 내 중성 pH 조건에서 그의 항원에 강하게 결합하지만, 세포의 엔도솜 내의 산성 pH 조건하에서 항원으로부터 해리된다. 일단 항원으로부터 해리되면, 항체는 FcRn 수용체에 의해 혈장으로 다시 재순환되는 반면, 해리된 항원들은 세포의 리소좀 내에서 분해된다. 재순환된 항체는 이어서 항원 분자에 다시 자유롭게 결합하고 상기 항원 분자를 중화시키며, 이 과정은 항체가 계속 순환되는 한 계속 반복된다.
WO2009/125825
Wang et. al. Mol Cell. 2016 Jul 7;63(1):135-45 Mortensen et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 31;114(5):986-991 Gal et. al. Mol Immunol. 2009 Sep;46(14):2745-52 Almitairi et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jan 23;115(4):768-773 Bally et. al. J Biol Chem. 2009 Jul 17;284(29):19340-8 Rossi et. al. 1998 J Biol Chem. 1998 Jan 9;273(2):1232-9 Lacroix et. al. J Biol Chem. 2001 Sep 28;276(39):36233-40 Tseng et. al. Mol Immunol. 1997 Jun;34(8-9):671-9 Igawa et. al. Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11):1203-7
본 발명은 항-C1s 항체 및 항-C1r 항체와 같은 항-보체 성분 항체 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 상이 항체가 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진시키는 대체(displacement) 기능을 갖는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 상기 항체가 비아코어(BIACORE)(등록상표) 칩 상에서 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 충분한 시간이 지났을 때 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체의 존재하에서 반응 단위(RU)의 값이 항체의 부재하에서의 반응 단위(RU) 값보다 낮은 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 크로스오버 시점이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초 이내인 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 2000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초 이내에 C1q의 거의 전부가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 μL/분으로 주입한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, RBC 어세이에서 인간 혈청 보체에 대해 70% 이상의 중화 활성을 갖는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, C1s에 특이적으로 결합하는 항체 또는 C1r에 특이적으로 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 상기 본 발명의 항체는 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. 추가의 실시양태에서, 상기 본 발명의 항체는 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 이온 농도에 따라 달라지는 항원-결합 활성을 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 이온 농도에 따라 달라지는 C1s-결합 활성을 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 이온 농도에 따라 달라지는 C1r-결합 활성을 갖는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1r에 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 저칼슘 농도 조건하에서보다 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 저칼슘 농도 조건하에서보다 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 저칼슘 농도 조건하에서보다 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1r에 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH 및 저칼슘 농도하에서보다 중성 pH 및 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH 및 저칼슘 농도하에서보다 중성 pH 및 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 산성 pH 및 저칼슘 농도하에서보다 중성 pH 및 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1r에 결합하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1r-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1r-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 저칼슘 농도에서 측정시 2 이상이며, 이때 상기 항-C1s 항체는 이량체 상태의 C1s에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1r-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1r-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 저칼슘 농도에서 측정시 2 이상이며, 이때 상기 항-C1s 항체는 이량체 상태의 C1r에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는, 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1r-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1r-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는, 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 2 이상이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는, 하기의 카밧(Kabat) 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 히스티딘 잔기를 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는, 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 히스티딘 잔기를 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는, 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 치환된 적어도 하나의 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는, 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 치환된 적어도 하나의 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는, pH 의존성을 갖는 항-C1s 항체는 중성 pH 조건에서 C1s에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는, pH 의존성을 갖는 항-C1r 항체는 중성 pH 조건에서 C1r에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 성분 1s(C1s)의 CUB1, EGF, 및 CUB2로 이루어진 CUB1-EGF-CUB2 도메인(상호작용 도메인 또는 CUB 도메인으로도 지칭됨)(본 설명에서는 'C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인'으로도 지칭됨)을 포함하는 영역내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 C1s의 CCP1-CCP2-SP 도메인(촉매 도메인 또는 CCP-SP 도메인으로도 지칭됨)에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체에 의해 결합된 에피토프는 C1s의 베타 도메인에 위치하지 않은 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체에 의해 결합된 에피토프는 C1s의 알파 도메인 또는 C1s의 감마 도메인에 위치한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체에 의해 결합된 에피토프는 선형 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체에 의해 결합된 에피토프는 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 291, 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 172, 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 210, 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 111, 보체 C1s 단백질의 아미노산 112 내지 210, 보체 C1s 단백질의 아미노산 131 내지 172, 또는 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 130 내의 에피토프이다. 일부 실시양태에서, C1s의 전술한 에피토프는 인간 C1s의 에피토프, 또는 바람직하게는 인간 C1s의 에피토프 및 필리핀원숭이 C1s의 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 성분 1r(C1r)의 CUB1, EGF, 및 CUB2로 이루어진 CUB1-EGF-CUB2 도메인(본 설명에서는 'C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인'으로도 지칭됨)을 포함하는 영역내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항-C1r 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 C1r의 CCP1-CCP2-SP 도메인(촉매 도메인으로도 지칭됨)에 결합하지 않는다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1r 항체에 의해 결합된 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체구조적 에피토프이다. 일부 실시양태에서, C1r의 전술한 에피토프는 인간 C1r의 에피토프, 또는 바람직하게는 인간 C1r의 에피토프 및 필리핀원숭이 C1r의 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체는 (a) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고, 이때 상기 항체는 인간-유래 또는 영장류-유래 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체는 (a) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 이때 상기 항체는 인간-유래 또는 영장류-유래 프레임워크 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1r 항체는 (a) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고, 이때 상기 항체는 인간-유래 또는 영장류-유래 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1r 항체는 (a) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 이때 상기 항체는 인간-유래 또는 영장류-유래 프레임워크 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 (a) 서열번호: 19, 20, 21, 23, 또는 24의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 26, 27, 28, 30, 또는 31의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)의 VH 서열 및 (b)의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 23, 또는 24의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 26, 27, 28, 30, 또는 31의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 23, 또는 24의 VH 서열 및 서열번호: 26, 27, 28, 30, 또는 31의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 19의 VH 서열 및 서열번호: 26의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 20의 VH 서열 및 서열번호: 27의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 21의 VH 서열 및 서열번호: 28의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 23의 VH 서열 및 서열번호: 30의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 서열번호: 24의 VH 서열 및 서열번호: 31의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 (a) 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VH 서열; (b) 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 또는 118의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 일치성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)의 VH 서열 및 (b)의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 또는 118의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110의 VH 서열 및 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 또는 118의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 103의 VH 서열 및 서열번호: 111의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 104의 VH 서열 및 서열번호: 112의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 105의 VH 서열 및 서열번호: 113의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 106의 VH 서열 및 서열번호: 114의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 107의 VH 서열 및 서열번호: 115의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 108의 VH 서열 및 서열번호: 116의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 109의 VH 서열 및 서열번호: 117의 VL 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 서열번호: 110의 VH 서열 및 서열번호: 118의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는 C1s에 결합하는 항체 단편이다. 일부 특정한 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1s 항체는 인간 IgG1 또는 인간화 IgG1이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는 C1r에 결합하는 항체 단편이다. 일부 특정한 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1r 항체는 인간 IgG1 또는 인간화 IgG1이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는 혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해 영역중에 적어도 하나의 아미노산 수식을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는 다음으로 이루어진 하기의 군에서 선택된 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역을 갖는다:
a) 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하고,
b) 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 활성화 Fc 감마 수용체에 대해서보다 더 강하며,
c) 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는 적어도 인간 C1s에 또는 바람직하게는 필리핀원숭이 C1s 및 인간 C1s 둘 다에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는 적어도 인간 C1r에 또는 바람직하게는 필리핀원숭이 C1r 및 인간 C1r 둘 다에 결합한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-C1s 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-C1r 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 항체가 생성되도록 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명의 항-C1s 항체는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1s 항체는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 한 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다.
본 발명의 항-C1r 항체는 약제로 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1r 항체는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1r 항체는 혈장으로부터 C1r의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1r 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 항-C1r 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 한 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1r이다.
본 발명의 항-C1s 항체는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않기 위한 것이다. 이와 관련하여, 혈장으로부터 C1q 클리어런스의 증대 수준은 반드시 영(제로)인 것은 아니다. 즉, 혈장으로부터 C1q 클리어런스의 증대 수준은 제로일 수 있거나, 또는 제로는 아니지만 거의 제로일 수 있거나, 또는 당해 분야의 숙련가가 기술적으로 무시하기에 충분히 비-유의적이거나 매우 낮을 수 있다. 일부 경우에서, 상기 약제는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다.
C1s/C1q 클리어런스(CL)의 증대는, 예를 들어, 다음과 같이 측정할 수 있다.
마우스 혈장내 인간 C1s 및 C1q의 전체 농도를 LC/ESI-MS/MS로 측정한다. 마우스 혈장내 정해진 양으로 인간 C1s 및 C1q를 혼합하고 희석시켜, 각각 0.477, 0.954, 1.91, 3.82, 7.64, 15.3, 30.5 마이크로그램(μg)/mL의 인간 C1s 농도 및 0.977, 1.95, 3.91, 7.81, 15.6, 31.3 및 62.5 μg/mL의 인간 C1q 농도를 생성시켜 보정 표준물을 제조한다. 2 μL의 보정 표준물 및 혈장 샘플을 50 mM/L의 중탄산암모늄 중에서 25 μL의 6.8 M/L 우레아, 9.1 mM/L 다이싸이오트레이톨 및 0.4 μg/mL 리소자임(계란 난백)과 혼합하고 56 ℃에서 45 분동안 배양하였다. 이어서, 2 μL의 500 mM/L 아이오도아세트아마이드를 첨가하고 37 ℃ 암소에서 30 분동안 배양한다. 다음으로, 50 mM/L 중탄산암모늄 중의 160 μL의 0.5 μg/mL 서열분석 등급 수식된 트립신(프로메가(Promega))을 첨가하고 37 ℃에서 밤새 배양한다. 마지막으로, 5 μL의 10% 트라이플루오로아세트산을 첨가하여 임의의 잔류 트립신을 탈활성화시킨다. 40 μL의 소화 샘플을 LC/ESI-MS/MS에 의한 어세이에 적용한다. LC/ESI-MS/MS는 2D I-등급 UPLC (워터스(Waters))가 장착된 제보(Xevo) TQ-S 3중 4중극자 기기(워터스)를 사용하여 수행한다. 인간 C1s 특이적 펩티드 LLEVPEGR 및 인간 C1q 특이적 펩티드 IAFSATR을 선택된 반응 모니터링(SRM)으로 모니터한다. SRM 전이는 인간 C1s의 경우 [M+2H]2+(m/z 456.8)에서 y6 이온(m/z 686.3)까지이고, 인간 C1q의 경우 [M+2H]2+(m/z 383.2)에서 y5 이온(m/z 581.3)까지이다. 농도에 대해 도표화된 피크 면적을 이용하여 가중(1/x2) 선형 회귀에 의해 보정 곡선을 제작한다. 마우스 혈장내 농도는 분석 소프트웨어 Masslynx Ver.4.1(워터스)을 사용하여 보정 곡선으로부터 산출한다.
마우스에서 항-C1s 항체의 투여후 전체 hC1s 및 hC1q에 대한 약동학은 다음과 같이 평가한다.
hC1s, hC1q 및 항-C1s 항체의 생체내 약동학은 항원을 단독으로(hC1q, 재조합 C1r2s2, hC1q와 rC1r2s2의 혼합물) 또는 항-C1s 항체와 함께 마우스(CB17/Icr-Prkdcscid/CrlCrl: 찰스 리버 재팬(Charles River Japan))에게 투여한 후에 평가한다. 3마리의 마우스를 각각의 투약군에 할당한다.
제일 먼저, hC1q 용액(0.84 mg/mL), rC1r2s2(0.47 mg/mL), 또는 hC1q 및 rC1r2s2(각각 0.84 및 0.47 mg/mL)를 함유하는 용액을 10 mL/kg의 용량으로 마우스에게 정맥내 주입한다. 항원 용액의 투약후에, 항-C1s 항체 용액(2.5 mg/mL)을 동일한 개체에게 동일한 방식으로 즉시 투여한다.
C1q 및 rC1r2s2의 용량 설정은 투여 직후 인간 혈장내의 생리학적 농도가 되도록 설계된다. 항-C1s 항체의 투여량은 연구동안 양 항원에 비해 과잉 농도가 되도록 조정하고, 따라서 거의 모든 hC1s가 순환시 결합된 형태일 것으로 추정된다.
혈액을 주입후 5, 30 분, 2, 7 시간, 3, 7, 14, 21 및 28 일후에 채취한다. 혈액은 즉시 원심분리시켜 혈장 샘플을 분리시킨다. hC1s 및 hC1q의 혈장 농도는 각 샘플링 시점에서 LC/ESI-MS/MS로 측정한다. hC1s 및 hC1q의 PK 파라미터들은 비-구획 어세이(피닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin) 버전 8.0, 서타라(Certara))로 평가한다.
마우스에게 (i) C1q 및 Fc 감마 수용체 결합을 둘 다 감소시키는 돌연변이를 함유하는 Fc, 또는 (ii) Fc 감마 수용체 결합은 유지하면서 C1q 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 Fc를 갖는 항체를 투여한다. 예를 들어, 본 발명에서, "SG136"의 Fc는 C1q 및 Fc 감마 수용체 결합을 둘 다 감소시키는 돌연변이를 함유하는 반면, "SG1148"의 Fc는 Fc 감마 수용체 결합은 유지하면서 C1q 결합을 감소시키는 돌연변이를 함유한다.
상기 마우스 PK 연구를 시험 항체(예를 들어, CCP1-CCP2-SP 또는 CUB1-EGF-CUB2 결합자)에 대해 수행하고, hC1q 및 hC1s의 PK 파라미터들을 산출한다. 이어서, 상기 결합자의 C1s CL 비(SG1148/SG136) 또는 상기 결합자의 C1q CL 비(SG1148/SG136)를 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체의 C1q CL 비는 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하, 1.4 이하, 1.3 이하, 1.2 이하, 1.1 이하, 1.0 이하이다.
본 발명의 항-C1r 항체는 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약제는 보체-매개 질환 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않기 위한 것이다. 일부 경우에서, 상기 약제는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1r이다.
본 발명은 또한 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1s 항체를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1s 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1s 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1s 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다.
본 발명은 또한 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1r 항체를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1r 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1r의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1r 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 본 발명의 항-C1r 항체를 투여하여 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1r이다.
보다 특히, 본 발명은 다음을 제공한다:
[1] C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진시키는 대체 기능을 갖는, 항체.
[2] 상기 항체는 비아코어 칩 상에서 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하고, 충분한 시간이 지났을 때 비아코어 어세이에 의해 측정시 항체 존재하에서의 반응 단위(RU) 값이 항체 부재하에서의 반응 단위(RU) 값보다 낮은, [1]의 항체.
[3] 하기 조건을 이용한 비아코어 어세이에 의해 측정시, 비아코어 어세이에서의 크로스오버 시점이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 또는 1000초 이내인, [2]의 항체: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터/분으로 주입한다.
[4] 하기의 조건을 이용한 비아코어 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 또는 2000초 이내에 C1q의 거의 전부가 C1qrs 복합체로부터 해리되는, [2]의 항체: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터/분으로 주입한다.
[5] C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, RBC 어세이에서 인간 혈청 보체에 대해 70% 이상의 중화 활성을 갖는, 항체.
[6] C1s에 특이적으로 결합하는 항체 또는 C1r에 특이적으로 결합하는 항체인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 항체.
[7] C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합하거나, 또는 C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합하는, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체:
1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
[8] C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, 상기 항체의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은, 항체.
[9] 상기 항체는 C1s 또는 C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 항체의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은, [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 항체.
[10] 하기 (i) 또는 (ii)에 기술된 바와 같이 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 낮은 친화성으로 C1s 또는 C1r에 결합하는, [9]의 항체:
(i) 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))가 2 이상이고,
(ii) 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))가 2 이상이다.
[11] 혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해 영역중에 적어도 하나의 아미노산 수식을 갖는 Fc 영역을 포함하는, [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 항체.
[12] Fc 영역이 다음으로 이루어진 하기의 군에서 선택된 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역인, [11]의 항체:
a) 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하고,
b) 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 활성화 Fc 감마 수용체에 대해서보다 더 강하며,
c) 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하다.
[13] 필리핀원숭이 C1s 및 인간 C1s 둘 다에 결합하거나, 또는 필리핀원숭이 C1r 및 인간 C1r 둘 다에 결합하는, [1] 내지 [12] 중 어느 하나의 항체.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
[15] 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 유효량의 [1] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
도 1a는 C1s 단백질의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 대한 항체의 결합 특이성을 도시한다. 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His 단백질에 대한 항-C1s 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램.
도 1b는 C1s 단백질의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 대한 항체의 결합 특이성을 도시한다. 천연 전효소 인간 C1s 단백질에 대한 항-C1s 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램.
도 2a는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(실선)은 임의의 C1q의 부재하에서 항체만 C1r2s2에 결합될 때의 기준선을 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 0 시간에서의 RU를 도 2a에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 2b는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(실선)은 임의의 C1q의 부재하에서 항체만 C1r2s2에 결합될 때의 기준선을 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 0 시간에서의 RU를 도 2B에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 2c는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 항체 주입시 RU를 도 2C에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 2d는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 항체 주입시 RU를 도 2D에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 3은 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 고정화된 비오틴화 천연 인간 C1q로부터 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체의 항체-매개 대체를 도시한다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 고정화된 천연 인간 C1q에 결합하도록 흘려보낸 후, C1r2s2의 해리율을 모니터하기 위해 버퍼를 단독으로 흘려보내거나(실선) 또는 C1r2s2를 해리시키기 위해 항체를 흘려보냈다(점선).
도 4는 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체에 대한 천연 인간 C1q 결합의 항체-매개 차단을 도시한다. C1q 차단 기능을 갖는 항체는 C1r2s2에 대한 결합에 있어서 C1q와 경합하였다.
도 5는 인간 혈청 보체 활성의 중화를 도시한다.
도 6은 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 결합하는 항체의 경합적 에피토프 비닝 결과를 도시한다.
도 7은 마우스에서 항-C1s 항체의 투여후 인간 C1s 및 인간 C1q의 약동학을 도시한다.
도 8은 항-C1s 항체에 의한 인간 혈청 보체 활성의 시간 의존성 중화를 도시한다.
도 9는 환원 및 비-환원 웨스턴 블로팅 어세이에서 천연 인간 전효소 C1s에 대한 항체 결합을 도시한다.
도 10은 환원 웨스턴 블롯에서 절두된 C1s 단백질에 대한 항체 결합을 도시한다.
도 11a는 C1r 단백질의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 대한 항체의 결합 특이성을 도시한다. 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-FLAG 단백질에 대한 항-C1r 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램.
도 11b는 C1r 단백질의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 대한 항체의 결합 특이성을 도시한다. 천연 인간 C1r 효소에 대한 항-C1r 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램.
도 12a는 비아코어(등록상표) 센서 표면 위에 포획된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(실선)은 임의의 C1q의 부재하에서 항체만 C1r2s2에 결합될 때의 기준선을 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 0 시간에서의 RU를 도 12A에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 12b는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 포획된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(작은 점선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(큰 점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(실선)은 임의의 C1q의 부재하에서 항체만 C1r2s2에 결합될 때의 기준선을 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 0 시간에서의 RU를 도 12B에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 12c는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 포획된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 항체 주입시 RU를 도 12C에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 12d는 비아코어(등록상표) 센서 표면위에 포획된 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로부터 천연 인간 C1q의 항체-매개 대체를 도시한다. 상기 항체에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상의 C1qrs의 안정한 포획을 기술한다. 센서그램 2(점선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터 C1q의 대체를 기술한다. 상기 센서그램들의 비교를 위해, 항체 주입시 RU를 도 12D에서 정규화(즉, 동일하게 설정)시킨다.
도 13은 인간 혈청 보체 활성의 중화를 도시한다.
본 명세서에 기술되거나 참조된 기법 및 절차들은 당해 분야의 숙련가들에 의해 일반적으로 충분히 이해되며 통상적인 방법, 예를 들어, 하기의 문헌들에 기술된 널리 사용되는 방법들을 이용하여 통상적으로 사용된다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 문헌[March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당해 분야의 숙련가에게 본 출원에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개를 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 명세서를 해석하기 위해서 하기의 정의들을 적용할 것이며, 적합한 경우는 언제든, 단수로 사용되는 용어들은 또한 복수를 포함하고 이와 반대도 마찬가지일 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정한 실시양태들을 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기에 나타낸 임의의 정의가 본 명세서에 참고로 인용된 임의의 문서와 충돌하는 경우에, 하기에 나타낸 정의에 따를 것이다.
