CN114521214A

CN114521214A - 视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

Info

Publication number: CN114521214A
Application number: CN202180005482.8A
Authority: CN
Inventors: 李城旭; 金智贤; 韩升烈
Original assignee: Erzhimiansi Co ltd
Current assignee: Erzhimiansi Co ltd
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2022-05-20
Also published as: KR102396200B1; EP4071247A4; KR20220013339A; EP4071247A1

Abstract

本发明涉及靶向视紫红质转录组的反式剪接核酶及其预防或治疗视网膜色素变性的用途。

Description

视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

技术领域

本发明涉及视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是由于分布于视网膜的光感受器(photoreceptor)功能异常，视网膜失去了将进入眼睛的光转化为电信号的功能而发生的遗传性和进行性疾病，其特征在于渐进式的视网膜变性。在疾病初期阶段，会因视杆(rodphotoreceptor)细胞的功能异常出现夜盲症，随着视细胞的损伤会从丧失周边视力开始视野逐渐变窄，最终发展至失明。目前，视网膜色素变性的治疗只能延缓视力下降速度，并没有根本的治疗方法。

视网膜色素变性是由多种视网膜光感受器等基因突变引起的，其遗传模式多种多样，可以以常染色体隐性/显性、X-连锁RP等单个基因异常中观察到的任何遗传模式发病。在各种遗传原因中，15～25％是常染色体显性视网膜色素变性(ADRP，Autosomal DominantRetinitis Pigmentosa)。已知许多基因突变与ADRP有关，其中，视紫红质(rhodopsin，RHO)基因的突变率高达30％左右。

视紫红质是存在于视网膜视杆细胞(rod cell)中的G蛋白偶联受体(G-proteincoupled receptor，GPCR)之一，其将通过眼睛进入的光传递为电信号，因此在黑暗环境中更加必要。RHO基因的突变会导致视杆细胞功能障碍和死亡，导致视杆细胞(rod-cone)形态异常，继而导致视锥细胞(cone cell)的功能障碍和死亡。RHO基因的突变会导致常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)，诱导致失明的视干细胞(rod photoreceptor)变性，并诱发视网膜色素变性。已知与该疾病相关的RHO基因的突变有超过150种不同的错义/无义(missense/nonsense)、插入/缺失(insertion/deletion)和剪接位点(splice site)突变，并且还在持续发现新的突变(非专利文献1)。

在多种RHO基因突变中，P23H突变是ADRP患者中最常见的突变。这种突变会使RHO蛋白出现折叠问题而无法被运至细胞膜，从而导致视觉电路和光能传输出现问题。对于ADRP而言，突变基因的去除和作为等位基因的正常(WT)基因的表达需同时进行，因此，去除RHO基因突变并保护作为功能性等位基因的WT RHO基因是该疾病的重要治疗方法。

Luxturna^TM用于治疗先天性黑蒙症(Leber congenital amaurosis，LCA)和常染色体隐性(autosomal recessive)视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)。它是针对维持眼球光感受器的RPE65基因突变的治疗剂。但该产品的问题在于仅可用于RPE65基因突变的患者。因此，还需要治疗剂来治疗其他RP因素的RHO基因突变引起的视网膜色素变性。

作为ADRP治疗剂，可以使用应用CRISPR/cas9系统的基因编辑技术，但CRISPR/cas9系统只能编辑一个基因突变。或者，需要使用双重递送系统(dual delivery system)递送正常的RHO基因。此外，为了编辑各种突变，还需要单独的sgRNA来靶向各个突变。也就是说，分别需要单独的系统来编辑各个单独的突变。并且，还具有需要同时引入或表达具有诱发免疫原性可能性的cas9等外部蛋白的缺点。

此外，可以考虑使用siRNA/反义RNA的基因沉寂(gene silencing)技术。然而，当使用siRNA/反义RNA时，与CRISPR/cas9系统一样只能对一个基因突变沉默，而且无法重新恢复正常(WT)。尽管可以考虑靶向正常和所有突变的siRNA/反义RNA，但这种药剂必须同时单独引入WT RHO基因。

如上所述，目前正在开发的针对RHO-ADRP的治疗剂仅有使用反义(antisense)和siRNA/shRNA的RNA靶向治疗剂，以及使用基因编辑技术的治疗剂。综上所述，为了解决现有技术中存在的问题来治疗ADRP，需要单独引入能够诱导WT RHO RNA表达的基因。

因此，本发明人对通过反式剪接核酶(trans-splicing ribozyme)去除各种类型的RHO转录体，同时表达野生型(WT)RHO基因进行研究，由此完成了本发明。

[在先技术文献]非专利文献1：Prog Retin Eye Res.2018January；62：1-23.

发明内容

要解决的技术问题

本发明的目的在于提供靶向视紫红质转录体(transcript)的同时能够诱导野生型(WT)视紫红质转录体表达的反式剪接核酶。

本发明的另一目的在于提供包括所述反式剪接核酶的基因转运体。

本发明的另一目的在于提供包括所述反式剪接核酶的基因构建体(construct)。

本发明的又一目的在于提供包括所述基因构建体的重组表达载体。

本发明的又一目的在于提供包括所述基因构建体的重组病毒。

本发明的又一目的在于提供包括所述核酶、所述基因构建体、所述重组表达载体或所述重组病毒作为有效成分的预防或治疗视网膜色素变性的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供包括将所述组合物向个体给药的步骤的预防或治疗视网膜色素变性的方法。

然而，本发明要解决的技术问题并不受限于上述言及课题，未言及的其他课题将通过下面的记载由本领域普通技术人员明确理解。

解决问题的技术方法

为解决上述问题，本发明提供靶向视紫红质转录体的反式剪接核酶。具体地，提供靶向视紫红质转录体的同时能够诱导野生型(WT)视紫红质转录体表达的反式剪接核酶。

根据本发明的一实施例，所述反式剪接核酶可以具有5'-内部指导序列(internalguide sequence，IGS)-核酶^*-3'的结构。

根据本发明的另一实施例，反式剪接核酶在所述核酶^*之后的3'方向还可以包括外显子(exon)区。即，在所述反式剪接核酶5'-内部指导序列(internal guide sequence，IGS)-核酶^*-3'的结构连接外显子(exon)，从而具有5'-内部指导序列(internal guidesequence，IGS)-核酶^*-外显子(exon)-3'的结构，可以在外显子部分连接正常视紫红质基因。

根据本发明的又一实施例，所述IGS区可以由特异性结合至视紫红质转录体(RNA)，并可以形成G/U摇摆碱基对(G/U wobble base pair)的长度为5～10nt的碱基序列构成。

具体地，所述IGS区可以由与包括视紫红质转录体的+30、+35、+42、+43、+52、+54、+55、+59、+75、+97、+116、+122、+123、+127、+132、+140、+154、+165、+171、+187、+191、+207、+215、+222、+230、+232、+244、+256、+262、+273、+298、+308、+381、+403、+661或+688位，优选为+59位碱基的区互补结合，并可形成G/U摇摆碱基对(G/U wobble base pair)的长度为5～10nt的碱基序列构成。

根据本发明的又一实施例，视紫红质转录体可以包括视紫红质突变。

所述视紫红质突变可以是发生在标记为SEQ ID NO：1的野生型视紫红质转录体的1位至1142位之间的碱基中至少一个碱基的突变。具体地，所述视紫红质突变转录体可以包括由下列组成的突变群组中选择的这少一种，但并不受限于此，可以包括已知或未来将发现的全部视紫红质突变转录体：

L328P、T342M、Q344R/P/ter、V345L/M、A346P、P347A/R/Q/L/S/T、ter349/Q/E、N15S、T17M、V20G、P23A/H/L、Q28H、G51R/V、P53R、T58R/M、V87D/L、G89D、G106R/W、C110F/R/S/Y、E113K、L125R、W161R、A164E/V、C167R/W、P171Q/L/S、Y178N/D/C、E181K、G182S/V、C185R、C187G/Y、G188R/E、D190N/G/Y、H211R/P、C222R、P267R/L、S270R、K296N/E/M、R135G/L/P/W、

M39R、N55K、G90V、M44T、V137M、G90D、T94I、A292E、A295V、F45L、V209M、F220C、P12R、R21C、Q28H、L40R、L46R、L47R、F52Y、F56Y、L57R、Y60ter、Q64ter、R69H、N78I、L79P、L88P、T92I、T97I、V104F、G109R、G114D/V、E122G、W126L/ter、S127F、L131P、Y136ter、C140S、T160T、M163T、A169P、P170H/R、S176F、P180A/S、Q184P、S186P/W、Y191C、T193M、M207R/K、V210F、I214N、P215L/T、M216R/L/K、R252P、T289P、S297R、A298D、K311E、N315ter、E341K、S343C及Q312ter。

