WO2013027988A2 - 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adenovirus comprising a trans-splicing ribozyme and a cancer treatment gene and its use, and more particularly, the present invention relates to a trans-splicing ribozyme acting on a cancer specific gene-HSVtk Recombinant adenovirus comprising a polynucleotide encoding a complex and a cancer treatment gene, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant adenovirus as an active ingredient, and the recombinant adenovirus or pharmaceutical composition to an individual in need of treatment A method of treating cancer comprising the step of administering.
  • Cancer is one of the leading causes of death in Korea, and many studies have been conducted to conquer cancer, but it is an incurable disease that has not yet been conquered.
  • Conventional treatments for cancer include surgery, chemotherapy, and radiation therapy, but many methods have been limited. Recently, different treatments are being studied. Among them, gene therapy is being actively studied.
  • Gene therapy refers to a method of genetically treating a congenital or acquired gene abnormality that is difficult to treat by conventional methods.
  • gene therapy may be performed by expressing therapeutic proteins by administering genetic material such as DNA and RNA in the human body to treat and prevent chronic diseases such as congenital or acquired genetic defects, viral diseases, cancer or cardiovascular diseases.
  • genetic material such as DNA and RNA
  • chronic diseases such as congenital or acquired genetic defects, viral diseases, cancer or cardiovascular diseases.
  • As a treatment method to suppress the expression of a specific protein it is expected to overcome the incurable disease as well as to replace the existing medical methods, since the cause of the disease can be interpreted at the genetic level.
  • Gene therapy for cancer may be classified into immunological gene therapy that induces an immune response in the human body and gene therapy in which the genes used directly destroy or induce cancer cells. In the latter case, the role of the vector to carry and express the gene into the cell is very important.
  • Adenovirus vectors are the most promising because of the high efficiency of gene transfer, the ability to transfer the gene into undifferentiated cells, and the ease of producing high titers of viral storage. It is recognized as one of gene therapy vectors.
  • adenovirus vectors for gene therapy delete a series of genes essential for replication, and incorporate a cytomegalovirus (CMV) or loose sarcoma virus (RSV) promoter with high levels of promoter activity to biomark the therapeutic protein. It is expressed with high efficiency inside.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV loose sarcoma virus
  • cancer tissue targeted therapy has been attempted in an effort to reduce the side effects caused by the expression of many of the target genes that can be used for gene therapy in normal cells that have a high degree of cell division (Fukuzawa). et al., Cancer Res 64: 363-369, 2004).
  • a method of using a tissue-specific promoter instead of CMV or RSV is being considered, but due to the disadvantage of poor therapeutic efficacy instead of increasing specificity, it has not been brought to practical use.
  • trans-splicing ribozymes based on these Group I introns target specific RNAs that are specifically expressed only in the gene transcripts or disease cells associated with the disease, correcting them with normal RNA, or It is expected that reprogramming to be replaced with therapeutic gene transcripts could lead to disease specific and safe gene therapy techniques.
  • trans-splicing ribozymes can induce expression of therapeutic gene products we desire while eliminating disease specific RNA, thus doubling the therapeutic effect.
  • Therapeutic genes used in gene therapy methods include thymidine kinase (hereinafter abbreviated to HSVtk) of herpes simplex virus, cytosine deaminoase (CD) of E. coli and purine nucleoside phosphorylase of E. coli. Genes and the like (hereinafter abbreviated as PNP) are known. Gene therapy using them is called gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT), and they all have in common the use of prodrugs.
  • Prodrugs used in GDEPT include hepacyclovir (GCV), 5-fluorouracil (5-FU) and 6-methylpurine-2-deoxyriboside (6-MeP-dR), respectively, HSV-TK, It is used together with CD and PNP.
  • Prodrugs that are not cytotoxic are converted into drugs that are toxic to cells by the introduced genes, which are mainly activated by phosphorylation.
  • the advantage of gene therapy using suicide genes is that the so-called bystander effect of killing adjacent cells by activated drugs in the cells into which these genes are introduced is the best strategy that can be taken with low efficiency of gene introduction. It is a technology called.
  • HSVtk in these gene therapy strategies is quite common. Specifically, the HSVtk / GCV system is disclosed in WO 90/07936, US 5,837,510, US 5,861,290, WO 98/04290, WO 97/37542 and US 5,631,236, as one of the most widely used methods of suicide gene therapy.
  • Cells expressing the HSVtk gene can phosphorylate liver cyclovir (GCV), which can interfere with the replication of DNA and induce cell death. This method is currently used in more than 30 clinical trials for gene therapy of various human cancers.
  • GCV liver cyclovir
  • PD-1 programmed death-1
  • PD-1 is a 55 kDa type I transmembrane protein that forms part of the Ig correlation gene and is well known as a co-inhibitor of T cells belonging to the immunoglobulin molecular group. That is, PD-1 is a member of an inhibitory factor belonging to the CD28 group of receptors (eg, including CD28, CTLA-4, ICOS and BTLA) expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells.
  • Ligands for PD-1 include PD-L1 and PD-L2, which are known to downregulate T cell activation when binding to PD-1.
  • PD-1 is not expressed in normal T cells in a normal state but increases in expression when the cells are activated.
  • PD-L1 is found in large numbers in many human cancers, and the interaction of PD-1 with PD-L1 delivers a stimulatory or inhibitory signal to T cells.
  • tumor invasive lymphocytes are reduced, T cell receptor mediated proliferation is reduced, and immune evasion by cancer cells occurs. Therefore, in recent studies, studies are being made to treat cancer by effectively inducing anti-cancer immune responses by blocking signal transduction of PD-1 or PD-L1.
  • the present inventors have diligently researched to develop a cancer treatment gene therapy method with improved tissue specificity and therapeutic efficacy.
  • the present inventors have encoded a cancer tissue specific trans-splicing ribozyme-HSVtk (Human Simplex Virus thymidine kinase) complex.
  • Recombinant adenoviruses designed to include polynucleotides and the sPD-1 gene, which is a cancer treatment gene not only show excellent therapeutic effects specific to cancer tissues, but also significantly reduce side effects of gene therapy. It was.
  • One object of the present invention is to provide a recombinant adenovirus comprising a polynucleotide encoding a trans-splicing ribozyme-HSVtk complex that acts on a cancer specific gene and a cancer therapeutic gene.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant adenovirus as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer in animals other than humans, comprising administering the recombinant adenovirus or pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the recombinant adenovirus of the present invention not only shows selectivity for cancer cells by trans-splicing ribozymes acting on cancer-specific genes, but also shows elevated anti-cancer activity by cancer treatment genes, thereby effectively preventing cancer. And may be widely used for treatment.
  • Trans-splicing ribozymes use antisense mTERT RNA sequences to specifically recognize mTERT RNA and cleave mTERT RNA at the 3 'end of an internal-guided-sequence (IGS).
  • IGS internal-guided-sequence
  • the 5 'end of the HSVtk coding RNA portion of the trans-splicing ribozyme is linked to the truncated end of the mTERT RNA. Possible base bonds between mTERT target mRNA and ribozyme are indicated by vertical lines.
  • FIG. 2 shows the regulatory effect of adenovirus HSVtk gene expression by mouse TERT-TR.
  • Ad5mTR an E1 / E3-deficient adenovirus
  • Ad5MOCK is a control of E1 / E3-deficient adenovirus.
  • CT26 cells (3 ⁇ 10 3 ) were seeded in 96-well plates and then exposed to Ad5MOCK or Ad5mTR of various MOIs in the presence of 100 ⁇ M GCV. The cytotoxicity was measured on day 3 of infection using the cell proliferation assay kit. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation for three assays.
  • Ad5mTR.sPD1 codes for mTERT-TR-HSVtk under the control of the CMV promoter in the E1 region and sPD1-Ig under the control of the EF1 ⁇ promoter in the E3 region.
  • HEK293 cells (4 ⁇ 10 5 ) were infected with 2MOI of adenovirus for 48 hours, disrupted with RIPA buffer, followed by immunoblot analysis. SPD1-Ig expression by Ad5mTR.sPD1 (80 ⁇ g protein per lane) was confirmed using anti-PD1 antibody.
  • HSVtk enzymatic activity in phosphorylated GCV was assessed in CT26 cells by measuring the accumulation of radioisotope labeled PCV (1 ⁇ Ci / ml). Data are expressed as mean ⁇ standard deviation for three assays.
  • FIG. 5 shows the expression of PD-L1 on the surface of CT26 colon cancer cells in mice.
  • a Total RNA was prepared in each cell and PD-L1 transcript was detected by RT-PCR.
  • Mouse liver cancer cells (Hepa-1) were analyzed using a comparison group.
  • b PD-L1 protein was analyzed on the surface of each cell by flow cytometry.
  • CT26 cells were infected with Ad5MOCK, Ad5mTR or Ad5mTR.sPD1 of various MOIs with 100 ⁇ M GCV. After 3 days, cytotoxicity was measured by the method of FIG. 1D. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation for three assays.
  • CT26 cells (1 ⁇ 10 6 ) were subcutaneously inoculated on both sides of BALB / c mice. The tumors were treated with 5 ⁇ 10 8 PFU of Ad5MOCK, Ad5EF1 ⁇ .sPD1, Ad5mTR or Ad5mTR.sPD1.
  • GCV 75 mg / kg
  • Figure 9 shows the inhibitory effect of secondary tumors by Ad5mTR.sPD1 treatment.
  • CT26 tumors were subcutaneously transplanted into BALB / c mice and injected with 5 ⁇ 10 8 PFU of Ad5mTR.sPD1 three times at three day intervals. Two weeks after the initial treatment, 1 x 10 6 tumor cells were introduced on the opposite side. One day after the first virus injection, GCV (75 mg / kg) was intraperitoneally injected and injected for 12 days. Tumor size was measured every three days.
  • GCV 75 mg / kg
  • Tumor size was measured every three days.
  • E.G7 tumors were subcutaneously transplanted into C57 / BL6 mice and the same method as in (a) above was performed.
  • Seven days after the secondary tumor was inoculated the tumor size of the sites inoculated in mice pretreated with Ad5mTR.sPD1 and untreated mice was measured. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • the present invention is a trans-splicing ribozyme-HSVtk (Human), which acts on a cancer specific gene, Tomer (Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA (SEQ ID NO: 1)
  • a recombinant adenovirus comprising a polynucleotide encoding a Simplex Virus thymidine kinase) complex and a cancer therapeutic gene.
  • cancer specific gene means a gene that is specifically expressed or significantly overexpressed only in cancer cells.
  • the cancer specific gene may add a feature in which the ribozyme according to the present invention may act cancer-specifically.