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는, 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"친화성"은 분자(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원)의 단일 결합 부위간의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 방법들을 포함하여 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 대표적인 실시양태들을 하기에 기술한다. "친화성", "결합 친화성", "결합 능력" 및 "결합 활성"은 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "결합 활성"은 한 분자(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원)의 단일 이상의 결합 부위들 간의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 본 명세서에서, 결합 활성은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 활성으로 엄격히 제한되지 않는다. 결합쌍의 구성원들이 1가 및 다가 결합 둘 다의 방식으로 서로에 결합할 수 있는 경우, 결합 활성은 이들 결합들의 총합의 강도이다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 결합 활성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 또는, 결합 속도 및 해리 속도(Kon 및 Koff)를 결합 평가에 사용할 수 있다. 결합 활성은 본 명세서에 기술된 방법들을 포함하여 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 대표적인 실시양태들을 하기에 기술한다.
"친화성 성숙된" 항체는, 개변을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변성 영역(HVR)에 하나 이상의 개변, 예를 들어, 항원에 대한 상기 항체의 친화성을 개선시키는 개변을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-C1s 항체" 및 "C1s에 결합하는 항체"는 항체가 C1s를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 C1s와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-C1s 단백질에 대한 항-C1s 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사성면역어세이(RIA)에 의해 측정시 C1s에 대한 상기 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, C1s에 결합하는 항체는 1 마이크로몰(μM) 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-C1s 항체는 상이한 종으로부터의 C1s 중에서 보존되는 C1s의 에피토프에 결합한다.
용어 "항-C1r 항체" 및 "C1r에 결합하는 항체"는 항체가 C1r을 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 C1r과 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-C1r 단백질에 대한 항-C1r 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사성면역어세이(RIA)에 의해 측정시 C1r에 대한 상기 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, C1r에 결합하는 항체는 1 마이크로몰(μM) 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-C1r 항체는 상이한 종으로부터의 C1r 중에서 보존되는 C1r의 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조물들을 포함한다.
"항체 단편"은 완전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 완전한 항체의 일부를 포함하는, 완전한 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경합 어세이에서 그 항원에 대한 상기 기준 항체의 결합을 차단하는 항체, 및 반대로, 경합 어세이에서 그 항원에 대한 상기 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 기준 항체를 지칭한다. 예시적인 경합 어세이가 본 명세서에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 보유한 정상 도메인 또는 정상 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 서브클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상기 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 정상 도메인들을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "세포상해제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포상해제는 방사성 동위원소(예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터캘레이트제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 핵산분해 효소; 항생제; 단편 및/또는 그의 변이체를 포함한 독소, 예를 들어, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
"이펙터 기능"은, 항체의 아이소타입에 따라 변하는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포상해(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포상해(ADCC); 탐식작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
어느 제, 예를 들어, 약학 제형의 "유효량"은 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 목적하는 치료 또는 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정 아미노산들을 포함한다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자들의 화학 활성 표면 집단들을 포함할 수 있으며, 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중의 표적 항원상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 정상 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(잔기 446-447)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은 EU 넘버링 체계(EU 지수로도 지칭된다)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL) 중에 하기의 서열로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "완전한 항체" 및 "전체 항체"는 본 명세서에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 호환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 일치하지 않을 수도 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 처음에 형질전환된 세포 중에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 특별히 제외한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 보편적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 서브그룹은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 서브그룹이다. 한 실시양태에서, 상기 VL에 대한 서브그룹은 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 한 실시양태에서, 상기 VH에 대한 서브그룹은 카밧 등의 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 정상 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열이 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR, 즉 VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함한, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기들(예를 들어, FR 잔기)은 본 명세서에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 붙여진다.
"이뮤노컨주게이트"는 세포상해제를 포함하지만 이로 한정되지는 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 컨주게이트된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시 95% 초과 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 핵산 분자를 통상적으로 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"항-C1s 항체를 코딩하는 단리된 핵산" 또는 "항-C1r 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편)를 지칭하며, 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기 핵산 분자(들), 및 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은, 예를 들어, 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 제조시에 발생하는 가능한 변이 항체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 일치하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, "단일클론"이란 수식어는 항체들의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 것으로서 상기 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법들 및 단일클론 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법들은 본 명세서에 기술되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어, 세포상해 부분) 또는 방사성표지에 컨주게이트되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 돌턴의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 3개의 정상 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 정상 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 정상 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"첨부 문서"란 용어는 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하며, 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"는, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 달성하도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후에, 상기 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 상기 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어, 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록 상표)(제네틱스 캄파니, 리미티드(Genetyx Co., Ltd.))를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬시키기에 적합한 파라미터들을 결정할 수 있다.
상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에게 저작권이 있으며, 소스 코드가 미국 저작권 사무소(미국 워싱턴 DC 20559 소재)에 사용자 문서(미국 저작권 등록번호 TXU510087하에 등록되어 있다)와 함께 제출되었다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함한 유닉스 실행 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교에 사용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대한 %아미노산 서열 동일성(다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대해 특정한 %아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 다음과 같이 계산한다:
100 x 분율 X/Y;
여기에서, X는 A 및 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다. 상기 아미노산 서열 A의 길이가 상기 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 %아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 %아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 알 것이다. 특별히 달리 서술되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 %아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이면서 상기 제형이 투여되는 대상에게 허용불가능하게 독성인 추가 성분들은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 외에, 대상에게 무독성인, 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 버퍼, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합한다"는 어구는, 배경(즉, 비-특이적) 결합은 포함하지만 유의적(즉, 특이적) 결합은 포함하지 않는 결합 수준으로 비관심 항원에 결합하는 항체의 활성 또는 특성을 지칭한다. 즉, "특이적으로 결합한다"는 배경(즉, 비-특이적) 결합에 더해 또는 그 대신에 유의적(즉, 특이적) 결합을 포함하는 결합 수준으로 관심 항원에 결합하는 항체의 활성 또는 특성을 지칭한다. 상기 특이성은 본 명세서에 언급되거나 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 전술된 비-특이적 또는 배경 결합의 수준은 제로이거나 또는 제로는 아니지만 거의 제로일 수 있거나 또는 당해 분야의 숙련가들이 기술적으로 무시하기에 충분히 매우 낮을 수 있다. 예를 들어, 숙련가가 적합한 결합 어세이에서 항체와 비관심 항원 사이의 결합에 대해 어떤 유의적인(또는 비교적 강한) 신호도 검출하거나 관찰할 수 없는 경우, 상기 항체는 상기 비관심 항원"에 특이적으로 결합하지 않는다"라고 할 수 있다. 대조적으로, 숙련가가 적합한 결합 어세이에서 항체와 관심 항원 사이의 결합에 대해 임의의 유의적인(또는 비교적 강한) 신호를 검출하거나 관찰할 수 있는 경우, 상기 항체는 상기 관심 항원"에 특이적으로 결합한다"고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "C1s"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C1s를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 미가공된 C1s 뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯된 임의 형태의 C1s도 포함한다. 상기 용어는 또한 C1s의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 C1s의 아미노산 서열을 서열번호: 1에 나타내었다. 예시적인 필리핀원숭이 원숭이 및 래트 C1s의 아미노산 서열들도 각각 서열번호: 3 및 2에 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "C1r"은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C1r을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 미가공된 C1r 뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯된 임의 형태의 C1r도 포함한다. 상기 용어는 또한 C1r의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 C1r의 아미노산 서열을 서열번호: 4에 나타내었다. 예시적인 필리핀원숭이 원숭이 및 래트 C1r의 아미노산 서열들도 각각 서열번호: 5 및 6에 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적인 과정을 개변시키고자 하는 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 상기 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원 결합에 관련된 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원과 결합하는 항체는 상기 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리되어 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 문헌[Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 상기 벡터에 결합되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제성 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 상기 벡터가 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭한다.
II. 조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체 및 그의 용도에 기반한다. 특정 실시양태에서, C1s에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, C1r에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 보체-매개 질환 또는 질병의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-보체 성분 항체
한 양태에서, 본 발명은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 항체가 C1qrs 복합체에 결합하고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하게 하는 대체 기능을 갖는 단리된 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 C1s에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은, 그 결합 활성이 이온 농도에 따라 달라지는, C1s에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-C1s 항체의 결합 활성은 pH, 즉, 수소 이온(양성자) 농도에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 항-C1s 항체의 결합 활성은 칼슘 농도에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 항-C1s 항체의 결합 활성은 pH 및 칼슘 농도 둘 다에 따라 달라진다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 C1r에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은, 그 결합 활성이 이온 농도에 따라 달라지는, C1r에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-C1r 항체의 결합 활성은 pH, 즉, 수소 이온(양성자) 농도에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 항-C1r 항체의 결합 활성은 칼슘 농도에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 항-C1r 항체의 결합 활성은 pH 및 칼슘 농도 둘 다에 따라 달라진다.
'실시양태의 설명' 부분 전체에 걸쳐, 용어 "C1s"는 항-C1s 항체에 특이적인 서열, 및 C1s 단백질에 특이적인 서열 및 도메인에 관한 설명을 제외하고 "C1r"로 대체될 수 있다.
상기와 같은 항체들은, 환자에서 투여 용량 및 횟수가 감소될 수 있고 결과적으로 전체 투여량이 감소될 수 있기 때문에, 약제로서 특히 우수할 것으로 예상된다. 항-C1s 항체는 C1qrs 복합체에 결합하고 혈장으로부터 C1qrs 복합체를 제거하는 항체에 비해 우수한 안전성 프로필을 가질 것으로 예상되는데, 그 이유는 이들이 혈장으로부터 C1r2s2만을 제거(C1s로의 결합을 통해)하고 혈장으로부터 C1q는 제거하지 않을 것이기 때문이다. 결과적으로, C1q 고갈과 연관된 부작용이 방지될 수 있다. 또한, C1q의 신속한 대체를 갖는 항체는 보체 활성의 더 빠른 중화를 가질 것으로 예상되며, 이것은 치료 효능의 더 빠른 개시로 이어질 수 있다.
(비아코어(등록상표)/대체 개념)
한 양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 표면 플라즈몬 공명 어세이를 위한 칩, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 칩 상에서 C1qrs 복합체에 결합하는 항체이고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진한다. 일부 양태에서, 상기 언급된 C1qrs 복합체에 결합하고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하는 기능은 본 명세서에서 "대체 기능/활성" 또는 "C1q 대체 기능/활성"으로 지칭된다. 상기 기능/활성은 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 정성적으로 또는 정량적으로 적절히 평가할 수 있다. 추가의 양태에서, 본 발명의 항체는, 항체의 존재하에서 반응 단위(RU)의 값이 충분한 시간이 지났을 때 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체의 부재하에서의 반응 단위(RU) 값보다 낮은 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다. 상기와 같은 어세이에서 수득된 센서그램에서, 항체 부재하에 C1q의 존재하에서의 곡선이 C1q 및 항체 존재하에서의 곡선과 교차하는 "크로스오버 시점"을 확인할 수 있다(상세사항에 대해 실시예 참조). 엄격하게, 상기 전자의 곡선과 교차시 상기 후자의 곡선의 노이즈 또는 진동으로 인해 단일 센서그램에서도 다수의 크로스오버 시점이 관찰될 수 있다. 상기와 같은 경우에서, 상기 다수의 크로스오버 시점들 중 임의의 시점을 "크로스오버 시점"으로 선택할 수 있다. "충분한 시간이 지난"은 반응 단위(RU) 값의 측정 시점이 측정을 위한 "크로스오버 시점"보다 충분히 이후인 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 반응 단위(RU) 값의 측정 시점은 항체 주입 시작 시점 후 적어도 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초이다. 또는, 상기 측정 시점은 크로스오버 시점 후 적어도 100초, 200초, 300초, 400초, 500초, 600 초, 700초, 800초, 900초, 1000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초일 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 크로스오버 시점(예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에서)이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초 이내인 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다.
한 양태에서, 본 발명의, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 2000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초 이내에 C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 μL/분으로 주입한다. 예를 들어, 상기와 같은 어세이에서 수득된 센서그램에서, C1q 및 항체의 존재하에서의 값(RU)이 C1q 부재하에 항체 존재하에서의 값(RU)과 근접하거나 상기 값에 이르는 경우, "C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 것"을 측정할 수 있다. 본 명세서에서, "(C1q의) 거의 전부"는 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 백분율을 지칭하고; "(C1q의) 전부"는 100%의 백분율을 지칭한다. 해리된 C1q의 백분율은 본 명세서에 기술된 임의의 어세이에 의해 정량적으로 측정할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 상기 항체의 "대체 기능/활성"을 측정하는 전술된 방법을 이용하여, C1r2s2 복합체로부터 C1q를 대체하는 항체를 선별하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 선별 방법은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체를 선택하는 것; 즉, C1qrs 복합체에 결합하고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 상기 대체 기능/활성을 갖는 항체는 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 적절히 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, 충분한 시간이 지났을 때, 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에 의해, (i) 항체 존재하에서의 반응 단위(RU)의 값, 및 (ii) 항체 부재하에서의 반응 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함한다. 상기 선별 방법은 상기 (i)의 값과 상기 (ii)의 값을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 상기 선별 방법은 상기 (i)의 값이 상기 (ii)의 값보다 낮은 경우 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 상기 선별 방법은, 항체 부재하에 C1q 존재하에서의 곡선이 C1q 및 항체 존재하에서의 곡선과 교차하는 "크로스오버 시점"을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 단일 센서그램에서도 다수의 크로스오버 시점이 관찰될 수 있으며, 상기 다수의 크로스오버 시점들 중 임의의 시점을 "크로스오버 시점"으로 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은 항체 주입 시작 시점 후 적어도 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초에 반응 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 상기 선별 방법은 크로스오버 시점 후 적어도 100초, 200초, 300초, 400초, 500초, 600초, 700초, 800초, 900초, 1000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초에 반응 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체, 또는 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체의 크로스오버 시점이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초 이내인 경우 대체 기능을 갖는 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체, 또는 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 2000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초 이내에 C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 경우 대체 기능을 갖는 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다. 상기 언급된 바와 같이, "(C1q의) 거의 전부"는 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 백분율을 지칭하고, "(C1q의) 전부"는 100%의 백분율을 지칭하며, 해리된 C1q의 백분율은, 비아코어(등록상표) 어세이를 포함하여 본 명세서에 기술된 임의의 어세이에 의해 정량적으로 측정할 수 있다.
(비아코어(등록상표)/차단 개념)
한 양태에서, 본 발명은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체를 제공하며, 이때 상기 항체는, 상기 항체가 C1r2s2에 결합하여 C1q의 C1r2s2로의 결합을 억제하는 차단 기능을 갖는다. 추가의 양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 차단 비를 갖는다. 상기 차단 기능/활성 또는 차단 비는 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 측정할 수 있다. C1q 차단 수준을 평가하기 위해 하기의 조건을 이용할 수 있다: C1r2s2의 포획 수준은 50, 100, 200, 400 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 항체 변이체를 250, 500, 1000, 2000 nM으로 주입하여 항체 결합을 포화시킨 후, 250, 500, 1000, 2000 nM의 항체 변이체의 존재 또는 부재하에 인간 C1q를 50, 100, 200 nM으로 주입한다. 차단 비는 다음 식으로 산출한다: [1-(항체 변이체 존재하의 인간 C1q 결합 반응/항체 변이체 부재하의 인간 C1q 결합 반응)] x 100%.
(pH 의존성)
한 양태에서, 본 발명의 항체는 pH-의존성 방식으로 C1s와 같은 항원에 결합하거나 C1r2s2에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는(C1s로의 결합을 통해) 단리된 항체를 제공하며, 이때 항원-결합 활성(즉, C1s에 대한 결합 활성)은 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 항체의 항원-결합 활성은 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮다.
pH-의존성 방식으로 C1s에 결합하는 것 외에, C1s에 대한 pH-의존성 항체의 친화성에 대한 칼슘의 영향은 또 다른 중요한 특성일 수 있다. C1s는 고칼슘 농도에서 이량체를 형성하지만 저칼슘 농도에서는 단량체로 해리된다. C1s가 이량체 상태인 경우, 2가 항체는 다중 C1s 분자를 가교결합시킴으로써 면역 복합체를 형성할 수 있다. 이에 의해 상기 항체는 친화성 및 결합력 상호작용 둘 다에 의해 복합체내의 C1s 분자에 결합하게 되고, 따라서 항체의 겉보기 친화성을 증가시킨다. 대조적으로, C1s가 단량체 상태인 경우, 상기 항체는 C1s에 대한 친화성 상호작용에 의해서만 결합한다. 이것은 pH-의존성 C1s 항체가 혈장내에서 이량체 C1s와 면역 복합체를 형성할 수 있지만, 일단 산성 엔도솜내에서는 C1s가 단량체로 해리될 것임을 의미한다. 이것은 면역 복합체의 분해를 초래하고, 이것은 이어서 항원으로부터 항체의 pH-의존성 해리를 증대시킨다.
한 양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다. 한 양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 저칼슘 농도에서 측정시 2 이상이며, 이때 상기 항-C1s 항체는 이량체 상태의 C1s에 결합한다.
특정 이론에 결부되지 않고, 1) 본 발명의 항체가 결합된 C1s의 에피토프 구조가 칼슘의 부재에 의해 입체구조적으로 변화됨으로써 항체의 친화성을 변화시킬 수 있거나, 또는 2) 본 발명 항체의 상호작용(친화성 또는 결합력)이 C1s의 조건(단량체 상태 또는 이량체 상태)에 따라 달라질 수 있는 경우에, 상기 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))를 평가하기 위해 특정 조건(중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서)을 사용한 측정을 이용할 수 있다.
즉, 본 발명의 항체는 하기 (i) 또는 (ii)에 기술된 바와 같이 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다:
(i) 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 2 이상이고,
(ii) 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 2 이상이다.
보다 일반적으로, 특정 이론에 결부되지 않고, 1) 본 발명 항체가 결합된 특정 항원의 에피토프 구조가 칼슘의 부재에 의해 입체구조적으로 변화됨으로써 항체의 친화성을 변화시킬 수 있거나, 또는 2) 본 발명 항체의 상호작용(친화성 또는 결합력)이 항원의 조건(단량체 상태 또는 이량체 상태)에 따라 달라질 수 있는 경우에, 상기 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))를 평가하기 위해 특정 조건(중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서)을 사용한 측정을 이용할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 항체는 다음과 같이, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 항원에 결합한다: 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서의 항원 결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 항원 결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 2 이상이다.
전술된 KD 비, 즉, KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 모 항체(즉, 본 발명의 수식 전의 원래 항체)와 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예를 들어, 부가, 삽입, 결실 또는 치환)가 원래 (모) 항체에 대해 도입된 항체 사이에 비교될 수 있다. 원래의 (모) 항체는 C1s에 특이적으로 결합하는 한 임의의 알려져 있거나 새로 단리된 항체일 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 원래 (모) 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))보다 적어도 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 8배, 10배 더 높다. 즉, 본 발명은, 모(원래) 항체로부터 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예를 들어, 부가, 삽입, 결실 또는 치환)가 도입되고, 하기 (i) 대 (ii)의 비가 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 8, 또는 10인 단리된 항-C1s 항체를 제공한다: (i) 단리된 항-C1s 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH)); (ii) 모(원래) 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH)). 상기 KD 비는 임의의 (높거나 낮은) 칼슘 농도에서 측정될 수 있다, 예를 들어, 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정되거나 또는 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 항체는 세포내 조건 및 세포외 조건 사이에서 상이한 항원-결합 활성을 갖는다. 세포내 및 세포외 조건은 세포의 내부와 외부 사이에서 상이한 조건을 지칭한다. 조건의 범주는, 예를 들어, 이온 농도, 보다 특히는 금속 이온 농도, 수소 이온 농도(pH) 및 칼슘 이온 농도를 포함한다. "세포내 조건"은 바람직하게는 엔도솜 내부의 환경에 대한 환경 특징을 지칭하는 반면, "세포외 조건"은 혈장 내 환경에 대한 환경 특징을 지칭한다. 이온 농도에 따라 변하는 항원-결합 활성을 갖는 특성을 가진 항체는 다수의 항체들을 상기 특성을 갖는 도메인에 대해 선별함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 전술한 특성을 갖는 항체는, 하이브리도마 방법 또는 항체 라이브러리 방법에 의해 그 서열이 서로 상이한 다수의 항체들을 생성하고 상이한 이온 농도에서 그들의 항원 결합 활성을 측정함으로써 수득할 수 있다. B 세포 클로닝 방법은 상기 항체들을 선별하는 방법의 예들 중 하나이다. 또한, 하기에 기술하는 바와 같이, 항체에 이온 농도에 따라 변하는 항원-결합 활성을 갖는 특성을 부여할 수 있는 적어도 하나의 특유의 아미노산 잔기가, 공통 구조로서 상기 특유의 아미노산 잔기를 공유하면서 상이한 서열을 갖는 다수의 항체들의 라이브러리로서 제조하기 위해, 명시되어 있다. 상기 라이브러리를 선별하여 전술한 특성을 갖는 항체를 효과적으로 단리할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 C1s에 대한 pH-의존성 결합을 나타내는 항-C1s 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "pH-의존성 결합"이란 표현은 "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"을 의미하고, 상기 두 표현 모두 호환적일 수 있다. 예를 들어, "pH-의존성 결합 특징을 갖는" 항-C1s 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다.
