KR20070032786A - 티미딘 키나아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드가 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 실질적으로 비-스플라이싱 티미딘 키나아제 유전자를 엔코딩하는 핵산 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
유전자 요법에서의 대사성 자살유전자의 용도에 대해 상당한 관심이 존재한다. 다수의 자살유전자, 예를들어 시토신 데아미나아제, 퓨린 누클레오시드 포스포릴라아제 또는 티미딘 키나아제를 코딩하는 유전자가 문헌에 기재되어 있다. 이 유전자들 중, 단순헤르페스 바이러스 타입 1 티미딘 키나아제를 코딩하는 유전자(HSV-tk)가 치료적 관점에서 특히 이롭다. HSV-tk 유전자는 누클레오시드 유사체인 갠시클로버(ganciclovir)와 병용되는 경우, 분열하는 세포를 특이적으로 제거할 수 있는 효소를 발현한다. 특히 중요한 것은 HSV-tk/갠시클로버의 용도와 관련되는 전파성 독성 효과("방관자" 효과)의 존재이다. 이러한 효과는 티미딘 키나아제(tk) 유전자를 혼입하는 세포 뿐만 아니라 근접한 세포도 파괴시킴이 그 자체로 명백하다.
HSV-tk/갠시클로버 시스템의 작용 메커니즘은 다음과 같이 개설될 수 있다: TK 효소를 발현하도록 변형된 포유동물 세포가 갠시클로버의 인산화의 첫 단계를 수행하여, 갠시클로버 모노포스페이트를 생성시킨다. 이후, 세포의 키나아제는 이 러한 갠시클로버 모노포스페이트를 디포스페이트, 이후 트리포스페이트로 연속적으로 대사되는 것을 가능케 한다. 이에 따라, 갠시클로버 트리포스페이트는 이후 DNA에 혼입되어 세포 DNA 중합효소 알파를 부분적으로 억제함으로써 독성 효과를 나타내고, 이에 의해 DNA 합성이 중지되므로, 세포가 사멸된다(Moolten, 1986; Mullen,1994).
HSV-tk/갠시클로버 시스템은 매우 다수의 치료 적용에 사용될 수 있고, 다수의 임상 시도가 지난 10년간 수행되어 왔다. 유전자 요법에서 HSV-tk 유전자를 이용하는 방법은, 예를들어 W090/07936, US 5,837,510, US 5,861,290, WO 98/04290, WO 97/37542 및 US 5,631,236에 기재되어 있다.
HSV-tk/갠시클로버 시스템의 하나의 흥미로운 적용은 많은 혈액암에 대한 선택적 치료인 동종이형의 골수이식의 결과를 방해할 수 있는 질환인 이식편-대-숙주병(GvHD)의 예방이다. GvHD는 이식된 줄기 세포 이식편 내의 T 세포가 수용자의 신체를 공격하기 시작하는 경우에 발생한다. 이식편으로부터 T 세포를 제거하는 것이 GvHD를 예방할 수 있으나, 질병 재발 및 이식 거부를 또한 일으킬 수 있다. 이러한 효과를 억제하기 위해, 동종이형의 골수 이식 환자는 동종이형의 골수 이식에 이은 지연시간 이후 공여 T 림프구를 도입시킴으로써 치료될 수 있다. HSV-tk 유전자를 공여 T 림프구로 이동시키는 것은 GvHD가 출현하는 경우에 갠시클로버 투여 후 T 림프구의 박멸을 가능케 한다. 한 연구에서, T 세포를 수여받은 환자는 HSV-tk 유전자로 형질도입된 공여 림프구의 용량이 증가함에 따라 골수 이식을 소모시켰다(Tiberghien et al., 2001). 순환하는 HSV-tk-발현 세포는 모든 환자에서 생착 1년 후 보다 많이 검출될 수 있었다. 12명중 6명의 환자가 GvHD가 발달하였고, 갠시클로버를 투여받았고, 순환하는 변형된 세포의 수가 현저히 감소하였다(절대수의 평균 85% 감소).
HSV-tk 유전자의 변이는 이의 생물학적 활성이 증가하도록 이루어진다. 이러한 변이 HSV-tk 유전자의 예는, 예를들어 문헌[Kokoris et al (1999)], WO 95/30007, US 5,877,010, WO 99/19466 및 WO 95/14102에 기재되어 있다. 그러나, 티미딘 키나아제/갠시클로버 시스템과 관련된 심각한 문제점은 HSV-tk가 형질도입된 세포에서의 갠시클로버 내성의 출현이다. 이는 갠시클로버에 내성인 세포의 상대 비율이 치료 과정을 통해 급속하게 증가할 수 있으므로 특히 중요하다.
HSV-tk 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 림프아형 인간 T 세포주에서의 갠시클로버 내성의 존재가 HSV-tk 유전자에서의 227개의 염기쌍 결실과 관련하여 발견되었다(Fillat et al., 2003). 동일한 결실이 또한 상기 벡터로 형질도입된 인간 1차 T 세포 및 형질도입된 공여 T 세포를 투여받은 12명의 환자에서도 존재하였다(Garin et al., 2001). WO 01/79502에는 이러한 결실의 원인이 상기 유전자의 비정상형을 지니는 바이러스 입자 및 전장 유전자를 지니는 나머지 바이러스 입자의 비율의 생성을 야기시키는, 스플라이스 부위로 작용하는 HSV-tk mRNA 내의 누클레오티드 서열의 존재로 인한 것으로 생각되는 것으로 기재되어 있다. WO 01/79502 및 문헌[Chalmers 2001, Molecular Therapy 4: 146-148]에는 스플라이스 부위가 제거되고, 티미딘 키나아제 유전자의 비정상형의 생성을 감소시키는 티미딘 키나아제 유전자의 변이가 기재되어 있다. 그러나, 이러한 변이는 여 전히 유해한 양의 유전자 스플라이싱과 관련된다. CD34-tk 융합 작제물이 문헌[Rettig et al., 2003]에 기재되어 있다. 이러한 융합 작제물은 변형된 HSV-tk 유전자를 함유한다. 그러나, 변형된 유전자가 HSV-tk mRNA의 스플라이싱을 감소시킨다는 것은 증명되지 않았다.