  • cancer-specific genes include mRNA of Telomerase reverse transcriptase (ERTT), alphafetoprotein (AFP) mRNA, carcinoembryonic antigen (CEA) mRNA, prostate-specific antigen (PSA) mRNA, or cytoskeleton-associated protein 2 (CKAP2) mRNA. It may be, but is not particularly limited thereto.
  • TERT Telomerase reverse transcriptase
  • TERT Telomerase reverse transcriptase
  • the term "Telomerase reverse transcriptase” (TERT) of the present invention is one of the most important enzymes that regulates the ability of cancer cells to survive and their ability to proliferation, and forms a terminal granule structure on the chromosome to protect the end of the chromosome. Through means an enzyme that inhibits the aging of cells. In normal cells, every time the cell divides, the length of the terminal granules decreases little by little, resulting in the loss of genetic material and the cell death. However, in cancer cells, since the enzyme continues to prolong the terminal granules, the cells do not die and are known to be a serious obstacle to treating cancer by directly contributing to the immortality of cancer cells.
  • telomerases have telomerase activity of 80-90% in germ cells, hematopoietic cells and cancer cells that replicate indefinitely, but normal cells around cancer cells do not have that activity.
  • the TERT may be used as a direct target of the cancer treatment gene provided by the present invention, but is not particularly limited thereto.
  • the term "ribozyme” refers to an RNA molecule having enzymatic activity that exhibits trans-splicing activity and self-splicing activity.
  • the ribozyme inhibits the activity of cancer-specific genes through a trans-splicing reaction, and as a result, may exhibit selective anti-cancer effects, and is expressed in a conjugated form with cancer treatment genes. Since it can be used as a means for carrying out the role of activating a cancer therapy gene, any form of thing can be used as long as it exhibits the activity which inactivates a cancer specific gene and can activate a cancer therapy gene.
  • the base of Rib67 ribozyme or SEQ ID NO: 2 which is a hTERT target trans-splicing group I ribozyme that has been demonstrated to be capable of recognizing and trans-splicing mRNA of TERT (Telomerase reverse transcriptase) specific for cancer It may be a ribozyme encoded by a polynucleotide having a sequence, but is not particularly limited thereto.
  • HSVtk Herpes simplex virus-thymidine kinase
  • HSVtk Herpes simplex virus-thymidine kinase
  • This enzyme converts non-toxic prodrugs into toxic substances and is one of the most susceptible genes that cause the cells into which the genes are introduced to die.
  • the HSVtk gene may be used as a cancer treatment gene that is expressed in a conjugated form to ribozyme and exhibits anticancer activity.
  • Such HSVtk gene may preferably have a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, Genbank accession numbers AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107 , AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747, etc., but is not particularly limited thereto.
  • the term “anti-cancer therapeutic gene” refers to a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide that exhibits a therapeutic effect upon expression in cancer cells.
  • the cancer treatment gene may be expressed in a conjugated form with the ribozyme or independently, and may exhibit anticancer activity.
  • the cancer treatment gene for the purposes of the present invention include drug-sensitive genes, apoptosis genes, cytostatic genes, cytotoxic genes, tumor suppressor genes, antigenic genes, cytokine genes, anti-angiogenic genes, and the like.
  • the cancer treatment gene may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • drug-sensitizing gene refers to a gene for an enzyme that converts a non-toxic precursor (drug-sensitizing gene) into a toxic substance, and suicide gene (suicide) because the cells into which the gene is introduced are killed. Also called gene.
  • the drug-sensitive genes include HSVtk (Herpes simplex virus-thymidine kinase) gene, ganciclovir, and E. coli cytosine deaminase (CD) gene, 5-fluorocytosine ( 5-fluorocytosine, 5-FC) and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the term "proapoptotic gene” refers to a nucleotide sequence that is expressed and induces programmed cell death.
  • the apoptosis gene includes p53, adenovirus E3-11.6K (derived from Ad2 and Ad5) or adenovirus E3-10.5K (derived from Ad), adenovirus E4 gene, p53 pathway gene, caspa Gene encoding the agent, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • cytostatic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell and stops the cell cycle during the cell cycle.
  • the cell proliferation inhibitory genes include p21, retinoblastoma gene, E2F-Rb fusion protein gene, genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors (eg, p16, p15, p18 and p19), growth Stop arrest specific homeobox (GAX) genes, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • cytotoxic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell and exhibits a toxic effect.
  • the cytotoxic gene may be a nucleotide sequence encoding Pseudomonas exotoxin, lysine toxin, diphtheria toxin, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • tumor suppressor gene refers to a nucleotide sequence that can be expressed in target cells to inhibit tumor phenotype or induce apoptosis.
  • Tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), p53 gene, APC gene, DPC-4 / Smad4 gene, BRCA-1 gene, BRCA-2 gene, WT-1 gene, retinoblastoma gene, MMAC-1 gene, adenomatous polyposis coil protein, missing colon tumor (DCC) gene, MMSC-2 gene, NF-1 gene, chromosome 3p21.3
  • the throat throat suppressor gene, MTS1 gene, CDK4 gene, NF-1 gene, NF-2 gene, VHL gene, and soluble programmed death-1 (sPD-1) located at, but are not limited thereto. .
  • sPD-1 soluble programmed death-1
  • PD-1 programmed death-1
  • PD-1 programmed death-1
  • PD-L1 the extracellular domain of.
  • the interaction between PD-1 and PD-L1 results in reduced tumor invasive lymphocytes, reduced T cell receptor mediated proliferation, and immune evasion by cancer cells. It has been reported that sPD-1, an advantageous embodiment of, can effectively induce anti-cancer immune responses by inhibiting immune dues due to the interaction between PD-1 and PD-L1.
  • the sPD-1 gene may be conjugated to a cancer-specific gene by trans-splicing activity of the ribozyme according to the present invention and used as a therapeutic gene in cancer cells. It may have a base sequence represented by, but is not particularly limited thereto.
  • the term "antigenic gene” refers to a nucleotide sequence that is expressed in target cells to produce cell surface antigenic proteins that can be recognized by the immune system.
  • the antigenic gene may be carcinoembryonic antigen (CEA), p53, etc., but is not particularly limited thereto.
  • cytokine gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell to produce a cytokine.
  • the cytokine gene is GM-CSF, interleukin (IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), interferon ⁇ , ⁇ , ⁇ (interferon ⁇ -2b), fusions such as interferon ⁇ -2 ⁇ -1, and the like, but are not particularly limited thereto.
  • anti-angiogenic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed and releases anti-angiogenic factors out of the cell.
  • the anti-angiogenic gene may be angiostatin, vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibitor, endostatin, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • adenovirus of the present invention has the same meaning as an adenovirus vector and means a virus belonging to the genus Adenovirus.
  • the adenoviridia includes all animal adenoviruses of the genus mastadenovirus.
  • human adenoviruses include the AF subgenra and their respective serotypes, wherein the AF subgenus is human adenovirus type 1, type 2, type 3, type 4, type 4a, Type 5, Type 6, Type 7, Type 8, Type 9, Type 10, Type 11 (Ad11A and Ad11P), Type 12, Type 13, Type 14, Type 15, Type 15 Type 16, Type 17, Type 18, Type 19, Type 19a, Type 20, Type 21, Type 22, Type 23, Type 24, Type 25, Type 26, Type 27 Type 28, type 29, type 30, type 31, type 32, type 33, type 34, type 34a, type 35, type 35p, type 36, type 37 Type 38, Type 39, Type 40, Type 41, Type 42, Type 43, Type 44, Type 45, Type 46, Type 47, Type 47, Type 48, Type 91, etc.
  • the AF subgenus is human adenovirus type 1, type 2, type 3, type 4, type 4a, Type 5, Type 6, Type 7, Type 8, Type 9, Type 10, Type 11 (Ad11A and Ad11P), Type 12, Type 13, Type 14, Type 15, Type 15 Type 16, Type 17, Type
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant adenovirus as an active ingredient.
  • the recombinant adenovirus provided by the present invention includes a polynucleotide encoding a trans-splicing ribozyme-HSVtk complex and a cancer treatment gene that acts on a cancer-specific gene, TERT, and is administered to cancer cells in which the TERT is expressed.
  • TERT cancer-specific gene
  • HSVtk dissociated from the trans-splicing ribozyme-HSVtk complex due to TERT and dissociated HSVtk may not only be cytotoxic but also induce an attack on immune cells by cancer treatment genes. Play a role.
  • the recombinant adenovirus of the present invention is superior to cancer cells because HSVtk does not dissociate from the trans-splicing ribozyme-HSVtk complex when administered to normal cells that do not express TERT. As it exhibits selectivity, it can be used for safer cancer treatment.
  • cancer refers to a problem in the regulation of normal division, differentiation and death of cells, abnormally overproliferating, invading surrounding tissues and organs to form agglomerates and destroying or modifying existing structures.
  • State cells or tissues such as pancreatic cancer, breast cancer, prostate cancer, brain tumors, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, liver cancer, gastric cancer, colon cancer, bone cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine Cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma and central nervous system tumor It may be, but is not particularly limited thereto.
  • prevention of the present invention means any action that inhibits or delays the onset of cancer by administration of a recombinant adenovirus or composition according to the present invention.
  • treatment of the present invention means any action in which cancer is improved or beneficially altered by administration of a recombinant adenovirus or composition according to the present invention.
  • composition for preventing or treating cancer of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that may be used in the pharmaceutical compositions of the invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which solid preparations contain at least the turmeric or turmeric extract, the linarol compound isolated therefrom or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed to prepare.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the invention provides a method of treating cancer comprising administering the recombinant adenovirus or pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount to an individual in need thereof.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to a patient's sexually transmitted disease, age, type of disease, and severity. , The activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, factors including the concurrent drug and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a single or multiple doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably oral administration or intravenous administration.
  • administration means introducing a predetermined substance into an animal by any suitable method, and the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention is oral via any general route as long as it can reach the target tissue. Or parenterally.
  • the therapeutic composition according to the present invention can be administered by any device that the active ingredient can move to the target cell.
  • Preferred dosages for the therapeutic compositions according to the invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered at 1 to 10 mg / kg, preferably at 1 to 5 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times.
  • the therapeutic composition of the present invention can be used alone or in combination with adjuvant treatment methods such as surgical surgery.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the invention include cisplatin, carboplatin carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide ), Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, doxorubicin (doxorubicin), bleomycin, blecomycin, plicomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluorouracil, vincristin, vinblastin, methotrexate, and the like, but are not particularly limited thereto.
  • the radiation therapy that can be used with the composition of the invention may be X-ray irradiation, ⁇ -ray irradi
  • the present inventors are a trans-splicing ribozyme designed to be cleaved at the 3 'end of hTERT mRNA, which is linked to HSVtk mRNA and recognizes and cleaves human TERT (hTERT).