특정 실시양태에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시 2 이상이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 2, 3, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다.
전술된 경우들에서, 예를 들어, 산성 pH는 5.8이고 중성 pH는 7.4이므로, KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)이다. 이와 관련하여, 산성 pH 및 중성 pH의 예들은 본 명세서에서 이후에 상세히 기술한다. 일부 실시양태에서, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)와 같은 KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 2 내지 10,000일 수 있다.
항원이 가용성 단백질인 경우, 상기 항원에 대한 항체의 결합은 혈장내 항원의 연장된 반감기(즉, 혈장으로부터 상기 항원의 감소된 클리어런스)를 야기할 수 있는데, 그 이유는 상기 항체가 항원 자체보다 혈장에서 더 긴 반감기를 가질 수 있으며 상기 항원에 대한 담체로 작용할 수 있기 때문이다. 이것은 세포내 엔도솜 경로를 통해 FcRn에 의한 항원-항체 복합체의 재순환에 기인한다(문헌[Roopenian and Akilesh (2007) Nat Rev Immunol 7(9): 715-725]). 그러나, 세포내로의 진입후에 항원을 산성 엔도솜 구획으로 방출시키면서 중성 세포외 환경에서 그의 항원에 결합하는, pH-의존성 결합 특징을 갖는 항체는, pH-비의존성 방식으로 결합하는 그의 상대에 비해 항원 중화 및 클리어런스의 면에서 우수한 특성을 갖는 것으로 예상된다(문헌[Igawa et al (2010) Nature Biotechnol 28(11); 1203-1207]; 문헌[Devanaboyina et al (2013) mAbs 5(6): 851-859]; 국제 특허출원 공개: WO 2009/125825).
한 양태에서, 본 발명은 저칼슘 농도 조건하에서보다 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명에서, 바람직한 금속 이온은, 예를 들어, 칼슘 이온을 포함한다. 칼슘 이온은 골격근, 평활근 및 심장근과 같은 근육의 수축; 백혈구의 이동, 탐식작용 등의 활성화; 혈소판의 형태 변화, 분비 등의 활성화; 림프구의 활성화; 히스타민 분비를 포함한 비만 세포의 활성화; 카테콜아민 알파 수용체 또는 아세틸콜린 수용체에 의해 매개된 세포 반응; 세포외배출; 뉴런 말단으로부터 전달 물질의 방출; 및 뉴런에서 축삭형질 흐름을 포함한, 많은 생물학적 현상들의 조절에 관련된다. 알려진 세포내 칼슘 이온 수용체는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민 및 미오신 경쇄를 포함하며, 이들은 다수의 칼슘 이온-결합 부위를 가지고 분자 진화 면에서 공통 기원으로부터 유래되는 것으로 생각된다. 또한 많은 공지된 칼슘-결합 모티프들이 있다. 상기 공지된 모티프는, 예를 들어, 카데린 도메인, 칼모듈린의 EF-핸드, 단백질 키나제 C의 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 인자 IX의 G1a 도메인, 아시아로당단백질 수용체 및 만노스-결합 수용체의 C-형 렉틴, LDL 수용체의 A 도메인, 아넥신, 3형 트롬보스폰딘 도메인, 및 EGF-유사 도메인을 포함한다.
본 발명에서, 금속 이온이 칼슘 이온인 경우, 항원-결합 활성은 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 것이 바람직하다. 한편, 세포내 칼슘 이온 농도는 세포외 칼슘 이온 농도보다 낮다. 반대로, 세포외 칼슘 이온 농도는 세포내 칼슘 이온 농도보다 높다. 본 발명에서, 저칼슘 이온 농도는 바람직하게는, 생체내 초기 엔도솜내 칼슘 이온 농도와 가까운 0.1 마이크로몰(μM) 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 0.5 μM 내지 10 μM, 및 특히 바람직하게는 1 μM 내지 5 μM이다. 한편, 본 발명에서, 고칼슘 이온 농도는 바람직하게는, 혈장내(혈중) 칼슘 이온 농도와 가까운 100 μM 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 200 μM 내지 5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.5 mM 내지 2.5 mM이다. 본 발명에서, 저칼슘 이온 농도는 엔도솜내 칼슘 이온 농도이고, 고칼슘 이온 농도는 혈장내 칼슘 이온 농도인 것이 바람직하다. 항원-결합 활성 수준을 저칼슘 및 고칼슘 이온 농도 사이에서 비교하는 경우, 본 발명 항체의 결합은 저칼슘 이온 농도에서보다 고칼슘 이온 농도에서 더 강한 것이 바람직하다. 즉, 본 발명 항체의 항원-결합 활성은 고칼슘 이온 농도에서보다 저칼슘 이온 농도에서 더 낮은 것이 바람직하다. 결합 활성 수준을 해리 상수(KD)로 나타내는 경우, KD(저칼슘 이온 농도)/KD(고칼슘 이온 농도)의 값은 1보다 크고, 바람직하게는 2 이상, 보다 더 바람직하게는 10 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상이다. KD(저칼슘 이온 농도)/KD(고칼슘 이온 농도) 값의 상한치는 특별히 제한되지 않으며, 숙련된 전문가의 기술로 생성될 수 있는 한 100, 400, 1000, 또는 10000과 같은 임의의 값일 수 있다. KD 대신 해리 속도 상수(kd)를 사용하는 것도 가능하다. KD 값을 산출하는 것이 어려운 경우, 상기 활성은 애널라이트이 동일한 농도로 통과할 때 비아코어(등록상표)에서의 결합 반응 수준에 근거하여 평가할 수 있다. 항원이 본 발명의 항원-결합 분자가 고정화된 칩 위로 통과할 때, 저칼슘 농도에서의 결합 반응은 바람직하게는 고칼슘 농도에서의 결합 반응의 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 보다 더 바람직하게는 1/5 이하, 및 특히 바람직하게는 1/10 이하이다. 일반적으로 생체내 세포외 칼슘 이온 농도(예를 들어, 혈장내)는 높고 세포내 칼슘 이온 농도(예를 들어, 엔도솜내)는 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서, 세포외 조건은 고칼슘 이온 농도이고 세포내 조건은 저칼슘 이온 농도인 것이 바람직하다. 항원-결합 활성이 세포외 칼슘 이온 농도 조건하에서보다 세포내 칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 특성이 본 발명의 항원-결합 분자(예를 들어, 항체)에 부여되는 경우, 세포 외부에서 본 발명의 항원-결합 분자에 결합된 항원은 세포 내부에서 본 발명의 항원-결합 분자로부터 해리됨으로써, 세포 외부로부터 세포 내로의 항원 혼입을 증대시킨다. 상기 항체는, 생체에 투여시, 생체내에서 혈장내 항원 농도를 감소시키고 항원의 생리학적 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 유용하다. 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인 또는 항체를 선별하는 방법은, 예를 들어, WO2012/073992 호(예를 들어, 단락 0200 내지 0213)에 기술된 방법을 포함한다. 본 발명의 항원-결합 도메인에 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 항원에 보다 약하게 결합하는 특성을 부여하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 방법들은 일본 특허출원 제 2011-218006 호에 기술되어 있으며, 예를 들어, 항원-결합 도메인중 적어도 하나의 아미노산 잔기를 금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기로 치환시키고/시키거나 항원-결합 도메인내에 금속 킬레이트화 활성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 방법을 포함한다. 항원-결합 도메인의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고/되거나 금속 킬레이트화 활성을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원-결합 도메인내에 삽입된 본 발명의 항원-결합 분자가 본 발명의 항원-결합 분자의 바람직한 실시양태이다.
금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 칼슘 이온 농도에 따라 항원 결합 도메인의 항원-결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기는 바람직하게는, 예를 들어, 칼슘-결합 모티프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 칼슘-결합 모티프는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 상세하게 기술되었다(예를 들어, 문헌[Springer et al., (Cell (2000) 102, 275-277)]; 문헌[Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490)]; 문헌[Moncrief et al., (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562)]; 문헌[Chauvaux et al., (Biochem. J. (1990) 265, 261-265)]; 문헌[Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456)]; 문헌[Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419)]; 문헌[Schaefer et al., (Genomics (1995) 25, 638 to 643)]; 문헌[Economou et al., (EMBO J. (1990) 9, 349-354)]; 문헌[Wurzburg et al., (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)]). 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민 및 미오신 경쇄의 EF 핸드; 단백질 키나제 C의 C2 도메인; 혈액 응고 단백질 인자 IX의 G1a 도메인; 아시아로당단백질 수용체 및 만노스-결합 수용체의 C-형 렉틴, ASGPR, CD23, 및 DC-SIGN; LDL 수용체의 A 도메인; 아넥신 도메인; 카데린 도메인; 3형 트롬보스폰딘 도메인; 및 EGF-유사 도메인이 바람직하게 칼슘 결합 모티프로 사용된다.
본 발명의 항원-결합 도메인은 칼슘 이온 농도에 따라 항원-결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기, 예를 들어, 금속 킬레이트화 활성을 갖는 전술한 아미노산 잔기, 및 칼슘-결합 모티프를 형성하는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 항원-결합 도메인에서 상기 아미노산 잔기의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 이들은 항원 결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변하는 한 임의의 위치에 위치할 수 있다. 한편, 상기 아미노산 잔기는, 상기 항원 결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변하는 한, 단독으로 또는 2개 이상의 조합으로 함유될 수 있다. 아미노산 잔기는 바람직하게는, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 항원-결합 도메인이 항체 가변 영역인 경우, 아미노산 잔기는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 중쇄 가변 영역의 CDR3에, 보다 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR3 중 카밧 넘버링에 따른 위치 95, 96, 100a 및/또는 101에 함유될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR1에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR1 중 카밧 넘버링에 따른 위치 30, 31 및/또는 32에 함유될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR2에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR2 중 카밧 넘버링에 따른 위치 50에 함유될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR3에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR3 중 카밧 넘버링에 따른 위치 92에 함유될 수 있다.
또한, 전술한 실시양태들을 조합하는 것이 가능하다. 예를 들어, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 선택된 2개 또는 3개의 CDR에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역 중 카밧 넘버링에 따른 위치 30, 31, 32, 50 및/또는 92 중 임의의 하나 이상에 함유될 수 있다.
칼슘 이온 농도에 따라 항원-결합 활성을 변화시키는 전술한 아미노산 잔기를 공통 구조로 공유하면서 상이한 서열을 갖는 다수의 항원-결합 도메인들을 라이브러리로서 제조한다. 상기 라이브러리를 선별하여, 그의 항원-결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변화되는, 목적 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항원-결합 도메인을 효과적으로 수득할 수 있다.
본 개시의 목적을 위해, C1s에 대한 항체의 "친화성"은 항체의 KD의 항으로 표현된다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 항원에 대한 항체 결합에 있어서 KD 값이 클수록, 상기 특정 항원에 대해 그의 결합 친화성은 더 약하다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성"(또는 등가의 표현 "pH-의존성 결합")이란 표현은 산성 pH에서의 항체의 KD가 중성 pH에서의 항체의 KD보다 더 큰 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 항체는, 산성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD가 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 2배 더 큰 경우, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 KD하에 산성 pH에서 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 결합 특성은 또한 항체의 kd의 항으로 표현할 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원에 관하여 항체의 해리 속도 상수를 지칭하며, 초의 역수(즉, 초-1)의 항으로 나타낸다. kd 값의 증가는 그 항원에 대한 항체의 더 약한 결합을 의미한다. 그러므로, 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높은 kd 값 하에 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 kd보다 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 kd 하에 산성 pH에서 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"은 산성 pH에서의 항체의 KD 값 대 중성 pH에서의 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, 항체가 2 이상의 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C1s에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"은 산성 pH에서의 항체의 kd 값 대 중성 pH에서의 항체의 kd 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, 항체가 2 이상의 산성/중성 kd 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C1s에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "산성 pH"란 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"란 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5의 pH 값을 포함한다. 특정 양태에서, "산성 pH"는 5.8 또는 6.0이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중성 pH"란 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"란 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0의 pH 값을 포함한다. 특정 양태에서, "중성 pH"는 7.0 또는 7.4이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"라는 표현은 혈장내(혈중) 칼슘 이온 농도에 가까운 100 μM 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 200 μM 내지 5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.5 mM 내지 2.5 mM을 의미한다. "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"라는 표현은 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 0.5 mM, 0.7 mM, 0.9 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 및 10 mM Ca2+의 칼슘 농도 값을 포함한다. 특정한 양태에서, "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"는 1.2 mM Ca2+를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"라는 표현은 생체내에서 초기 엔도솜내 칼슘 이온 농도에 가까운 0.1 μM 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 0.5 μM 내지 10 μM, 및 특히 바람직하게는 1 μM 내지 5 μM을 의미한다. "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"라는 표현은 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2.0 μM, 2.5 μM, 2.6 μM, 2.7 μM, 2.8 μM, 2.9 μM, 3.0 μM, 3.1 μM, 3.2 μM, 3.3 μM, 3.4 μM, 3.5 μM, 4.0 μM, 5.0 μM, 6.0 μM, 7.0 μM, 8.0 μM, 9.0 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 및 30 μM Ca2+의 칼슘 농도 값을 포함한다. 특정한 양태에서, "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"는 3.0 μM Ca2+를 지칭한다.
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, KD 값 및 kd 값은 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라즈몬 공명-기반 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어, 본 명세서 실시예 2 참조). KD 값 및 kd 값은 25 ℃ 또는 37 ℃에서 측정할 수 있다. 상기 측정은 150 mM NaCl의 존재하에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 측정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 기술에서는 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용한다: 37 ℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
한 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 본 발명의 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r과 C1s의 복합체의 클리어런스를 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r과 C1s의 복합체의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 본 발명의 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 본 발명의 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 효과적인 양의, 본 발명의 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) 개체의 혈장으로부터 C1s가 제거될 필요가 있는 개체를 확인하고; (b) 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하며, KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 측정시, 2 내지 10,000의, pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의되는 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 갖는 항체를 제공하고(이때, 상기 항체는 생체내에서 혈장내에서 C1s에 결합하고 생체내에서 엔도솜내에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, 상기 항체는 인간 IgG 또는 인간화 IgG이다); (c) 상기 항체를 개체에게 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37 ℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술이 사용될 수 있다: 37 ℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 대상에서 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) 제1 항체의 항원-결합 도메인을 통해 C1s에 결합하는 제1 항체를 확인하고; (b) (1) 제2 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하고, (2) 히스티딘으로 치환된 제1 항체의 가변 영역의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 제1 항체의 가변 영역내에 삽입된 적어도 하나의 히스티딘을 갖는 것을 제외하고 아미노산 서열이 제1 항체와 일치하며, (3) 제1 항체의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값보다 더 높고 2 내지 10,000의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 가지고(이때, KD(pH5.8)/KD(pH7.4)는 KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 측정시 pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의된다), (4) 생체내에서 혈장내 C1s에 결합하고, (5) 생체내에서 엔도솜에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, (6) 인간 IgG 또는 인간화 IgG인 제2 항체를 확인하고; (c) 감소된 C1s의 혈장 수준을 가져야 하는 대상을 확인하고; (d) 대상에서 C1s의 혈장 수준이 감소되도록 상기 대상에게 상기 제2 항체를 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37 ℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용할 수 있다: 37 ℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 대상에서 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) (1) 제1 항체의 항원-결합 도메인을 통해 C1s에 결합하고, (2) 제1 항체의 적어도 하나의 가변 영역이 제2 항체의 상응하는 가변 영역보다 적어도 하나 더 많은 히스티딘 잔기를 갖는 것을 제외하고, 제2 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하는 제2 항체와 아미노산 서열이 일치하며, (3) 제2 항체의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값보다 더 높고 2 내지 10,000의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 가지고(이때, KD(pH5.8)/KD(pH7.4)는 KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 측정시 pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의된다), (4) 생체내에서 혈장내 C1s에 결합하고, (5) 생체내에서 엔도솜에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, (6) 인간 IgG 또는 인간화 IgG인 제1 항체를 확인하고; (b) 감소된 C1s의 혈장 수준을 가져야 하는 대상을 확인하고; (c) 대상에서 C1s의 혈장 수준이 감소되도록 상기 대상에게 상기 제1 항체를 적어도 1회 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37 ℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용할 수 있다: 37 ℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 고체 경로 성분은 C1s이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, C4b2a의 생성을 감소시키기 위해 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체를 포함하는 본 개시내용의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 보체 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 인간이다. 투여는 본원에 개시된 경로들을 포함하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 경로에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 투여이다. 일부 실시양태에서, 투여는 척추강내 투여이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 하나보다 많은 종으로부터의 C1s에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 상기 항-C1s 항체는 인간 및 비-인간 동물로부터의 C1s에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 항-C1s 항체는 인간, 래트 및 원숭이(예를 들어, 필리핀원숭이, 히말라야원숭이, 마카크, 마모셋, 침팬지 및 비비)로부터의 C1s에 결합한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-C1s 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VH HVR 서열을 포함하는 항-C1s 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 34, 40, 46, 52 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VL HVR 서열을 포함하는 항-C1s 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 (a) (i) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열번호: 19, 20, 21, 23, 또는 24의 VH 서열 및 서열번호: 26, 27, 28, 30, 또는 31의 VL 서열을 포함하는 항체내에 아미노산 수식을 도입하여 제조된 항-C1s 항체 변이체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들에서 선택된 위치들에 하나 이상의 아미노산 잔기 대신 치환된 적어도 하나의 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 항-C1s 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C1s 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, FR 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 하기의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 FR 서열들을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-C1s 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 23 또는 24의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C1s 항체는 C1s에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호: 19, 20, 21, 23 또는 24에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-C1s 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 23 또는 24에, 그 서열의 번역후 수식을 포함하여 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호: 32, 38, 44, 50, 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호: 33, 39, 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호: 34, 40, 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호: 26, 27, 28, 30 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-C1s 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C1s 항체는 C1s에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호: 26, 27, 28, 30 또는 31에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-C1s 항체는 서열번호: 26, 27, 28, 30 또는 31에, 그 서열의 번역후 수식을 포함하여 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호: 35, 41, 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 36, 42, 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 37, 43, 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-C1s 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 19 및 서열번호: 26중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 20 및 서열번호: 27중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 21 및 서열번호: 28중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 23 및 서열번호: 30중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 24 및 서열번호: 31중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 항체는 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 동일한 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 항체가 제공된다:
1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체는 C1s에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체는 중성 pH에서 C1s에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-C1r 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VH HVR 서열을 포함하는 항-C1r 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VL HVR 서열을 포함하는 항-C1r 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 (a) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 (a) (i) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (iii) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 전부의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110의 VH 서열, 및 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 또는 118의 VL 서열을 포함하는 항체내에 아미노산 수식을 도입하여 제조된 항-C1r 항체 변이체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들 중 하나 이상에서 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 하기의 카밧 넘버링 시스템 위치들에서 선택된 위치들에 하나 이상의 아미노산 잔기 대신 치환된 적어도 하나의 히스티딘을 포함한다:
중쇄: H26, H27, H28, H29, H30, H31, H32, H33, H34, H35, H50, H51, H52, H52a, H53, H54, H55, H57, H58, H59, H60, H61, H62, H63, H64, H65, H93, H94, H95, H96, H97, H98, H99, H100, H100a, H101, 및 H102; 및
경쇄: L24, L25, L26, L27, L27a, L28, L29, L30, L31, L32, L33, L50, L51, L52, L53, L54, L55, L56 L91, L92, L93, L94, L95, L95a, L96, 및 L97.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서, 항-C1r 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-C1r 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C1r 항체는 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, FR 서열을 포함하는 VH 또는 VL을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1r 항체는 하기의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 FR 서열들을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-C1r 항체는 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C1r 항체는 C1r에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-C1r 항체는, 서열번호: 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110에, 그 서열의 번역후 수식을 포함하여 VH 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VH는 (a) 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호: 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호: 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 또는 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-C1r 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-C1r 항체는 C1r에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 HVR 밖(즉, FR 중)의 영역에서 발생한다. 선택적으로, 상기 항-C1r 항체는, 서열번호: 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에, 그 서열의 번역후 수식을 포함하여 VL 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 VL은 (a) 서열번호: 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호: 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 또는 166의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-C1r 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 103 및 서열번호: 111 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 104 및 서열번호: 112 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 105 및 서열번호: 113 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 106 및 서열번호: 114 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 107 및 서열번호: 115 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 108 및 서열번호: 116 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 109 및 서열번호: 117 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 항체는, 각각 서열번호: 110 및 서열번호: 118 중의 VH 및 VL 서열, 및 이들 서열들의 번역후 수식을 포함한다. 번역후 수식은 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 글루타민 또는 글루타메이트의, 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 항-C1r 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 항체는 본 명세서에 제공된 항-C1r 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 동일한 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 항체가 제공된다:
6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1r 항체는 C1r에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1r 항체는 중성 pH에서 C1r에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합한다:
6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
한 양태에서, 본 개시내용은 보체 성분 1s(C1s)의 CUB1, EGF, 및 CUB2로 이루어진 CUB1-EGF-CUB2 도메인을 포함하는 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, pH-의존성 결합을 갖는 단리된 인간화 단일클론 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체가 결합된 에피토프는 C1s의 베타 도메인에 위치하지 않은 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체가 결합된 에피토프는 C1s의 알파 도메인 또는 C1s의 감마 도메인에 위치한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체가 결합된 에피토프는 선형 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1s 항체가 결합된 에피토프는, 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 291, 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 172, 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 210, 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 111, 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 112 내지 210, 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 131 내지 172, 또는 서열번호: 1에 나타낸 보체 C1s 단백질의 아미노산 16 내지 130 내의 에피토프이다. 일부 실시양태에서, C1s의 전술한 에피토프는 인간 C1s의 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항-C1s 항체는 활성화된 C1s 단백질 및 불활성 형태의 C1s 둘 다에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 성분 1r(C1r)의 CUB1, EGF, 및 CUB2로 이루어진 CUB1-EGF-CUB2 도메인을 포함하는 영역 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항-C1r 항체를 제공한다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 단리된 항-C1r 항체가 결합된 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체구조적 에피토프이다. 일부 실시양태에서, C1r의 전술한 에피토프는 인간 C1r의 에피토프이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 항-C1s 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함한 단일클론 항체이다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아보디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어, 완전한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 아이소타입이다.