따라서, 유전자 스플라이싱에 민감하지 않고, 갠시클로버 내성과 관련된 문제점을 다루는, 변형된 티미딘 키나아제 유전자를 필요로 한다.
발명의 개요
본 발명은 기존에 기재된 HSV-tk 유전자에 비해 스플라이싱 되지 않은 mRNA를 보다 높은 비율로 발현하는 HSV-tk 유전자를 제공함으로써 상기 기재한 문제점을 극복한다. 본 발명자들은 기존에 확인된 수용 부위의 업스트림에서 스플라이스 수용 부위인 14개의 염기쌍을 확인하였다. 본 발명자들은 기존에 확인된 공여 및 수용 부위의 변형에 의해 스플라이싱을 억제하려는 기존의 시도가 이러한 수용 부위의 활성화 및 이후의 유전자 스플라이싱을 야기할 수 있음을 보여준다. 놀랍게도, 본 발명자들은 특정 누클레오티드에서의 HSV-tk 유전자의 변형이 실질적으로 스플라이스가 없는 mRNA를 발현할 수 있는 HSV-tk 유전자를 생성한다는 것을 입증한다. 특히, 본 발명자들은 스플라이스 공여 부위의 누클레오티드중 하나 이상의 변이가 스플라이싱을 현저하게 예방할 수 있음을 보여준다.
발명의 진술
본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드가 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
바람직하게는, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상은 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드는 변경되지 않는다.
한 구체예에서, 위치 330의 누클레오티드는 T에서 C로 변경된다.
본 발명의 두번째 양태에 따르면, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드가 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
한 구체예에서, 위치 330의 누클레오티드는 T에서 C로 변경된다.
본 발명의 세번째 양태에 따르면, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상 및 위치 662 및 663의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
바람직하게는, 위치 554 및 555에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 변경되지 않는다.
바람직하게는, 위치 662 및 663에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 변경되지 않는다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
한 구체예에서, 위치 330의 누클레오티드는 T에서 C로 변경된다.
본 발명의 네번째 양태에 따르면, 도 1의 TkMut2 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다섯번째 양태에 따르면, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 누클레오티드(들)에 해당하는 스플라이스 수용 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
한 구체예에서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드는 T에서 C로 변경된다.
또 다른 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
또 다른 구체예에서, 위치 541의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 A에서 T로 변경된다.
또 다른 구체예에서, 위치 542의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 G에서 C로 변경된다.
또 다른 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상은 또한 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않게 된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않게 된다.
또 다른 구체예에서, 위치 555의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 G에서 A로 변경된다.
본 발명의 여섯번째 양태에 따르면, 도 1의 TkMut23 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 일곱번째 양태에 따르면, 도 1의 TkMut234 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 여덞번째 양태에 따르면, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 누클레오티드(들)에 해당하는 스플라이스 수용 부위 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
또 다른 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
바람직하게는, 위치 330의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 T에서 C로 변경된다.
바람직하게는, 위치 555의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 G에서 A로 변경된다.
본 발명의 아홉번째 양태에 따르면, 도 1의 Tk-Mut24 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 열번째 양태에 따르면, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드는 또 다른 누클레오티드로 대체된다.
한 구체예에서, 위치 555의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 G에서 A로 변경된다.
한 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 누클레오티드에 해당하는 스플라이스 수용 부위 누클레오티드중 하나 이상이 또한 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않게 된다.
또 다른 구체예에서, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또한 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않게 된다.
또 다른 구체예에서, 위치 541의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 A에서 T로 변경된다.
또 다른 구체예에서, 위치 542의 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드는 G에서 C로 변경된다.
본 발명의 열한번째 양태에 따르면, 도 1의 TkMut4 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
본 발명의 열두번째 양태에 따르면, 도 1의 TkMut34 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
바람직하게는, 대체 누클레오티드는 상기 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 서열을 변화시키지 않는다.
본 발명의 열세번째 양태에 따르면, 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명의 열네번째 양태에 따르면, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 열다섯번째 양태에 따르면, 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 열여섯번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 약제 조성물; 및 (ⅱ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 열일곱번째 양태에 따르면, 약제로 사용하기 위한 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 열여덟번째 양태에 따르면, 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자의 치료에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 사용하기 위한 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 약제 조성물, 및 실질적 비독성제를 함유하는 생성물이 제공되고, 실질적 비독성제는 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환된다.
본 발명의 열아홉번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입시키고; (ⅱ) 상기 세포를 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제와 동시적, 개별적 또는 순차적으로 접촉시키는 것을 포함하여 세포를 파괴하는 방법이 제공된다.
본 발명의 스무번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입시키고; (ⅱ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅲ) 상기 세포를 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제와 접촉시키는 것을 포함하여 세포를 파괴하는 방법이 제공된다.
본 발명의 스물한번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 약제 조성물을 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자에 도입시키고; (ⅱ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 환자에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 도입시키는 것을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 스물두번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 약제 조성물을 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자에 도입시키고; (ⅱ) 상기 폴리누클레오티드 또는 벡터를 세포에 흡수시키고; (ⅲ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅳ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 상기 환자에 도입시키는 것을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 스물세번째 양태에 따르면, (ⅰ) 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자로부터의 세포 또는 공여 세포를 분리시키고; (ⅱ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 생체외에서 세포로 도입시키고; (ⅲ) 변형된 세포를 상기 환자에 도입시키고; (ⅳ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅴ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 상기 환자에 투여하는 것을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 스물네번째 양태에 따르면, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하도록 유전공학 처리된 숙주 T 세포에 이를 투여하고; (ⅱ) 이식편-대-숙주병이 발병하기 전에 실질적 비독성제와 티미딘 키나아제의 상호작용을 통해 유전공학 처리된 T 세포를 사멸시키기에 충분한 양의 실질적 비독성제를 상기 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 환자의 이식편-대-숙주병을 예방하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 실질적 비독성제는 갠시클로버, 아시클로버(acyclovir), 트리플루로티미딘, 1-[2-데옥시, 2-플루오로, β-D-아라비노 푸라노실]-5-요오도우라실, 아라-A, 아라 1, 1-β-D 아라비노 푸라노실 티민, 5-에틸-2'데옥시우린, 5-요오도-5'-아미노-2, 5'-디데옥시우리딘, 요오독스우리딘, AZT, AIV, 디데옥시시티딘, 아라 C 및 브로모비닐 데옥시우리딘(BVDU)중 어느 하나이다.