  • Design FIG. 1 and devise a similar system using trans-splicing ribozyming targeting the mouse TERT mRNA (mTERT-TR) to confirm the effect of the trans-splicing ribozyme in mice.
  • Ad5mTR Ad5mTR containing mTERT-TR-regulated HSVtk (mTERT-TR-HSVtk)
  • FIG. 2A adenovirus containing mTERT-TR-regulated HSVtk
  • FIG. 2B a derived colorectal cancer cell line
  • FIG. 2C Similar to cytotoxicity in vitro, the growth of tumors was significantly inhibited by injection of Ad5mTR into subcutaneous CT26 tumors in BALB / c mice.
  • the inventors have constructed a dual-module adenovirus (Ad5mTR.sPD1) comprising HSVtk and sPD1-Ig in the E3 region regulated by mTERT-TR in the E1 region of the adenovirus genome (FIG. 4A). Testing of the activity confirmed that IFN- ⁇ secretion by antigen-specific T cells in response to tumor cell challenge was enhanced by supernatants containing sPD1-Ig (FIG. 4D) and PD- at the surface of tumor cells. Expression of L1 was confirmed by flow cytometry (FIG. 5).
  • CT26 cells infected with Ad5mTR.sPD1 exhibited levels of ex vivo cytotoxicity similar to those infected with Ad5mTR (FIG. 6A), and Ad5mTR.sPD1 significantly promoted tumor regression compared to Ad5mTR, and indeed nearly complete tumor regression. It was confirmed that this occurred (Fig. 6b).
  • HSVtk promotes antigen-specific CD8 T cell responses by DCs (FIG. 3B) and sPD1-Ig promotes anti-tumor CD8 T cell reactivity extracellularly (FIG. 4D).
  • the recombinant adenovirus of the present invention is the treatment of human cancer Can also be used for
  • mice All cells were cultured in RPMI medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) and 1% penicillin / streptomycin.
  • FBS fetal bovine serum
  • OT-1 mice B6 background
  • Rag1-/-mice B6 background
  • AdenoZAPTM and AdenoQuickTM systems were used to generate Ad5mTR containing the TERT-TR-HSVtk gene of mice under the control of the CMV promoter.
  • pAVQ-CMV-mTERT AS100 Rib (+67) TK was treated with SpeI / SacII to obtain a DNA fragment containing CMV.mTR.HSVtk, and the fragment was inserted into a SpeI / EcoRV cleavage site of pZAP1.1 to pZAP1.
  • 1.CMV.mTR.HSVtk was produced.
  • pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk was cleaved with PacI / DraIII, linked to RightZAP1.2 and introduced into HEK293 cells.
  • To prepare sPD1-Ig the extracellular domain of PD-1 was amplified by PCR using the following primers
  • Reverse primer 5'-AGA TCT TCC TCC TCC TCC TTG AAA CCG GCC TTC TGG TTT GGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • the amplification product was inserted into the XhoI / BglII locus of the pFUSE-mIgG2A.Fc1 vector (Invitrogen, San Diego, Calif.) To prepare pFUSE-mIgG2A.Fc1.EF1.sPD-1.
  • pFUSE-mIgG2A.Fc1.EF1.sPD1-Ig-derived EF1.sPD1-Ig was inserted into the EcoRI / SwaI locus of the pE3.1 vector (OD260) to prepare pE3.1.EF1.sPD1-Ig.
  • pE1.2.CMV.mTR.HSVtk was constructed by inserting the CMV.mTR.HSVtk fragment of pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk into the BamHI / SpeI locus of the pE1.2 vector (OD260).
  • Ad5mTR.sPD1 pE1.2.CMV.mTR.HSVtk and pE3.1.EF1.sPD1-Ig were cleaved with the restriction enzyme DraIII / PflMI, linked to AdenoQuick13.1, and then introduced into HEK293 cells. It was.
  • Ad5EF1.sPD1 in the same manner as Ad5mTR.sPD1, pE3.1.EF1.sPD1-Ig and pE1.2 empty vectors were cleaved with the restriction enzyme DraIII / PflMI and linked to AdenoQuick13.1. It was introduced into HEK293 cells.
  • HSVtk enzyme activity was determined by measuring the accumulation of phosphorylated GCV in cells.
  • Cell proliferation assay (Dojindo Laboratories, Rockville, MD) was performed by evaluating the cytotoxicity of adenoviruses using standard methods. In summary, cells (3 ⁇ 10 3 ) were seeded in 96-well plates and incubated overnight at 37 ° C. The cultured cells were infected with adenoviruses of various multiplicity of infection (MOI). After 1 day, GCV was added to a final concentration of 200 ⁇ M and then cell proliferation was measured for 3 days. All experiments were repeated three times.
  • MOI multiplicity of infection
  • HEK293 cells (4 ⁇ 10 5 ) were infected with 2MOI adenovirus. At 24 hours after infection, the culture supernatant and cell residue (80 ⁇ g) were analyzed by immunoblot using an anti-Pdcd-1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). To deplete CD8 T cells, 500 ⁇ g of 2.43 ⁇ anti-CD8 antibody was intraperitoneally injected 2 days prior to infection with adenovirus and then intraperitoneally every 5 days for 15 days.
  • Example 1-5 CD8 T Cell / DC Coculture Assay to Analyze IFN- ⁇ Production
  • DLN-DCs Absorbent lymph node derived DCs
  • DLN-DCs Absorbent lymph node derived DCs
  • MC38 / OVA cells colon cancer cells MC38, B6 background
  • mice stably expressing ovalbumin (OVA) were cultured in 6-well plates.
  • SPD1-Ig was obtained from the culture supernatant of HEK293 infected with 10MOI adenovirus for 24 hours, and then added to MC38 / OVA cells (1 ⁇ 10 4 ) to which OT-1 CD8 T lymphocytes (1 ⁇ 10 6 ) were added. Incubated for 72 hours. Pure CD8 + T lymphocytes from OT-1 mice were isolated using a MACS column as described above. The amount of IFN- ⁇ produced from CD8 T lymphocytes was measured using a mouse IFN- ⁇ CBA assay kit (BD bioscience, San Jose, CA).
  • Example 1-7 In Vivo Animal Studies and In Vitro Assays
  • E.G7 cells C57 / BL6 backgound; 1 ⁇ 10 6
  • adenovirus and GCV were treated by the method described above.
  • E.G7 tumors of Rag1-/-mice were treated with Ad5mTR.sPD1 following the intravenous injection of CD8 T cells isolated from OT-1 mice.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • ribozymes that recognize and cleave human TERT were delivered to tumor cells using recombinant adenovirus.
  • the ribozyme was designed to be linked to HSVtk mRNA and cleaved at the 3 ′ end of hTERT mRNA, leading to novel translation of HSVtk mRNA in tumor cells.
  • This type of ribozyme is defined as a trans-splicing ribozyme (FIG. 1).
  • HSVtk expression regulated by trans-splicing ribozymes is limited to cells that express high levels of hTERT mRNA, including tumor cells.
  • this system has been proposed as an effective way of delivering HSVtk to tumor cells without affecting the cells of surrounding normal tissues where hTERT is expressed at low levels.
  • this strategy has shown a high effect on human colon cancer cells transplanted into xenograft mouse models.
  • One problem with this system in immunological analysis is that experiments with human tumor cells were performed in immunodeficient mice with suppressed xenograft rejection. Thus, such a system is not suitable for evaluating the effect of HSVtk on anti-tumor immunization.
  • Ad5MOCK adenovirus excluding the expression cassette was prepared as a control.
  • CT26 cells a colorectal cancer cell line derived from BALB / c mice, wherein the cell line has high levels of mTERT mRNA.
  • CT26 cells were exposed to Ad5mTR of various MOIs in the presence of GCV. While 2.5MOI was sufficient to kill most cells, Ad5MOCK showed no cytotoxicity even at 50MOI (FIG. 2B). Similar to cytotoxicity in vitro, injection of Ad5mTR into subcutaneous CT26 tumors in BALB / c mice significantly inhibited tumor growth (FIG. 2C).
  • Ad5mTR showed a similar effect to the anti-tumor effect of adenovirus comprising human TERT-TR-HSVtk, which was found to be suitable for use in the study of anti-tumor immunity in mice.
  • Example 2-2 Improved DC-Mediated Tumor Antigen Presentation by HSVtk
  • HSVtk in tumor cells by DNA introduction or adenovirus infection is known to enhance antigenic response of cytotoxic CD8 T cells. Since expression of HSVtk in the presence of biological GCV can induce apoptosis in significant but not all of the tumor volume within, tumor antigens derived from killed cells can be detected by APCs such as DCs, The cells migrate to lymph nodes that respond to tumor antigen-specific T cells. Although this model has been presented in the literature, we decided to test this possibility using defined antigenspecific T cells. For this experiment, we used mouse tumor cell line E.G7 (a derivative of EL4 cells stably expressing obalbumin) as a model tumor antigen, and T cells were model tumor-antigen (OVA) -specific CD8.
  • E.G7 a derivative of EL4 cells stably expressing obalbumin
  • OT-I T cells cultured and purified using DCs derived from tumor-bearing mice treated with Ad5mTR were higher in IFN than OT-I T cells cultured using DCs derived from tumor-bearing mice treated with control virus. Produced - ⁇ .
  • DCs derived from mice treated with Ad5mTR can provide sufficient levels of OVA antigen to stimulate OVA specific T cells (FIG. 3B).
  • HSVtk expression in tumors and thus GCV-induced apoptosis is the result of the release of tumor antigens, which are efficiently captured by DCs capable of stimulating tumor antigen specific cytotoxic T cells.
  • HSVtk tumor-specific expression of HSVtk can not only effectively stimulate anti-tumor T cell activity through DCs but also directly induce cytotoxicity of tumor cells.
  • Ad5mTR stimulated anti-tumor CD8 T cell responsiveness with an increased likelihood of interest.
  • the combination of these proposals with another strategy for inactivating tumor-induced immune resistance further enhanced anti-tumor T cell reactivity.
  • PD-L1 is a known immunosuppressive agent expressed on the surface of tumor cells.
  • sPD1 a soluble form of the PD-L1 receptor that neutralizes PD-L1, and eliminated PD-L1 mediated T cell inhibition.
  • sPD1 was constructed by fusing sPD1 with the Fc region of IgG2a.
  • Ad5mTR.sPD1 dual-module adenovirus
  • Ad5mTR.sPD1 dual-module adenovirus
  • HEK293 cells were infected with Ad5mTR.sPD1, sPD1-Ig was expressed and secreted in the extracellular environment, and confirmed by immunoblot analysis (FIG. 4B).