추가의 양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 하기 1 내지 7 부분에 기술된 바와 같은 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
1. 항체 친화성
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 1 μM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd 또는 KD)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 방사성 표지된 항원 결합 어세이(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 친화성은, 적정된 일련의 비표지 항원의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 상기 어세이의 조건을 확립시키기 위해서, 마이크로타이터(MICROTITER)(등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs)) 5 μg/ml로 밤새 코팅하고, 이어서 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 비-흡착성 플레이트(눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM[125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다(예를 들어, 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치한다). 이어서, 상기 관심 Fab를 밤새 배양하지만; 상기 배양은 확실히 평형에 도달하도록 보다 오랜 기간(예를 들어, 약 65 시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서 배양(예를 들어, 1 시간 동안)을 위해 상기 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광제(마이크로신트(MICROSCINT)-20™); 패커드(Packard))를 가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기(패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 경합 결합 어세이에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시양태에 따라, Kd를 비아코어(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 어세이를 이용하여 측정한다. 예를 들어, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용한 어세이를 약 10 반응 단위(RU)의 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25 ℃에서 수행한다. 한 실시양태에서, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE 헬쓰케어)을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 5 마이크로그램(μg)/ml(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 마이크로리터(μl)/분의 유량으로 주입하여 대략 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기들을 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)에 PBS 중에서 대략 25 μl/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% 폴리소베이트 20(트윈-20™) 계면활성제(PBST)를 주입한다. 결합속도(kon) 및 해리속도(koff)는 단순 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 상기 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 산출한다. 상기 평행 해리상수(Kd)는 koff/kon의 비로서 산출한다. 예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 결합속도(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 결합속도는 형광 소광 기법을 이용하여 측정할 수 있으며, 상기 기법은 분광계, 예를 들어, 스톱-플로우(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS, pH 7.2 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25 ℃에서의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정한다.
일부 실시양태에서, pH 7.4 및 pH 5.8에서의 본 발명의 각각의 히스티딘-치환된 변이체의 결합 친화성을 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 측정한다. 재조합 단백질 A/G(피어스(Pierce))를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시킬 수 있다. 항체 및 애널라이트들은 7(+) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4), 5(+) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 5.8), 또는 5(-) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 5.8) 중에서 제조할 수 있다. 각각의 항체는 단백질 A/G에 의해 센서 표면 위에 포획할 수 있다. 항체 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 천연 전효소 인간 C1s(콤테크(CompTech)) 또는 제조된 재조합 인간 C1s를 50 nM으로 주입한 후에, 해리시킬 수 있다.
본 발명의 비아코어 어세이 단계들의 구체적인 예는 다음과 같다.
C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자의 결합 특이성을 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 37 ℃에서 측정한다. 재조합 단백질 A/G(피어스)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시킨다. 항체 및 애널라이트들은 7(+) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조한다. 각각의 항체를 단백질 A/G에 의해 센서 표면 위에 포획한다. 항체 포획 수준은 100 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 천연 전효소 인간 C1s(콤테크 A103)(단량체로서 50 nM에서) 또는 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His(단량체로서 100 nM에서)를 주입한 후, 해리시킨다. 센서 표면은 10 mM 글리신-HCl pH 1.5로 매 주기마다 재생시킨다. C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자는 천연 전효소 인간 C1s에 결합하지만, CUB1-EGF-CUB2 도메인이 결여된 절두 단백질인 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His는 결합하지 않은 것을 측정할 수 있다.
항체의 C1q 대체 기능은 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 C1r2s2 포획 방법에 의해 입증된다. 항-His 항체(GE 헬쓰케어)는 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시킨다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q(콤테크 A099)는 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조한다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 먼저 항-His 항체에 의해 센서 표면 위에 포획한다("hc1r2s2"). 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 천연 인간 C1q를 200 RU의 포획을 갖도록 100 nM에서 주입한("hc1q") 후, 즉시 항체를 500 nM에서 10 μL/분으로 1200초 동안 주입한다. 센서 표면은 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 매 주기마다 재생시킨다. C1q 대체 기능을 갖는 항체의 경우, 센서그램 2(C1r2s2, C1q, 및 항체의 존재하에서)의 반응 단위는, 센서그램 1 및 2가 교차하는 시점("크로스오버 시점") 후에 센서그램 1(C1r2s2, C1q, 및 버퍼의 존재하에서 및 항체의 부재하에서)에서의 반응 단위보다 낮다. 상기 크로스오버 시점은 항체(Ab) 반응(센서그램 2)으로부터 버퍼 반응(센서그램 1)을 감하고, 미분값이 양에서 음으로 변할 때의 시점을 참고함으로써 확인한다.
항체의 C1q 대체 기능은 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 C1q 포획 방법에 의해 입증한다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 비오틴화된 천연 인간 C1q(콤테크 A099)는 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조한다. 비오틴화 천연 인간 C1q를 먼저 CAP 센서 칩(GE 헬쓰케어)의 하나의 유동 세포 위에 포획한다. 포획 수준은 800 내지 1000 공명 단위(RU)의 범위를 목표로 한다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 300 nM에서 주입한 후, 항체를 500 nM에서 10 μL/분으로 180초 동안 주입한다. 센서 표면은 매 주기마다 3-대-1 비의 8 M 구아니딘-HCl 및 1 M NaOH로 재생시킨다. C1q 대체 기능을 갖는 항체는 C1r2s2의 해리 속도를 증대시킨다, 즉, 항체의 존재하에서의 상기 곡선은 항체 부재하에서의 곡선 아래에 있다.
항체에 의한 C1r2s2로의 C1q 결합의 차단을 평가하기 위해, 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 차단 어세이를 수행한다. 항-His 항체(GE 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시킨다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q는 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조한다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 먼저 항-His 항체에 의해 센서 표면 위에 포획한다("hc1r2s2"). 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 상기 항체 변이체를 500 nM에서 주입한 후, 천연 인간 C1q를 100 nM에서 주입한다("hc1q"). 센서 표면은 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 재생시킨다. C1q 차단 기능을 갖는 항체는 C1r2s2에 대한 결합에 있어서 C1q와 경합하는 것들이다.
일부 실시양태에서, 필요한 경우, pH 5.8에서의 추가의 해리 단계를 pH 7.4에서의 해리 단계 직후에 통합시킨다. 5(+) 버퍼 중에서의 상기 해리 속도는 스크러버(Scrubber) 2.0 (바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software)) 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 피팅하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술된 다른 단편들을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조한다; 또한 WO 1993/16185 호; 및 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조한다.
다이아보디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097 호; WO 1993/01161 호; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트라이아보디 및 테트라보디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬 소재); 예를 들어, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조).
항체 단편은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 완전한 항체의 단백질분해적 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 이 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 다양한 기법에 의해 제조할 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체들이, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]에 기술되어 있다. 일례로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 정상 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어, 상기 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337 호, 미국 특허 제 7,527,791 호, 미국 특허 제 6,982,321 호 및 미국 특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 그래프트화를 기술하고 있음); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면처리"를 기술하고 있음); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)에 추가로 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: "베스트-핏" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)]; 및 문헌[Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리로의 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조).
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생산할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-374 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 공격에 반응하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전한 항체를 생산하도록 수식된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 상기 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체내에 무작위로 통합된다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 검토는, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 6,075,181 호 및 미국 특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HUMAB)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 5,770,429 호; K-M 마우스(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 7,041,870 호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허출원 공개 US 2007/0061900 호를 참조한다. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 정상 영역과 결합시킴으로써 추가로 수식될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되었다(예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 추가의 방법들로는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 기술하고 있음) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기법(트라이오마(Trioma) 기법)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-191 (2005)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한, 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 정상 도메인과 결합시킬 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 하기에서 기술된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]에 추가로 기술되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리들을 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리 중에서 무작위로 재조합하고, 이어서 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 나이브 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들어, 인간으로부터) 항체의 단일 공급원을 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같은 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 제공할 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, PCR 프라이머 함유 랜덤 서열을 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공보들은, 예를 들어, 미국 특허 제 5,750,373 호, 및 미국 특허 공개 제 2005/0079574 호, 제 2005/0119455 호, 제 2005/0266000 호, 제 2007/0117126 호, 제 2007/0160598 호, 제 2007/0237764 호, 제 2007/0292936 호, 및 제 2009/0002360 호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 C1s에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 C1s의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수도 있다. 이중특이성 항체는 또한, C1s를 발현하는 세포에 세포상해제를 국소화시키는데 사용할 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)], WO 1993/08829 호, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위해 정전기 스티어링 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004A1 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980 호 및 문헌[Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조); 이중특이성 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "다이아보디" 기법을 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어, 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어, US 2006/0025576A1 호 참조).
본 명세서의 항체 또는 단편은 또한 C1s뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, US 2008/0069820 호 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 상기 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내에 적절한 수식을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 수식은, 예를 들어, 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 삽입 및/또는 상기 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물에 도달할 수 있으나, 단 상기 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 변이도입을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에 "바람직한 치환"의 제목하에 나타내었다. 보다 실질적인 변화들이, 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같이 제공되어 있다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시킬 수 있으며 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해서 선별할 수 있다.
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아미노산들은 공통 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 상기 클래스들 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성된 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성들(예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변화(예를 들어, 개선)를 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 특정 생물학적 특성들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 증진된 항체이며, 상기 항체는 편의상, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 증진 기법, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 기법들을 사용하여 생성할 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 선별한다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에 개변(예를 들어, 치환)이 수행될 수 있다. 상기와 같은 개변은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 코딩된 잔기들(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196(2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행될 수 있으며, 이때 생성되는 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리의 제작 및 그로부터의 재선택에 의한 친화성 증진은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기술되었다. 친화성 증진에 대한 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어, 에러-프론 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-특이적 변이도입)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서, 상기 라이브러리를 선별하여 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-유도 접근방법을 포함하며, 상기 접근방법에서는 다수의 HVR 잔기들(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위 선정된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 변이도입 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 개변이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개변(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 수행될 수 있다. 상기 개변은, 예를 들어, 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기들 밖에 존재할 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
변이도입을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989), Science 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 변이도입"이라 칭한다. 상기 방법에서는, 표적 잔기들(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 기를 확인하고, 이들을, 상기 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 추가의 치환을 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치들에 도입시킬 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원간의 접촉점들을 확인할 수 있다. 상기와 같은 접촉 잔기 및 주변 잔기들을 치환 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체들은, 이들이 목적하는 특성을 함유하는지를 측정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 편리하게는 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 개변시킴으로써 수행할 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물을 변이시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 결합되는 분지된 바이안테너리 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 수식은 특정한 개선된 특성들을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546 호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정시 Asn297에 결합된 모든 당구조물들(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서의 상기 당쇄내 푸코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역내의 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 항체내 미미한 서열 변화로 인해 위치 297의 대략 ±3개 아미노산 상류 또는 하류에, 즉, 위치 294 내지 300에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 2003/0157108 호(프레스타 엘 (Presta, L.)); US 2004/0093621 호(교와 학코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허출원 US 2003/0157108 A1 호, 프레스타 엘; 및 WO 2004/056312 A1 호, 아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]; 문헌[Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 호 참조)를 포함한다.
이등분 올리고사카라이드, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878 호(장 마레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 호(우마나 등)에 기술되어 있다. 상기 Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087 호(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 호(라주 에스(Raju, S.); 및 WO 1999/22764 호(라주 에스)에 기술되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
(스위핑 기법)
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 수식을 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이다.
혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해, IgG의 Fc 영역중 FcRn에 결합하기 위한 부위의 아미노산 잔기는 세포내로의 그의 흡수를 증대시키도록 수식시킬 수 있다. pH 의존성을 갖는 항체가 이러한 방식으로 수식될 때, 상기 돌연변이체는, FcRn에 보다 강하게 결합할 수 있고 항원이 효과적으로 엔도솜내로 전달된(pH가 산성인 경우) 다음 분해되게 하지만, 자체로 더 효과적으로 세포 표면으로 재순환될 수 있는 "스위핑" 항체이다. 상기와 같은 수식된, "스위핑" 항체는 상기 수식을 갖지 않는 원래의 (모) 항체에 비해, 중성 pH에서 및 세포 표면상에서 FcRn에 강하게 결합하고 항원의 흡수 및 분해를 증대시킬 수 있다(문헌[Semin Immunopathol. 2018; 40(1): 125-140]).
일부 양태에서, 상기 항체는 혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해 Fc 영역에 저겅도 하나의 아미노산 수식을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강한 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2013/047752 호에서 언급된 바와 같이, 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 위치 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, 및 440(EU 넘버링)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 모(원래) 항체인 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 것보다 더 강한 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2013/125667 호에서 언급된 바와 같이, 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 위치 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, 및 447(EU 넘버링)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강한, 중성 pH에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2011/122011에서 언급된 바와 같이, 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 위치 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436(EU 넘버링)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게 하는 일부의(전부는 아닌) 이펙터 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포상해 어세이를 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 측정할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 어세이를 수행하여, 항체가 Fc 감마 R 결합이 결여되어(따라서 아마도 ADCC 활성이 결여되어) 있지만, FcRn 결합 능력을 유지하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc 감마 RIII 만을 발현하는 반면, 단핵세포는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII 및 Fc 감마 RIII를 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 어세이의 비제한적인 예들이 미국 특허 제 5,500,362 호(예를 들어, 문헌[Hellstrom et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 어세이 방법을 사용할 수 있다(예를 들어, 플로 사이토메트리를 위한 ACTI™ 비-방사성 세포상해 어세이(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포상해 어세이(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 상기와 같은 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있는지를 확인하기 위해 C1q 결합 어세이를 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 호 및 WO　2005/100402 호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이를 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다.
FcR에 대해 증가 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체들이 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312 호, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 상기 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334(잔기들의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 미국 특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642 호, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기술된 바와 같이, 변화된(즉, 증가되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포상해(CDC)을 야기하는 개변이 Fc 영역에서 수행된다.
증가된 반감기, 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)(모체 IgG의 태아로의 전달을 담당)(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 증가된 결합을 갖는 항체들이 US2005/0014934 A1 호(힌톤(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 증가시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기들: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-740 (1988)]; 미국 특허 제 5,648,260 호; 미국 특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351 호를 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "싸이오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 싸이올기가 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 상기 반응성 싸이올기를 사용하여 상기 항체를 다른 잔기, 예를 들어, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 컨주게이트시켜, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 이뮤노컨주게이트를 생성시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 수식될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 상기 항체에 결합된 중합체들의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 상기 항체의 특정한 특성 또는 기능, 상기 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 고려사항들에 기반하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 잔기의 컨주게이트가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 비단백질성 잔기는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 잔기를 상기 항체-비단백질성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 항-C1s 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체의 제조 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-C1s 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입한다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생산할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,648,237 호, 미국 특허 제 5,789,199 호 및 미국 특허 제 5,840,523 호를 참조한다(또한 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 상기 항체는 가용성 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함한 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]; 및 문헌[Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,959,177 호, 미국 특허 제 6,040,498 호, 미국 특허 제 6,420,548 호, 미국 특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티보디스(PLANTIBODIES)™ 기법을 기술하고 있음)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주; 인간 배아 신장주(예를 들어,문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-252 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)])를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들어, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다.
pH-의존성 특징을 갖는 항체를, 예를 들어, WO 2009/125825 호에 기술된 바와 같은 선별 방법 및/또는 변이도입 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 상기 선별 방법은, pH-의존성 결합 특징을 갖는 항체를 특정 항원에 특이적인 항체들의 집단 내에서 확인하는 임의의 과정을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별 방법은 산성 pH 및 중성 pH 둘 다에서 항체들의 초기 집단 내의 개개 항체들의 하나 이상의 결합 파라미터(예를 들어, KD 또는 kd)를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 항체들의 결합 파라미터는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명을 이용하여, 또는 특정 항원에 대한 항체의 결합 특징에 대한 정량적 또는 정성적 평가를 가능하게 하는 임의의 다른 어세이 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별 방법은 2 이상의 산성 KD/중성 KD 비로 항원에 결합하는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 상기 선별 방법은 2 이상의 산성 kd/중성 kd 비로 항원에 결합하는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변이도입 방법은 항원에 대한 항체의 pH-의존성 결합을 증대시키기 위해 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 내에 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 혼입시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 변이도입은 항체의 하나 이상의 가변 도메인 내에서, 예를 들어, 하나 이상의 HVR(예를 들어, CDR) 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 변이도입은 항체의 하나 이상의 HVR(예를 들어, CDR) 내의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 변이도입은 항체의 적어도 하나의 HVR(예를 들어, CDR) 중의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, "증대된 pH-의존성 결합"은 항체의 돌연변이된 버전이 변이도입 이전의 항체의 원래 "모"항체(즉, 덜 pH-의존성인) 버전보다 더 큰 산성 KD/중성 KD 비 또는 더 큰 산성 kd/중성 kd 비를 나타내는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체의 돌연변이된 버전은 2 이상의 산성 KD/중성 KD 비를 갖는다. 또는, 상기 항체의 돌연변이된 버전은 2 이상의 산성 kd/중성 kd 비를 갖는다.
다중클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 이작용성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 컨주게이트), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨주게이트시키는 것이 유용할 수 있다.
동물(통상적으로 비-인간 포유동물)을, 예를 들어, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 컨주게이트(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3개 부피의 프로인트(Freund's) 완전 보조제와 혼합시키고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨주게이트 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에 상기 동물을 프로인트 완전 보조제 중의 펩티드 또는 컨주게이트의 원래량의 1/5 내지 1/10로 다수의 부위에 피하 주사함으로써 추가접종한다. 7 내지 14일 후에 상기 동물을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 어세이한다. 동물들은 역가 평탄역까지 추가접종한다. 바람직하게는, 상기 동물은, 동일 항원이지만 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 컨주게이트로 추가접종한다. 컨주게이트는 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물 중에서 제조될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제가 상기 면역 응답을 증대시키기 위해 적절히 사용된다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개개의 항체들은, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역후 수식(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 상기 "단일클론"이라는 수식어는 상기 항체의 특성이 별개의 항체들의 혼합물은 아닌 것을 가리킨다.
예를 들어, 상기 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터를 본 명세서에서 상기에 기술된 바와 같이 면역화시켜, 상기 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
상기 면역화제는 전형적으로 항원 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로 인간 기원의 세포를 목적하는 경우 말초혈 림프구(PBL)가 사용되거나, 또는 비-인간 포유동물 공급원을 목적하는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 상기 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]).