본 발명의 스물다섯번째 양태에 따르면, 환자의 세포를 파괴하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도가 제공된다.
본 발명의 스물여섯번째 양태에 따르면, 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 용도가 제공된다.
상세한 설명
본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예가 이제 하기의 비제한적인 예에 의해 기재된다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자의 능력에 속하는 통상적인 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 참조: 문헌[J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992 and periodic supplements, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY]. 상기 문헌의 각각은 본원에 참조로서 포함되어 있다.
HSV-tk 유전자
본원에서 사용되는 용어 "변경되지 않음"은 야생형 서열(Tk wt)로부터 변경되지 않음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "또 다른 누클레오티드로 대체됨"은 야생형 서열(Tk wt)과는 상이한 누클레오티드로 대체됨을 의미한다. 대체는 관련 스플라이스 공여 부위 또는 스플라이스 수용 부위가 제거되도록 이루어진다.
본 발명의 티미딘 키나아제 변이는 매우 다양한 티미딘 키나아제로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 티미딘 키나아제 변이는, 예를들어 영장류 헤르페스 바이러스, 조류 헤르페스 바이러스와 같은 비영장류 헤르페스 바이러스 둘 모두를 포함하는 헤르페스 바이러스과 티미딘 키나아제로부터 유래된다. 적절한 헤르페스 바이러스의 대표적 예는 단순 헤르페스 바이러스 타입 1(McKnight et al., 1980), 단순 헤르페스 바이러스 타입 2(Swain and Galloway, 1983), 수두대상포진 바이러스(Davidson and Scott, 1986), 명주원숭이 헤르페스 바이러스(Otsuka and Kit, 1984), 고양이 헤르페스 바이러스 타입 1(Nunberg et al.,, 1989), 슈도레이비스 바이러스(Kit and Kit, U.S. Patent No. 4,514,497, 1985), 말 헤르페스 바이러스 타입 1(Robertson and Whalley, 1988), 소 헤르페스 바이러스 타입 1(Mittal and Field, 1989), 칠면조 헤르페스 바이러스(Martin et al., 1989), 마레크병 바이러스(Scott et al., 1989), 헤르페스 바이러스 사이미리(Honess et al., 1989) 및 엡슈타인-바 바이러스(Baer et al., 1984)를 포함한다.
이러한 헤르페스 바이러스는 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection, "ATCC", Rockville, Maryland)와 같은 상업적 공급원으로부터 용이하게 수득될 수 있다. 특정의 상기 확인된 헤르페스 바이러스의 기탁물, 예를들어 ATCC No. VR-539 (단순 헤르페스 타입 1); ATCC Nos. VR-734 및 VR-540 (단순 헤르페스 타입 2); ATCC NO. VR-586 (수두대상포진 바이러스); ATCC No. VR-783 (감염성 후두기관염); ATCC Nos. VR-624, VR-987, VR-2103, VR-2001, VR-2002, VR-2175, VR-585 (마레크병 바이러스); ATCC Nos. VR-584B 및 VR-584B (칠면조 헤르페스 바이러스); ATCC Nos. VR-631 및 VR-842 (소 헤르페스 바이러스 타입 1); 및 ATCC Nos. VR-2003, VR-2229 및 VR-700 (말 헤르페스 바이러스 타입 1)가 ATCC로부터 용이하게 수득될 수 있다. 헤르페스 바이러스는 또한 자연 발생원(예를들어, 감염된 동물)으로부터 용이하게 분리되고 확인될 수 있다.
티미딘 키나아제 유전자는 변이되지 않은 티미딘 키나아제와 비교하였을 때 유전자의 스플라이싱을 현저하게 감소시키는 하나 이상의 변이를 포함하는 티미딘 키나아제 유전자를 엔코딩하는 핵산 분자를 작제하기 위해 하기 기재되는 바와 같이 용이하게 분리되고 변이될 수 있다. 본원에서 사용되는 "변이되지 않은 티미딘 키나아제"는 맥나이트(McKnight) 등의 문헌[(Nucl. Acids Res. 8:5949-5964, 1980)]에 기재되는 바와 같은 천연 또는 야생형 티미딘 키니아제를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서, 누클레오티드 위치는 도 1의 위치를 참조로 하여 언급됨을 주지해야 한다. 그러나, 이러한 참조가 이루어지는 경우, 본 발명은 도면에 기재된 바와 같은 정확한 서열에 제한되는 것이 아니라, 이의 변형 및 유도를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 기타 티미딘 키나아제 서열에서의 누클레오티드 위치의 확인이 인지된다(즉, 당업자는 도 1에서 확인된 위치에 상응하는 위치의 누클레오티드를 인지할 것이다). 당업자는 유사한 서열을 용이하게 정렬시키고, 동일한 누클레오티드 위치를 알아낼 수 있다.
HSV-tk 변이의 작제
본 발명의 티미딘 키나아제 변이는 다양한 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 예를들어, 변이는 천연 서열의 단편에 대한 라이게이션을 가능하게 하는 제한 부위에 의해 플랭킹(flanking)된 변이 서열을 함유하는 올리고누클레오티드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 도입될 수 있다. 라이게이션 후, 생성된 재작제된 서열은 요망되는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 지니는 유도체를 엔코딩한다.
대안적으로, 올리고누클레오티드 부위 특이적(또는 분절 특이적) 돌연변이유발 방법이 요망되는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 지니는 변경된 유전자를 생성하는데 사용될 수 있다. 티미딘 키나아제 변이의 결실 또는 절단이 또한 요망되는 결실 부근의 편리한 제한 엔도누클라아제 부위를 이용하여 작제될 수 있다. 제한 후에, 오버행(overhang)은 메워지고, DNA는 다시 라이게이션된다. 상기 기재된 변경를 제조하는 예시적 방법은 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌[Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재되어 있다.