更具体地，所述核酶可以靶向视紫红质P23H突变转录体，但并非受限于此。所述视紫红质P23H突变是在正常视紫红质的第23位中发生了脯氨酸向组氨酸的突变。

所述反式剪接核酶包括或是由标记以SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中任一个的碱基序列构成。

并且，本发明的反式剪接核酶包括全部与标记为所述SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中任一个的碱基序列的序列同源性为70％以上、80％以上、90％以上的序列。

根据本发明的一实施例，在所述核酶的5'-末端方向可以连接有进行反义(AS)编码的核苷酸。

所述反义可以是与靶视紫红质转录体互补的序列。

根据本发明的又一实施例，所述AS区的长度为10nt至210nt，优选为50nt至150nt。

根据本发明的又一实施例，所述反式剪接核酶包括由SEQ ID NO：6组成的IGS区，SEQ ID NO：10的长度为150nt的AS区。

根据本发明的另一实施例，所述反式剪接核酶包括5'-内部指导序列(internalguide sequence，IGS)-核酶^*-3'的结构；或者5'-AS(antisense)-IGS-核酶^*-3'的结构；或者5'-内部指导序列(internal guide sequence，IGS)-核酶^*-外显子(exon)-3'的结构；或者5'-反义(antisense，AS)-IGS-核酶^*-外显子(exon)-3'的结构。

根据本发明的又一实施例，在所述IGS区与AS区之间可以包括5～20个随机核苷酸，所述随机核苷酸序列可以是限制酶序列，所述随机核苷酸序列的优选长度为8nt，包括图4所示的P1(SEQ ID NO：7)及P10序列(SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9)。

根据本发明的又一实施例，所述核酶^*区包括或是由标记为SEQ ID NO：5的碱基序列构成。

并且，所述核酶^*区包括全部与标记为所述SEQ ID NO：5的碱基序列的序列同源性为70％以上，80％以上，90％以上的序列。

根据本发明的又一实施例，所述外显子区可以包括全部或部分正常视紫红质基因序列，或包括全部或部分优化的RHO基因序列。

本发明中使用的术语“核酶(ribozyme)”是指起到酶作用的RNA分子或由含有该RNA分子的蛋白构成的分子，也称作RNA酶或催化RNA。是利用具有明确的三级结构的RNA分子进行化学反应，并具有催化或自催化特性。正如公知，部分核酶可以剪切自身或其他RNA分子来抑制活性，其他核酶可以催化核糖体的转氨酶(aminotransferase)活性。这样的核酶有锤头型(hammerhead)核酶，VS核酶以及发夹型(hairpin)核酶等。

本发明涉及具有具体的反式剪接功能的核酶，更具体地，可以包括靶向视紫红质转录体相关特定基因的反式剪接核酶。

本发明中“反式剪接(trans-splicing)核酶”是指通过单独存在的靶RNA与核酶的内部指导序列(internal guide sequence，IGS)的碱基结合来识别靶RNA进行剪切后，在剪切的靶RNA的目标碱基后连接核酶的3'外显子的反应，即具有反式剪接功能的核酶。

本发明中，核酶序列能够标记为DNA及与其对应的RNA序列，当标记为DNA序列时，于此对应的RNA序列也包括在本发明的范围是显而易见的。

在本发明中，“视紫红质转录体，或RHO转录体或RHO RNA”是指由正常视紫红质或视紫红质突变基因的转录而获得的物质(例如：RNA)。在本发明中，为了区分正常视紫红质转录体与突变视紫红质转录体，“视紫红质突变转录体”标记为“RHO突变转录体”或“RHO突变RNA”或根据突变部位标记为“P23H RHO”等，“正常视紫红质转录体”标记为“WT RHO转录体”或WT RHO或“WT RHO RNA”。

并且，“靶向视紫红质突变转录体部位中至少一个的反式剪接核酶”是指，当注入至细胞内时，能够识别参与视网膜色素变性的视紫红质RNA，选择性地引起反式剪接反应的基因操作形式的核酶，可以通过本技术领域公知方法来制备。例如，在核酶的5'末端连接对靶RNA的填补部位具有特异性的互补序列，使其具有靶向特定RNA的基质特异性。

作为参考，本技术领域已经公开了许多有关视紫红质突变基因的信息(参考非专利文献1及https：//www.retina-international.org/files/sci-news/rhomut.htm等)。

本发明是以公知的视紫红质突变基因信息为基础，制备“靶向视紫红质转录体的反式剪接核酶”来将突变视紫红质替换为正常(野生型，WT)视紫红质的技术(图1)。

引起功能性异常的RHO突变主要出现在5'-UTR部位的下游。本发明的反式剪接核酶靶向5'-UTR部位，通过反式剪接剪切包括突变的RHO转录体，与此同时诱导WT RHO转录体的表达。即，本发明的反式剪接核酶可以与突变类型无关地治疗和/或预防疾病。

并且，本发明的反式剪接核酶还可能靶向正常视紫红质转录体，但此时能够重新恢复至正常视紫红质，因此本发明的反式剪接核酶不会影响视紫红质。

根据另一侧面，本发明提供包括所述反式剪接核酶的非病毒基因转运体。具体地，将所述反式剪接核酶以RNA形式搭载在非病毒基因转运体来直接传递至机体。

所述非病毒基因转运体可以是脂质体，脂质纳米粒子，但并不受限于此，可以使用任何本技术领域公知的非病毒性基因传递方法。

所述脂质体可使用Lipofectamine、Lipofectin、Cellfectin、Lipofectes等，可以不受限制地使用市面上销售的Cellfectin、DMRIE-C、lipofectin、lipofectamine LTX、RNAiMAX、Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、DOTAP、SAINT-RED、Avalanche-Omni、EX plex、polyfect、superfect、effectene、attractene、HiPerFect等脂质体。

脂质纳米粒子构成中的磷脂在脂质纳米粒子内包裹并保护由可离子化的脂质及药物相互作用形成的核心(core)，与靶细胞的磷脂双分子层结合而将药物传递至细胞内时，可以使通过细胞膜及内体逃逸(endosomal escape)更加容易。

所述磷脂可以使用促进脂质纳米粒子的融合的任意磷脂，例如，可以是从由二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、棕榈酰-油酰卵磷脂酰胆碱(palmitoyloleoylphosphatidylcholine，POPC)、蛋磷脂酰胆碱(egg phosphatidylcholine，EPC)、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(dioleoylphosphatidylglycerol,DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dipalmitoylphosphatidylglycerol，DPPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine，DSPE)，磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine])(DOPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine])等组成的群组中选择的一种以上。

阳离子脂质转运体主要利用由阳离子脂质构成的纳米大小的脂质体或脂质材料纳米粒子的正电荷来与负电荷的基因、包括基因的表达载体或核酸形成复合体之后，利用吞噬作用将该复合体传递至细胞内的方法。传递至细胞内的复合体从内体向溶酶体得到1次传递之后从细胞质脱离并表达。阳离子聚合物除了使用聚合物体代替脂质之外，以与阳离子脂质转运体类似的方式传递基因，代表性的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)、壳聚糖(chitosan)等。

在本发明的反式剪接核酶连接视紫红质基因等靶基因后，可以将其搭载于非病毒基因转运体。利用所述非病毒基因转运体靶向RHO转录体从而传递正常视紫红质基因。

根据另一侧面，本发明提供包括所述反式剪接核酶的基因构建体(construct)。

所述构建体可以在所述核酶的3'-末端方向额外连接靶基因。这是指在上述言及的外显子(exon)区额外连接靶基因。

所述靶基因可以是视紫红质基因和/或报告基因。

所述报告基因可以是从由萤光素酶(luciferase)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰型绿色荧光蛋白(modified green fluorescent protein；mGFP)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein；EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、修饰型红色荧光蛋白(mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(CFP)及增强型青色荧光蛋白(ECFP)组成的群组中选择的一种以上，但并不受限于此，可以使用任意本领域公知的报告基因。