불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 상기와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 성장시킨다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 상기 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 입수할 수 있다) 및 SP-2 세포(및 그의 유도체, 예를 들어, X63-Ag8-653)(미국 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수할 수 있다)로부터 유래된 것들이 바람직하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되었다(문헌[Kozbor et al. J. Immunol. 133(6):3001-3005 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생성에 대해 어세이한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 어세이, 예를 들어, 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA)에 의해서 측정한다. 상기와 같은 기법 및 어세이들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 문헌[Munson, Anal. Biochem. 107(1):220-239 (1980)]의 스캣차드(Scatchard) 어세이에 의해 측정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론들을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(고딩(Goding)의 상기 문헌)에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 포유동물에서 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론들에 의해 분비된 단일클론 항체는 상기 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 적절히 분리시킨다.
C. 어세이
본 명세서에 제공된 항-C1s 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 어세이에 의해 그의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
1. 결합 어세이 및 다른 어세이
한 양태에서, 본 발명의 항체를, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 양태에서, C1s에 대한 결합에 있어서 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체와 경합하는 항체를 확인하거나, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해, 경합 어세이를 이용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경합 항체가 과량으로 존재하는 경우, 상기 항체는 C1s에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상만큼 차단한다(예를 들어, 감소시킨다). 특정 실시양태에서, 상기와 같은 경합 항체는 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체구조적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 지도화에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 특정 실시양태에서, 상기와 같은 경합 어세이는 중성 pH 조건에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경합 어세이는, 예를 들어, 옥텟(Octet)™ 시스템을 이용하는 탠덤 경합 어세이이다.
예시적인 경합 어세이에서는, 고정화된 C1s를, C1s에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체들 중 하나), 및 C1s에 대한 결합에 있어서 제1 항체와 경합하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2의 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 C1s를, 상기 제1 표지된 항체는 포함하지만 상기 제2의 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. C1s에 대한 상기 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후에, 과잉의 비결합 항체를 제거하고, 고정화된 C1s와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 C1s와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이는 상기 제2 항체가 상기 C1s에 대한 결합에 있어서 상기 제1 항체와 경합함을 시사한다(문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 C1s에 대한 결합에 있어서 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 경합하는 항체를 샌드위치 어세이를 이용하여 확인할 수 있다. 샌드위치 어세이는, 각각 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체를 이용하는 것을 포함한다. 샌드위치 어세이에서는, 시험 샘플 애널라이트에 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체가 결합된 다음, 제 2 항체가 상기 애널라이트에 결합하므로, 불용성인 3-부분 복합체를 형성한다(데이빗 및 그리니(David & Greene), 미국 특허 제 4,376,110 호 참조). 제2 항체는 자체로 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나(직접적 샌드위치 어세이), 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다(간접적 샌드위치 어세이). 예를 들어, 샌드위치 어세이의 한 유형은 ELISA 어세이으로, 이 경우에는 검출가능한 잔기가 효소이다. 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동시에 C1s에 결합하는 항체는 항-C1s 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 항체인 것으로 측정할 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동시에 C1s에 결합하지 않는 항체는 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 C1s에 대한 결합에 있어서 항-C1s 항체와 경합하는 항체인 것으로 측정할 수 있다.
2. 활성 어세이
한 양태에서, 생물 활성을 갖는 그의 항-C1s 항체를 확인하기 위한 어세이가 제공된다. 생물 활성은 고전적 경로의 활성화 및 상기 경로의 활성화로부터 비롯되는 절단 생성물, C2a, C2b, C3a, C4a, C4b, C5a 및 C5b의 생성을 차단하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 상기 생물 활성에 대해 시험한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체를, 즉 RBC 어세이를 이용하여, 양 RBC 항원에 대해 유도된 항체에 의해 감작된 양 적혈구 세포(RBC)의 보체-매개 용혈을 억제하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체를, cRBC 항원에 대해 유도된 항체에 의해 감작된 닭 적혈구 세포(cRBC)의 보체-매개 용혈을 억제하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 보체 단백질의 공급원으로서 인간 혈청을 이용하여, 방출된 헤모글로빈의 양을 분광광도 방법으로 측정함으로써 본 발명 항체의 활성을 측정할 수 있다.
RBC 어세이는 문헌[J. Vis. Exp. 2010; (37): 1923]에 개시된 방법과 같은 공지된 방법을 이용하여 적절하게 수행할 수 있다. 상기 논문은 RBC 용해 어세이으로서 50% 용혈성 보체(CH50) 어세이를 수행하는 방법을 기술하고 있다. 간략하게, 상기 어세이는 고전적 보체 경로의 활성화를 측정하고, 상기 경로의 임의 성분의 감소, 부재 또는 불활성을 검출한다. 상기 어세이는 혈청내 보체 성분의 적혈구 세포를 용해시키는 활성을 평가한다. 항체를 시험 혈청과 함께 배양하면, 상기 경로가 활성화되고 용혈을 야기한다. 상기 고전적 경로의 하나 이상의 성분이 감소되면, CH50 값이 감소된다. 상기 CH50 어세이는, 더 정확하게는 보체 성분들에 의한 세포 용해에 대한 %억제를 측정하는 본 명세서의 실시예들에서 사용된 어세이과 정확히 동일하지는 않지만; 개념 및 기본 구성은 본 발명과 실질적으로 동일하다. 본 발명에서, 한 실시양태에서, 상기 RBC 어세이를 다음과 같이 수행한다. 인간 혈청을 관심 항체와 함께 예비-배양한다(예를 들어, 섭씨 37 도(℃)에서 3 시간동안). 이어서, 상기 혈청을 동부피의 감작된 양 적혈구 세포에 첨가하고 배양(예를 들어, 37 ℃에서 1 시간동안)하여 적혈구 세포를 용해시킨다. 이어서, 반응을 중단시킨다. 혼합물을 원심분리하여 미용해 세포를 펠릿화하고, 상등액을 회수하고, 415 nm에서의 흡광도(OD)에서 630 nm에서의 OD를 감한 값을 이용하여 헤모글로빈의 방출을 분석한다. 적혈구 세포 용해의 %억제를 계산하기 위해, 0% 억제는 항체가 첨가되지 않은(버퍼만) 조건으로 설정하고, 100% 억제는 EDTA가 5 mM의 최종 농도로 첨가된 조건으로 설정한다(예를 들어, 실시예 7 참조). 항체가 적혈구 세포 용해의 %억제를 나타내는 경우, 이것은 상기 항체가 인간 혈청 보체에 대한 중화 활성, 예를 들어, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 활성을 가짐을 의미한다.
따라서, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 활성을 평가하기 위해, RBC 어세이를 이용하여 본 발명 항체의 인간 혈청 보체에 대한 중화 활성을 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은, RBC 어세이에서 인간 혈청 보체에 대해 70% 이상의 중화 활성을 갖는, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체를 제공한다.
D. 이뮤노컨주게이트
본 발명은 또한 하나 이상의 세포상해제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명의 항-C1s 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
한 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는, 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 약물에 항체가 접합된 항체-약물 컨주게이트(ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제　5,208,020 호, 미국 특허 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 호 참조); 오리스타틴, 예를 들어, 모노메틸오리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제 5,635,483 호 및 미국 특허 제 5,780,588 호 및 미국 특허 제 7,498,298 호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국 특허 제 5,712,374 호, 미국 특허 제 5,714,586 호, 미국 특허 제 5,739,116 호, 미국 특허 제 5,767,285 호, 미국 특허 제 5,770,701 호, 미국 특허 제 5,770,710 호, 미국 특허 제 5,773,001 호, 및 미국 특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis)젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 포함하나 이로 한정되지 않는 효소 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는 방사성 원자에 접합되어 방사성컨주게이트를 형성하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성컨주게이트의 생성에 이용할 수 있다. 예로는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 상기 방사성컨주게이트가 검출에 사용되는 경우, 상기 방사성컨주게이트는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc-99m 또는 123I, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(자기공명 영상화, MRI로도 알려짐)용 스핀 표지, 예를 들어, 또한 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노싸이올레인(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포상해제의 컨주게이트를 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소싸이오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO94/11026 호 참조). 상기 링커는 세포 중에서 세포상해 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국 특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는 특별히, (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터) 상업적으로 시판하는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나 이로 한정되지는 않는 가교결합제 시약을 사용하여 제조된 상기 컨주게이트를 고려하나, 이로 한정되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체는 생물 샘플 중의 C1s의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어, 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁액, 타액, 객담, 구강 세척액, 뇌척수액, 양막액, 복수, 유즙, 초유, 유선 분비물, 림프, 소변, 땀, 누액, 위액, 활액, 복막액, 수정체액 또는 점액을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물 샘플내 C1s의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물 샘플을 항-C1s 항체의 C1s에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-C1s 항체와 접촉시키고, 상기 항-C1s 항체와 C1s 간에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체를 사용하여, 예를 들어, C1s가 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우, 항-C1s 항체를 사용한 요법에 적격인 대상을 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 다음을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: 연령-관련 황반 변성, 알츠하이머(Alzheimer)병, 근위축성 측삭 경화증, 아나필락시스, 은친화 과립성 치매, 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 비정형 용혈 요독 증후군, 자가면역 질환, 바라퀘-시몬스(Barraquer-Simons) 증후군, 베체트(Behcet)병, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 수포성 유사천포창, 버거씨(Buerger)병, C1q 신장병증, 암, 치명적 항인지질 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 한랭 응집소병, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 크론(Crohn)병, 한랭글로불린혈증성 혈관염, 권투선수 치매, 루이소체(Lewy Bodies) 치매(DLB), 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 원반모양 홍반성 루푸스, 다운(Down) 증후군, 국소분절 사구체경화증, 형식적 사고 장애, 전두측두엽 치매(FTD), 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 할러포르덴-스파츠(Hallervorden-Spatz)병, 용혈성 요독 증후군, 유전성 혈관부종, 저인산염혈증, 특발성 폐렴 증후군, 면역 복합체병, 봉입체 근염, 감염성 질환(예를 들어, 세균(예, 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 스트렙토코커스), 바이러스(예, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 또는 다른 감염원에 의해 야기된 질환), 염증 질환, 허혈/재관류 손상, 경도 인지 장애, 면역성혈소판감소증 자반병(ITP), A형 몰리브덴 조효소 결핍(MoCD), 1형 미증식 사구체신염(MPGN), 2형 미증식 사구체신염(MPGN)(조밀 침착병), 미증식 신염, 다발경색 치매, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)), 사구체신염, 가와사키(Kawasaki)병, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다발계 위축증, 중증 근무력증, 심근경색, 근긴장 장애, 시신경 척수염, C형 니만-피크(Niemann-Pick)병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 파킨슨(Parkinson)병, 파킨슨병 치매, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 심상성 천포창, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 다발근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 건선, 패혈증, 쉬가(Shiga)-독소생성 대장균(STEC)-HuS, 척추근 위축증, 뇌졸중, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 이식 거부반응, 혈관염(예를 들어, ANCA 관련 혈관염), 베게너(Wegner) 육아종증, 겸상세포 질환, 한랭글로불린혈증, 혼합 한랭글로불린혈증, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 2형 혼합 한랭글로불린혈증, 3형 혼합 한랭글로불린혈증, 신염, 약물-유도성 혈소판감소증, 루푸스 신염, 수포성 유사천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 지연 용혈성 수혈 반응, 저보체혈성 두드러기성 혈관염 증후군, 위수정체 수포 각막병증, 및 혈소판 수혈불응증.
특정 실시양태에서, 표지된 항-C1s 항체가 제공된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들어, 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기들, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지로는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 서양와사비 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어, HRP를 산화시키는 효소와 결합된 것들), 락토퍼옥시다제 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
F. 약학 제형
본 명세서에 기술된 바와 같은 항-C1s 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 일반적으로 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 버퍼, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소비톨; 염-형성 짝이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 복합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형들이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO2006/044908 호에 기술된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 버퍼를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 병용 치료에 사용되는 제형을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적절하게, 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 매크로에멀션 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 봉입할 수 있다. 상기 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 무균이다. 무균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행할 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 유효량의 상기 항-C1s 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 적어도 하나의 추가 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, C4b2a의 생성을 감소시키기 위해 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에서 보체 활성화를 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체를 포함하는 본 개시내용의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 인간이다. 투여는 본 명세서에 개시된 경로들을 포함하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 임의의 경로에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 또는 피하 투여이다. 일부 실시양태에서, 투여는 척추강내 투여이다.
보체-매개 질환 또는 질병은 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서 비정상적인 양의 보체 C1s 또는 비정상적 수준의 보체 C1s 단백질분해 활성을 특징으로 하는 질병이다.
일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 세포, 조직 또는 체액 중에 증가된(정상보다 높은) 양의 C1s 또는 증가된 수준의 보체 C1s 활성의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 뇌조직 및/또는 뇌척수액 중에 C1s의 증가된 양 및/또는 증가된 활성의 존재를 특징으로 한다. 세포, 조직 또는 체액 중 "정상보다 높은" 양의 C1s는, 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 양이 정상적인 대조군 수준보다 높은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 높은 것을 의미한다. 세포, 조직 또는 체액 중에서의 "정상보다 높은" 수준의 C1s 활성은, 세포, 조직 또는 체액 중에서 C1s에 의해 수행된 단백질분해성 절단이 정상적인 대조군 수준보다 높은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 높은 것을 의미한다. 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 추가의 증상을 나타낸다.
다른 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 세포, 조직 또는 체액 중에 정상보다 낮은 양의 C1s 또는 더 낮은 수준의 보체 C1s 활성의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 뇌조직 및/또는 뇌척수액 중 C1s의 더 낮은 양 및/또는 더 낮은 활성의 존재를 특징으로 한다. 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 "정상보다 낮은" 양은, 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 양이 정상적인 대조군 수준보다 낮은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 낮은 것을 의미한다. 세포, 조직 또는 체액 중에서의 C1s 활성의 "정상보다 낮은" 수준은, 세포, 조직 또는 체액 중에서 C1s에 의해 수행된 단백질분해성 절단이 정상적인 대조군 수준보다 낮은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 낮은 것을 의미한다. 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 추가의 증상을 나타낸다.
보체-매개 질환 또는 질병은 보체 C1s의 양 또는 활성이 개체에서 질환 또는 질병을 야기하게 하는 정도인 질환 또는 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 자가면역 질환, 암, 혈액 질환, 감염성 질환, 염증 질환, 허혈-재관류 손상, 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 질병, 안질환, 신장 질환, 이식 거부반응, 혈관 질환 및 혈관염 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 감염성 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 염증 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 혈액 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 허혈-재관류 손상이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 안질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 신장 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 이식 거부반응이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 항체-매개 이식 거부반응이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 혈관염 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질환 또는 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 신경퇴행성 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 질병은 타우병증이다.
보체-매개 질환 또는 질병의 예는 연령-관련 황반 변성, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 아나필락시스, 은친화 과립성 치매, 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 비정형 용혈 요독 증후군, 자가면역 질환, 바라퀘-시몬스 증후군, 베체트병, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 수포성 유사천포창, 버거씨병, C1q 신장병증, 암, 치명적 항인지질 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 한랭 응집소병, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 크론병, 한랭글로불린혈증성 혈관염, 권투선수 치매, 루이소체 치매(DLB), 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 원반모양 홍반성 루푸스, 다운 증후군, 국소분절 사구체경화증, 형식적 사고 장애, 전두측두엽 치매(FTD), 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 길랑-바레 증후군, 할러포르덴-스파츠병, 용혈성 요독 증후군, 유전성 혈관부종, 저인산염혈증, 특발성 폐렴 증후군, 면역 복합체병, 봉입체 근염, 감염성 질환(예를 들어, 세균(예, 나이세리아 메닌지디티스 또는 스트렙토코커스), 바이러스(예, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 또는 다른 감염원에 의해 야기된 질환), 염증 질환, 허혈/재관류 손상, 경도 인지 장애, 면역성혈소판감소증 자반병(ITP), A형 몰리브덴 조효소 결핍(MoCD), 1형 미증식 사구체신염(MPGN), 2형 미증식 사구체신염(MPGN)(조밀 침착병), 미증식 신염, 다발경색 치매, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)), 사구체신염, 가와사키병, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다발계 위축증, 중증 근무력증, 심근경색, 근긴장 장애, 시신경 척수염, C형 니만-피크병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 파킨슨병, 치매를 갖는 파킨슨병, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 심상성 천포창, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 다발근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 건선, 패혈증, 쉬가-독소생성 대장균(STEC)-HuS, 척추근 위축증, 뇌졸중, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 이식 거부반응, 혈관염(예를 들어, ANCA 관련 혈관염), 베게너 육아종증, 겸상세포 질환, 한랭글로불린혈증, 혼합 한랭글로불린혈증, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 2형 혼합 한랭글로불린혈증, 3형 혼합 한랭글로불린혈증, 신염, 약물-유도성 혈소판감소증, 루푸스 신염, 수포성 유사천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 지연 용혈성 수혈 반응, 저보체혈성 두드러기성 혈관염 증후군, 위수정체 수포 각막병증, 및 혈소판 수혈불응증을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
알츠하이머병 및 특정 형태의 전두측두엽 치매(피크병, 산발성 전두측두엽 치매 및 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매)가 타우병증의 가장 흔한 형태이다. 이에 따라서, 본 발명은, 타우병증이 알츠하이머병, 피크병, 산발성 전두측두엽 치매 및 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매인, 전술한 임의의 방법에 관한 것이다. 다른 타우병증은 진행성 책상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD) 및 아급성 경화성 범뇌염을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
신경퇴행성 타우병증은 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 은친화 과립성 치매, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 다운 증후군, 전두측두엽 치매, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러포르덴-스파츠병, 봉입체 근염, 다발계 위축증, 근긴장 장애, C형 니만-피크병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 다발경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 만성 외상성 뇌질환(CTE), 외상성 뇌 손상(TBI), 및 뇌졸중을 포함한다.