티미딘 키나아제 변이는 또한 강제된 누클레오티드 오편입(예를들어, 문헌[Liao and Wise, 1990]), 또는 무작위적으로 변이된 올리고누클레오티드의 용도(Horwitz et al., 1989)에 의한 PCR 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발(Drinkwater and Klinedinst, 1986)의 기술을 이용하여 작제될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 누클레오티드는 코돈이 동일한 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈을 퇴보시키게 변경되는 식으로 유전부호에 주의하여 변형된다. 이런식으로, 야생형 단백질을 엔코딩하지만 기능성 스플라이스 부위를 함유하지 않는 관심 단백질의 코딩 영역을 제조하는 것이 가능하다.
스플라이스 부위
스플라이싱 동안 제거(또는 "스플라이스드 아웃(spliced out)")되는 RNA의 부분은 통상적으로 인트론으로 불리고, 스플라이싱에 의해 결합되는 인트론의 양측의 RNA의 두개의 단편은 통상적으로 엑손으로 불린다(도 2).
스플라이스 공여 부위는 스플라이싱 과정 동안 제거되고, 절단되고 스플라이스 수용 부위 내의 누클레오티드 잔기에 재결합되는 부위를 함유하는, RNA의 5'측에 놓여진 RNA 내의 부위이다. 따라서, 스플라이스 공여 부위는, 통상적으로 디누클레오티드 GU에서 종료되는, 엑손의 말단과 인트론의 출발부위 사이의 이음부이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 스플라이스 공여 부위의 말단 GU 디누클레오티드(또는 상응하는 DNA 서열 내의 GT 디누클레오티드)의 하나 또는 둘 모두는 변경되어 스플라이스 부위가 제거된다.
스플라이스 수용 부위는 스플라이싱 과정 동안 제거되고, 절단되고 스플라이스 공여 부위 내의 누클레오티드 잔기에 재결합되는 부위를 함유하는, RNA의 3'측에 놓여진 RNA 내의 부위이다. 따라서, 스플라이스 수용 부위는 인트론의 말단(통상적으로 디누클레오티드 AG로 종료됨)과 다운스트림 엑손의 출발부위 사이의 이음부이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 스플라이스 수용 부위의 말단 AG 디누클레오티드의 하나 또는 둘 모두는 변경되어 스플라이스 부위가 제거된다.
폴리누클레오티드
본 발명에 사용된 폴리누클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 유전 부호의 퇴보의 결과로서 다수의 상이한 폴리누클레오티드가 동일한 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 통상적인 기술을 이용하여, 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 반영하도록 하기 위해, 본 발명에 사용된 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 서열에는 영향을 주지 않는 누클레오티드 치환을 당업자가 수행할 수 있음이 이해되어야 한다. 폴리누클레오티드는 당 분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리누클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
본 발명에 사용된 폴리누클레오티드는, 예를들어 발현된 폴리펩티드의 세포 분비를 촉진하기 위해 융합 단백질을 엔코딩할 수 있다. 예를들어, HSV-tk 폴리펩티드가 세포로부터 발현되는 것이 요망되는 경우, 단백질을 특정 세포 구획 또는 분비 경로로 표적화하기 위해 표적 서열을 첨가하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 표적 서열은 당 분야에서 광범위하게 특성규명되어 있다.
DNA 폴리누클레오티드와 같은 폴리누클레오티드는 재조합적으로, 합성적으로, 또는 당업자에 의해 이용가능한 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
보다 긴 폴리누클레오티드는 일반적으로 재조합 방법, 예를들어 PCR(중합효소 연쇄반응) 클로닝 기술을 이용하여 생성될 것이다. 이는 클로닝하려는 지질 표적 서열의 영역을 플랭킹하는 염기쌍(예를들어, 약 15 내지 30 누클레오티드)을 제조하고, 이러한 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 요망되는 영역의 증폭을 발생시키는 조건 하에서 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리(예를들어, 아가로오스 젤에서 반응 혼합물을 정제시킴으로써)시키고, 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 프라이머는 적절한 제한효소 인지 부위를 함유하도록 고안되어, 증폭된 DNA는 적절한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 변이 티미딘 키나아제를 위한 코딩 영역만을 함유할 수 있음이 인지될 것이다. 그러나, 폴리누클레오티드가 표적세포 내의 코딩 서열의 효율적인 번역을 가능케 하는 핵산의 부분이 작업적으로 연결되어 이를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 폴리누클레오티드(DNA 형태)가 코딩 영역의 전사를 가능케 하는, 작업적으로 연결된 프로모터 및 표적세포 내의 코딩 영역의 효율적인 번역을 가능케하는 핵산 부분을 추가로 포함하는 것이 또한 바람직하다.
단백질
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 단일 사슬 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라 개별적 성분의 폴리펩티드가 공유 또는 비공유 수단에 의해 결합된 다중-폴리펩티드 복합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 모노머가 아미노산이고, 펩티드 결합 또는 이황화 결합을 통해 함께 결합된 폴리머를 의미한다. 용어 서브유닛 및 도메인은 또한 생물학적 기능을 지니는 폴리펩티드 및 펩티드를 의미할 수 있다.
변형체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본원에 언급된 특정 단백질 및 누클레오티드 이외에, 본 발명은 또한 이들의 변형체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 용도를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 임의의 주어진 서열의 변형체는 당해 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드가 이의 내인성 기능중 하나 이상을 보유하는 방식으로 잔기의 특정 서열(아미노산 또는 핵산 잔기)이 변형된 서열이다. 변형체 서열은 자연 발생 단백질에 존재하는 하나 이상의 잔기의 첨가, 결실, 치환 변형 대체 및/또는 변경에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여, 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 하나(또는 이 이상)의 아미노산 잔기 또는 서열의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함하나, 단, 생성된 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 내인성 기능중 하나 이상을 보유한다.
폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 관하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체(mimetic), 즉 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 내인성 기능중 하나 이상을 모방하여 지니는 화학적 화합물을 포함한다.