通过插入报告基因作为靶基因，可以观察视紫红质转录体特异性核酶的表达水平。

所述基因构建体可以包括可操作地连接(operatively linked)于所述基因构建体的启动子序列。

所述启动子可以是从由巨细胞病毒启动子(cytomegalovirus promoter，CMV)、CAG(CMV early enhancer element+chicken beta-Actin promoter/SD+rabbit beta-Globin SA)启动子、SV40启动子、腺病毒启动子(major late promoter)、pLλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子、痘苗病毒7.5K启动子、HSV-tk启动子、SV40E1启动子、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)启动子、LTR启动子等的原核细胞或哺乳动物病毒的启动子；金属硫蛋白启动子(metallothionin promoter)、β-肌动蛋白启动子、泛C启动子、EF1-α(elongation factor 1-alpha)启动子、IL-2(interleukin-2)基因启动子、淋巴毒素(lymphotoxin)基因启动子、GM-CSF(granulocyte-macrophage colonystimulating factor)基因启动子等的动物细胞启动子；RHO(rhodopsin)基因启动子、RK(rhodopsin kinase)基因启动子、RedO(red opsin)基因启动子等的视网膜组织特异性启动子组成的群组中选择的一种以上，但并不受限于此。

本本发明中，“基因构建体(construct)”是指包括能够提高对于目标视紫红质转录体部位的特异性的元素(element)的构建体。具体地，可以是包括所述反式剪接核酶的构建体。

在所述构建体的反式剪接核酶额外连接反义序列是为了提高对目标视紫红质转录体的特异性从而提高治疗效果，可以使用任意的实现该目的的序列。

并且，根据本发明的构建体的核酶靶向视紫红质转录体部位，并包括对于目标视紫红质转录体特异性的反义序列，可以仅对于表达视紫红质转录体的细胞特异性表达。

图2是显示根据本发明一实施例制备的包括启动子、反式剪接核酶区、正常视紫红质基因区的基因构建体的基本结构的模拟图。

根据另一侧面，本发明提供包括所述言及的基因构建体的重组表达载体。

根据另一侧面，本发明提供包括所述言及的基因构建体的重组病毒。

所述病毒是从由腺病毒、腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒组成的群组中选择的任一种，但并不受限于此，可以使用本领域中能够使用的任意病毒。

在本说明书中，“载体”是可以在适当的宿主细胞表达反式剪接核酶的表达载体，是指包括可操作地连接从而使得载体内的核酶基因插入物得到表达的必备调节要素的基因结构。在本说明书中，可操作地连接(operably linked)是指执行常规功能的核酸表达调控序列与对目标基因进行编码的核酸序列在功能上实现连接(functional linkage)。例如，将核酶编码序列可操作地连接至启动子，核酶编码序列的表达将受到启动子的影响或调节。若两个核酸序列(核酶编码序列及该序列的5'末端的启动子部位序列)在启动子作用的诱导下使得核酶编码序列被转录则为可操作地连接，上述两个序列之间的连接特性不会诱导移码突变(frame-shift mutation)，表达调控序列不会抑制核酶的表达，则可以认为是可操作地连接。与重组载体可操作地连接可以通过本领域公知的基因重组技术实现，对位置-特异性DNA剪切及连接可以使用本领域公知的酶等来实现。

根据本发明的载体除了启动子、操纵子、Kozak密码子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号、增强子等表达调节因素之外，还包括用于靶向或分泌膜的信号序列或前导序列，并根据目的制备成多种方式。载体的启动子可以是结构性或诱导性的。并且，表达载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择性标记，对于可复制的表达载体而言，可以包括复制起点。载体可以自我复制或与宿主DNA整合。所述载体可以包括质粒载体、粘粒载体或病毒载体等。

具体可以是病毒载体。病毒载体可以包括来源于腺病毒、腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒等的载体，但并不受限于此。

根据本发明的另一示例，提供引入了所述重组载体的转化细胞。

本发明中的术语“引入”是指通过转染(transfection)或转导(transduction)向细胞引入外来基因。可以通过磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电击法、显微注射法、脂质体融合法、Lipofectamine及原生质体融合法等本技术领域公知的多种方法来进行转染。并且，转导可以通过感染(infection)的手段使用病毒或病毒载体粒子向细胞内传递基因。

本发明中术语“转化细胞”是指向宿主细胞引入了所目的的多核苷酸的细胞。

可以通过上述“引入”方法来实现转化，如本领域的公知，可以根据宿主细胞来选择标准技术。

具体地，本发明的转化细胞可以是通过引入包括对靶向视紫红质转录体的核酶进行编码的多核苷酸的重组载体来制备。

根据本发明的一具体示例，所述重组病毒可以是重组腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)。具体地，可以是包括对本发明的反式剪接核酶进行编码的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸可操作地连接于启动子的重组腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)。

所述重组AAV可以是天然或人工血清型AAV、分离株(isolate)AAV或演化支(clade)AAV。

对所述反式剪接核酶进行编码的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：2至5中任一个具有70％以上、80％以上、或90％以上的序列同源性。

所述启动子可以是CMV启动子或RHO启动子。

所述重组AAV还可以额外包括调控序列(regulatory sequence)。

所述调控序列可以是剪接供体/剪接受体序列(SD/SA)和/或土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis postregulatory element，WPRE)序列。

根据本发明的SD/SA可以提高转录起始(transcription initiation)与RNA聚合酶(polymerase)Ⅱ的处理(processing)及mRNA核中向细胞质的移动(nucleocytoplasmicexport)。

根据本发明的WPRE可以提高mRNA的处理以及核中向细胞质的移动，由此来分别提高pre-mRNA的水平。通过上述结构可以显著提高细胞内核酶的RNA水平，提高在机体内的功效。

根据本发明的SD/SA序列相当于去除RNA转录体的内含子的剪接反应中，被剪切的内含子的开始部分与结束部分的序列，通常SD序列可以是内含子5'末端的GU序列，SA序列可以是内含子的3'末端的AG序列。

根据本发明的WPRE是指通过诱导促进DNA转录的三级结构来提高基因表达的序列。

在本发明中，所述SD/SA序列及WPRE序列可以分别包括SEQ ID NO：11及SEQ IDNO：13的序列，只要是存在于靶基因表达盒内并且促进靶基因的表达即可。

AAV基因组可以来源于天然或人工血清型AAV、分离株(isolate)AAV或演化支(clade)AAV。由此，AAV基因组可以是天然AAV病毒基因组或人工制成的AAV病毒基因组。众所周知，可以根据多种生物系统来对AAV病毒进行分类。

通常，根据血清型来命名AAV病毒。血清型是因其自身的衣壳表面抗原的表达分布而具有能够用于与其他变体亚种进行区分的独特反应性的AAV的变体亚种(variantsubspecies)。通常，具有特定AAV血清型的病毒不会与对其他AAV血清型具有特异性的中和抗体有效地发生交叉反应。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11，还包括最近在灵长类大脑中确认的Rec2及Rec3等重组血清型。

本发明特别关注的血清型包括能够有效转导至视网膜色素上皮等眼球内组织的AAV2、AAV5及AAV8。有关AAV血清型的内容可以查看Choi等人的(Curr Gene Ther.2005；5(3)；299-310)及Wu等人的(Molecular Therapy；14(3),316-327)。

AAV病毒还通过演化支或克隆来命名。这表示天然或人工AAV病毒的系统发生学关系，及通常可以追溯到共同祖辈的AAV病毒的系统发生学群组，并且包括其全部子孙。AAV病毒可以根据天然获取或者人工制备的特定AAV病毒的基因分离株(isolate)等特定分离株来命名。术语基因分离株(genetic isolate)是指与其他天然AAV病毒发生限制性基因混合(genetic mixing)，由此来定义可在基因水平上识别并区分的单独的种群(population)的AAV病毒种群。

通常，AAV的天然或人工血清型或分离株或演化支的AAV基因组包括一个以上的反向末端重复序列(ITR)。ITR序列起到在同侧(cis)位置提供功能复制起点的作用，使得细胞从基因组的载体的融合及由此的剪切成为可能。在优选具体示例中，一个以上的ITR序列对编码Rep-1或其变体的多核苷酸序列进行侧接(flank)。

AAV基因组包括rep和/或cap基因等包装基因，对用于AAV病毒离子的包装功能进行编码。rep基因对Rep78、Rep68、Rep52及Rep40或其变体蛋白中一个以上进行编码。cap基因对VP1、VP2及VP3或其变体等一个以上的衣壳蛋白进行编码。这样的蛋白构成AAV病毒粒子的衣壳。启动子可操作地连接于各个包装基因。