본 개시내용은 또한 시누클레인병증, 예를 들어, 파킨슨병(PD); 루이소체 치매(DLB); 다발계 위축증(MSA); 등을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 치매를 갖는 PD(PDD)를 본 개시내용의 방법으로 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 알츠하이머병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 파킨슨병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 이식 거부반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 질병은 항체-매개 이식 거부반응을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 개체에서 보체-매개 질환 또는 질병의 적어도 하나의 증상의 개시를 예방하거나 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 개체에서 보체-매개 질환 또는 질병의 적어도 하나의 증상을 경감시키거나 제거한다. 증상의 예는 자가면역 질환, 암, 혈액 질환, 감염성 질환, 염증 질환, 허혈-재관류 손상, 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 질병, 신장 질환, 이식 거부반응, 안질환, 혈관 질환 또는 혈관염 질병과 연관된 증상들을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 상기 증상은 신경학적 증상, 예를 들어, 손상된 인지 기능, 기억 장애, 운동 기능의 소실 등일 수 있다. 상기 증상은 또한 개체의 세포, 조직 또는 체액 중 C1s 단백질의 활성일 수 있다. 상기 증상은 또한 개체의 세포, 조직 또는 체액 중 보체 활성화의 정도일 수 있다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서의 보체 활성화를 조절한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서의 보체 활성화를 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 보체 활성화에 비해, 개체에서의 보체 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 적혈구 세포 상의 C3 침착을 감소시킨다; 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 RBC 상에 C3b, iC3b 등의 침착을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 보체-매개 적혈구 세포 용해를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 혈소판 상의 C3 침착을 감소시킨다; 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 혈소판 상에 C3b, iC3b 등의 침착을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 결과를 제공한다: (a) 보체 활성화의 감소; (b) 인지 기능의 개선; (c) 뉴런 손실의 감소; (d) 뉴런내 포스포-타우 수준의 감소; (e) 아교 세포 활성화의 감소; (f) 림프구 침윤의 감소; (g) 대식세포 침윤의 감소; (h) 항체 침착의 감소; (i) 아교 세포 손실의 감소; (j) 희소돌기아교세포 손실의 감소; (k) 수지상 세포 침윤의 감소; (l) 호중구 침윤의 감소; (m) 적혈구 세포 용해의 감소; (n) 적혈구 세포 탐식작용의 감소; (o) 혈소판 탐식작용의 감소; (p) 혈소판 용해의 감소; (q) 이식편 생존율의 개선; (r) 대식세포 매개 탐식작용의 감소; (s) 시력의 개선; (t) 운동 조절의 개선; (u) 혈전 형성의 개선; (v) 응고의 개선; (w) 신장 기능의 개선; (x) 항체 매개 보체 활성화의 감소; (y) 자가항체 매개 보체 활성화의 감소; (z) 빈혈의 개선: (aa) 수초탈락의 감소; (ab) 호산구증가증의 감소; (ac) 적혈구 세포 상의 C3 침착의 감소(예를 들어, RBC 상에 C3b, iC3b 등의 침착의 감소); 및 (ad) 혈소판 상의 C3 침착의 감소(예를 들어, 혈소판 상에 C3b, iC3b 등의 침착의 감소); 및 (ae) 아나필라톡신 독소 생성의 감소; (af) 자가항체 매개 수포 형성의 감소; (ag) 자가항체 유도성 소양증의 감소; (ah) 자가항체 유도성 홍반의 감소; (ai) 자가항체 매개 피부 미란의 감소; (aj) 수혈 반응으로 인한 적혈구 세포 파괴의 감소; (ak) 동종항체로 인한 적혈구 세포 용해의 감소; (al) 수혈 반응으로 인한 용혈의 감소; (am) 동종항체 매개 혈소판 용해의 감소; (an) 수혈 반응으로 인한 혈소판 용해의 감소; (ao) 비만세포 활성화의 감소; (ap) 비만세포 히스타민 방출의 감소; (aq) 혈관 투과성의 감소; (ar) 부종의 감소; (as) 이식편 내피 상에 보체 침착의 감소; (at) 이식편 내피중 아나필라톡신 생성의 감소; (au) 표피-진피 접합부 분리의 감소; (av) 표피-진피 접합부에서 아나필라톡신 생성의 감소; (aw) 이식편 내피에서 동종항체 매개 보체 활성화의 감소; (ax) 신경근 접합부의 항체 매개 손실의 감소; (ay) 신경근 접합부에서 보체 활성화의 감소; (az) 신경근 접합부에서 아나필라톡신 생성의 감소; (ba) 신경근 접합부에서 보체 침착의 감소; (bb) 마비의 감소; (be) 저림의 감소; (bd) 증가된 방광 조절; (be) 증가된 장 조절; (bf) 자가항체와 관련된 사망률의 감소; 및 (bg) 자가항체와 관련된 이환율의 감소.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 결과들의 수준 또는 정도에 비해, 하기의 결과들 중 하나 이상의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많은 감소를 달성하는데 효과적이다: (a) 보체 활성화; (b) 인지 기능의 저하; (c) 뉴런 손실; (d) 뉴런내 포스포-타우 수준; (e) 아교세포 활성화; (f) 림프구 침윤; (g) 대식세포 침윤; (h) 항체 침착; (i) 아교세포 손실; (j) 희소돌기아교세포 손실; (k) 수지상 세포 침윤; (l) 호중구 침윤; (m) 적혈구 세포 용해; (n) 적혈구 세포 탐식작용; (o) 혈소판 탐식작용; (p) 혈소판 용해; (q) 이식편 거부반응; (r) 대식세포 매개 탐식작용; (s) 시력 손실; (t) 항체 매개 보체 활성화; (u) 자가항체 매개 보체 활성화; (v) 수초탈락; (w) 호중구증가증.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 결과들의 수준 또는 정도에 비해, 하기의 결과들 중 하나 이상의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많은 감소를 달성하는데 효과적이다: a) 인지 기능,; b) 이식편 생존율; c) 시력; d) 운동 조절; e) 혈전 혈성; f) 응고; g) 신장 기능; 및 h) 적혈구용적율(적혈구 세포수).
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 보체 활성화를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 보체 활성화에 비해, 개체에서 보체 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 인지 기능을 개선시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 인지 기능에 비해, 개체에서 인지 기능을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 인지 기능의 저하 속도를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 인지 기능 저하 속도에 비해, 개체에서 인지 기능의 저하 속도를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 뉴런 손실을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 뉴런 손실에 비해, 개체에서 뉴런 손실을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 포스포-타우 수준을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 포스포-타우 수준에 비해, 개체에서 포스포-타우 수준을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 아교세포 활성화를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 아교세포 활성화에 비해, 개체에서 아교세포 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 아교세포는 별아교세포 또는 미세아교세포이다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 림프구 침윤을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 림프구 침윤에 비해, 개체에서 림프구 침윤을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 대식세포 침윤을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 대식세포 침윤에 비해, 개체에서 대식세포 침윤을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 항체 침착을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 항체 침착에 비해, 개체에서 항체 침착을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 아나필라톡신(예를 들어, C3a, C4a, C5a) 생성을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 아나필라톡신 생성 수준에 비해, 개체에서 아나필라톡신 생성을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항-C1s 항체는 보체 활성화를 억제한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 질병을 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개 질환 또는 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는데 사용하기 위한 것이며; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다.
추가의 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 질병의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기와 같은 보체-매개 질환 또는 질병이 있는 개체에게 유효량의 항-C1s 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 상기 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 하기에 기술되는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)을 증대시키는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)은 증대시키지만 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 본 발명은 개체에서 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는 방법을 제공하며; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체, 및 예를 들어, 하기에 기술하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에 단독으로 또는 다른 제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공-투여될 수 있다.
상기에 언급된 상기와 같은 병용 치료법은 병행 투여(여기서 2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함된다), 및 별도 투여(이 경우, 본 발명의 항체의 투여는 상기 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항-C1s 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 일어난다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 치료와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)는, 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 필요한 경우, 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 부분적으로 투여가 단기간인지 또는 장기적인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에서는 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 투약 스케줄이 고려된다.
본 발명의 항체는 우량 의료 규범(good medical practice)과 일치되는 방식으로 제형화되고, 복용되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 요인들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 조건, 질환의 원인, 제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 다른 요인들을 포함한다. 상기 항체는, 문제의 질병을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제와, 반드시는 아니지만, 선택적으로 함께 제형화된다. 상기와 같은 다른 제의 유효량은 제형중에 존재하는 제의 양, 질병 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라서 사용되거나, 또는 본 명세서에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 상기 질환의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 상기 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 μg/kg 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)가, 예를 들어, 1회 이상의 별개 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라 약 1 μg/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라서, 치료는 일반적으로는 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 수 있다. 상기 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 상기 항체의 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량을 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 투여법이 유용할 수도 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기법 및 어세이에 의해 용이하게 모니터된다.
임의의 상기 제형들 또는 치료 방법들은 항-C1s 항체 대신에 또는 상기 항체에 더하여 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 첨부 문서를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 유지하며, 무균적 억세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성 성분은 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 첨부 문서는 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 상기 제품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포상해제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제품은 상기 조성물을 사용하여 특정 병태를 치료할 수 있음을 나타내는 첨부 문서를 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 버퍼, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은, 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-C1s 항체 대신에 또는 상기 항체에 더하여 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법들 및 조성물들의 실시예이다. 상기에서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들도 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
명확한 이해를 위해 상기 본 발명을 예시 및 예로써 다소 상세하게 기술하였지만, 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 본 명세서에 인용된 모든 특히 및 과학 문헌의 개시내용은 분명하게 전체적으로 참고로 도입된다.
실시예 1: 단백질의 발현 및 정제
실시예 1.1: 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, C-말단 GGGGS 링커 및 8x 히스티딘 태그(서열번호: 7)를 갖는 인간 C1s(NCBI 기준 서열: NP_958850.1) 및 C-말단 GGGGS 링커 및 FLAG 태그를 갖는 인간 C1r(NCBI 기준 서열: NP_001724.3)이다. 상기 인간 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(문헌[Kardos et. al. J Immunol. 2001 Nov 1;167(9):5202-8])(서열번호: 8)를 갖는다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체의 발현을 위해, 인간 C1s-His 및 C1r-Flag를 FreeStyle293-F 세포주(써모피셔(Thermo Fisher))를 사용하여 일시적으로 동시-발현시켰다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)에 적용하고, Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 분획들을 IMAC 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하고 이미다졸 구배로 용출시켰다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 용출된 분획들을 수거하고, 농축하고, 이어서 1X TBS, 2mM CaCl2 버퍼로 평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 1.2: 재조합 사이노 C1r2s2 His/Flag 사량체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, C-말단 GGGGS 링커 및 FLAG 태그(서열번호: 9)를 갖는 필리핀원숭이(사이노) C1s 및 C-말단 GGGGS 링커 및 8x 히스티딘 태그를 갖는 사이노 C1r이다. 상기 사이노 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(서열번호: 10)를 갖는다. 재조합 사이노 C1r2s2 Flag/His 사량체의 발현을 위해, 사이노 C1s-His 및 사이노 C1r-Flag를 FreeStyle293-F 세포주(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 동시-발현시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2 Flag/His 사량체를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)에 적용하고, Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 분획들을 IMAC 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하고 이미다졸 구배로 용출시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 용출된 분획들을 수거하고, 농축하고, 이어서 1X TBS, 2mM CaCl2 버퍼로 평형화된 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 재조합 사이노 C1r2s2 Flag/His 사량체를 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 1.3: 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, N-말단 CAMPATH-1H 신호 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호: 11)를 갖는 인간 C1s CCP1-CCP2-SP M292-D688 서열(NCBI 기준 서열: NP_958850.1)이다. 인간 C1s CCP1-CCP2-SP는 GGGGS 링커와 연결된 C-말단 8x 히스티딘 태그(서열번호: 12)를 갖는다. C-말단상에 His-태그를 갖는 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP를 FreeStyle293-F 세포주(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His를 발현하는 조정 배지를 HisTrap 엑셀 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하고 이미다졸 구배로 용출시켰다. 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His 단백질을 함유하는 분획들을 수거하고, 이어서 1X TBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His 단백질을 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 1.4: 재조합 인간 C1s-Flag의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, C-말단 GGGGS 링커 및 Flag 태그(서열번호: 13)를 갖는 인간 C1s(NCBI 기준 서열: NP_958850.1)이다. 재조합 인간 C1s-Flag를 Expi 293F 세포(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 인간 C1s-Flag를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)로 충전된 컬럼에 적용하고, 1X TBS 버퍼를 함유하는 Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 인간 C1s-Flag를 함유하는 분획들을 수거하고, 농축하고, 이어서 1X TBS 버퍼로 평형화된 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 재조합 인간 C1s-Flag를 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 1.5: 재조합 사이노 C1s-Flag의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, C-말단 GGGGS 링커 및 Flag 태그(서열번호: 9)를 갖는 사이노 C1s이다. 재조합 사이노 C1s-Flag를 FreeStyle293-F 세포(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 사이노 C1s-Flag를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)로 충전된 컬럼에 적용하고, 1X TBS 버퍼를 함유하는 Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 사이노 C1s-Flag를 함유하는 분획들을 수거하고, 농축하고, 이어서 1X TBS 버퍼로 평형화된 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 재조합 사이노 C1s-Flag를 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 1.6: 절두된 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은 인간 C1s(NCBI 기준 서열: NP_958850.1)의 아미노산 M1 내지 V173이다. 문헌[Tsai et. al. (Mol Immunol. 1997 Dec;34(18):1273-80]에 기술된 구조물을 따르기 위해 N174Q의 변이를 부가하였다. GGGGS 링커 및 Flag-태그(서열번호: 13)를 C-말단에 부가하였다. 재조합 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag를 FreeStyle293-F 세포(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 인간 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)로 충전된 컬럼에 적용하고, 1X PBS 버퍼를 함유하는 Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 인간 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag를 함유하는 분획들을 수거하고, 4 ℃에서 저장하고, 환원 웨스턴 블롯에서의 항체 결합 어세이를 위해 사용하였다.
실시예 1.7: 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-Flag의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용된 서열은, N-말단 CAMPATH-1H 신호 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호: 11) 및 GGGGS 링커와 연결된 C-말단 Flag 태그를 갖는 인간 C1r CCP1-CCP2-SP I307-D705 (NCBI 기준 서열: NP_001724.3)이다. 인간 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(문헌[Kardos et. al. J Immunol. 2001 Nov 1;167(9):5202-8])(서열번호: 167)를 갖는다. C-말단상에 Flag-태그를 갖는 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP를 FreeStyle293-F 세포주(써모피셔)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP를 발현하는 조정 배지를 항-Flag M2 친화성 수지(시그마)에 적용하고, Flag 펩티드(시그마)로 용출시켰다. 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-Flag 단백질을 함유하는 분획들을 수거하고, 이어서 1X TBS로 평형화된 슈퍼덱스 200 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 이어서, 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-Flag 단백질을 함유하는 분획들을 모으고, 농축하고, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 2: 항-C1s 및 항-C1r2s2 항체의 생성
실시예 2.1: 항-C1s 항체의 생성
하기와 같이 항-C1s 항체를 선택하고 어세이하였다:
6마리의 NZW 토끼를 천연 인간 C1s 전효소(콤테크, A103)로 피내 면역화시켰다. 4개 또는 5개의 반복 용량을 2개월 기간에 걸쳐 제공한 후 혈액 및 비장을 채취하였다. B 세포 선택을 위해, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체, 비오틴화 천연 인간 C1s 전효소, 비오틴화 재조합 인간 C1s-His, 비오틴화 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His 및 재조합 사이노 C1s-Flag를 제조하고 사용하였다. 천연 인간 C1s 전효소, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체, 재조합 인간 C1s-His 또는 재조합 사이노 C1s-Flag에 결합할 수 있는 B 세포를 염색하고, 세포 분류기를 사용하여 분류한 다음, WO2016098356A1 호에 기술된 절차에 따라 플레이팅하고 배양하였다. 배양 후에, B 세포 배양 상등액을 추가 어세이를 위해 수거하고 B 세포 펠릿을 저온보존하였다.
재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 재조합 사이노 C1s-Flag 결합을 B 세포 배양 상등액을 사용하여 ELISA로 평가하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 재조합 사이노 C1s-Flag에 결합할 수 있는 B 세포를 에피토프 어세이를 위해 선택하였다.
ELISA에 의해 에피토프 특성화를 수행하였다. 전술한 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His를 상기 특성화에 사용하였다. B 세포주들은 C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자 또는 C1s CCP1-CCP2-SP 결합자로 분류되었다.
C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자에 대한 중화 활성을 선택된 B 세포 상등액을 사용하여 중화 어세이에 의해 점검하였다. 중화 어세이 절차는 하기에 기술되는 RBC 용해 어세이에 따랐다. 우수한 중화 활성을 갖는 B 세포가 바람직하였으며 유전자 클로닝을 위해 그를 선택하였다.
실시예 2.2: 항-C1r2s2 항체의 생성
하기와 같이 항-C1r2s2 항체를 선택하고 어세이하였다:
3마리의 NZW 토끼를 전술한 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체로 피내 면역화시켰다. 5개의 반복 용량을 2개월 기간에 걸쳐 제공한 후 혈액 및 비장을 채취하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체에 결합할 수 있고 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His에는 결합하지 않는 B 세포, 또는 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체에 결합할 수 있는 B 세포를 염색하고, 세포 분류기를 사용하여 분류한 다음, WO2016098356A1 호에 기술된 절차에 따라 플레이팅하고 배양하였다. 배양 후에, B 세포 배양 상등액을 추가 어세이를 위해 수거하고 B 세포 펠릿을 저온보존하였다.
재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 재조합 사이노 C1r2s2 His/Flag 사량체 결합을 B 세포 배양 상등액을 사용하여 ELISA로 평가하였다. 교차 반응성을 갖는 B 세포를 에피토프 어세이를 위해 선택하였다.
ELISA 기반 에피토프 특성화를 수행하였다. 전술한 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His, 재조합 인간 C1s-Flag 및 재조합 사이노 C1s-Flag를 제조하고 상기 특성화에 사용하였다. C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자인 B 세포주 또는 C1r 결합자인 B 세포주를 확인하였다. 또한, C1r 결합자들은 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-FLAG에 대한 결합 활성을 기반으로 C1r CUB1-EGF-CUB2 결합자 및 C1r CCP1-CCP2-SP 결합자로 분류되었다.
C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자 및 C1r CUB1-EGF-CUB2 결합자에 대한 중화 활성을 선택된 B 세포 상등액을 사용하여 중화 어세이에 의해 점검하였다. 중화 어세이 절차는 하기에 기술되는 RBC 용해 어세이에 따랐다. 우수한 중화 활성을 갖는 B 세포가 바람직하였으며 유전자 클로닝을 위해 그를 선택하였다.
실시예 2.3.1: C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자의 유전자 클로닝 및 서열분석
목적하는 결합 특이성 및 기능을 갖는 선택된 B 세포주의 RNA를 저온보존된 세포 펠릿으로부터 ZR-96 퀵(Quick)-RNA 키트(자이모 리서치(ZYMO RESEARCH), Cat No. R1053)를 사용하여 정제하였다. 이들은 COS0221-0681로 명명하였다. 상기 선택된 세포주에서 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 역전사 PCR로 증폭시키고, IgG4(서열번호: 14), SG136(서열번호: 15), 및/또는 SG1148(서열번호: 16) 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA와 재조합하였다. SG136 Fc는 C1q 및 Fc 감마 수용체 결합을 둘 다 감소시키는 변이를 함유한다. SG1148 Fc는 Fc 감마 수용체 결합은 유지하면서 C1q 결합을 감소시키는 변이를 함유한다. 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA도 또한 역전사 PCR로 증폭시키고, k0MC 경쇄 정상 영역(서열번호: 17)을 코딩하는 DNA와 재조합하였다. 하기에 기술하는 추가의 평가를 통해, 그들의 결합 활성, 특이성 및 기능성을 기반으로 5개의 클론(COS0448, COS0499, COS0547, COS0631 및 COS0637)을 선택하였다. 1개의 클론(COS0583: VH, 서열번호: 22; VL, 서열번호: 29)을 어세이 대조군으로 사용하였다. 상기 5개 항체들의 VH, VL, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 서열번호가 표 2에 열거되어 있다.
Figure pct00002
실시예 2.3.2: C1r CUB1-EGF-CUB2 결합자의 유전자 클로닝 및 서열분석
목적하는 결합 특이성 및 기능을 갖는 선택된 B 세포주의 RNA를 저온보존된 세포 펠릿으로부터 ZR-96 퀵-RNA 키트(자이모 리서치, Cat No. R1053)를 사용하여 정제하였다. 이들은 COR0001-0094, 0189-0376으로 명명하였다. 상기 선택된 세포주에서 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 역전사 PCR로 증폭시키고, IgG4(서열번호: 14), SG136(서열번호: 15), 및/또는 SG1148(서열번호: 16) 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA와 재조합하였다. SG136 Fc는 C1q 및 Fc 감마 수용체 결합을 둘 다 감소시키는 변이를 함유한다. SG1148 Fc는 Fc 감마 수용체 결합은 유지하면서 C1q 결합을 감소시키는 변이를 함유한다. 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA도 또한 역전사 PCR로 증폭시키고, k0MC 경쇄 정상 영역(서열번호: 17)을 코딩하는 DNA와 재조합하였다. 하기에 기술하는 추가의 평가를 통해, 그들의 결합 활성, 특이성 및 기능성을 기반으로 8개의 클론(COR0011, COR0058, COR0067, COR0205, COR0208, COR0212, COR0278 및 COR0338)을 선택하였다. 상기 8개 항체들의 VH, VL, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 서열번호가 표 3에 열거되어 있다.
Figure pct00003
실시예 2.4: 단일클론 항체 발현 및 정제
Expi 293-F 세포 및 엑스피펙타민(Expifectamine) 293(라이프 테크놀로지스(Life technologies))을 제조사의 지시에 따라 사용하여 재조합 항체를 일시적으로 발현시켰다. 배양 상등액 또는 재조합 항체를 선별에 사용하였다. 재조합 항체를 단백질 A(GE 헬쓰케어)로 정제하고 PBS, TBS 또는 His 버퍼(20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH6.0) 중에서 용출시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 수행하여 필요한 경우 고분자량 및/또는 저분자량 성분을 제거하였다.
실시예 3: 항-C1s 및 항-C1r 항체의 결합 특이성
실시예 3.1: 항-C1s 항체의 결합 특이성(비아코어(등록상표))
6개의 C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자들의 결합 특이성을 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 측정하였다. 재조합 단백질 A/G(피어스)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시켰다. 항체 및 애널라이트은 7(+) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 각각의 항체를 단백질 A/G에 의해 센서 표면 위에 포획하였다. 항체 포획 수준은 100 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 천연 조효소 인간 C1s(콤테크 A103)(단량체로서 50 nM에서) 또는 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His(단량체로서 100 nM에서)를 주입한 후, 해리시켰다. 센서 표면을 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl pH 1.5로 재생시켰다. 결과는 도 1a 및 1b에 나타내었다. 6개의 C1s CUB1-EGF-CUB2 결합자들은 천연 조효소 인간 C1s에 결합하였지만, CUB1-EGF-CUB2 도메인이 결여된 절두된 단백질인 재조합 인간 C1s CCP1-CCP2-SP-His에는 결합하지 않았다.