통상적으로, 아미노산 치환은, 예를들어 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로부터 이루어질 수 있으나, 단, 변형된 서열은 요망되는 활성 또는 능력을 보유한다. 아미노산 치환은 비천연 발생 유사체의 용도를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 사일런트(silent) 변화를 일으키고, 기능적으로 동등한 단백질을 생성시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지닐 수 있다. 수송 또는 조절 기능이 보유되는 한, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 잔기의 친양성의 유사성에 기초하여 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 예를들어, 음극적으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양극적으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 지니는 하전되지 않은 극성 머리기를 지니는 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
보존성 치환은, 예를들어 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼의 동일한 블럭 및, 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 라인의 아미노산이 서로 치환될 수 있다:
| 지방족 | 비극성 | G A P |
| I L V | ||
| 극성(하전되지 않음) | C S T M | |
| N Q | ||
| 극성(하전됨) | D E | |
| K R | ||
| 방향족 | H F W Y |
"단편"은 또한 변형체이고, 이러한 용어는 통상적으로 기능적으로 또는, 예를들어 분석에서 흥미있는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 선택된 영역을 의미한다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 의미한다.
이러한 변형체는 부위 특이적 돌연변이유발과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어지는 경우, 합성 DNA는 삽입 부위의 양쪽의 자연 발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 플랭킹 서열과 함께 삽입부를 엔코딩한다. 플랭킹 서열은 자연 발생 서열 내의 부위에 해당하는 편리한 제한 부위를 함유하여, 적절한 효소(들)를 이용하여 절단되고, 합성 DNA가 절단 부분으로 라이게이션될 수 있다. 이후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 엔코딩된 단백질을 제조하게 된다. 이들 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 당 분야에 공지된 다수의 표준 기술의 예이고, 기타 공지된 기술이 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는, 폴리누클레오티드 변형체는 코돈 최적화된 서열을 포함할 것이다. 코돈 최적화는 RNA 안전성을 향상시킴으로써 유전자 발현을 향상시키는 방법으로 당 분야에 공지되어 있다. 유전 부호의 중복성은 여러 상이한 코돈이 동일한 아미노산을 엔코딩할 수 있는 것을 의미한다. 예를들어, 루신, 아르기닌 및 세린은 각각 여섯개의 상이한 코돈에 의해 엔코딩된다. 다양한 유기체는 이들의 다양한 코돈의 용도에서 선호성을 나타낸다. 예를들어, HIV와 같은 바이러스는 다수의 드문 코돈을 이용한다. 드문 코돈이 포유동물에서 공통적으로 사용되는 상응하는 코돈으로 대체되는 방식으로 누클레오티드 서열이 변경됨으로써, 포유동물 표적 세포 내의 서열의 발현 증가가 이루어질 수 있다. 코돈 사용빈도 표가 포유동물 세포 뿐만 아니라 다수의 기타 유기체에 대해 공지되어 있다. 바람직하게는, 서열의 적어도 일부가 코돈 최적화된다. 더욱 더 바람직하게는, 서열은 이의 전체가 코돈 최적화된다.
벡터
당 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 벡터는 하나의 환경으로부터 또 다른 환경으로의 존재물의 이동을 가능케 하거나 이를 촉진하는 도구이다. 본 발명에 따라, 예를들어, 재조합 DNA 기술에 사용되는 일부 벡터는 본 발명에서 사용되는 누클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 복제시키고/거나 본 발명에서 사용되는 단백질을 발현시키려는 목적을 위해 DNA의 분절(예를들어, 이종유래 DNA 분절, 예를들어 이종유래 cDNA 단편)과 같은 존재물을 숙주 및/또는 표적 세포로 이동시키는 것을 가능케 한다. 재조합 DNA 기술에 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 폴리누클레오티드는 바람직하게는 벡터로 통합된다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 벡터 내의 폴리누클레오티드는 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작업적으로 연결되므로, 즉 상기 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작업적으로 연결된"은 기재된 성분이 이들이 의도하는 방법으로 작용하는 것을 가능케 하는 관계를 의미한다. 코딩 서열에 "작업적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립하는 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다.
조절 서열은 전사 정조자에 대해 보다 반응성인 조절 서열에 의해 유도된 전사 수준을 이루기 위해, 예를들어 추가의 전사 조절 요소의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
벡터는 적절한 숙주로 형질전환되거나 트랜스펙션되어 tk 유전자 생성물의 발현을 제공할 수 있다. 이러한 과정은 단백질을 엔코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하기 위한 조건 하에서 상기 기재된 바와 같이 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 임의로 발현된 단백질을 회수하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는, 예를들어 복제 기점, 임의로 폴리누클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절자가 장치된 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 표지 유전자, 및/또는 추적가능한 표지, 예를들어 GFP를 함유할 수 있다. 벡터는, 예를들어 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 단백질을 엔코딩하는 서열에 작업적으로 연결된 조절 서열은 프로모터/인핸서 및 기타 발현 조절 신호를 포함한다. 이러한 조절 서열은 고안된 발현 벡터가 사용되는 숙주 세포와 양립되게 선택될 수 있다. 용어 "프로모터"는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 최소 프로모터로부터 업스트림 요소 및 인핸서를 포함하는 프로모터까지 크기 및 복잡성이 다양한 핵산 영역을 포함한다.
프로모터는 원핵생물 프로모터 및 기타 진핵생물 세포에서 작용하는 프로모터가 사용될 수 있으나, 통상적으로 포유동물 세포에서 작용하는 프로모터로부터 선택된다. 프로모터는 통상적으로 바이러스 또는 진핵생물 유전자의 프로모터 서열로부터 유래된다. 예를들어, 이는 발현이 발생하는 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 진핵생물 프로모터에 관하여, 이들은 편재하는 방식(예를들어, a-액틴, b-액틴, 튜불린)으로 작용하거나, 대안적으로 조직 특이적 방식(예를들어, 피루베이트 키나아제에 대한 유전자의 프로모터)으로 작용하는 프로모터일 수 있다. 바이러스 프로모터는 또한, 예를들어 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 장 말단 반복(long terminal repeat)(MMLV LTR) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) IE 프로모터가 사용될 수 있다.