用于本发明的载体的AAV基因组可以是天然或人工AAV病毒的全部基因组。例如，包括全部AAV基因组的载体可以用于在体外(in vitro)制备AAV病毒。这样的载体原则上可以向患者给药。优选地，AAV基因组能够以向患者给药为目的进行衍生化(derivatise)。这样的衍生化(derivatisation)是本领域的标准，并且本发明包括AAV基因组的公知的衍生物，及使用根据本技术领域公知方法来生成的衍生物。

根据另一侧面，本发明提供包括所述言及的基因构建体的非病毒基因转运体。

所述非病毒基因转运体可以是脂质体、脂质纳米粒子，但并不受限于此，可以使用本领域公知的任意非病毒性基因传递方法。对此的具体说明可参考上述内容，在此不再赘述。

根据另一侧面，本发明提供包括所述核酶、所述非病毒基因转运体、所述基因构建体、所述重组表达载体或所述重组病毒作为有效成分的预防或治疗视网膜色素变性的药物组合物。

根据另一侧面，本发明提供包括将所述药物组合物向个体给药的步骤的预防或治疗视网膜色素变性的方法。

在本发明中使用的“预防”是指通过使用本发明的药物组合物来延迟视网膜色素变性的发病的全部行为。

本发明中使用的术语“治疗”是指通过使用本发明的药物组合物来改善或有益地改变视网膜色素变性的全部行为。

根据本发明的药物组合物还可以包括允许入药的载体、赋形剂或稀释剂。本发明的可以用于药物组合物的允许入药的载体、赋形剂及稀释剂的示例有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、碳酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。

本发明的药物组合物可以根据所需方法口服给药或肠胃外给药，优选为肠胃外给药。通过肠胃外给药向眼球内给药的途径有三种：玻璃体腔注射(intravitrealinjection)、脉络膜上腔注射(suprachoroidal injection)、视网膜下注射(sunretinalinjection)。

根据本发明的一实施例，本发明的药物组合物靶向光感受器，因此最有效且直接的给药途径是视网膜下注射。本发明的注射剂可以分散在无菌介质中以便直接向患者直接给药，也可以在注射时加入注射用蒸馏水分散为适当浓度后给药。此外，当制成注射剂时，可与缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等混合，制成单位剂量安瓿或多剂型。

具体地，不是直接插入至人体基因，而是利用AAV(Adeno-associated virus)在游离状态下诱导本发明的反式剪接核酶表达，从而诱导去除靶RHO转录体并诱导表达WT RHO蛋白。

本发明的药物组合物给药量根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式，给药途径和时间有所不同，但能够由本领域普通技术人员进行适当选择。一方面，本发明的药物组合物可以单独使用，也可以与其他治疗药物一起使用，或者通过外科手术等辅助治疗方法同时进行。

发明效果

本发明的反式剪接核酶在去除目标视紫红质转录体的同时替换为正常(野生型)视紫红质基因(RNA)，提供表达正常视紫红质基因的效果。由此，根据本发明的反式剪接核酶可以提供从根本上治疗视网膜色素变性的效果。特别是靶转录体部位是选择了可以靶向包括全部类型视紫红质突变的视紫红质转录体的部位，由此，一种治疗剂可以适用于多种视紫红质突变的患者。并且，可以根据在患者细胞内表达的目标视紫红质转录体表达量来表达正常视紫红质蛋白，因此能够最小化正常视紫红质蛋白过度表达的副作用及毒性。并且，反式剪接核酶的RNA替换功能不利用内源性细胞机制(endogenous cell machinery)，是以反式剪接核酶RNA本身的机制起作用而不需要引入外部蛋白来实现在细胞内的功能，因此是更加安全的治疗剂。

附图说明

图1是显示根据本发明的靶向RHO转录体的反式剪接核酶的机制的模拟图。

图2是显示根据本发明一实施例制备的包括启动子、反式剪接核酶区、正常视紫红质基因区的基因构建体基本结构的模拟图。

图3是显示通过体外映射及细胞内映射的RHO RNA的目标部位确定过程及其结果的模拟图。

图4是显示根据本发明一实施例的包括靶向视紫红质RNA+59位碱基部位的反式剪接核酶(下面称为“RHO靶向核酶”)的构建体的优化过程的模拟图。

图5是根据本发明一实施例的包括RHO靶向核酶的载体的模拟图。

图6是为优化RHO靶向核酶而在293A细胞比较构建体活性的结果。

图7是利用稳定细胞(stable cell)确认的RHO靶向核酶的体外效果。

图8是确认的RHO靶向核酶对多种突变的体外效果。

图9是根据本发明一实施例的将RHO靶向核酶表达为腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)载体的重组AAV表达载体的模拟图。

图10是显示根据本发明一实施例的利用包括RHO靶向核酶的AAV表达载体在疾病动物模型确认核酶效果的结果(a是给药后两周，b是给药后五周的结果)。

图11是显示根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后的血清内免疫及炎症反应结果(A是给药后两周，B是给药后五周的结果)。

图12是根据本发明一实施例的向动物模型给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后，在视网膜(Retina)与视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium；RPE)组织确认的核酶效果。

图13是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后确认的机体内核酶分布结果。

图14是根据本发明一实施例的向正常小鼠给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后分析毒性的结果。

图15是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后的视网膜电位图检查结果。

图16是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的AAV载体后分析血清(A)及核酶活性的结果(B)。

图17是根据本发明一实施例的包括RHO靶向核酶的多种重组AAV载体的制备模拟图。

图18是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的重组AAV载体后第三周的核酶分布及反式剪接活性的结果。

图19及图20是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药包括RHO靶向核酶的重组AAV载体后的视网膜电位图的检查结果。

图21是根据本发明一实施例的向疾病动物模型给药括RHO靶向核酶的重组AAV载体后确认视网膜的核酶分布及核酶RNA表达的结果。

具体实施方式

将1μg视紫红质RNA与1μg随机文库核酶放入1.5ml试管混合后，加入100μl的Opti-MEM混合。对于2μl的Lipofectamine 2000，100μl的Opti-MEM等可以进行多种变换，并且可以具有多种实施例，下面将在附图中示例出特定实施例并详细说明。然而，本发明并不受限于特定实施方式，而应包括在本发明的思想及技术范围内的全部变换，其等同物及替代物。在对本发明进行说明的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆本发明时，省略详细说明。

实施例1：设计靶向视紫红质(RHO)RNA的反式剪接核酶

为了确定靶RNA位点，比较RHO RNA变体的序列，并设计了RHO RNA靶向反式剪接核酶(图2)。

实施例2：通过体外映射及细胞内映射确定视紫红质(RHO)RNA的目标部位

利用WT RHO RNA或P23H RHO RNA与核酶RNA文库进行体外映射(in vitromapping)及细胞内映射。为了实现体外映射，在试管中混合视紫红质RNA与随机文库核酶并进行反应，随后执行RT-PCR，然后通过对估计是反式剪接产物的PCR DNA条带的序列进行分析，由此来确定发生反式剪接的视紫红质RNA部位。

更具体地，通过体外转录过程合成视紫红质RNA，通过体外转录过程，在5'末端合成具有随机序列(GNNNNN)的反式剪接RNA文库。将0.1pmole的视紫红质RNA与1X体外反式剪接反应缓冲液(50mM Hepes(pH 7.0)，150mM NaCl，5mM MgCl2)混合并调成10uL，将1pmole核酶文库RNA与1X体外反式剪接反应缓冲液混合并调至9uL后，放入1uL的1mM GTP将最终浓度调至0.1mM GTP。将其分别在95℃1分钟，37℃3分钟进行反应，将两者混合后在37℃下反应3小时。反应液经过苯酚抽提法/EtOH沉淀法回收RNA后执行RT-PCR。接着，放入核酶特异性RT引物(5'-ATGTGCTGCAAGGCGATT-3')后，在20uL体积条件下通过逆转录合成cDNA。使用2uL合成的cDNA，并分别使用10pmole的视紫红质RNA特异性5'引物(5'-CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3')，10pmole的核酶特异性3'引物(RY-TS)(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3')，以95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的条件执行35个循环的PCR，在2％TBE琼脂糖凝胶中确认PCR条带。确认的全部PCR产物通过苯酚&沉淀过程更换缓冲液后，通过碱基序列分析来确认在视紫红质RNA的哪个部位发生了反式剪接反应。根据反式剪接的序列分析结果，能够最好地靶向RHO mRNA的5'UTR部分的第59位点(图3a及图3b)。