  • the expression level of HSVtk in Ad5mTR.sPD1 infected cells was compared to that of Ad5mTR infected cells in a manner measured by enzymatic activity (FIG. 4C).
  • sPD1-Ig secreted in an ex vivo environment can enhance anti-tumor T cell reactivity by neutralizing PD-L1 on the surface of tumor cells.
  • Cocultures of tumor cells expressing OVA and OVA-specific OT-I T cells were added to the culture supernatants of Ad5EF1 ⁇ .sPD1 infected 293HEK cells, and T cell reactivity was measured based on the amount of IFN- ⁇ secretion.
  • IFN- ⁇ secretion by antigen-specific T cells in response to tumor cell challenge was enhanced by supernatants containing sPD1-Ig (FIG. 4D).
  • Expression of PD-L1 on tumor cell surfaces was confirmed by flow cytometry (FIG. 5).
  • CT26 colorectal cancer model was used (FIG. 2C).
  • CT26 cells were chosen because they express high levels of PD-L1 on their cell surface (FIG. 5).
  • CT26 cells infected with Ad5mTR.sPD1 showed similar levels of ex vivo cytotoxicity as infected with Ad5mTR, which was expected that sPD1-Ig would not be a direct cause of cytotoxicity by HSVtk (FIG. 6A).
  • Ad5mTR.sPD1 significantly promoted tumor regression compared to Ad5mTR, and in fact almost complete tumor regression was observed (FIG. 6B).
  • control adenovirus (Ad5EF1 ⁇ .sPD1) containing sPD1-Ig alone does not exhibit any anti-tumor effect in these models, which indicates that sPD1-Ig expression in tumor tissues is insufficient to induce tumor regression and that of sPD1-Ig This means that antigenic response by HSVtk is required in vivo for the effect.
  • HSVtk promotes antigen-specific CD8 T cell responses by DCs (FIG. 3B) and sPD1-Ig promotes anti-tumor CD8 T cell reactivity extracellularly (FIG. 4D).
  • Cancer specific T cells increased in the blood of mice administered Ad5mTR.sPD1, which increased the likelihood of inhibiting secondary tumor growth in the distal portion of the mouse by injection of the virus at the primary tumor site.
  • CT26 tumors developed in BALB / c mice were administered three times with Ad5mTR.sPD1 at three-day intervals. Fourteen days after the initial administration, the development of secondary CT26 tumors was attempted in the opposite site of the same mouse. At this time, primary tumors were minimally proliferated in mice administered Ad5mTR.sPD1, whereas primary tumors of large size (> 600 mm 3 ) developed in mice administered Ad5MOCK. Thus, a new population of normal BALB / c mice was used as a control for secondary tumor development.

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Abstract

본 발명은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의해 암 세포에 대한 선택성을 나타낼 뿐만 아니라, 암치료 유전자에 의한 상승된 항암활성을 나타내므로, 암의 효과적인 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
본 발명은 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 국내 사망 원인의 1위를 차지하는 중대 질환으로 암을 정복하기 위한 수많은 연구가 있어 왔지만 아직까지 정복되지 않고 있는 난치병이다. 암에 대한 기존의 치료법으로는 수술, 화학 요법 및 방사선 치료 등이 있으나, 각각의 방법에 한계가 많아 최근에는 이러한 치료법들과는 개념이 다른 치료법들이 연구되고 있는데 그중에서 특히 유전자 치료법이 활발히 연구되고 있다.
유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.
암에 대한 유전자 치료는 인체 내의 면역반응을 유도하는 면역학적 유전자 치료법과, 사용된 유전자가 직접 암세포를 파괴하거나 사멸을 유도하는 유전자 치료법으로 구분될 수 있다. 후자의 경우에는 유전자를 세포 내로 운반하고 발현시키는 벡터의 역할이 매우 중요한데 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달의 높은 효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성으로 인해 가장 유망한 유전자 치료용 벡터 중의 하나로 인정받고 있다.
일반적으로 사용되는 유전자 치료용 아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 일련의 유전자들을 삭제시키고, 프로모터 활성의 수준이 높은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터를 넣어 치료 목적 단백질을 생체 내에 높은 효율로 발현시킨다.
최근에는, 유전자 치료에 활용될 수 있는 표적 유전자들의 다수가 세포분열을 많이 하는 일반 세포에도 발현함으로 인해서 발생하는 부작용을 줄이기 위한 노력으로 암세포 특이적인 치료(cancer tissue targeted therapy)가 시도되고 있다(Fukuzawa et al., Cancer Res 64: 363-369, 2004). 이를 위해 CMV나 RSV 대신 조직 특이적(tissue-specific) 프로모터를 쓰는 방법이 고려되고 있으나, 특이성이 높아지는 대신 치료 효능이 떨어지는 단점으로 인해 실용화에 이르지 못하고 있는 실정이다.
상기와 같은 단점을 해결하기 위해 최근에는 조직 특이적 프로모터 이외의 인자를 이용하여 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스를 개발하려는 연구가 진행되고 있는데, 대표적인 예로서, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 등을 사용하는 방법이 개발되고 있다.
상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 이용한 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스의 개발에 관한 연구는 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 라이보자임이 실험관 내에서뿐만 아니라 박테리아 나아가 인체 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 수행함으로써 별도로 존재하는 두개의 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 밝혀지면 주목받게 되었다.
구체적으로, 이러한 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 질환과 관련된 유전자 전사체 또는 질병 세포에서만 특이적으로 발현되는 특정 RNA를 표적으로 하여, 이들을 정상적인 RNA로 보정하거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환되도록 재 프로그램을 유발할 수 있어, 질환 특이적이며 안전한 유전자 치료 기술이 될 수 있을 것이라 예상되고 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 질환 특이 RNA를 제거함과 동시에 우리가 원하는 치료용 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있으므로 치료 효과를 배가시킬 수 있다.
특히, 최근 연구에 있어 암 조직에서 특이적으로 작용할 수 있는 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase)를 타겟하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 알려지면서, 이를 이용한 암치료제를 개발하려는 시도가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 뚜렷한 결과는 알려져 있지 않다.
유전자 치료 방법에 있어 사용되어지는 치료용 유전자로는 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제(이하, HSVtk로 약칭함), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(CD) 및 대장균의 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(이하, PNP로 약칭함) 유전자 등이 알려져 있다. 이들을 이용한 유전자 치료는 유전자 지향성 효소 프로드럭 치료(gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT)라 불리우며, 모두 프로드럭을 사용하는 공통점이 있다. GDEPT에 사용되는 프로드럭으로는 간사이클로비르(GCV), 5-플루오로우라실(5-FU) 및 6-메틸퓨린-2-데옥시리보사이드(6-MeP-dR)가 각각 HSV-TK, CD 및 PNP와 같이 사용되고 있다. 세포 독성이 없는 프로드럭은 도입된 유전자들에 의해 세포에 독성이 있는 약물로 변환되는데 주로 인산화에 의해 활성이 생긴다. 자살 유전자를 이용한 유전자 요법의 장점은 이들 유전자가 도입된 세포에서 활성화된 약물에 의해 인접한 세포도 사멸시키는 소위 방관자 효과가 크다는데 있는데, 이는 유전자의 도입 효율이 낮은 상태에서 취할 수 있는 최선의 전략으로 일컬어지는 기술이다.
이러한, 유전자 치료 전략에 있어 HSVtk를 이용하는 것은 상당히 보편화되어 있다. 구체적으로, HSVtk/GCV 시스템은 자살 유전자 요법 중에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나로 WO 90/07936, US 5,837,510, US 5,861,290, WO 98/04290, WO 97/37542 및 US 5,631,236 등에 개시되어 있다. HSVtk 유전자를 발현하는 세포는 간사이클로비르(GCV)를 인산화할 수 있고, 그 결과 DNA를 복제하는 작용을 방해하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이 방법은 현재 다양한 인간 암의 유전자 치료시 30가지 이상의 임상 시험에 사용되고 있다. 그러나, 이 또한 증식되는 세포만이 사멸할 수 있고 방관자 효과가 탁월한 편이 아니며, 다량 사용시 세포 독성 문제도 야기할 수 있다는 문제점을 갖고 있으므로, 현재는 세포 사멸 효과와 방관자 효과를 향상시키기 위해 두 가지 이상의 프로드럭을 사용하여 암을 정복하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, PD-1(programmed death-1)은 55kDa의 제I형 경막 단백질로서, Ig 상관 유전자의 일부를 이루고 있으며, 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려져 있다. 즉, PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에 발현되는 수용체의 CD28 군(예를 들어, CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA 포함)에 속하는 억제 인자의 일원이다. PD-1에 대한 리간드로는 PD-L1 및 PD-L2가 있으며, 이들은 PD-1과 결합할 때 T 세포의 활성화를 하향 조절하는 것으로 알려져 있다. PD-1은 일반적인 T 세포에서는 정상 상태일 때 발현되지 않다가 상기 세포가 활성화되면 발현이 증가한다고 알려져 있다. 또한, PD-L1은 다수의 인간 암에서 다량 발견되며, PD-1과 PD-L1의 상호작용은 T 세포에 자극 또는 억제 신호를 전달한다. 즉, PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인하여 종양 침습성 림프구가 줄어들고, T 세포 수용체 매개 증식이 감소하며, 암 세포에 의한 면역 회피 현상이 발생하게 된다. 따라서, 최근 연구에 있어 PD-1 또는 PD-L1의 신호 전달을 차단함으로써 항암 면역반응을 효과적으로 유도하여 암을 치료하려는 연구가 진행 중에 있다.
본 발명자들은 조직 특이성과 치료 효능이 동시에 향상된 암 치료 유전자 치료 방안을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 암 조직 특이적 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk(Human Simplex Virus thymidine kinase) 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암 치료 유전자인 sPD-1 유전자를 포함하도록 디자인한 재조합 아데노바이러스가 암 조직에 특이적인 우수한 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 유전자 치료에 따른 부작용을 현저히 줄일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의해 암 세포에 대한 선택성을 나타낼 뿐만 아니라, 암치료 유전자에 의한 상승된 항암활성을 나타내므로, 암의 효과적인 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 마우스 TERT를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자임(mTERT-TR)-HSVtk를 나타내는 개략도이다. 마우스 TERT(mTERT) 전사물의 표적부위는 스플라이싱 부위 주변의 서열로 표시하였다. 트랜스-스플라이싱 리보자임은 안티센스 mTERT RNA 서열을 이용하여 mTERT RNA를 특이적으로 인식하고, IGS(internal-guided-sequence)의 3' 말단에서 mTERT RNA를 절단한다. 트랜스-스플라이싱 리보자임의 HSVtk 코딩 RNA 부분의 5' 말단은 mTERT RNA의 절단된 말단에 연결된다. mTERT 표적 mRNA 및 리보자임 사이의 가능성있는 염기결합은 세로선으로 표시하였다.