이종유래의 유전자의 발현 수준이 세포의 수명 동안에 조절될 수 있도록 유도될 수 있는 프로모터가 또한 이로울 수 있다. 유도가능하다는 것은 프로모터를 이용하여 수득된 발현의 수준이 조절될 수 있는 것을 의미한다.
또한, 이들 프로모터중 어떠한 것은 추가의 조절 서열, 예를들어 인핸서 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 키메라 프로모터가 또한 상기 기재된 두개 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하여 사용될 수 있다.
바람직하게는, 바이러스 벡터는 특정 세포 유형 또는 세포 유형들에 우선적으로 형질도입된다.
레트로바이러스 벡터
한 구체예에서, 본 발명에 사용된 벡터는 일단 바이러스가 표적 세포로 진입하면 복제되지 않거나 감염성의 프로제니 바이러스 입자를 생성할 수 없도록 유전공학 처리된 레트로바이러스 기재 벡터이다. 조직 배양 환경 및 생(生) 유기체 둘 모두에서 유전자의 전달을 위해 널리 사용되는 다수의 레트로바이러스가 존재한다. 예로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 마우스 유방암 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo- MSV), 아벨슨(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(MC29), 및 조류 적혈모구증 바이러스(AEV) 및 렌티바이러스를 포함하는 모든 기타 레트로바이러스과를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 발견될 수 있다.
레트로바이러스 게놈의 기본 구조는 5'LTR 및 3'LTR 사이 또는 이들 내에 게놈이 패키징될 수 있도록 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있게 하는 통합 부위, 및 패키징 성분을 엔코딩하는 gag, pol 및 env 유전자(이들은 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 폴리펩티드임)가 위치한 구조이다. 더욱 복잡한 레트로바이러스는 감염된 표적 세포의 핵으로부터 세포질로의 통합된 프로바이러스의 RNA 전사체의 효율적인 수송을 가능케 하는, HIV의 rev 및 RRE 서열과 같은 추가의 특징을 지닌다.
프로바이러스에서, 이들 유전자는 장 말단 반복(LTR)으로 언급되는 영역에 의해 두 말단에서 플랭킹된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 책임진다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열을 돕고, 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 인캡시데이션(encapsidation)은 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치한 psi 서열에 의해 발생한다.
LTR 스스로는 U3, R 및 U5로 언급되는 세개의 요소로 나누어질 수 있는 동일한 서열이다. U3는 RNA의 3' 말단에 대해 독특한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양 말단에 반복된 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 말단에 대해 독특한 서열로부터 유래된다. 세개의 요소의 크기는 다양한 레트로바이러스에서 상당히 다양할 수 있다.
결함이 있는 레트로바이러스 벡터 게놈에서, gag, pol 및 env은 존재하지 않거나 기능적이지 않을 수 있다. RNA의 양 말단의 R 영역은 반복 서열이다. U5 및 U3는 각각 RNA 게놈의 5' 및 3' 말단에 대해 독특한 서열을 나타낸다.
보다 바람직하게는, 바이러스 벡터는 표적화된 벡터로, 즉 천연 바이러스에 비해 조직 친화성이 변화되어, 상기 벡터는 특정 세포에 대해 표적화된다. 이는 레트로바이러스 Env 단백질을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 외피 단백질은 비독성 외피이거나, 1차 표적 세포 내의 비독성적인 양으로 생성될 수 있는 외피, 예를들어 MMLV 양생 외피 또는 변형된 양생 외피이다.
바람직하게는, 외피는 인간 세포의 형질도입을 가능케 하는 것이다. 적절한 env 유전자의 예는 VSV-G, MLV 양생 env, 예를들어 4070A env, RD114 고양이 백혈병 바이러스 env 또는 인플루엔자 바이러스로부터의 혈구응집소(HA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Env 단백질은 제한된 수의 인간 세포 유형의 수용체에 결합될 수 있는 단백질이고, 표적 부분을 함유하는 고안된 외피일 수 있다. env 및 gag-pol 코딩 서열은 선택된 패키징 세포주에서 활성인 프로모터 및 임의로 인핸서로부터 전사되고, 전사 단위는 아데닐중합체형성 신호에 의해 종결된다. 예를들어, 패키징 세포가 인간 세포인 경우, 적절한 프로모터-인핸서 조합은 인간 사이토메갈로 바이러스 주요 조기 발현(hCMV-MIE) 유전자로부터의 조합이고, SV40 바이러스로부터의 아데닐중합체형성 신호가 사용될 수 있다. 기타 적절한 프로모터 및 아데닐중합체형성 신호는 당 분야에 공지되어 있다.
MLV
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 벡터이다. 양생 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MLV-A)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터는 세계적으로 임상 프로토콜에서 공통으로 사용된다. 이들 바이러스는 진입을 위해 세포 표면 포스페이트 전달체 수용체를 이용한 후, 증식하는 세포 염색체로 영구적으로 통합된다. 이후, 이 유전자는 세포의 수명 동안 유지된다. MLV 기재 작제물에서의 유전자 활성은 조절하기 쉽고, 장기간에 걸쳐 유효할 수 있다. 이들 MLV 기재 시스템을 이용하여 수행된 임상 실험은 이들이 유해한 부작용이 없이 매우 내성임을 나타낸다.
본 발명에 사용하기 위한 MLV 벡터의 예는 자살 유전자 HSV-tk 및 표지 유전자 ΔLNGFR 둘 모두를 지니는 SFCMM-3으로부터 유래된 벡터이다(Verzeletti 98, Human Gene Therapy 9: 2243). SFCMM-3의 제조에 사용되는 본래의 벡터는 LXSN이다(Miller et al. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques 7: 980-990, 1989)(Genebank accession #28248). LXSN 벡터는 독특한 Hpa I 부위("블런트 절단")로 HSV-tk 유전자를 삽입하고, Hind III 및 Nae I로 절단하여 neo 유전자를 제거하고, 이 부위에 ΔLNGFR을 엔코딩하는 cDNA를 삽입함으로써 변형된다.