为了进行细胞内映射，在试管中混合视紫红质RNA与随机文库核酶，并在细胞内共转染(co-transfection)。具体地，将293A细胞分注至35mm培养皿1x10⁵个后，在37℃，5％CO₂培养器中培养。放入1.5ml试管进行混合后，分别在常温下静置5分钟。然后，混合上述两试管中的内容物，并在常温下保存20分钟来形成脂质体(liposome)形式的复合体。20分钟后将试管离心分离10秒后分别喷洒至细胞上来共转染(co-transfection)，4小时后更换新的培养基。在37℃，5％CO₂培养器培养24小时后，用1X PBS洗涤细胞，用500ul的trizol处理来提取RNA。将5μg提取的RNA用1μl的DNase I处理来去除gDNA，向其中1μg放入核酶特异性RT引物(5'-ATGTGCTGCAAGGCGATT-3')后，在20uL体积条件下通过逆转录合成cDNA。使用2uL合成的cDNA，分别使用10pmole视紫红质RNA特异性5'引物(5'-CTACTCAGCCCCAGCGGAGG-3')，10pmole核酶特异性3'引物(RY-TS)(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3')，以95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的条件执行35个循环的PCR，在2％TBE琼脂糖凝胶确认PCR条带。确认的全部PCR产物通过苯酚&沉淀过程更换缓冲液后，通过碱基序列分析来确认在视紫红质RNA的哪个部位发生了反式剪接反应。

实施例3：制备反式剪接核酶

对包括靶向标记为SEQ ID NO：1的WT RHO，以及P23H RHO序列中+59位碱基部位的反式剪接核酶的构建体进行优化(图4)。所述目标部位包括RHO RNA的+59位的碱基，在5'末端引入了能够靶向所述目标部位的IGS(5'-GCCCAA-3'：SEQ ID NO：6)。为了分析细胞内靶向RHO RNA的+59碱基的核酶(下面称为“RHO靶向核酶”)的反式剪接活性，制备了改性的RHO靶向核酶构建体。众所周知，仅具有长度为6-nt的IGS的I型内含子在哺乳动物细胞内表达时不会被激活或显示出特异性活性。为了制备改性的RHO靶向核酶构建体，在核酶的IGS上游插入包括延长的P1(SEQ ID NO：7)及长度为7-nt的P10螺旋(SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9)的互补寡核苷酸，由此来改变核酶。

实施例4：优化反式剪接核酶

为了确认实施例3中制备的第一、第二，及第三设计的RHO靶向核酶中最适合反式剪接的RHO靶向核酶，制备了包括RHO靶向核酶的载体(图5)。

在图5中，AS150标记为SEQ ID NO：10，SD/SA标记为SEQ ID NO：11，5'UTR一部分序列标记为SEQ ID NO：12。T2A为接头序列，YFP为荧光蛋白序列是本领域公知，因此省略显示具体序列。多聚腺苷酸(polyA)序列同样为本领域公知。

在体外(哺乳动物细胞)比较并检验了3种设计的RHO靶向核酶的效果。其结果如图6所示。比较第一设计与第二设计时，第二设计的反式剪接作用更优(图6A)。比较第二设计与第三设计时，第二设计的反式剪接效率更优(图6B)。为了选择第二设计来优化核酶的特异性与效率，通过调节反义长度来进行了比较，确认到150个长度的反义(SEQ ID NO：10)具有最佳效果(图6C)。为了确认反式剪接产物是否得到准确的反式剪接而进行了测序，并确认到在目标部位发生了反式剪接(图6D)。

实施例5：在体外分析反式剪接活性

利用稳定细胞(stable cell)确认了RHO靶向核酶的体外效果。使用标记有YFP的野生型RHO(wild Rho-YFP)作为正对照组。制备了稳定表达视紫红质mRNA的293A WT RHO，293A P23H RHO细胞株，并利用该细胞株进行了功能分析。正常视紫红质蛋白能够向细胞膜移动而实现定位(localization)，但P23H视紫红质突变则因蛋白折叠出现问题，不向细胞膜移动而停留在细胞质内质网。由此，可以通过确认蛋白位置来确认视紫红质蛋白的功能变化。

将RHO靶向核酶表达载体转染至稳定细胞(stable cell)，为确认反式剪接效果，提取RNA并执行RT-PCR。

具体地，将稳定细胞(stable cell)分注至35mm培养皿1x10⁵个后，在37℃，5％CO₂培养器培养。将2μg的RHO靶向核酶表达载体与100μl的Opti-MEM放入1.5ml试管混合，将2μl的Lipofectamine 2000与100μl的Opti-MEM放入另一个1.5ml试管中混合后，在常温下静置5分钟。然后将上述两试管内的内容物混合，在常温下保存20分钟来形成脂质体(liposome)形式的复合体。20分钟后，将试管离心分离10秒后分别喷洒至细胞上来转染(transfection)，4小时后更换新的培养基。在37℃5％CO₂培养器培养48小时后，用1X PBS洗涤细胞，用500ul的trizol处理来提取RNA。将5μg提取的RNA用1μl的DNase I处理来去除gDNA，对其中1μg通过逆转录合成cDNA。使用合成的cDNA并通过PCR确认了反式剪接产物，并且通过碱基序列分析确认了是否正确发生反式剪接作用(图7A)。

并且，利用上述相同方法对RHO靶向核酶表达载体进行转染后，利用RHO抗体对RHO蛋白进行染色。利用荧光抗体并通过荧光显微镜确认了2次抗体的RHO蛋白的细胞内分布。确认到因P23H突变，停留在细胞内的视紫红质蛋白在核酶的作用下向细胞膜分布(图7B)。

此外，通过向293A细胞共转染(co-transfection)确认了RHO靶向核酶对多种突变的体外效果(图8)。具体地，将0.5μg的RHO靶向核酶表达载体与2μg的多种突变表达载体，100μl的Opti-MEM放入1.5ml的试管中混合，将2.5μl的Lipofectamin2000与100μl的Opti-MEM放入另一个1.5ml试管混合后，在常温下静置5分钟。然后按照上述相同方法转染后执行RT-PCR。其结果确认到在目标部位准确发生了反式剪接，由此能够确认多个突变部位被替换为正常RHO RNA。由此，根据本发明的靶向紫红质转录体的反式剪接核酶不局限于编辑特定突变基因，而能够不受突变类型限制地替换突变部位。

实施例6.制备重组病毒及在动物模型确认反式剪接效果

6-1：制备重组病毒

为了将实施例4中第二设计的RHO靶向核酶表达为腺相关病毒(Adeno-associatedviruses，AAV)载体制备了重组AAV表达载体。使用CMV启动子作为启动子(图9)。用E.coRI对20μg的pAAV骨架质粒进行反应后，用琼脂糖凝胶洗脱。利用INFUSION酶对合成的核酶+RHODNA进行反应后，转化(transformation)后获得菌落。培养各个菌落获得质粒，并通过测序来筛选出序列正确的克隆。将如此制备的质粒用EcoRV与XbaI反应后利用琼脂糖凝胶洗脱。通过INFUSION酶将合成的YFP DNA进行反应后转化获得菌落。培养菌落获得质粒，并通过测序来筛选出序列被正确克隆的菌落。为了增加反义序列，用E.coRI反应后用琼脂糖凝胶洗脱。将通过PCR获得的AS150序列用INFUSION酶反应后转化获得菌落。用相同方法对序列进行分析后获得最终AAV-cRib-YFP质粒。

为了制备AAV病毒载体，在293T细胞三重转染(triple transfection)Helper载体、RHO核酶表达载体，以及Rep2Cap5载体，在72小时后细胞发生裂解(lysis)，上清液进行PEG down。将其通过碘克沙醇梯度超速离心(iodixanol gradient ultracentrifuge)方法获得了AAV表达载体。

6-2：在动物模型确认反式剪接效果

利用实施例6-1的AAV表达载体在作为疾病模型的hP23H-RFP小鼠中确认了核酶的效果。hP23H小鼠-RFP模型是一种以人体P23H基因与RFP荧光蛋白相融合的状态敲入(knock-in)的RP小鼠模型，其被广泛用于RHO P23H研究。通过视网膜下注射(subretinalinjection)向小鼠眼球注入1μl的AAV表达载体。将连接在IO试剂盒的34G针头用巩膜穿刺(scleral puncture)扎入后，以1μl/眼的体积向两眼的视网膜下注射给药。给药后，向小鼠的眼球滴入一滴抗生素滴眼液防止感染，然后通过FP/OCT拍摄来确认是否形成视网膜疱疹(bleb)，由此判断是否成功给药。