도 2는 마우스 TERT-TR에 의한 아데노바이러스 HSVtk 유전자 발현의 조절효과를 나타낸다. (a) E1/E3-결핍성 아데노바이러스인 Ad5mTR가 마우스의 TERT-TR 조절하에서 HSVtk를 발현시킨 결과를 나타낸다. Ad5MOCK은 E1/E3-결핍성 아데노바이러스의 대조군이다. (b) CT26 세포(3 × 103)를 96-웰 플레이트에 접종한 다음, 100 μM GCV의 존재하에서 다양한 MOI의 Ad5MOCK 또는 Ad5mTR에 노출시킨 결과를 나타낸다. 세포증식 분석키트를 사용하여 감염 3일에 세포독성을 측정한 결과를 나타낸다. 자료는 3회 분석실험에 대한 평균±표준편차값으로 표시하였다. (c) 5 × 108 PFU의 Ad5MOCK 또는 Ad5mTR를 주사하고 GCV(75 mg/kg)를 하루에 두번씩 복강주사한 BALB/c 마우스의 양 측면에 CT26 세포(1 × 106)를 피하 접종시킨 결과를 나타낸다. 자료는 평균±SEM(n=5)으로 표시하였다.
도 3은 HSVtk에 의해 유도된 향상된 DC-매개성 항원제시효과를 나타낸다. (a) C57/BL6 마우스의 E.G7 종양에 Ad5MOCK 또는 Ad5mTR를 주사하였다. 4일 후에 종양을 수거하고, H&E 염색에 의해 조직학적 분석을 수행하였다. (b) 아데노바이러스를 주사한지 2일 후, 항-CD11c 마이크로비드를 사용한 MACS 크로마토그래피에 의해 E.G7 종양 주변의 흡수성 림프노드로부터 DCs(5 × 104)를 수거한 다음, OT-1 형질전환 마우스로부터 OVA 특이적 CD8 T 세포와 공동배양하였다. 72시간 후, 배양상등액을 수거하고 IFN-γ의 양을 측정하였다. DC-Ad5MOCK은 Ad5MOCK가 주사된 마우스로부터 수득한 DCs를 나타내고, CD-Ad5mTR는 Ad5mTR가 주사된 마우스로부터 수득한 DCs를 나타낸다. 자료는 평균±표준편차값으로 표시하였다.
도 4는 mTERT-TR-조절성 HSVtk 및 sPD1-Ig를 발현시키는 이중-모듈 아데노바이러스의 제조방법을 나타낸다. (a) Ad5mTR.sPD1는 E1 영역의 CMV 프로모터의 조절하에서 mTERT-TR-HSVtk를 코딩하고, E3 영역의 EF1α 프로모터의 조절하에서 sPD1-Ig를 코딩한다. (b) HEK293 세포(4 × 105)에 48시간 동안 2MOI의 아데노바이러스를 감염시키고, RIPA 완충액을 사용하여 파쇄한 다음, 면역블럿 분석을 수행하였다. Ad5mTR.sPD1(레인당 단백질 80㎍)에 의한 sPD1-Ig 발현은 항-PD1 항체를 사용하여 확인하였다. (c) 인산화 GCV에서 HSVtk 효소활성은 방사성 동위원소 표지된 PCV(1μCi/ml)의 축적량을 측정함에 의해 CT26 세포에서 평가하였다. 자료는 3회 분석실험에 대한 평균±표준편차값으로 표시하였다. (d) 10MOI의 아데노바이러스로 감염된 세포에서 수거된 배양상층액에 OT-1 마우스에서 정제된 OVA-특이적 CD8 T 세포(1 × 106)와 MC38/OVA 세포(1 × 104)의 공동배양물을 혼합하였다. 72시간 후에, 배양상층액을 수거하고, IFN-γ 수준을 측정하였다. 자료는 평균±표준편차값으로 표시하였다.
도 5는 마우스의 CT26 대장암 세포의 표면에서 PD-L1이 발현됨을 나타낸다. a. 총 RNA는 각 세포에서 제조되고, PD-L1 전사체는 RT-PCR에 의해 검출되었다. 마우스의 간암세포(Hepa-1)를 비교군으로 사용하여 분석하였다. b. 유세포분석에 의해 각 세포의 표면에서 PD-L1 단백질을 분석하였다.
도 6은 Ad5mTR.sPD1의 생체외 및 생체내 항-종양 활성을 나타낸다. (a) 100μM GCV와 함께, 다양한 MOI의 Ad5MOCK, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1로 CT26 세포를 감염시켰다. 3일 후, 세포독성을 도 1d의 방법으로 측정하였다. 자료는 3회 분석실험에 대한 평균±표준편차값으로 표시하였다. (b) BALB/c 마우스의 양 옆에 CT26 세포(1 × 106)를 피하접종하였다. 상기 종양에 5 × 108 PFU의 Ad5MOCK, Ad5EF1α.sPD1, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1를 처리하였다. GCV(75 mg/kg)를 하루에 두번식 복강주사하였다. 종양부피는 지정된 시간에 측정하고 표시하였다. 자료는 평균±SEM(n=10)으로 표시하였다.
도 7은 sPD1-Ig에 의한 종양성장 억제가 CD8 T 세포에 의해 매개됨을 나타낸다. (a) BALB/c 마우스의 피하 CT26 종양에 Ad5MOCK, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1(좌측패널)을 주사하였다. sPD1-Ig의 항-종양 활성에서 CD8 T 세포의 관련성을 결정하기 위하여, C57/BL6 마우스의 피하 CT26 종양에 Ad5MOCK, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1(우측패널)을 주사하였다. 바이러스를 처리하기 2일전 및 처리후 5일마다 마우스에 2.43α 항-CD8 항체(500㎍)를 정맥주사하여 CD8 T 세포를 고갈시켰다(우측패널). 화살표는 항체를 주사한 시간을 나타낸다. 종양부피는 지정된 시간에 측정하고 표시하였다. (b) 2.43α 항-CD8 항체의 존재 또는 부재시에 종양 성장의 억제를 12일경 Ad5MOCK에 대한 상대값으로 산출하였다. 자료는 평균±SEM으로 표시하였다.
도 8은 T 및 B 세포결핍 Rag1-/- 마우스에서 sPD1-Ig에 의한 종양증식의 억제효과를 나타낸다. (a) C57/BL6에 피하주사된 E.G7 종양에 Ad5MOCK, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1(좌측패널)을 주사하였다. sPD1-Ig의 항-종양 활성에서 임파구의 관련성을 측정하기 위하여, Rag1-/- 마우스에 피하주사된 E.G7 종양에 Ad5MOCK, Ad5mTR, 또는 Ad5mTR.sPD1(우측 패널)을 주사하였다. 종양 성장은 지정된 시간에 산출하고 표시하였다. (b) Rag1-/- 마우스 또는 야생형 마우스에서 종양성장의 조절은 12일째의 Ad5MOCK 값에 대하여 상대적으로 산출하였다. (c) Rag1-/- 마우스의 E.G7 종양(1 × 106 세포)를 5 × 10^8 PFU의 Ad5MOCK, Ad5mTR 또는 Ad5mTR.sPD1로 7일간격으로 두번 주사하였다. OT-1 마우스의 CD8 T 세포(5 × 104)를 최초 아데노바이러스 주사와 동시에 정색주사하였다. 종양성장은 지정된 시간에 산출하고 표시하였다. 자료는 평균±SEM(n=6)으로 표시하였다. (d) 면역세포의 생체외 분석을 수행하기 위하여, Rag1-/- 마우스의 E.G7 종양을 OT-1 마우스 유래 CD8 T 세포 및 적절한 아데노바이러스와 공동배양하였다. 최초의 아데노바이러스 주사후 8일경에, PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)를 마우스 안구정맥으로부터 수거하였다. 유세포분석을 통해 전체 생존세포로부터 OT-1 CD8 T 세포의 수를 산출하고, TCR Vα2+, Vβ5+, T 세포(OT-1 세포)의 비율을 산출하였다.
도 9는 Ad5mTR.sPD1 처리에 의한 2차 종양의 억제효과를 나타낸다. (a) CT26 종양을 BALB/c 마우스에 피하이식하고, 3일 간격으로 3회 5 × 108 PFU의 Ad5mTR.sPD1를 주사하였다. 최초 처리하고 2주후, 반대편에 1 × 106개의 종양세포를 도입하였다. 최초 바이러스 주사하고 1일 후에 GCV(75 mg/kg)를 복강주사하기 시작하였으며, 12일 동안 주사하였다. 종양 크기는 3일마다 측정하였다. (b) E.G7 종양을 C57/BL6 마우스에 피하이식하고 상술한 (a)와 동일한 방법을 수행하였다. (c) 2차 종양이 접종되고 7일 후, Ad5mTR.sPD1로 사전 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스에서 접종된 부위의 종양크기를 측정하였다. 자료는 평균±표준편차값으로 표시하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 암 특이 유전자인 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA(서열번호 1)에 작용하는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk(Human Simplex Virus thymidine kinase) 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
본 발명의 용어 "암 특이 유전자"란, 암세포에서만 특이적으로 발현되거나 또는 현저하게 과발현되는 유전자를 의미한다. 상기 암 특이 유전자는 본 발명에 따른 라이보자임이 암특이적으로 작용할 수 있는 특징을 부가할 수 있다. 이러한 암 특이 유전자로는, TERT(Telomerase reverse transcriptase)의 mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, 또는 CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "TERT(Telomerase reverse transcriptase)"란, 암 세포의 영속성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로서, 염색체에 말단소립 구조를 형성해 염색체 끝을 보호하는 역할을 통해 세포의 노화를 억제하는 효소를 의미한다. 정상적인 세포에서는 세포가 분열할 때마다 말단소립의 길이가 조금씩 줄어들어 결국 유전물질이 손실되고, 세포가 사멸하게 되는 기작을 갖는다. 그러나, 암세포에서는 이 효소가 말단소립을 계속적으로 연장시켜 주기 때문에 세포가 사멸하지 않으며, 암세포의 불멸성에 직접 기여함으로써 암을 치료하는데 중대한 장애 요소로 알려져 있다. 이러한, 텔로머라제(telomerase)는 무한히 복제되는 생식세포, 조혈세포 및 암세포에서 80 내지 90%의 텔로머라제 활성을 갖고 있지만, 암세포 주변의 정상세포들은 그 활성을 갖지 않는 특징을 갖는다. 본 발명의 목적상 상기 TERT는 본 발명에서 제공하는 암치료 유전자의 직접적인 표적으로서 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "라이보자임"이란, 트랜스-스플라이싱 활성 및 셀프-스플라이싱 활성을 나타내는 효소활성이 있는 RNA분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 라이보자임은 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 결과적으로는 선택적인 항암효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암치료 유전자를 활성화시키는 역할을 수행하기 위한 수단으로서 사용할 수 있으므로, 암 특이 유전자를 불활성화시키고, 암치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 활성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다. 바람직하게는 암에 특이적인 TERT(Telomerase reverse transcriptase)의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 그룹 I 라이보자임인 Rib67 라이보자임 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 라이보자임이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)"란, 단순 포진 바이러스으로부터 유래되는 티미딘 인산화 효소를 의미한다. 이 효소는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키므로서, 그 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 하는 약제감수성 유전자의 대표적인 하나이다. 본 발명의 목적상 상기 HSVtk 유전자는 라이보자임에 접합된 형태로 발현되어 항암활성을 나타내는 암치료 유전자로 사용될 수 있다. 이러한 HSVtk 유전자는 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 진뱅크(genbank) 등록번호 AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107, AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747 등에 기재된 것이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "암치료 유전자(anti-cancer therapeutic gene)"란, 암 세포 내에서 발현시에 치료학적 효과를 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 암치료 유전자는 상기 라이보자임과 접합된 형태로 발현되거나 또는 독립적으로 발현되어, 항암활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 암치료 유전자로는, 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자, 항신생 혈관 생성 유전자 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않을 뿐만 아니라, 본 발명에서는 상기 암치료 유전자를 단독적으로 사용하거나 또는 둘 이상 복합적으로 사용할 수도 있다.