렌티바이러스 벡터
한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터의 광범위한 그룹의 일부이다. 렌티바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)]에서 발견될 수 있다. 요컨대, 렌티바이러스는 영장류 및 비영장류 그룹으로 나누어질 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 후천성면역결핍 증후군(AIDS)의 병원체, 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입 "지발 바이러스"인 비스나/매디 바이러스(VMV), 뿐만 아니라 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)및 보다 최근에 기재된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다.
렌티바이러스 패밀리 및 기타 유형의 레트로바이러스 사이의 차이는 렌티바이러스가 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포 둘 모두를 감염시킬 가능성을 지닌다는 점이다(Lewis, 1992; Lewis and Emerman, 1994). 대조적으로, 기타 레트로바이러스, 예를들어 MLV는 분열하지 않는 세포 또는 천천히 분열하는 세포, 예를들어 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 세포를 감염시킬 수 없다. 렌티바이러스는 말기에 분화된 세포/일차 세포를 형질 도입시킬 수 있고, 렌티바이러스 스크리닝 방법의 사용은 일차 표적의 분열하지 않는 숙주 세포 또는 천천히 분열하는 숙주 세포에서의 라이브러리 선택을 가능케 한다.
아데노바이러스 벡터
또 다른 구체예에서, 본 발명의 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스는 RNA 중간체를 겪지 않는 이중 가닥의 선형 DNA 바이러스이다. 유전적 서열 상동성에 기초하여 6개의 서브그룹으로 나누어지는 50개 이상의 다양한 인간 혈청형의 아데노바이러스가 존재한다. 아데노바이러스의 천연 표적은 호흡상피 및 위장관상피로, 일반적으로 가벼운 증상을 일으킨다. 혈청형 2 및 5(95%의 서열 상동성을 지님)는 아데노바이러스 벡터 시스템에서 가장 흔하게 사용되고, 보통 유아의 상기도와 관련된다.
아데노바이러스는 엔벨로핑되지 않은 정연한 정이십면체이다. 통상적인 아데노바이러스는 140 nm의 인캡시데이션된 DNA 바이러스를 포함한다. 상기 바이러스의 정이십면체 대칭은 240개의 헥손 및 12개의 펜톤을 지닌 152개의 캡소미어로 구성된다. 입자의 코어는 DNA 복제를 위한 프라이머로 작용하는 말단 단백질(TP)과 함께 5' 말단에서 공유적으로 회합된 36kb의 선형 두가닥 DNA를 함유한다. DNA는 역방위 말단반복(ITR) 및 혈청형에 따라 다양한 길이를 지닌다.
아데노바이러스는 인간 및 비인간 유래의 광범위한 세포 유형의 생체내 및 시험관내 형질도입을 가능하게 하는 이중 가닥의 DNA의 엔벨로핑되지 않은 바이러스이다. 이들 세포는 호흡기 상피세포, 간세포, 근육세포, 심근세포, 윤활막세포, 일차 유방상피 세포 및 유사분열후 말기에 분화된 세포, 예를들어 뉴런을 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 또한 분열하지 않는 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이는 폐 상피의 감염된 세포가 느린 교체율을 지니는 낭성섬유증과 같은 질병에 매우 중요하다. 사실, 성인 낭성섬유증에 걸린 환자의 폐로 낭성섬유증 수송체(CFTR)의 아데노바이러스 매개 수송을 이용하는 여러 시도가 진행중이다.
아데노바이러스는 유전자 요법 및 이종유래 유전자의 발현에서 벡터로 사용되어 왔다. 이의 큰(36 kb) 게놈은 8kb의 외래 삽입 DNA를 수용할 수 있고, 보충되는 세포주에서 효율적으로 복제되어 1012 이하의 매우 높은 역가를 생성할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스는 일차 비복제성 세포에서의 유전자의 발현을 연구하기 위한 최적의 시스템중 하나이다.
아데노바이러스 게놈으로부터의 바이러스 또는 외래 유전자의 발현은 복제하는 세포를 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 수용체 매개 세포내이입에 의해 세포로 진입한다. 일단, 세포내에서 아데노바이러스 벡터는 숙주 염색체로 잘 통합되지 않는다. 대신, 이는 숙주 핵내의 선형 게놈과 같이 에피솜(숙주 게놈과 독립적으로 작용함)으로 작용한다. 그러므로, 재조합 아데노바이러스의 용도는 숙주 게놈으로의 무작위적 통합과 관련된 문제를 완화시킨다.
폭스바이러스 벡터
DNA의 큰 단편이 폭스 바이러스의 게놈으로 용이하게 클로닝되고, 재조합적으로 약독화된 백신 변형체가 문헌[(Meyer, et al., 1991; Smith and Moss, 1983)]에 기재됨에 따라, 폭스 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.
폭스바이러스 벡터의 예는 레포리폭스바이러스: [Upton, et al., 1986, (shope fibroma virus)]; 카프리폭스바이러스: [Gershon, et al., 1989, (Kenya sheep-1)]; 오르토폭스바이러스: [Weir, et al., 1983, (vaccinia)]; [Esposito, et al., 1984, (monkeypox and variola virus)]; [Hruby, et al., 1983, (vaccinia)]; [Kilpatrick, et al., 1985, (Yaba monkey tumour virus)]; 아비폭스바이러스: [Binns, et al., (1988) (fowlpox)]; [Boyle, et al., 1987, (fowlpox)]; [Schnitzlein, et al., 1988, (fowlpox, quailpox)]; [entomopox (Lytvyn, et al., 1992)]를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폭스바이러스 벡터는 진핵생물 세포 내의 관심유전자에 대한 발현 비히클로 광범위하게 사용된다. 이들의 클로닝 용이성 및 다양한 숙주 세포에서의 증식은, 특히 이들을 외래 단백질의 발현을 위한 용도로 널리 사용되게 하고, 백신 항원의 전달 비히클로서 사용되게 한다(Moss, 1991).
백시니아 바이러스 벡터
본 발명의 벡터는 MVA 또는 NYVAC와 같은 백시니아 바이러스 벡터일 수 있다. 가장 바람직한 것은 변형 백시니아 균주 바이러스 앙카라형(MVA) 또는 이로부터 유래된 균주이다. 백시니아 벡터의 대안은 인간 세포에서 감염되고 재조합 단백질을 발현할 수 있으나 복제를 할 수 없는 ALVAC로 공지된 카나리폭스 또는 조류폭스 및 이로부터 유래된 균주와 같은 아비폭스 벡터를 포함한다.