给药后第二周或第五周摘除眼球制成玻片。AAV表达载体中结合有YFP荧光物质，因此无需对RHO蛋白进行额外的染色，通过DAPI染色对细胞内核进行染色。图10是给药后两周(图10a)，给药后五周(图10b)的结果。

将AAV5-YFP(荧光阳性)与AAV-WT hRho-YFP(基因，荧光阳性)作为AAV5-cRib-YFP的对照组。AAV5-YFP与AAV-WT hRho-YFP物质在视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium；RPE)也能够表达，由此可以确认没有对光感受器特异性地引入，相反，附着有RHO靶向核酶的AAV5-cRib-YFP未在RPE表达，而仅在光感受器特异性表达。

实施例7：确认向动物模型给药反式剪接核酶后的免疫及炎症反应

向hP23H-RFP小鼠疾病模型给药反式剪接核酶后，确认血清内免疫及炎症反应，其结果如图11所示(A：给药后两周，B：给药后五周)。

在相关细胞因子中，IL-6、IL-17A、TNF-α、INF-γ、IL-10对AAV5-cRib-YFP在第二周展现出增加趋势，IL-4与IL-2没有发现变化。在作为对照组的AAV5-YFP与AAV-WT hRho-YFP处理中看不到上述反应，由此可以认为不是病毒载体自身的效果。在第二周展现出增加趋势的细胞因子在第五周减少，并以与对照组类似的量减少，由该结果可知通过视网膜下注射(subretinal injection)表达反式剪接核酶的载体后增加的炎症及免疫反应，在给药初期增加后在第五周恢复至原来水平。

实施例8：向动物模型给药反式剪接核酶后在视网膜与视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium；RPE)组织确认核酶效果

向疾病模型给药有效物质后，确认是否靶向RHO RNA在机体光感受器内出现反式剪接。为此，摘除小鼠的眼球并分离视网膜与视网膜色素上皮细胞(RPE/choroid)，从各部位提取RNA后执行RT-PCR来观察是否生成反式剪接产物。其结果如图12所示。

在RPE无法确认扩增的反式剪接产物PCR条带，但确认到视网膜特异性反式剪接产物(图12A)。对扩增的反式剪接产物进行测序，确认到靶向突变RHO RNA替换为了正常RHORNA(图12B)。

并且，提取视网膜与视网膜色素上皮细胞的gDNA并对AAV ITR部位执行qPCR后发现，相比视网膜，在视网膜色素上皮细胞检测出的量更多(图12C)，这说明AAV载体能很好地传递至RPE，但由核酶调节的转基因(transgene)表达对光感受器具有特异性。

实施例9：向疾病模型给药反式剪接核酶后确认机体内核酶分布

向hP23H-RFP小鼠疾病模型给药核酶后第二周，在全部脏器发现核酶分布(图13)。在给药后第二周小鼠死亡后获得了全部脏器，通过提纯gDNA获得gDNA。对1μg各个脏器的gDNA利用反式剪接核酶特异性引物执行实时PCR。对于全部脏器的肝脏组织，从给药表达反式剪接核酶的载体的全部个体中在检测范围(detection range)内检测到核酶。此外向部分个体的肺、小肠、前列腺组织给药载体后在检测范围内检测到核酶，在其他组织中没有检测到核酶。

实施例10：向正常小鼠给药反式剪接核酶后的毒性分析

向正常小鼠(C57BL/6J)给药不同浓度的反式剪接核酶后观察眼球变化，通过给药反式剪接核酶后不同周数的Fundus及OCT图像，H&E染色结果(图14)来确认毒性。在实验组中确认出现因视网膜下给药形成的疱疹，由此确定正确给药(红色点线)。在个别个体中发现角膜炎及玻璃体出血(白色点线)。通过H&E染色确认时，以3x10⁹GC/眼以上浓度处理的组中出现了水晶体变性、视网膜变性及外侧视网膜萎缩、脉络膜组织结构炎症。由此，确认在1x10⁹GC/眼以下的浓度没有毒性。

实施例11：向疾病模型给药反式剪接核酶后检查视网膜电位图

向hP23H-RFP小鼠(5周龄小鼠)疾病模型给药反式剪接核酶后，确认随着时间变化的视网膜电位图结果(图15及表1)。为了进行视网膜电位图检查，实施了暗视ERG并比较B-波振幅(amplitude)。为了评价视网膜电位图，使用氯胺酮对小鼠进行全身麻醉后，向眼球滴入麻醉滴眼液进一步进行局部麻醉，然后滴入散瞳剂诱导散瞳。将小鼠放在显微镜辅台上，在分别将探针设置在尾巴根部，眉间，角膜的状态下测量对于mono-flash刺激(0.9logcds/m2(10响应/强度))的ERG。完成测量后，向小鼠眼球滴入一滴抗生素滴眼液。使用‘LabScribeERG(iWorx数据采集软件)'进行分析。

视紫红质基因的P23H突变无法在细胞内正常作用，导致视杆细胞(rod cell)，视锥细胞(cone cell)的死灭从而使得视功能退化。光感受器(rod，cone)起到将光能转化为电信号的作用，随着光感受器的数量和功能退化使得电信号减少。通过电位图检查(ERG)来评价电信号，由此确认视功能上的差异。在视网膜电位图检查中，B-波是用于判断是否实际传递电信号的指标，在给药RHO靶向核酶(AAV5-cRib-YFP)后的第五周确认到B-波显著增加，该效果持续到第八周。由此可见，通过AAV5-cRib-YFP在疾病模型中视功能得到维持与改善。

[表1]

实施例12：向疾病模型给药反式剪接核酶后血清核酶活性分析

向hP23H-RFP小鼠(5周龄)疾病模型给药反式剪接核酶后第八周确认了血清分析及核酶活性(图16)。在给药后第八周，在比较给药PBS的正常动物(G1)与仅给药PBS的G2组时，未发现因有效物质导致的细胞因子变化(图16A)。在实施例7中，在第二周出现细胞因子变化，在第五周与正常动物比较时没有发现差异，与该结果比较来进行判断可知，到第八周为止对细胞因子的变化也没有带来影响。

为了确认在给药后是否在第八周仍持续出现靶向RHO RNA的反式剪接，摘除小鼠的眼球并从视网膜提取RNA后，通过RT-PCR确认到生成了反式剪接产物(图16B)。这是指重组AAV载体被传递到视网膜，使得AAV5-cRib-YFP的表达及作用持续到第八周。

实施例13：优化重组病毒载体

为了确认向视网膜的感染及表达能力，制备了多种重组AAV载体(图17)。如图17所示，5'末端连接有剪接供体/剪接受体序列(splicing donor/splicing acceptorsequence，SD/SA sequence)，在3'末端连接有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuckhepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE)。SD/SA及WPRE序列分别标记为SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：13。为了筛选出最优的物质，与之前的实施例中使用的AAV载体不同，生产了具有多种重组AAV血清(serotype)及启动子(promoter)的物质。对此，利用了CMV启动子与RHO启动子，并且为确认最终物质的效能，去除了YFP荧光物质，并插入WPRE来提高表达。

13-1：确认核酶分布及反式剪接效率

在将制备的重组AAV载体向hP23H-RFP小鼠(5周龄)疾病模型给药后第三周确认核酶分布及反式剪接(图18)。

图18显示的G1至G7的结构如下表2。

[表2]

为了确认对于血清型(serotype)的感染率，在注入后第三周摘除眼球，分离视网膜(retina)与RPE/脉络膜，分别提取RNA与gDNA，在与gDNA比较时，AAV血清型5相比血清型2或8对于视网膜与RPE均很好地得到感染。通过RT-PCR进行RNA分析，确认到当由CMV启动子调节时，在RPE中核酶的表达也高，相反在视网膜中，由RHO启动子调节的核酶的表达相比由CMV启动子的调节更高(图18A及18B)。

确认了是否在实际视网膜中通过反式剪接核酶的作用生成了反式剪接产物，确认到在AAV血清型5中，受RHO启动子的调节的物质的反式剪接产物的PCR条带较深(图18C)。

由此，AAV血清型5的RL-Rib-WPRE向视网膜的传递及表达优秀，反式剪接效率同样优秀。

13-2：向疾病模型给药反式剪接核酶后检查视网膜电位图

向hP23H-RFP小鼠(5周龄)视网膜感染疾病模型给药反式剪接核酶后第六周进行了视网膜电位图检查，其结果如图19及表3所示。

[表3]