본 발명의 용어 "약제감수성 유전자(drug-sensitizinggene)"란, 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자를 의미하는데, 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)라고도 한다. 즉, 정상세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법에 사용되는 유전자이다. 본 발명의 목적상 상기 약제감수성 유전자로는 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(cytosine deaminase, CD) 유전자, 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "세포사멸 유전자(proapoptotic gene)"란, 발현되어 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 세포사멸 유전자로는, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자, 카스파제를 코딩하는 유전자 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)"란, 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 세포증식 억제 유전자로는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "세포독성 유전자(cytotoxic gene)"란, 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 세포독성 유전자로는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)"란, 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 종양 억제인자 유전자로는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, VHL 유전자, sPD-1(soluble programmed death-1) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "sPD-1(soluble programmed death-1)"란, 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려진 55kDa의 제I형 경막 단백질인 PD-1(programmed death-1)의 세포외 도메인을 의미한다. 일반적으로 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인하여 종양 침습성 림프구가 줄어들고, T 세포 수용체 매개 증식이 감소하며, 암 세포에 의한 면역 회피 현상이 발생하게 되지만, 최근의 연구에 있어 PD-1의 유리된 양태인 sPD-1이 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인한 면역 회비 현상을 억제하여 항암 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있다는 것이 보고되었다. 따라서, 본 발명의 목정상 상기 sPD-1 유전자는 본 발명에 따른 라이보자임의 트랜스-스플라이싱 활성에 의해 암 특이 유전자에 접합되어 암 세포에 치료유전자로 사용될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "항원성 유전자(antigenic gene)"란, 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원성 유전자로는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA), p53 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "사이토카인 유전자(cytokine gene)"란, 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 사이토카인 유전자로는 GM-CSF, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2b), 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)"란, 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항신생혈관 생성 유전자로는 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "아데노바이러스"란, 아데노바이러스 벡터와 동일한 의미가 있고, 아데노비리디아에 속에 속하는 바이러스를 의미한다. 상기 아데노비리디아에는 마스트아데노바이러스 속의 동물성 아데노바이러스를 모두 포함한다. 특히, 인간의 아데노 바이러스로는 A-F 아속(subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형(Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형, 제91형 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 재조합 아데노바이러스는 암 특이 유전자인 TERT에 작용하는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하여, TERT가 발현되는 암세포에 투여될 경우 TERT로 인하여 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체로부터 HSVtk가 해리되고 해리된 HSVtk는 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라 암 치료 유전자에 의하여 면역세포에 대한 공격을 유도할 수 있으므로, 암 치료제로서의 역할을 수행한다. 이에 반하여, TERT가 발현되지 않는 정상세포에 투여될 경우에는 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk 복합체로부터 HSVtk가 해리되지 않아 세포독성을 나타내지 않으므로, 본 발명의 상기 재조합 아데노바이러스는 암세포에 대한 우수한 선택성을 나타내므로, 보다 안전한 암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "암"이란, 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로는 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시킨 상태의 세포 또는 조직을 의미하는데, 이러한 예로 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
아울러, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 강황 또는 울금 추출물, 이로부터 분리된 리나로올 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학 조성물은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin), 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이 될 수 있으나, 이 또한 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 인간의 TERT(hTERT)를 인식하고 절단하는 리보자임이 HSVtk mRNA와 연결되고, hTERT mRNA의 3'말단에서 절단되도록 설계된 트랜스-스플라이싱 리보자임을 설계하고(도 1), 마우스에서 상기 트랜스-스플라이싱 리보자임의 효과를 확인할 수 있도록 마우스의 TERT mRNA(mTERT-TR)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자밍을 사용한 유사한 시스템을 고안하고, 이를 E1/E3-결핍 아데노바이러스 게놈에 삽입하여 mTERT-TR-조절성 HSVtk(mTERT-TR-HSVtk)를 포함하는 아데노바이러스(Ad5mTR)를 제작하였으며(도 2a), 이를 BALB/c 마우스에서 유래된 대장암 세포주인 CT26 세포주에 감염시킨 결과, 2.5MOI로 감염시켰을때, 대부분의 세포를 사멸시킬 수 있었고(도 2b). 체외환경에서의 세포독성과 유사하게, BALB/c 마우스에서 피하 CT26 종양에 Ad5mTR를 주사할 경우 종양의 성장이 유의하게 억제됨을 확인하였다(도 2c). 또한, 본 발명자들은 동계의 B6 마우스에 피하주사된 E.G7 종양에서 세포사멸을 유도하는 Ad5mTR의 능력을 시험한 결과, 바이러스 감염후에 종양 항원이 방출됨을 확인하고(도 3a), Ad5mTR로 처리된 마우스로부터 유래된 DCs가 OVA 항원을 충분한 수준으로 제공하여 OVA 특이적 T 세포를 자극할 수 있음을 확인하였다(도 3b).
한편, 본 발명자들은 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에서 mTERT-TR에 의해 조절되는 HSVtk와 E3 영역에 있는 sPD1-Ig를 포함하는 이중-모듈 아데노바이러스(Ad5mTR.sPD1)를 제작하고(도 4a), 이의 활성을 시험한 결과, 종양 세포 공격에 반응하여 항원-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 분비는 sPD1-Ig를 포함하는 상층액에 의해 향상됨을 확인하고(도 4d), 종양세포 표면에서 PD-L1의 발현을 유세포분석에 의해 확인하였다(도 5). 또한, Ad5mTR.sPD1으로 감염된 CT26 세포는 Ad5mTR로 감염된 것과 유사한 수준의 생체외 세포독성을 나타내고(도 6a), Ad5mTR.sPD1는 Ad5mTR와 비교하여 유의적으로 종양 퇴행을 촉진시키며, 실제로 거의 완전한 종양 퇴행이 발생함을 확인하였다(도 6b). 본 발명에서 예상한 대로, HSVtk는 DCs에 의한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진시키고(도 3b), sPD1-Ig는 세포외에서 항-종양 CD8 T 세포 반응성을 촉진시킨다(도 4d).
이러한 이중-모듈 Ad5mTR.sPD1에 의한 향상된 종양성장 억제효과가 CD8 T 세포가 고갈된 마우스에서는 거의 손실되었고(도 7a), 항-종양 활성에 영향을 미치는 CD8의 고갈은 Ad5mTR 보다는 Ad5mTR.sPD1에 대하여 더욱 높은 효과를 나타내었으며(1.9-배 대 4.76-배)(도 7b), CT26 모델에서 Ad5mTR 보다는 Ad5mTR.sPD1에 대하여 더욱 강한 효과를 나타내었고(1.61-배 대 6.58-배)(도 8b), E.G7을 포함하는 Rag1-/- 마우스에 정맥주사된 OT-I T 세포에 의해 항원-특이적 T 세포 반응이 형성될 때, 아데노바이러스 투여의 상기 항-종양 효과가 회복되고, 상기 효과는 Ad5mTR를 투여한 후 보다는 Ad5mTR.sPD1를 투여할 때 더욱 뚜렷해졌으며(도 8c), 혈중 OT-I T 세포의 수는 Ad5mTR와 비교하여 Ad5mTR.sPD1를 투여하였을 때 더 크게 증가하였다(도 8d).
이러한 아데노바이러스의 효과를 생체내에서 확인한 결과, Ad5mTR.sPD1이 투여된 마우스에서는 1차 종양이 최소한으로 증식되고, 2차 종양이 성장하지 않았으며(도 9a 및 9c), 동일한 결과를 E.G7 종양모델을 포함하는 B6 마우스에서 확인하였다(도 9b 및 9c).
이러한 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 효과는 마우스를 대상으로 확인하였으나, 상기 아데노바이러스의 효과를 유발시키는 TERT는 마우스 뿐만 아니라 인간의 종양에서도 발현되므로, 본 발명에서 제공하는 재조합 아데노바이러스는 인간의 암치료를 위하여도 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 세포 및 마우스
모든 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 6주령 자성 BALB/c 및 C57/BL6 마우스를 SLC(Japan)에서 구입하였다. OT-1 마우스(B6 background) 및 Rag1-/- 마우스(B6 background)는 Jackson laboratory에서 입수하였다. 모든 동물실험은 국립암센터(National Cancer Center, Korea)의 실험동물 사용과 관리에 대한 관리규정(Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)에 의거하여 수행하였다.