실시예 3.2: 항-C1r 항체의 결합 특이성(비아코어(등록상표))
인간 C1r CUB1-EGF-CUB2 결합자들의 결합 특이성을 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 측정하였다. 재조합 단백질 A/G(피어스)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시켰다. 항체 및 애널라이트은 7(+) 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 각각의 항체를 단백질 A/G에 의해 센서 표면 위에 포획하였다. 항체 포획 수준은 100 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 천연 인간 C1r 효소(콤테크 A102)(이량체로서 25 nM에서) 또는 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-FLAG(단량체로서 50 nM에서)를 주입한 후, 해리시켰다. 센서 표면을 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl pH 1.5로 재생시켰다. 결과는 도 11a 및 11b에 나타내었다. C1r CUB1-EGF-CUB2 결합자들은 천연 인간 C1r 효소에 결합하였지만, C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인이 결여된 절두된 단백질인 재조합 인간 C1r CCP1-CCP2-SP-FLAG에는 결합하지 않은 것을 측정할 수 있었다.
실시예 4: 항-C1s 및 항-C1r 항체의 C1q 대체 기능의 평가(비아코어(등록상표) - 고정화된 C1r2s2)
실시예 4.1: 항-C1s 항체의 C1q 대체 기능의 평가(비아코어(등록상표) - 고정화된 C1r2s2)
항체의 C1q 대체 기능을 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 C1r2s2 포획 방법에 의해 입증하였다. 항-His 항체(GE 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시켰다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q(콤테크 A099)를 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 먼저 항-His 항체에 의해 센서 표면 위에 포획하였다(도 2a의 "hc1r2s2"). 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 천연 인간 C1q를 200 RU의 포획을 갖도록 100 nM에서 주입한(도 2a의 "hc1q") 후, 즉시 항체를 500 nM에서 10 μL/분으로 1200초 동안 주입하였다. 센서 표면을 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 재생시켰다. 결과를 도 2a 내지 2d에 나타내었다. C1q 대체 기능을 갖는 항체의 경우, 센서그램 2(도 2a 및 2c의 큰 점선; "C1r2s2+C1q+Ab")의 반응 단위는, 센서그램 1 및 2가 교차하는 시점("크로스오버 시점") 이후에 센서그램 1(도 2a 내지 2c의 작은 점선; "C1r2s2+C1q+버퍼")에서의 반응 단위보다 낮았다. 센서그램 2가 센서그램 1과 교차하는 시간에 따라서, COS0499를 빠른 대체 변이체로 분류하였다. COS0547, COS0631 및 COS0637은 비교적 느린 대체를 나타내었다. COS0448은 빠른 대체와 느린 대체의 중간에 있었다.
크로스오버 시점은 항체(Ab) 반응(센서그램 2)으로부터 버퍼 반응(센서그램 1)을 감하고, 미분값이 양에서 음으로 변할 때의 시점을 참고함으로써 확인하였다(표 4). Ab 주입 시작으로부터의 시간을 표 4에 "크로스오버 시점"으로 나타내었다.
여기에서, COS448, COS499, COS0547, COS583, COS0631, 및 COS0637은 달리 각각 COS448oo(-SG1148), COS499ee(-SG1148), COS0547gg(-SG1148), COS583gg(-SG1148), COS0631gg(-SG1148), 및 COS0637cc(-SG1148)로도 칭할 수 있음을 유의한다.
Figure pct00004
실시예 4.2: 항-C1r 항체의 C1q 대체 기능의 평가(비아코어(등록상표) - 고정화된 C1r2s2)
항체의 C1q 대체 기능을 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 C1r2s2 포획 방법에 의해 입증하였다. 항-His 항체(GE 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시켰다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q(콤테크 A099)를 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 먼저 항-His 항체에 의해 센서 표면 위에 포획하였다("hc1r2s2"). 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 천연 인간 C1q를 200 RU의 포획을 갖도록 100 nM에서 주입한("hc1q") 후, 즉시 항체를 500 nM에서 10 μL/분으로 1200초 동안 주입하였다. 센서 표면을 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 재생시켰다. 결과를 도 12a 내지 12d에 나타내었다. C1q 대체 기능을 갖는 항체의 경우, 센서그램 2(C1r2s2, C1q 및 항체의 존재하에서)의 반응 단위는, 센서그램 1 및 2가 교차하는 시점("크로스오버 시점") 이후에 센서그램 1(C1r2s2, C1q 및 버퍼의 존재하에서, 및 항체의 부재하에서)에서의 반응 단위보다 낮았다.
크로스오버 시점은 항체(Ab) 반응(센서그램 2)으로부터 버퍼 반응(센서그램 1)을 감하고, 미분값이 양에서 음으로 변할 때의 시점을 참고함으로써 확인한다(표 5).
여기에서, COR0011, COR0058, COR0067, COR0205, COR208, COR0212, COR0278, 및 COR0338은 달리 각각 COR0011bb(-SG1148), COR0058bb(-SG1148), COR0067ff(-SG1148), COR205gg(-SG1148), COR208cc(-SG1148), COR0212bb(-SG1148), COR0278bb(-SG1148), 및 COR0338gg(-SG1148)로 칭할 수 있음을 유의한다.
Figure pct00005
실시예 5: 항-C1s 항체의 C1q 대체 기능의 평가(비아코어(등록상표) - 고정화된 C1q)
항체의 C1q 대체 기능을 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 C1q 포획 방법에 의해 입증하였다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q(콤테크 A099)를 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 비오틴화 천연 인간 C1q를 먼저 CAP 센서 칩(GE 헬쓰케어)의 하나의 유동 세포 위에 포획하였다. 포획 수준은 800 내지 1000 공명 단위(RU)의 범위를 목표로 하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 300 nM에서 주입한 후, 항체를 500 nM에서 10 μL/분으로 180초 동안 주입하였다. 센서 표면은 매 주기마다 3-대-1 비의 8 M 구아니딘-HCl 및 1 M NaOH로 재생시켰다. 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE 헬쓰케어)를 사용하여 블랭크를 감한 후의 센서그램을 도 3에 나타내었다. C1q 대체 기능을 갖는 항체는 C1r2s2의 해리 속도를 증대시켰다, 즉, 도 3에서 "2: C1q+C1r2s2+Ab"(점선) 곡선이 "1: C1q+C1r2s2+버퍼"(실선) 곡선 아래에 있다. COS0499는 빠른 대체 변이체이다. COS0631 및 COS0637은 느린 대체 변이체들이다. COS0448 및 COS0547은 중간 속도의 대체를 나타내었다.
실시예 6: 항-C1s 항체의 C1q 차단 기능의 평가(비아코어(등록상표)
항체에 의한 C1r2s2로의 C1q 결합의 차단을 평가하기 위해, 37 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 차단 어세이를 수행하였다. 항-His 항체(GE 헬쓰케어)를 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 CM4 센서 칩의 모든 유동 세포 위에 고정화시켰다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체 및 천연 인간 C1q를 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-비함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 재조합 인간 C1r2s2 Flag/His 사량체를 먼저 항-His 항체에 의해 센서 표면 위에 포획하였다(도 4의 "hc1r2s2"). 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 상기 항체 변이체를 500 nM에서 주입한 후(도 4의 "Ab"), 천연 인간 C1q를 100 nM에서 주입하였다(도 4의 "hc1q"). 센서 표면을 매 주기마다 10 mM 글리신-HCl(pH 1.5)로 재생시켰다. C1q 차단 기능을 갖는 항체는 C1r2s2에 대한 결합에 있어서 C1q와 경합하는 것들이다. 결과는 도 4에 나타내었다. COS0448, CPS0631, COS0637 및 COS0499가 C1q 결합에 대해 강한 차단 기능을 나타내었다. COS0547에서는 부분적 차단이 관찰되었다. 다른 한편으로, COS0583은 차단 기능을 나타내지 않았다.
실시예 7: 보체 중화 기능(RBC 용해 억제)의 평가
항체들의 중화 기능을 다음과 같이 평가하였다. 감작된 양 또는 닭의 RBC를 사용하여 항체들의 보체 억제 활성을 평가하였다. 하기의 방법은 양 RBC 용해 어세이에 사용된 프로토콜을 기술한다. 인간 혈청(바이오프레딕(Biopredic))을 어세이 버퍼(0.05% BSA 함유 HBSS Ca2+ Mg2+)를 사용하여 8%로 희석하고, 37 ℃에서 40 μg/mL로 희석된 동부피의 항체와 함께 3 시간동안 예비배양하였다. 대조군으로, 인간 혈청을 어세이 버퍼와만, 또는 10 mM EDTA 함유 어세이 버퍼와 함께 예비배양하였다. 양 적혈구 세포(이노베이티브 리서치(Innovative Research))를 항-양 적혈구 세포 간질 항체(압캠(Abcam))로 감작시키고, 세정하고, 계수하고, 어세이 버퍼 중에 5 x 108 세포/mL로 조정하였다. 이어서, 항체/혈청 혼합물을 동부피의 감작된 양 적혈구 세포(이노베이티브 리서치)에 가하고, 37 ℃에서 1 시간동안 배양하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 상기 반응에서 인간 혈청 및 항체들의 최종 농도는 각각 2% 및 10 μg/mL이었다. EDTA를 함유하는 냉각 어세이 버퍼로 상기 반응을 중단시켰다. 혼합물을 원심분리하여 미용해된 세포를 펠릿화하고, 상등액을 회수하고, 415 nm에서의 흡광도(OD)에서 630 nm에서의 OD를 감한 값을 이용하여 헤모글로빈의 방출을 어세이하였다. 적혈구 세포 용해의 억제%를 계산하기 위해, 0% 억제는 항체가 첨가되지 않은(버퍼만) 조건으로 설정하고, 100% 억제는 EDTA가 5 mM의 최종 농도로 첨가된 조건으로 설정하였다. 도 5 및 도 13에 나타낸 데이터는 2개의 복제 웰로부터의 평균 + SD로 나타내었다.
실시예 8: 경합적 에피토프 어세이
옥텟(폴 포르테바이오(Pall ForteBio))을 사용하여 실시간 결합 어세이에 의해 경합적 에피토프 비닝 실험을 수행하였다. 비오틴화 재조합 인간 C1s-Flag를 제조하고, 스트렙트아비딘 바이오센서 팁(폴 포르테바이오) 위에 포획하였다. 항원이 포획된 팁을 25 마이크로그램(μg)/mL의 제1 항체 세트내에 200 초동안 침지시켰다. 이어서, 상기 팁을 25 μg/mL의 제2 항체 세트와 함께 200 초동안 배양하였다. 항체 해리 효과를 배제시키기 위해, 제2 항체 세트는 동일한 농도의 제1 항체를 포함한다. 결과는 데이터 분석 HT 소프트웨어(폴 포르테바이오, 버전 10.0.1.7)로 어세이하였다. 제2 항체 세트의 양성 반응은 상이한 에피토프들을 가리키고, 제2 항체 세트의 음성 반응은 동일한 에피토프들을 나타낸다. C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 결합하는 항체들을 3개의 "에피토프 빈"으로 분류하였다. 대체 항체들은 에피토프 빈 1 및 2 내에 위치한다. 도 6에서, "Ab1"은 제1 항체 세트를 나타내고, "Ab2"는 제2 항체 세트를 나타낸다. 문자 'Y' 및 'N'은 나란히 있는 각각의 항체 쌍들의 결합에 대한 yes/no를 나타낸다(즉, "no"는 항체가 서로와 경합하고 "나란히 있는" 항원에는 결합하지 않음을 의미하며, 따라서 이들은 동일 에피토프 빈에 위치한다). C1s의 CCP1-CCP2-SP 도메인 내에서는 결합하지만 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내에서는 결합하지 않는 C1s CCP1-CCP2-SP 결합자(VH: 서열번호: 18, VL: 서열번호: 25)를 대조군 항체로 첨가하였다.
실시예 9: 항-C1s CUB1-EGF-CUB2 및 CCP1-CCP2-SP 결합자 항체를 사용한 마우스 PK 연구
고성능 액체 크로마토그래피-전기분무 탠덤 질량 분석법(LC/ESI-MS/MS)에 의한 마우스 혈장내 총 인간 C1s 및 C1q 농도의 측정
마우스 혈장 내 인간 C1s 및 C1q의 전체 농도를 LC/ESI-MS/MS로 측정하였다. 인간 C1s 및 C1q를 마우스 혈장 중에서 정해진 양으로 혼합하고 희석시켜 보정 표준물을 제조하여, 각각 0.477, 0.954, 1.91, 3.82, 7.64, 15.3, 30.5 마이크로그램(μg)/mL의 인간 C1s 농도 및 0.977, 1.95, 3.91, 7.81, 15.6, 31.3 및 62.5 μg/mL의 인간 C1q 농도를 제공하였다. 2 μL의 보정 표준물 및 혈장 샘플을 50 mM/L 중탄산나트륨 중에서 25 μL의 6.8 M/L 우레아, 9.1 mM/L 다이싸이오트레이톨 및 0.4 μg/mL 리소자임(계란 난백)과 혼합하고, 56 ℃에서 45 분동안 배양하였다. 이어서, 2 μL의 500 mM/L 아이오도아세트아마이드를 첨가하고, 37 ℃ 암소에서 30 분동안 배양하였다. 다음으로, 50 mM/L 중탄산암모늄 중의 160 μL의 0.5 μg/mL 서열분석 등급의 수식된 트립신(프로메가)을 첨가하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 마지막으로, 5 μL의 10% 트라이플루오로아세트산을 첨가하여 임의의 잔류 트립신을 탈활성화시켰다. 40 μL의 소화 샘플을 LC/ESI-MS/MS에 의한 어세이에 적용하였다. LC/ESI-MS/MS는 2D I-등급 UPLC(워터스)가 장착된 제보 TQ-S 3중 4중극자 분석기기(워터스)를 사용하여 수행하였다. 인간 C1s 특이적 펩티드 LLEVPEGR 및 인간 C1q 특이적 펩티드 IAFSATR을 선택 반응 모니터링(SRM)으로 모니터하였다. SRM 전이는 인간 C1s의 경우 [M+2H]2+(m/z 456.8)에서 y6 이온(m/z 686.3)까지이고, 인간 C1q의 경우 [M+2H]2+(m/z 383.2)에서 y5 이온(m/z 581.3)까지였다. 농도에 대해 도표화된 피크 면적을 이용하여 가중(1/x2) 선형 회귀에 의해 보정 곡선을 제작하였다. 마우스 혈장내 농도는 분석 소프트웨어 Masslynx Ver.4.1(워터스)을 사용하여 보정 곡선으로부터 산출하였다.
마우스에서 항-C1s 항체의 투여후 전체 hC1s 및 hC1q에 대한 약동학의 평가
실시예 1에서 제조된 hC1s, hC1q 및 항-C1s 항체들의 생체내 약동학을, 항원을 단독으로(hC1q, 재조합 C1r2s2, hC1q와 rC1r2s2의 혼합물) 또는 항-C1s 항체와 함께 마우스(CB17/Icr-Prkdcscid/CrlCrlj: 찰스 리버 재팬)에게 투여한 후에 평가하였다. 3마리의 마우스를 각각의 투약군에 할당하였다.
제일 먼저, hC1q 용액(0.84 mg/mL), rC1r2s2(0.47 mg/mL), 또는 hC1q 및 rC1r2s2(각각 0.84 및 0.47 mg/mL)를 함유하는 혼합물의 용액을 10 mL/kg의 용량으로 마우스에게 정맥내 주입하였다. 항원 용액의 투약후에, 항-C1s 항체 용액(2.5 mg/mL)을 동일한 개체에게 동일한 방식으로 즉시 투여하였다.
C1q 및 rC1r2s2의 용량 설정은 투여 직후 인간 혈장내 생리학적 농도가 되도록 설계하였다. 항-C1s 항체의 투여량은 연구동안 항원 둘 다에 비해 과잉 농도가 되도록 조정하고, 따라서 거의 모든 hC1s가 순환시 결합된 형태일 것으로 추정되었다.
혈액을 주입후 5, 30 분, 2, 7 시간, 3, 7, 14, 21 및 28 일에 채취하였다. 혈액을 즉시 원심분리시켜 혈장 샘플을 분리하였다. hC1s 및 hC1q의 혈장 농도를 각 샘플링 시점에서 LC/ESI-MS/MS로 측정하였다. hC1s 및 hC1q의 PK 파라미터들은 비-구획 어세이(피닉스 윈논린 버전 8.0, 서타라)으로 평가하였다.
하기의 항체들을 마우스에게 항-C1s 항체로서 투여하였다(표 2 및 7):
1. COS0098bb-SG1148/SG136
2. COS0112gg-SG1148/SG136
3. COS0127bb-SG1148/SG136
4. COS0158ee-SG1148/SG136
5. COS0182hh-SG1148/SG136
6. COS0448oo-SG1148/SG136
7. COS0499ee-SG1148/SG136
8. COS0547gg-SG1148/SG136
9. COS0631gg-SG1148/SG136
10. COS0637cc-SG1148/SG136
마우스 PK 연구 결과는 도 7에 나타내었다. hC1q 및 hC1s의 PK 파라미터들을 표 6에 나타내었다. 5개 CCP1-CCP2-SP 결합자들(COS0098bb, COS0112gg, COS0127bb, COS0158ee 및 COS0182hh)의 hC1s CL 비(SG1148/SG136)는 각각 9.2, 6.9, 5.6, 3.8 및 6.6이었다.
5개 CUB1-EGF-CUB2 결합자들(COS0448oo, COS0499ee, COS0547gg, COS0631gg 및 COS0637cc)의 hC1s CL 비(SG1148/SG136)는 각각 4.2, 5.8, 3.6, 13.6 및 28.0이었다. 상기 값은 Fc 감마 수용체를 통한 hC1s 제거를 가속화시킬 가능성을 나타낸다. COS0098bb 및 COS0637cc는 각각 CCP1-CCP2-SP 및 CUB1-EGF-CUB2 결합자들 중에서 최고의 가능성을 갖는 것으로 고려된다. hC1q CL 비(SG1148/SG136)를 동일한 방식으로 평가하였다. 모든 CCP1-CCP2-SP 결합자들이 SG136에 비해 C1q 제거를 약 2배 가속화하였다. 다른 한편으로, CUB1-EGF-CUB2 결합자는 COS0499ee를 제외하고 C1q CL에 영향을 미치지 않았다. 상기 연구로부터, CUB1-EGF-CUB2 결합자는 CCP1-CCP2-SP 결합자에 비해 C1q 약동학에 영향을 덜 미칠 수 있다.
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 10: 시간 의존성 보체 중화 기능(RBC 용해 억제)
항체들의 시간 의존성 중화 기능을 다음과 같이 평가하였다. 인간 혈청(바이오프레딕)을 어세이 버퍼(0.05% BSA 함유 HBSS Ca2+ Mg2+)를 사용하여 8%로 희석하고, 37 ℃에서 40 μg/mL로 희석된 동부피의 항체와 함께 0.5, 1 또는 3 시간동안 예비배양하였다. 대조군으로, 인간 혈청을 어세이 버퍼와만, 또는 10 mM EDTA 함유 어세이 버퍼와 함께 예비배양하였다. 이어서, 항체/혈청 혼합물을 동부피의 감작된 양 적혈구 세포(이노베이티브 리서치)에 가하고, 37 ℃에서 1 시간동안 배양하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 상기 반응에서 인간 혈청 및 항체의 최종 농도는 각각 2% 및 10 μg/mL이었다. EDTA를 함유하는 냉각 어세이 버퍼로 상기 반응을 중단시켰다. 혼합물을 원심분리하여 미용해된 세포를 펠릿화하고, 상등액을 회수하고, 415 nm에서의 흡광도(OD)에서 630 nm에서의 흡광도를 감한 값을 이용하여 헤모글로빈의 방출을 어세이하였다. 억제%에 대한 어세이 및 양 적혈구 세포 감작은 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 데이터는 2개의 복제 웰로부터의 평균 + SD로 나타내었다. 도 8은 하기의 항-C1s 항체들에 의한 인간 혈청 보체 활성의 시간 의존성 중화를 예시한다: COS0448oo-SG1148; COS0499ee-SG1148; COS0631gg-SG1148; 및 COS0637cc-SG1148.