相比正常小鼠(G0)，P23H–RFP疾病小鼠(G1)对光的B-波反应显著较低，这是由于在P23H-RFP小鼠中，光感受器因RHO突变受到损伤导致在电信号的传递上出现问题。

向疾病模型给药各个AAV后测量视网膜电位图时，全部实验组中平均暗视B波振幅(scotopic B-wave amplitude)相比PBS给药组(G1)增加。特别是在启动子间的比较中，相比CMV启动子，在受到RHO启动子调节时，相比PBS给药组(G1)的B-波显著增加(G3<G4，G5<G6)，在血清型之间的比较中，在AAV2/5给药组(G5，G6)与AAV2/8给药组(G7)中相比PBS给药组(G1)的B-波增加。其中，确认AAV2/5RL-Rib-WPRE给药组的增加最为显著，在上述实验组中，AAV2/5RL-Rib-WPRE视网膜下给药时，疾病模型的视功能改善效果最显著。

一方面，在图17的重组AAV载体中，将包括AAV血清型5或者8与RHO启动子的AAV2/5RL-Rib-WPRE，AAV2/8RL-Rib-WPRE的重组AAV载体向hP23H-RFP小鼠(5周龄)疾病模型给药后第四周检查视网膜电位图来进行比较，其结果如图20及表4所示。

[表4]

如表4及图20所示，在给药后第四周，AAV2/5RL-Rib-WPRE给药组(H3)及AAV2/8RL-Rib-WPRE给药组(H4)的B-波相比PBS给药组(H2)中均显著增加。考虑到AAV2/8RL-Rib-WPRE给药组(H4)相比PBS给药组(H2)及AAV2/5RL-Rib-WPRE给药组(H3)，在给药前(0周)B-波更高，可以判断AAV2/5RL-Rib-WPRE给药组(H3)及AAV2/8RL-Rib-WPRE给药组(H4)的B-波增加类似。由此，对AAV2/5RL-Rib-WPRE或AAV2/8RL-Rib-WPRE进行视网膜下给药时，对疾病模型的视功能改善效果相比PBS给药组(H2)十分优秀。

13-3：确认向疾病模型给药反式剪接核酶后视网膜的核酶分布及反式剪接

下面如表5所示，向hP23H-RFP小鼠(5周龄)疾病模型给药反式剪接核酶后第六周，确认了视网膜的核酶分布与反式剪接，结果如图21。

[表5]

在疾病模型确认功能效果后，摘除眼球组织并分离视网膜gDNA与RNA来进行分析，确认到与实施例13-1的第三周结果相同，AAV血清型5向视网膜的传递更优。当进行RNA分析时，同样发现AAV血清型5的表达更高，不仅如此，由RHO启动子调节的核酶的表达更高。与第三周的结果相同，AAV2/5RL-Rib-WPRE向视网膜的传递及表达在第六周同样优秀。

综合上述结果，在hRHO-P23H疾病模型，由AAV血清型5及8的向视网膜及RPE的传递高效，由RHO启动子调节的反式剪接核酶对视网膜具有特异性表达。

本发明的反式剪接核酶在给药初期的第三周开始到第六周持续表达，在第四周及第六周通过视网膜电位图检测视功能时，能够确认其起到改善视功能的效果。

以上详细描述了本发明的特定部分，但是对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些具体技术仅是优选实施例，本发明的范围并不受限于此。本发明的实质范围将由后述权利要求及其等同物来限定。

序列表

<110> Rznomics Inc.

<120> 视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

<130> DHP20-471

<150> KR 20/092,265

<151> 2020-07-24

<160> 13

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 2768

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2768)