실시예 1-2: 아데노바이러스 제작
CMV 프로모터의 조절하에서 마우스의 TERT-TR-HSVtk 유전자를 포함하는 Ad5mTR을 생성시키기 위하여 AdenoZAPTM과 AdenoQuickTM 시스템을 사용하였다. pAVQ-CMV-mTERT AS100 Rib(+67) TK에 SpeI/SacII을 처리하여 CMV.mTR.HSVtk를 포함하는 DNA 단편을 수득하고, 상기 단편을 pZAP1.1의 SpeI/EcoRV 절단부위에 삽입하여 pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk를 제작하였다. pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk을 PacI/DraIII로 절단하고, RightZAP1.2에 연결시킨 다음, HEK293 세포에 도입하였다. sPD1-Ig을 제작하기 위하여, PD-1의 세포외 도메인을 하기의 프라이머를 사용한 PCR 방법으로 증폭시켰다
정방향 프라이머: 5'-CCG CTC GAG CTC ACC ATG TGG GTC CGG CAG GTA CCC TGG-3'(서열번호 5)
역방향 프라이머: 5'-AGA TCT TCC TCC TCC TCC TTG AAA CCG GCC TTC TGG TTT GGG-3'(서열번호 6)
상기 증폭산물을 pFUSE-mIgG2A.Fc1 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)의 XhoI/BglII 좌위에 삽입시켜 pFUSE-mIgG2A.Fc1.EF1.sPD-1를 제작하였다. pFUSE-mIgG2A.Fc1.EF1.sPD1-Ig 유래 EF1.sPD1-Ig를 pE3.1 벡터(OD260)의 EcoRI/SwaI 좌위에 삽입시켜 pE3.1.EF1.sPD1-Ig를 제작하였다. pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk의 CMV.mTR.HSVtk 단편을 pE1.2 벡터(OD260)의 BamHI/SpeI 좌위에 삽입시켜 pE1.2.CMV.mTR.HSVtk를 제작하였다. Ad5mTR.sPD1를 제작하기 위하여, pE1.2.CMV.mTR.HSVtk와 pE3.1.EF1.sPD1-Ig를 제한효소인 DraIII/PflMI로 절단하고, AdenoQuick13.1에 연결시킨 다음, HEK293 세포에 도입하였다. Ad5EF1.sPD1를 제작하기 위하여, Ad5mTR.sPD1와 동일한 방식으로, pE3.1.EF1.sPD1-Ig와 pE1.2 빈 벡터를 제한효소인 DraIII/PflMI로 절단하고, AdenoQuick13.1에 연결시킨 다음, HEK293 세포에 도입하였다.
실시예 1-3: 세포외 환경에서 GCV 흡수 및 세포독성 분석
HSVtk 효소활성은 세포에서 인산화된 GCV의 축적량을 측정하여 결정하였다. 세포증식 분석(cell proliferation assay, Dojindo Laboratories, Rockville, MD)은 표준방법을 사용하여 아데노바이러스의 세포독성을 평가하는 방식으로 수행하였다. 요약하면, 세포(3 × 103)를 96-웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 상기 배양된 세포에 다양한 MOI(multiplicity of infection)의 아데노바이러스를 감염시켰다. 1일 후, GCV를 최종농도 200 μM이 되도록 첨가한 다음, 3일 동안 세포증식을 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하였다.
실시예 1-4: 항체 및 시약
Ad5CMV.mTR.sPD1로부터 sPD1-Ig 단백질 발현을 확인하기 위하여, HEK293 세포(4 × 105)에 2MOI의 아데노바이러스를 감염시켰다. 감염후 24시간이 경과한 시점에서, 배양상층액과 세포잔류물(80㎍)을 항-Pdcd-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 이용한 면역블럿 방법으로 분석하였다. CD8 T 세포를 고갈시키기 위하여, 500㎍의 2.43α 항-CD8 항체를 아데노바이러스를 감염시키기 2일 전에 복강주사하고, 그 후 15일 동안 5일마다 복강주사하였다.
실시예 1-5: IFN-γ 생산량을 분석하기 위한 CD8 T 세포/DC 공동배양 분석
흡수성 림프노드 유래 DCs(DLN-DCs)를 17.5% Nycodenze gradient를 사용하여 증폭시키고, 항-CD11c 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용한 MACS 컬럼에서 정제하였다. OT-1 마우스로부터 유래된 순수한 CD8 T 세포를 항-CD8 마이크로비드를 사용하여 분리하였다. 96-웰 플레이트에서 72시간동안 DLN-DCs(5 × 104)를 순수한 CD8 T 세포(1 × 105)와 함께 배양하였다. 72시간 후에 배양상층액을 수득하고, IFN-γ의 함량을 ELISA(eBioscience, San Diego, CA)로 측정하였다.
실시예 1-6: 세포외 환경 OT-1 T 세포 활성화 분석
안정적으로 오브알부민(OVA)을 발현시키는 마우스의 대장암 세포MC38, B6 background)인 MC38/OVA 세포를 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 24시간 동안 10MOI의 아데노바이러스로 감염시킨 HEK293의 배양상층액으로부터 sPD1-Ig를 수득한 다음, OT-1 CD8 T 임파구(1 × 106)가 부가된 MC38/OVA 세포(1 × 104)에 가하여 72시간 동안 배양하였다. OT-1 마우스 유래의 순수한 CD8+ T 임파구를 상술한 바와 같이 MACS 컬럼을 사용하여 분리하였다. CD8 T 임파구로부터 생산된 IFN-γ의 생성량은 마우스 IFN-γ CBA assay 키트(BD bioscience, San Jose, CA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 1-7: 생체내 동물연구 및 생체외 분석
6주령의 자성 BALB/c 마우스의 피하에 1 × 106개의 CT26 세포를 접종하였다. 종양이 감지될 때(7일 경과), 5 × 108PFU의 아데노바이러스를 종양내에 주사하고, GCV(75 mg/kg)를 14일 동안 하루 2회씩 정맥주사하였다. 아데노바이러스를 7일간격으로 2회 투여하였다. 종양부피는 다음의 공식을 이용하여 결정하였다.
길이 × 폭2 × 0.5236
피하 종양형성과 바이러스 주사를 위한 유사한 과정을 CD8 T 세포 고갈실험에서 수행하였다. E.G7 세포(C57/BL6 backgound; 1 × 106)를 Rag1-/- 마우스 또는 C57/BL6 마우스에 주사하고, 아데노바이러스와 GCV를 상술한 방법으로 처리하였다. 생체외 분석을 수행하기 위하여, Rag1-/- 마우스의 E.G7 종양에 OT-1 마우스로부터 분리된 CD8 T 세포의 정맥투입방법에 따라 Ad5mTR.sPD1를 처리하였다. 감염후 8일이 경과한 시점에서, PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)를 혈액으로부터 수득하고, 유세포분석을 수행하였다.
실시예 2: 결과
실시예 2-1: 마우스의 TERT-TR-HSVtk를 포함하는 아데노바이러스의 제작
본 발명자들은 공지된 종양 마커인 TERT를 사용하여 종양특이적 아데노바이러스를 이용한 신규한 HSVtk 발현전략을 개발하였다. 상기 전략에서, 인간의 TERT(hTERT)를 인식하고 절단하는 리보자임을 재조합 아데노바이러스를 이용하여 종양세포에 전달하였다. 추가로, 상기 리보자임은 HSVtk mRNA와 연결되고, hTERT mRNA의 3'말단에서 절단되도록 설계하였는데, 이는 종양세포에서 HSVtk mRNA의 신규한 해독을 유도하였다. 이러한 종류의 리보자임은 트랜스-스플라이싱 리보자임이라고 정의된다(도 1). 이론적으로, 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 조절되는 HSVtk 발현은 종양세포를 포함하는 hTERT mRNA를 높은 수준으로 발현시키는 세포에 제한된다. 따라서, 이러한 시스템은 hTERT가 낮은 수준으로 발현되는 주변의 정상조직의 세포에 영향을 미치지 않고 종양세포로 HSVtk를 전달하는 효과적인 방법으로 제안되었다. 실제로, 이러한 전략은 이종이식 마우스모델에 이식된 인간의 대장암 세포에 높은 효과를 나타내었다. 면역학적 분석시에 이러한 시스템의 하나의 문제점은 인간의 종양세포를 이용한 실험이 이종이식 거부반응이 억제된 면역결핍 마우스에서 수행되었다는 것이다. 따라서, 이러한 시스템은 항-종양 면역화에 대한 HSVtk의 효과를 평가하기에는 적합하지 않다. 이러한 제한점을 해결하고자, 본 발명자들은 마우스의 TERT mRNA(mTERT-TR)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 리보자밍을 사용한 유사한 시스템을 고안하고, 동계의 마우스 종양모델을 사용하여 TERT-TR-조절된 HSVtk의 면역학적 효과를 평가하였다. 상기 TERT 인식 서열은 HSVtk 코딩서열의 근처에 위치하여, HSVtk 발현은 mTERT 전사체의 존재에 의존적이다(도 1). CMV 프로모터에 의해 조절되는 이러한 전체적인 발현카세트는 E1/E3-결핍 아데노바이러스 게놈에 삽입되어 mTERT-TR-조절성 HSVtk(mTERT-TR-HSVtk)를 포함하는 아데노바이러스(Ad5mTR)를 제작하였다(도 2a).
또한, 대조군으로서 상기 발현카세트를 제외시킨 아데노바이러스(Ad5MOCK)를 제작하였다. Ad5mTR에 의한 HSVtk 발현이 마우스의 종양세포에 세포독성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 BALB/c 마우스에서 유래된 대장암 세포주인 CT26 세포를 사용하였는데, 상기 세포주는 mTERT mRNA를 높은 수준으로 발현시킨다. CT26 세포를 GCV의 존재하에서 다양한 MOI의 Ad5mTR에 노출시켰다. 2.5MOI가 대부분의 세포를 죽이기에 충분한 반면, Ad5MOCK는 50MOI에서도 세포독성을 전혀 나타내지 않았다(도 2b). 체외환경에서의 세포독성과 유사하게, BALB/c 마우스에서 피하 CT26 종양에 Ad5mTR를 주사할 경우 종양의 성장이 유의하게 억제되었다(도 2c).
따라서, Ad5mTR은 인간의 TERT-TR-HSVtk를 포함하는 아데노바이러스의 항-종양 효과와 유사한 효과를 나타내고, 이는 마우스에서 항-종양 면역성의 연구에 사용하기에 적합함을 알 수 있었다.