실시예 11: 환원 및 비-환원 웨스턴 블로팅 어세이에서 천연 인간 전효소 C1s에 대한 항체 결합
천연 인간 C1s 전효소 단백질(콤테크)의 웨스턴 블롯 어세이를 비-환원(NR) 및 환원 조건(R) 하에 수행하였다. C1s 전효소를 3-머캅토-1,2-프로판다이올(와코(Wako))의 존재 또는 부재하에 95 ℃에서 SDS를 함유하는 샘플 부하 버퍼중에서 비등시켰다. 각각의 블롯을 실온에서 5 μg/mL의 농도의 나타낸 항-C1s 항체들과 함께 1 시간동안 배양하고, 항-인간 IgG 알칼리 포스파타제(바이오래드(Biorad)) 2차 항체로 검출하였다. 도 9는 하기의 항체들 상에서의 환원 및 비-환원 웨스턴 블로팅 어세이에서 천연 인간 전효소 C1s에 대한 항체 결합을 예시한다: COS0448oo-SG136; COS0499ee-SG136; COS0547gg-SG136; COS0583gg-SG136; COS0631gg-SG136; 및 COS0637cc-SG136.
실시예 12: 환원 웨스턴 블롯에서 절두된 C1s 단백질에 대한 항체 결합
절두된 인간 C1s 단백질에 대한 항-C1s 항체들의 결합을 다음과 같이 환원 웨스턴 블롯으로 어세이하였다. 재조합 전장 인간 C1s-Flag 및 절두된 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag를 SDS 및 3-머캅토-1,2-프로판다이올(와코)을 함유하는 샘플 부하 버퍼 중에서 비등시켰다. 각각의 블롯을 실온에서 1 μg/mL의 농도의 지시된 항-C1s 항체들과 함께 1 시간동안 배양하고, F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fc 알칼리 포스파타제(써모피셔) 2차 항체로 검출하였다. 대조군으로, 항-Flag (M2) 항체(시그마) 알칼리 포스파타제를 사용하여 재조합 전장 및 절두된 인간 C1s를 검출하였다. 표기 FL은 전장 C1s-Flag를 나타내고, 1 내지 173은 절두된 인간 C1s M1 내지 V173+N174Q-Flag를 나타낸다. 도 10은 하기의 항체들 상에서의 환원 웨스턴 블롯에서 절두된 C1s 단백질에 대한 항체 결합을 예시한다: COS0448oo-SG136; COS0499ee-SG136; COS0583gg-SG136; COS0631gg-SG136; 및 COS0637cc-SG136.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTI-COMPLEMENT COMPONENT ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> C1A1804Y1P <150> JP 2018-077527 <151> 2018-04-13 <150> JP 2018-188770 <151> 2018-10-04 <160> 167 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 688 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Cys Ile Val Leu Phe Ser Leu Leu Ala Trp Val Tyr Ala Glu 1 5 10 15 Pro Thr Met Tyr Gly Glu Ile Leu Ser Pro Asn Tyr Pro Gln Ala Tyr 20 25 30 Pro Ser Glu Val Glu Lys Ser Trp Asp Ile Glu Val Pro Glu Gly Tyr 35 40 45 Gly Ile His Leu Tyr Phe Thr His Leu Asp Ile Glu Leu Ser Glu Asn 50 55 60 Cys Ala Tyr Asp Ser Val Gln Ile Ile Ser Gly Asp Thr Glu Glu Gly 65 70 75 80 Arg Leu Cys Gly Gln Arg Ser Ser Asn Asn Pro His Ser Pro Ile Val 85 90 95 Glu Glu Phe Gln Val Pro Tyr Asn Lys Leu Gln Val Ile Phe Lys Ser 100 105 110 Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe Thr Gly Phe Ala Ala Tyr Tyr Val 115 120 125 Ala Thr Asp Ile Asn Glu Cys Thr Asp Phe Val Asp Val Pro Cys Ser 130 135 140 His Phe Cys Asn Asn Phe Ile 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285 Gly Asp Pro Ile Pro Cys Pro Lys Glu Ile Ser Ala Asn Ser Ile Trp 290 295 300 Glu Pro Glu Lys Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Val Val Lys Ile Thr 305 310 315 320 Cys Val Asp Gly Phe Glu Val Val Glu Gly Asn Val Gly Ser Thr Ser 325 330 335 Phe Tyr Ser Thr Cys Gln Ser Asn Gly Gln Trp Ser Asn Ser Arg Leu 340 345 350 Glu Cys Gln Pro Val Asp Cys Gly Val Pro Glu Pro Ile Glu Asn Gly 355 360 365 Lys Val Glu Asp Pro Glu Asp Thr Val Phe Gly Ser Val Ile His Tyr 370 375 380 Thr Cys Glu Glu Pro Tyr Tyr Tyr Met Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu 385 390 395 400 Tyr His Cys Ala Ala Asn Gly Ser Trp Val Asn Asp Gln Leu Gly Val 405 410 415 Glu Leu Pro Lys Cys Ile Pro Val Cys Gly Val Pro Thr Glu Pro Phe 420 425 430 Lys Val Gln Gln Arg Ile Phe Gly Gly Tyr Ser Thr Lys Ile Gln Ser 435 440 445 Phe Pro Trp Gln Val Tyr Phe Glu Ser Pro Arg Gly Gly Gly Ala Leu 450 455 460 Ile Asp Glu Tyr Trp Val Leu Thr Ala Ala His Val Val Glu Gly Asn 465 470 475 480 Ser Asp Pro Val Met Tyr Val Gly Ser Thr Leu Leu Lys Ile Glu Arg 485 490 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sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 18 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Phe Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 19 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Gly 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Phe Val Ser Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp 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artificially synthesized sequence <400> 32 Asn Tyr Gly Met Ile 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 33 Phe Val Ser Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 34 Gly Ala Tyr Asn Thr Asp Ser Tyr Ser Tyr Ser Leu Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Leu <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 35 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 36 Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 37 Gln Ser Asn Tyr Ala Thr Thr Thr Thr Tyr Gly Thr 1 5 10 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 38 Asn Tyr Asn Met Ala 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 39 Ile Ile Glu Thr Thr Thr Asn Thr Tyr Tyr Ala Arg Trp Ala Arg Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 40 Arg Val Ser Asn Ser His Asp Leu 1 5 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 41 Gln Ala Ser Gln Thr Ile Gly Gly Trp Cys Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 42 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 43 Gln His Gly Tyr Tyr Thr Ser Ser Thr Ile Glu Asn Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 44 Ser Tyr His Met Asp 1 5 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 45 Ile Ile Thr Tyr Thr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 46 Arg Gln Tyr Asp Ala Tyr Asn Val 1 5 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 47 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 48 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 49 Gln His Gly Tyr Tyr Thr Ser Ser Asn Ile Asp Ser Val 1 5 10 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 50 Arg Tyr Ser Met Gly 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 51 Ile Ile Tyr Ala Asp Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 52 Gly Gln Phe Ile Asn Ser Asn Glu Phe Phe Asn Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 53 Gln Ala Ser Gln Ser Leu His Asn Asn Lys Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 54 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 55 Ala Gly Glu Phe Ser Cys Ser Asn Gly Asp Cys Asn Ala 1 5 10 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 56 Ala Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 57 Leu Ile Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 58 Gly Arg Ser Val Asn Tyr Asn Ser Asp Phe Lys Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 59 Gln Ala Ser Gln Ser Leu His Asp Lys Lys Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 60 Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 61 Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Asn Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 62 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr Thr 20 25 30 Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Phe Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Gln Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asn 85 90 95 Gly Asp Thr Asp Tyr Thr Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 63 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Pro 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Thr Ile Ser Ala Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Asp Gly Thr Tyr Met Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 64 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn Asn Tyr Pro 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Tyr Pro Tyr Arg Asp Ile Thr Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 65 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Thr 20 25 30 Met Ile Trp Val Arg 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Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 90 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 91 Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 92 Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Thr Thr Thr 1 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 93 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 94 Gly Ala Ser Thr Leu Thr Asn 1 5 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 95 Gln Asn Tyr Tyr Ser Gly Gly Ser Ala Asp Thr Thr 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 96 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Val Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 97 Lys Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 98 Gln Gln Asp Tyr Thr Tyr Ser Asp Val Thr Asn Ile 1 5 10 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 99 Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 100 Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 101 Gln Gln Tyr Tyr Ala Thr Thr Ser Val Asp 1 5 10 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 102 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 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Lys Pro 85 90 95 Glu Ser Asp Tyr Val Asn Gly Met Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 104 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Ser Asn Tyr Asn 20 25 30 Met Gln Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ser Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Gly 85 90 95 Ala Asn Phe Gly Asp Tyr Thr Val Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 105 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 105 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Asn Ala 20 25 30 Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Ile Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Leu Asn Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Arg Asp Ser Ser Ser Gly Tyr Ala Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 106 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 106 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Phe Lys Pro Thr Asp Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn Ala 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Tyr Leu Thr Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Glu 85 90 95 Phe Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 107 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 107 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr 20 25 30 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ala Ser Asp Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu 85 90 95 Asp Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 108 Gln Glu Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly Arg Lys 85 90 95 Ile Asn Asp Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 109 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 109 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Tyr Thr Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly 85 90 95 Asp Ser Tyr Gly Ala Val Asp Thr Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 110 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 110 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Asn Ala 20 25 30 Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 35 40 45 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Ile Trp Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Leu Asn Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Arg Ala Ser Ser Ser Gly Tyr Ala Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 111 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 111 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Asp Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Leu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gly Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Gly Tyr Ser Arg 85 90 95 Thr Asp Asp Thr Phe Phe Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 Ile Lys <210> 112 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 112 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Asn Ile Asn 85 90 95 Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 113 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 114 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 114 Asp Ile Ile Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Tyr 20 25 30 Phe Ser Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Gly Tyr Asn Ile 85 90 95 Asn Asp Asn Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 115 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 115 Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly His Arg Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp 85 90 95 Phe Thr Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 116 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 116 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Gly Trp Ile Tyr Asp Thr 85 90 95 Ile Asp Ser Asn Cys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 117 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 117 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Glu Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly 85 90 95 Ile Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 118 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 118 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 119 Gly Tyr Tyr Met Cys 1 5 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 120 Asn Tyr Asn Met Gln 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 121 Ser Asn Ala Met Cys 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 122 Ser Asn Ala Met Ser 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 123 Asn Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 124 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 124 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 125 Ser Tyr Asp Met Thr 1 5 <210> 126 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 126 Ser Asn Ala Met Cys 1 5 <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 127 Ile Ile Ala Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 128 Ile Ile Trp Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 129 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Ile Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 130 Ile Ile Tyr Leu Thr Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 131 Ile Ile Ala Ser Asp Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 132 Ile Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 133 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 133 Ile Ile Tyr Thr Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 134 Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Ile Trp Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 135 Pro Glu Ser Asp Tyr Val Asn Gly Met Gly Leu 1 5 10 <210> 136 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 136 Gln Gly Ala Asn Phe Gly Asp Tyr Thr Val Asp Leu 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 137 Arg Asp Ser Ser Ser Gly Tyr Ala Phe Lys Leu 1 5 10 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 138 Gly Glu Phe Ser Leu 1 5 <210> 139 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 139 Asp Leu Asp Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Asp Leu 1 5 10 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 140 Lys Ile Asn Asp Ala Phe Asp Pro 1 5 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 141 Gly Gly Asp Ser Tyr Gly Ala Val Asp Thr Ala Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 142 Arg Ala Ser Ser Ser Gly Tyr Ala Phe Lys Leu 1 5 10 <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 143 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Leu Ser 1 5 10 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 144 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 145 Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 146 Gln Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Tyr Phe Ser 1 5 10 <210> 147 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 147 Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 148 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 148 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 149 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 149 Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Ser Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 150 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 151 Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 152 Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 153 Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 154 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 155 Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 156 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 156 Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 157 Arg Ala Ser Arg Leu Ala Ser 1 5 <210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 158 Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 159 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 159 Gln Ser Asn Tyr Gly Tyr Ser Arg Thr Asp Asp Thr Phe Phe Tyr Gly 1 5 10 15 <210> 160 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 160 Gln Gln Gly Tyr Ser Asn Ile Asn Val Asp Asn Thr 1 5 10 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 161 Gln Cys Thr Tyr Asp Asp Ser Ser Thr 1 5 <210> 162 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 162 Gln Cys Thr Tyr Gly Tyr Asn Ile Asn Asp Asn Tyr Gly Asn Ala 1 5 10 15 <210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 163 Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Phe Thr Asp Thr Thr 1 5 10 <210> 164 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 164 Gln His Gly Trp Ile Tyr Asp Thr Ile Asp Ser Asn Cys 1 5 10 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 165 Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Ile Asn Ala 1 5 10 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 166 Gln Cys Thr Tyr Asp Asp Ser Ser Thr 1 5 <210> 167 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 167 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ile Lys Cys Pro Gln Pro Lys Thr Leu Asp Glu Phe Thr 20 25 30 Ile Ile Gln Asn Leu Gln Pro Gln Tyr Gln Phe Arg Asp Tyr Phe Ile 35 40 45 Ala Thr Cys Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Ile Glu Gly Asn Gln Val Leu 50 55 60 His Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Asp Asp Gly Thr Trp His Arg Ala 65 70 75 80 Met Pro Arg Cys Lys Ile Lys Asp Cys Gly Gln Pro Arg Asn Leu Pro 85 90 95 Asn Gly Asp Phe Arg Tyr Thr Thr Thr Met Gly Val Asn Thr Tyr Lys 100 105 110 Ala Arg Ile Gln Tyr Tyr Cys His Glu Pro Tyr Tyr Lys Met Gln Thr 115 120 125 Arg Ala Gly Ser Arg Glu Ser Glu Gln Gly Val Tyr Thr Cys Thr Ala 130 135 140 Gln Gly Ile Trp Lys Asn Glu Gln Lys Gly Glu Lys Ile Pro Arg Cys 145 150 155 160 Leu Pro Val Cys Gly Lys Pro Val Asn Pro Val Glu Gln Arg Gln Gln 165 170 175 Ile Ile Gly Gly Gln Lys Ala Lys Met Gly Asn Phe Pro Trp Gln Val 180 185 190 Phe Thr Asn Ile His Gly Arg Gly Gly Gly Ala Leu Leu Gly Asp Arg 195 200 205 Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Thr Leu Tyr Pro Lys Glu His Glu Ala 210 215 220 Gln Ser Asn Ala Ser Leu Asp Val Phe Leu Gly His Thr Asn Val Glu 225 230 235 240 Glu Leu Met Lys Leu Gly Asn His Pro Ile Arg Arg Val Ser Val His 245 250 255 Pro Asp Tyr Arg Gln Asp Glu Ser Tyr Asn Phe Glu Gly Asp Ile Ala 260 265 270 Leu Leu Glu Leu Glu Asn Ser Val Thr Leu Gly Pro Asn Leu Leu Pro 275 280 285 Ile Cys Leu Pro Asp Asn Asp Thr Phe Tyr Asp Leu Gly Leu Met Gly 290 295 300 Tyr Val Ser Gly Phe Gly Val Met Glu Glu Lys Ile Ala His Asp Leu 305 310 315 320 Arg Phe Val Arg Leu Pro Val Ala Asn Pro Gln Ala Cys Glu Asn Trp 325 330 335 Leu Arg Gly Lys Asn Arg Met Asp Val Phe Ser Gln Asn Met Phe Cys 340 345 350 Ala Gly His Pro Ser Leu Lys Gln Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly 355 360 365 Gly Val Phe Ala Val Arg Asp Pro Asn Thr Asp Arg Trp Val Ala Thr 370 375 380 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ser Arg Gly Tyr Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Thr Lys Val Leu Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys Lys Glu Met Glu Glu 405 410 415 Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 420 425 430

Claims (15)

  1. C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, 상기 항체가 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진시키는 대체 기능을 갖는, 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 비아코어(등록상표) 칩 상에서 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하며, 충분한 시간이 지났을 때 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체 존재하에서의 반응 단위(RU) 값이 항체 부재하에서의 반응 단위(RU) 값보다 낮은 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    비아코어(등록상표) 어세이에서의 크로스오버 시점이, 하기 조건을 이용한 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체 주입 시작 시점 후 1000초 이내인 항체: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터/분으로 주입한다.
  4. 제 2 항에 있어서,
    하기 조건을 이용한 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체 주입 시작 시점 후 2000초 이내에 C1q의 거의 전부가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 항체: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM에서 10 마이크로리터/분으로 주입한다.
  5. C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, RBC 어세이에서 인간 혈청 보체에 대해 70% 이상의 중화 활성을 갖는, 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    C1s에 특이적으로 결합하는 항체 또는 C1r에 특이적으로 결합하는 항체인, 항체.
  7. C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서,
    C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며 상기 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 1) 내지 5)로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합하거나, 또는
    C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하며 상기 에피토프에 대한 결합에 있어서 하기 6) 내지 13)으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 경합하는, 항체:
    1) 서열번호: 32의 HVR-H1 서열, 서열번호: 33의 HVR-H2 서열, 서열번호: 34의 HVR-H3 서열, 서열번호: 35의 HVR-L1 서열, 서열번호: 36의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 37의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    2) 서열번호: 38의 HVR-H1 서열, 서열번호: 39의 HVR-H2 서열, 서열번호: 40의 HVR-H3 서열, 서열번호: 41의 HVR-L1 서열, 서열번호: 42의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 43의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    3) 서열번호: 44의 HVR-H1 서열, 서열번호: 45의 HVR-H2 서열, 서열번호: 46의 HVR-H3 서열, 서열번호: 47의 HVR-L1 서열, 서열번호: 48의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 49의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    4) 서열번호: 50의 HVR-H1 서열, 서열번호: 51의 HVR-H2 서열, 서열번호: 52의 HVR-H3 서열, 서열번호: 53의 HVR-L1 서열, 서열번호: 54의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 55의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
    5) 서열번호: 56의 HVR-H1 서열, 서열번호: 57의 HVR-H2 서열, 서열번호: 58의 HVR-H3 서열, 서열번호: 59의 HVR-L1 서열, 서열번호: 60의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 61의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    6) 서열번호: 119의 HVR-H1 서열, 서열번호: 127의 HVR-H2 서열, 서열번호: 135의 HVR-H3 서열, 서열번호: 143의 HVR-L1 서열, 서열번호: 151의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 159의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    7) 서열번호: 120의 HVR-H1 서열, 서열번호: 128의 HVR-H2 서열, 서열번호: 136의 HVR-H3 서열, 서열번호: 144의 HVR-L1 서열, 서열번호: 152의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 160의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    8) 서열번호: 121의 HVR-H1 서열, 서열번호: 129의 HVR-H2 서열, 서열번호: 137의 HVR-H3 서열, 서열번호: 145의 HVR-L1 서열, 서열번호: 153의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 161의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    9) 서열번호: 122의 HVR-H1 서열, 서열번호: 130의 HVR-H2 서열, 서열번호: 138의 HVR-H3 서열, 서열번호: 146의 HVR-L1 서열, 서열번호: 154의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 162의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    10) 서열번호: 123의 HVR-H1 서열, 서열번호: 131의 HVR-H2 서열, 서열번호: 139의 HVR-H3 서열, 서열번호: 147의 HVR-L1 서열, 서열번호: 155의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 163의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    11) 서열번호: 124의 HVR-H1 서열, 서열번호: 132의 HVR-H2 서열, 서열번호: 140의 HVR-H3 서열, 서열번호: 148의 HVR-L1 서열, 서열번호: 156의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 164의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체,
    12) 서열번호: 125의 HVR-H1 서열, 서열번호: 133의 HVR-H2 서열, 서열번호: 141의 HVR-H3 서열, 서열번호: 149의 HVR-L1 서열, 서열번호: 157의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 165의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체, 및
    13) 서열번호: 126의 HVR-H1 서열, 서열번호: 134의 HVR-H2 서열, 서열번호: 142의 HVR-H3 서열, 서열번호: 150의 HVR-L1 서열, 서열번호: 158의 HVR-L2 서열, 및 서열번호: 166의 HVR-L3 서열을 포함하는 항체.
  8. C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체로서, 상기 항체의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은, 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 C1s 또는 C1r의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 항체의 항원-결합 활성이 pH 7.4에서보다 pH 5.8에서 더 낮은 항체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    하기 (i) 또는 (ii)에 기술된 바와 같이 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 낮은 친화성으로 C1s 또는 C1r에 결합하는 항체:
    (i) 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))가 2 이상이고,
    (ii) 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))가 2 이상이다.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해 영역중에 적어도 하나의 아미노산 수식을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고, Fc 영역이 다음으로 이루어진 하기의 군에서 선택된 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역인 항체:
    a) 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하고,
    b) 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성이 활성화 Fc 감마 수용체에 대해서보다 더 강하며,
    c) 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 활성이 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강하다.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    필리핀원숭이 C1s 및 인간 C1s 둘 다에 결합하거나, 또는 필리핀원숭이 C1r 및 인간 C1r 둘 다에 결합하는 항체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
  15. 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체에게 유효량의 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 보체-매개 질환 또는 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법.
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