<223> 智人（Homo sapiens）视紫红质（RHO）

<400> 1

agagtcatcc agctggagcc ctgagtggct gagctcaggc cttcgcagca ttcttgggtg 60

ggagcagcca cgggtcagcc acaagggcca cagccatgaa tggcacagaa ggccctaact 120

tctacgtgcc cttctccaat gcgacgggtg tggtacgcag ccccttcgag tacccacagt 180

actacctggc tgagccatgg cagttctcca tgctggccgc ctacatgttt ctgctgatcg 240

tgctgggctt ccccatcaac ttcctcacgc tctacgtcac cgtccagcac aagaagctgc 300

gcacgcctct caactacatc ctgctcaacc tagccgtggc tgacctcttc atggtcctag 360

gtggcttcac cagcaccctc tacacctctc tgcatggata cttcgtcttc gggcccacag 420

gatgcaattt ggagggcttc tttgccaccc tgggcggtga aattgccctg tggtccttgg 480

tggtcctggc catcgagcgg tacgtggtgg tgtgtaagcc catgagcaac ttccgcttcg 540

gggagaacca tgccatcatg ggcgttgcct tcacctgggt catggcgctg gcctgcgccg 600

cacccccact cgccggctgg tccaggtaca tccccgaggg cctgcagtgc tcgtgtggaa 660

tcgactacta cacgctcaag ccggaggtca acaacgagtc ttttgtcatc tacatgttcg 720

tggtccactt caccatcccc atgattatca tctttttctg ctatgggcag ctcgtcttca 780

ccgtcaagga ggccgctgcc cagcagcagg agtcagccac cacacagaag gcagagaagg 840

aggtcacccg catggtcatc atcatggtca tcgctttcct gatctgctgg gtgccctacg 900

ccagcgtggc attctacatc ttcacccacc agggctccaa cttcggtccc atcttcatga 960

ccatcccagc gttctttgcc aagagcgccg ccatctacaa ccctgtcatc tatatcatga 1020

tgaacaagca gttccggaac tgcatgctca ccaccatctg ctgcggcaag aacccactgg 1080

gtgacgatga ggcctctgct accgtgtcca agacggagac gagccaggtg gccccggcct 1140

aagacctgcc taggactctg tggccgacta taggcgtctc ccatccccta caccttcccc 1200

cagccacagc catcccacca ggagcagcgc ctgtgcagaa tgaacgaagt cacataggct 1260

ccttaatttt tttttttttt ttaagaaata attaatgagg ctcctcactc acctgggaca 1320

gcctgagaag ggacatccac caagacctac tgatctggag tcccacgttc cccaaggcca 1380

gcgggatgtg tgcccctcct cctcccaact catctttcag gaacacgagg attcttgctt 1440

tctggaaaag tgtcccagct tagggataag tgtctagcac agaatggggc acacagtagg 1500

tgcttaataa atgctggatg gatgcaggaa ggaatggagg aatgaatggg aagggagaac 1560

atatctatcc tctcagaccc tcgcagcagc agcaactcat acttggctaa tgatatggag 1620

cagttgtttt tccctccctg ggcctcactt tcttctccta taaaatggaa atcccagatc 1680

cctggtcctg ccgacacgca gctactgaga agaccaaaag aggtgtgtgt gtgtctatgt 1740

gtgtgtttca gcactttgta aatagcaaga agctgtacag attctagtta atgttgtgaa 1800

taacatcaat taatgtaact agttaattac tatgattatc acctcctgat agtgaacatt 1860

ttgagattgg gcattcagat gatggggttt cacccaacct tggggcaggt ttttaaaaat 1920

tagctaggca tcaaggccag accagggctg ggggttgggc tgtaggcagg gacagtcaca 1980

ggaatgcaga atgcagtcat cagacctgaa aaaacaacac tgggggaggg ggacggtgaa 2040

ggccaagttc ccaatgaggg tgagattggg cctggggtct cacccctagt gtggggcccc 2100

aggtcccgtg cctccccttc ccaatgtggc ctatggagag acaggccttt ctctcagcct 2160

ctggaagcca cctgctcttt tgctctagca cctgggtccc agcatctaga gcatggagcc 2220

tctagaagcc atgctcaccc gcccacattt aattaacagc tgagtccctg atgtcatcct 2280

tatctcgaag agcttagaaa caaagagtgg gaaattccac tgggcctacc ttccttgggg 2340

atgttcatgg gccccagttt ccagtttccc ttgccagaca agcccatctt cagcagttgc 2400

tagtccattc tccattctgg agaatctgct ccaaaaagct ggccacatct ctgaggtgtc 2460

agaattaagc tgcctcagta actgctcccc cttctccata taagcaaagc cagaagctct 2520

agctttaccc agctctgcct ggagactaag gcaaattggg ccattaaaag ctcagctcct 2580

atgttggtat taacggtggt gggttttgtt gctttcacac tctatccaca ggatagattg 2640

aaactgccag cttccacctg atccctgacc ctgggatggc tggattgagc aatgagcaga 2700

gccaagcagc acagagtccc ctggggctag aggtggagga ggcagtcctg ggaatgggaa 2760

aaacccca 2768

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反式剪接核酶

<400> 2

gctcccgccc aaaaaagtta tcaggcatgc acctggtagc tagtctttaa accaatagat 60

tgcatcggtt taaaaggcaa gaccgtcaaa ttgcgggaaa ggggtcaaca gccgttcagt 120

accaagtctc aggggaaact ttgagatggc cttgcaaagg gtatggtaat aagctgacgg 180

acatggtcct aaccacgcag ccaagtccta agtcaacaga tcttctgttg atatggatgc 240

agttcacaga ctaaatgtcg gtcggggaag atgtattctt ctcataagat atagtcggac 300

ctctccttaa tgggagctag cggatgaagt gatgcaacac tggagccgct gggaactaat 360

ttgtatgcga aagtatattg attagttttg gagtactcgg ggagc 405

<210> 3

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反式剪接核酶

<400> 3

cgtactccgc ccaaaaaagt tatcaggcat gcacctggta gctagtcttt aaaccaatag 60

attgcatcgg tttaaaaggc aagaccgtca aattgcggga aaggggtcaa cagccgttca 120

gtaccaagtc tcaggggaaa ctttgagatg gccttgcaaa gggtatggta ataagctgac 180

ggacatggtc ctaaccacgc agccaagtcc taagtcaaca gatcttctgt tgatatggat 240

gcagttcaca gactaaatgt cggtcgggga agatgtattc ttctcataag atatagtcgg 300

acctctcctt aatgggagct agcggatgaa gtgatgcaac actggagccg ctgggaacta 360

atttgtatgc gaaagtatat tgattagttt tggagtactc gcgagtacg 409

<210> 4

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反式剪接核酶

<400> 4

cgtactccgc ccaaaaaagt tatcaggcat gcacctggta gctagtcttt aaaccaatag 60

attgcatcgg tttaaaaggc aagaccgtca aattgcggga aaggggtcaa cagccgttca 120

gtaccaagtc tcaggggaaa ctttgagatg gccttgcaaa gggtatggta ataagctgac 180

ggacatggtc ctaaccacgc agccaagtcc taagtcaaca gatcttctgt tgatatggat 240

gcagttcaca gactaaatgt cggtcgggga agatgtattc ttctcataag atatagtcgg 300

acctctcctt aatgggagct agcggatgaa gtgatgcaac actggagccg ctgggaacta 360

atttgtatgc gaaagtatat tgattagttt tggagtactc gccagtacg 409

<210> 5

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核酶*

<400> 5

aaaagttatc aggcatgcac ctggtagcta gtctttaaac caatagattg catcggttta 60

aaaggcaaga ccgtcaaatt gcgggaaagg ggtcaacagc cgttcagtac caagtctcag 120

gggaaacttt gagatggcct tgcaaagggt atggtaataa gctgacggac atggtcctaa 180

ccacgcagcc aagtcctaag tcaacagatc ttctgttgat atggatgcag ttcacagact 240

aaatgtcggt cggggaagat gtattcttct cataagatat agtcggacct ctccttaatg 300

ggagctagcg gatgaagtga tgcaacactg gagccgctgg gaactaattt gtatgcgaaa 360

gtatattgat tagttttgga gtactcg 387

<210> 6

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGS

<400> 6

gcccaa 6

<210> 7

<211> 9

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1

<400> 7

cccgcccaa 9

<210> 8

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P10

<400> 8

cguacuc 7

<210> 9

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P10

<400> 9

gaguacg 7

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AS150

<400> 10

ggcggccagc atggagaact gccatggctc agccaggtag tactgtgggt actcgaagtg 60

gctgcgtacc acacccgtcg cattggagaa gggcacgtag aagttagggc cttctgtgcc 120

attcatggct gtggcccttg tggctgaccc 150

<210> 11

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SD/SA

<400> 11

aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt tttgtttatc ttatttctaa tactttccct 60

aatctctttc tttcagggca ataatgatac aatgtatcat gcctctttgc accattctaa 120

agaataacag tgataatttc tgggttaagg caatagcaat atttctgcat ataaatattt 180

ctgcatataa attgtaactg atgtaagagg tttcatattg ctaatagcag ctacaatcca 240

gctaccattc tgcttttatt ttatggttgg gataaggctg gattattctg agtccaagct 300

aggccctttt gctaatcatg ttcatacctc ttatcttcct cccacagctc ctgggcaacg 360

tgctggtctg tgtgctggcc catcactttg gcaaagaatt 400

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5' UTR

<400> 12

gggagcagcc acgggtcagc cacaagggcc acagcc 36

<210> 13

<211> 589

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WPRE

<400> 13

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

Claims

1.一种反式剪接核酶，其特征在于，靶向视紫红质转录体。

2.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述反式剪接核酶的结构为5'-内部指导序列(IGS)-核酶^*-3'。

3.根据权利要求2所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述反式剪接核酶在所述核酶^*之后的3'方向还包括外显子区。

4.根据权利要求2所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述IGS区是由可与视紫红质转录体互补结合的长度为5～10nt的碱基序列构成。

5.根据权利要求4所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述IGS区是由可与包括视紫红质转录体的+30、+35、+42、+43、+52、+54、+55、+59、+75、+97、+116、+122、+123、+127、+132、+140、+154、+165、+171、+187、+191、+207、+215、+222、+230、+232、+244、+256、+262、+273、+298、+308、+381、+403、+661或+688位碱基的区互补结合的长度为5～10nt的碱基序列构成。

6.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述视紫红质转录体包括视紫红质突变。

7.根据权利要求6所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述视紫红质转录体突变是在标记为SEQ ID NO：1的视紫红质转录体的第1至1142位之间的碱基中至少一个碱基上发生的突变。

8.根据权利要求7所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述视紫红质突变包括从由下列组成的突变群组中选择的至少一种：L328P、T342M、Q344R/P/ter、V345L/M、A346P、P347A/R/Q/L/S/T、ter349/Q/E、N15S、T17M、V20G、P23A/H/L、Q28H、G51R/V、P53R、T58R/M、V87D/L、G89D、G106R/W、C110F/R/S/Y、E113K、L125R、W161R、A164E/V、C167R/W、P171Q/L/S、Y178N/D/C、E181K、G182S/V、C185R、C187G/Y、G188R/E、D190N/G/Y、H211R/P、C222R、P267R/L、S270R、K296N/E/M、R135G/L/P/W、

9.根据权利要求1所述的反式剪接核酶，其特征在于，所述反式剪接核酶包括由SEQ IDNO：2至SEQ ID NO：4中任一个标记的碱基序列。

10.一种非病毒基因转运体，其特征在于，包括权利要求1所述的反式剪接核酶。

11.一种基因构建体，其特征在于，包括权利要求1所述的反式剪接核酶。

12.根据权利要求11所述的构建体，其特征在于，所述构建体是在所述核酶的3'-末端方向额外连接靶基因。

13.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述靶基因是视紫红质基因或报告基因。

14.根据权利要求11所述的构建体，其特征在于，

所述构建体是在所述核酶的5'-末端方向连接有编码反义的核甘酸的基因构建体，

所述反义具有与目标视紫红质转录体互补的序列。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的构建体，其特征在于，包括可操作地连接在所述基因构建体的启动子序列。

16.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求11至14中任一项所述的基因构建体。

17.一种重组病毒，其特征在于，包括权利要求11至14中任一项所述的基因构建体。

18.一种非病毒基因转运体，其特征在于，包括权利要求11至14中任一项所述的基因构建体。

19.根据权利要求17所述的重组病毒，其特征在于，所述病毒是从由腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或痘苗病毒组成的群组中选择的任一种。

20.根据权利要求17所述的重组病毒，其特征在于，

所述重组病毒是包括对权利要求1所述的反式剪接核酶进行编码的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸可操作地连接在启动子的重组腺相关病毒(AAV)，

所述重组AAV是天然来源或人工血清型AAV、分离株AAV或演化支AAV。

21.一种预防或治疗视网膜色素变性的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的核酶、权利要求10所述的非病毒基因转运体，权利要求11至14中任一项所述的基因构建体、权利要求16所述的重组表达载体、权利要求17所述的重组病毒或权利要求18所述的非病毒基因转运体作为有效成分。

22.一种预防或治疗视网膜色素变性的方法，其特征在于，包括将权利要求21所述的组合物向个体给药的步骤。