실시예 2-2: HSVtk에 의한 향상된 DC-매개성 종양 항원 제시
DNA 도입 또는 아데노바이러스 감염에 의한 종양세포에서의 HSVtk의 발현은 세포독성 CD8 T 세포의 항원반응을 증진시킨다고 알려져 있다. 생체GCV의 존재하에서 HSVtk의 발현은 내에서 종양 부피의 전부는 아니더라도 유의한 부분에서 세포사멸을 유도할 수 있기 때문에 사멸된 세포로부터 유도된 종양 항원은 DCs와 같은 APCs에 의해 검출될 수 있고, 이들 세포는 종양 항원특이적 T 세포에 반응하는 림프노드로 이동한다. 비록 이러한 모델이 문헌에서 제시되었으나, 본 발명자들은 정의된 항원특이적 T 세포를 사용하여 이러한 가능성을 시험하기로 결정하였다. 이러한 실험을 위해, 본 발명자들은 모델 종양 항원으로서 마우스의 종양세포주 E.G7(오브알부민을 안정적으로 발현하는 EL4 세포의 유도체)를 사용하였고, T 세포를 모델 종양-항원(OVA)-특이적 CD8 T 세포 군집으로서 사용된 OVA 특이적 T 세포 수용체 형질전환 마우스로부터 정제하였다. OT-1 마우스로부터 정제된 모든 CD8 T 세포는 OVA 특이적 세포독성 T 세포이다. 우선, 본 발명자들은 동계의 B6 마우스에 피하주사된 E.G7 종양에서 세포사멸을 유도하는 Ad5mTR의 능력을 시험하였다. 종양을 분리하고, Ad5mTR의 투여후에 조직학적으로 평가할 때, 유의수준의 세포사멸이 관찰되었고, 이는 바이러스 감염후에 종양 항원이 방출됨을 의미한다(도 3a). 다음으로, 본 발명자들은 종양-흡수 림프노드로부터 DCs를 정제하고, DC/CD8 T 세포 공동배양 분석을 이용하여 IFN-γ 생성을 위해 OVA가 로드된 것인지의 여부를 평가하였다. Ad5mTR로 처리된 종양함유 마우스로부터 유래된 DCs를 사용하여 배양 및 정제된 OT-I T 세포는 대조군 바이러스로 처리된 종양함유 마우스로부터 유래된 DCs를 사용하여 배양된 OT-I T 세포보다도 다량으로 IFN-γ를 생산하였다. 이러한 결과는 Ad5mTR로 처리된 마우스로부터 유래된 DCs가 OVA 항원을 충분한 수준으로 제공하여 OVA 특이적 T 세포를 자극할 수 있음을 나타낸다(도 3b). 따라서, 종양에서 HSVtk 발현과 이에 따른 GCV 유도성 세포사멸은 종양 항원의 방출결과이고, 이들 항원은 종양 항원특이적 세포독성 T 세포를 자극할 수 있는 DCs에 의해 효율적으로 포획되었다.
이로부터, HSVtk의 종양특이적 발현은 DCs를 통해 항-종양 T 세포 활성을 효과적으로 자극할 수 있을 뿐만 아니라 종양세포의 세포독성을 직접적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-3: mTERT-TR-HSVtk 및 sPD1-Ig를 모두 포함하는 아데노바이러스의 제작
Ad5mTR은 흥미로운 가능성이 증가하는 항-종양 CD8 T 세포 반응성을 자극하였다. 종양-유도된 면역 저항성을 불활성화시키기 위한 또 다른 전략을 가지는 이들 제안의 조합은 항-종양 T 세포 반응성을 추가로 향상시켰다. PD-L1은 종양세포의 표면에서 발현되는 공지된 면역 억제제이다. 본 발명자들은 PD-L1을 중화시키는 상기 PD-L1 수용체의 수용성 형태인 sPD1을 제작하고, PD-L1 매개성 T 세포 억제를 제거하였다. 생체내에서 sPD1의 안정성을 증가시키기 위하여, sPD1을 IgG2a의 Fc 영역과 융합시켜서 sPD1-Ig을 제작하였다. 본 발명자들은 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에서 mTERT-TR에 의해 조절되는 HSVtk와 E3 영역에 있는 sPD1-Ig를 포함하는 이중-모듈 아데노바이러스(Ad5mTR.sPD1)를 제작하였다(도 4a). 상기 Ad5mTR.sPD1으로 HEK293 세포를 감염시키고 세포외 환경에서 sPD1-Ig를 발현시키고 분비시켰으며, 면역블럿 분석법으로 확인하였다(도 4b). Ad5mTR.sPD1 감염세포에서 HSVtk의 발현수준은 효소활성에 의해 측정된 방식으로 Ad5mTR 감염세포의 것과 비교하였다(도 4c). 또한, 본 발명자들은 생체외 환경에서 분비된 sPD1-Ig가 종양세포 표면의 PD-L1을 중화시킴으로써 항-종양 T 세포 반응성을 향상시킬 수 있는지의 여부를 시험하였다. Ad5EF1α.sPD1 감염된 293HEK 세포의 배양상층액에 OVA를 발현하는 종양세포와 OVA 특이적 OT-I T 세포의 공동배양물을 가하고, T 세포 반응성을 IFN-γ 분비량에 의거하여 측정하였다. 기대된 바와 같이, 종양 세포 공격에 반응하여 항원-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 분비는 sPD1-Ig를 포함하는 상층액에 의해 향상되었다(도 4d). 종양세포 표면에서 PD-L1의 발현은 유세포분석에 의해 확인되었다(도 5). 이들 결과는 상기 이중-모듈 아데노바이러스가 생체내의 종양미세환경에서 항-종양 T 세포의 반응성을 향상시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 2-4: Ad5mTR.sPD1에 의한 종양성장의 효과적인 억제
sPD1-Ig이 생체내에서 HSVtk의 항-종양 활성을 증진시킬 수 있는지를 확인하고자, CT26 대장암 모델을 사용하였다(도 2c). CT26 세포는 그들의 세포표면에 PD-L1을 높은 수준으로 발현시키기 때문에 상기 모델을 선택하였다(도 5). Ad5mTR.sPD1로 감염된 CT26 세포는 Ad5mTR로 감염된 것과 유사한 수준의 생체외 세포독성을 나타내고, 이는 sPD1-Ig이 HSVtk에 의한 세포독성의 직접적인 원인이 되지 않을 것으로 예상하였다(도 6a). 이에 비하여, Ad5mTR.sPD1는 Ad5mTR와 비교하여 유의적으로 종양 퇴행을 촉진시키며, 실제로 거의 완전한 종양 퇴행이 관찰되었다(도 6b). sPD1-Ig를 단독으로 포함하는 대조군 아데노바이러스(Ad5EF1α.sPD1)는 이들 모델에서 어떠한 항-종양 효과도 나타내지 않는데, 이는 종양조직에서 sPD1-Ig 발현이 종양퇴행을 유도하는데 불충분하고 이러한 sPD1-Ig의 효과를 위해 생체내에서 HSVtk에 의한 항원반응이 필요하다는 것을 의미한다.
실시예 2-5: sPD1-Ig의 종양성장 억제효과는 CD8 T 세포에 의해 매개된다
HSVtk는 DCs에 의한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 촉진시키고(도 3b), sPD1-Ig는 세포외에서 항-종양 CD8 T 세포 반응성을 촉진시킨다(도 4d). 이러한 결과는 생체내에서 향상된 CD8 T 세포 반응성이 Ad5mTR.sPD1의 향상된 항-종양 효과의 원인임을 제시하였다. 이들 가능성을 확인하기 위항여, CT26 종양보유 마우스에 항-CD8 항체를 투여하여 CD8 T 세포를 고갈시켰다. 이중-모듈 Ad5mTR.sPD1에 의한 향상된 종양성장 억제효과가 CD8 T 세포가 고갈된 마우스에서는 거의 손실되었다(도 7a). 흥미롭게도, Ad5mTR의 항-종양 활성 역시 감소되었는데, 이는 CT26 마우스 종양모델에서 Ad5mTR의 효과가 CD8 T 세포에 의해 매개된 항-종양 면역반응 의존적이라는 점을 제시한다. 그러나, 항-종양 활성에 영향을 미치는 CD8의 고갈은 Ad5mTR 보다는 Ad5mTR.sPD1에 대하여 더욱 높은 효과를 나타내었다(1.9-배 대 4.76-배)(도 7b). 종양-특이적 CD8 T 세포의 역할을 보다 직접적으로 평가하기 위하여, E.G7 종양모델과 OVA-특이적 OT-I T 세포를 사용하였다. Ad5mTR.sPD1이 투여된 동계의 B6 마우스로의 E.G7 종양의 피하주사는 CT26 모델에서 관찰된 것과 유사하게 향상된 종양 퇴행결과를 나타내었다. 이에 비하여, 동일한 실험이 동계의 임파구-결핍 Rag1-/- 마우스에서 수행될 경우에는, 두가지 바이러스의 항-종양 효과가 현저하게 감소되었다(도 8a). CT26 모델에서 CD8 T 세포 고갈의 효과와 일치하게 감소의 정도는 Ad5mTR 보다는 Ad5mTR.sPD1에 대하여 더욱 강한 효과를 나타내었다(1.61-배 대 6.58-배)(도 8b). E.G7을 포함하는 Rag1-/- 마우스에 정맥주사된 OT-I T 세포에 의해 항원-특이적 T 세포 반응이 형성될 때, 아데노바이러스 투여의 상기 항-종양 효과가 회복되고, 상기 효과는 Ad5mTR를 투여한 후 보다는 Ad5mTR.sPD1를 투여할 때 더욱 뚜렷해졌다(도 8c). 특히, 혈중 OT-I T 세포의 수는 Ad5mTR와 비교하여 Ad5mTR.sPD1를 투여하였을 때 더 크게 증가하였다(도 8d). 이러한 결과는 Ad5mTR.sPD1이 종양특이적 CD8 T 세포의 기능을 직접적으로 향상시킴에 의해 종양 퇴행을 촉진시킨다는 점을 제공한다.
실시예 2-6: Ad5mTR.sPD1 처리의 항암효과
1차 종양 부위에 바이러스의 주사에 의해 마우스의 원위부에서 2차 종양의 성장을 억제할 가능성이 증가된 Ad5mTR.sPD1가 투여된 마우스의 혈액내에서 암 특이적 T 세포가 증가하였다. BALB/c 마우스에서 발생된 CT26 종양에 Ad5mTR.sPD1을 3일 간격으로 3회 투여하였다. 최초 투여일로부터 14일후에, 동일 마우스의 반대편 부위에서 2차 CT26 종양의 발생이 시도되었다. 이때, Ad5mTR.sPD1이 투여된 마우스에서는 1차 종양이 최소한으로 증식된 반면, Ad5MOCK이 투여된 마우스에서는 큰 크기(> 600 mm3)의 1차 종양이 발생하였다. 따라서, 정상적인 BALB/c 마우스의 새로운 집단은 2차 종양 발생을 위한 대조군으로 사용되었다. 대조군에서는 2차 종양이 순조롭게 성장하였으나, Ad5mTR.sPD1이 투여된 마우스에서는 성장하지 않았다(도 9a 및 9c). 동일한 결과가 E.G7 종양모델을 포함하는 B6 마우스에서 확인되었다(도 9b 및 9c). 따라서, 이중 모듈 아데노바이러스의 주사는 항암 면역성을 향상시켜서 항암효과를 도출하였다.

Claims (7)

  1. 암 특이 유전자인 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA(서열번호 1)에 작용하는, 트랜스-스플라이싱 라이보자임-HSVtk(Human Simplex Virus thymidine kinase) 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Rib67 라이보자임을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열과 HSVtk를 코딩하는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  3. 상기 암치료 유전자는 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 아데노바이러스.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 암치료 유전자는 sPD-1(soluble Programmed Death-1)를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 것인 재조합 아데노바이러스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스를 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
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