전달 시스템
본 발명은 본 발명의 변이 tk 폴리누클레오티드를 위한 전달 시스템을 추가로 제공한다.
본 발명의 전달 시스템은 바이러스 또는 바이러스 전달 시스템일 수 있다. 비-바이러스 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜, 리포펙틴, 양이온 안면 친양쪽성체(CFA) 및 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폴리누클레오티드는 임의의 적절한 유전자 전달 비히클인 GDV에 의해 표적 세포 집단으로 전달될 수 있다. 이는 지질 또는 단백질 복합체에 포뮬레이팅된 DNA, 또는 주사 또는 바이오리스틱(biolistic) 전달, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 셈리키 산림열 바이러스 및 배큘로바이러스성 바이러스와 같은 바이러스를 통해 네이키드(naked) DNA로서 투여되는 DNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 폴리누클레오티드는 단핵구, 대식세포, 림프구, 또는 조혈줄기세포와 같은 세포에 의해 전달된다. 특히, 세포 의존 전달 시스템이 사용된다. 이러한 시스템에서, TK 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 생체외에서 하나 이상의 세포로 도입된 후, 환자에게 도입된다.
본 발명의 작용제는 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 약제 조성물로서 투여된다.
숙주 세포
본 발명의 벡터 및 폴리누클레오티드는 벡터/폴리누클레오티드를 복제하고/하거나 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 TK를 발현하도록 하기 위한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 세균 세포 또는 진핵생물 세포, 예를들어 효모, 곤충 또는 포유동물 세포일 수 있다.
숙주 세포는 당 분야에 널리 공지된 레트로바이러스 패키징 세포주와 같은 바이러스를 패키징하고 증식시키기 위한 세포일 수 있다.
숙주 세포는 동물 또는 환자(인간 또는 동물)의 파괴하려는 세포일 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드 및 벡터는 파괴하려는 세포를 표적으로 하는 데에 유용하다. TK를 발현하는 세포는 TK에 의해 독성 형태로 전환되는 실질적 비독성제와 접촉될 수 있다.
세포 파괴 방법
본 발명의 한 양태에서, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 파괴하려는 세포에 도입시키고; (ⅱ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; 상기 세포를 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제와 접촉시키는 것을 포함하여, 상기 세포를 파괴하는 방법이 제공된다.
폴리누클레오티드 또는 벡터의 세포로의 도입, 및 상기 세포와 실질적 비독성제의 접촉은 임의의 순서일 수 있다. 파괴되는 세포는 배지에서 배양되는 세포와 같은 시험관내 세포일 수 있거나, 이들은 동물의 일부인 세포일 수 있다. 파괴하려는 세포의 대표적 예는 T 세포, 자가면역 세포, 종양 세포, 특정 유전자를 발현하지 않거나 부적절하게 발현하는 세포, 및 박테리아, 바이러스 또는 기타 세포내 기생충에 감염된 세포이다.
치료
본원에 기재되는 모든 치료는 치료적, 완화적 및 예방적 치료를 포함하는 것이 인식되어야 한다. 포유동물의 치료가 특히 바람직하다. 인간 및 척추동물 치료는 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 한 양태에서, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 또는 약제 조성물을 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자에게 도입시키고; (ⅱ) 상기 폴리누클레오티드 또는 발현 벡터를 상기 세포에 흡수시키고; (ⅲ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅳ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 환자에게 도입시키는 것을 포함하여, 상기 세포를 지닌 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, (ⅰ) 환자로부터의 세포 또는 공여 세포를 분리하고; (ⅱ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 발현 벡터를 생체외에서 파괴를 요하는 세포로 도입시키고; (ⅲ) 상기 변형된 세포를 환자에 도입시키고; (ⅳ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 및 방법에 의해 치료될 수 있는 질병의 대표적 예는 암, 과각화증, 전립선비대, 갑상샘과다증, 광범위한 내분비병증, 자가면역병, 알레르기, 재협착, 광범위한 바이러스 질병, 예를들어 HIV 및 AIDS, 간염 및 세포내 기생충병을 포함한다.
본 발명의 폴리누클레오티드, 벡터 및 방법은 동종이형의 골수 이식후의 치료 과정에서 사용될 수 있다. 동종이형의 골수 이식은 다수의 혈액암, 예를들어 백혈병, 림프종 및 다발골수종을 위한 선택적 치료방법이다. 동종이형의 골수 이식이, 특히 고용량의 화학방사선요법과 병용되는 경우, 자가 이식 또는 동계 이식과 비교하여 우수한 결과를 생성함을 나타내었다.
동종이형의 골수 이식의 수행에 있어서, 동종반응 T 림프구는 이식편 대 숙주병(GvHD)을 예방하기 위해 이식편으로부터 제거될 수 있다. GvHD는 이식된 줄기세포 이식편 내의 T 세포가 수용자의 신체를 공격하기 시작하는 경우에 발생한다. 그러나, 이러한 세포의 제거는 질병 재발, 이식 거부 및 바이러스 감염의 재활성화의 발병률을 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 억제하기 위해, 동종이형의 골수 이식 환자는 동종이형의 골수 이식에 이은 지연시간 후에 공여 T 림프구를 도입시킴으로써 치료될 수 있다. 그러나, 동종이형의 골수 이식에 이은 공여 T 림프구의 지연 도입의 치료 징조는 치료의 빈번하고 잠재적인 치명적 합병증인 GvHD에 의해 제한된다. 이러한 문제점은 "자살 유전자"를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하도록 유전공학 처리된 T 세포를 환자에게 투여함으로써 다루어진다. 변이 TK를 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드 및 벡터가 이와 관련하여 사용된다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, (ⅰ) 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 포함하도록 유전공학 처리된 숙주 T 세포를 투여하고; (ⅱ) 이식편 대 숙주병이 발병하기 전에 실질적 비독성제와 티미딘 키나아제의 상호작용을 통해 환자의 이식편-대-숙주 효과를 제공할 수 있는 유전공학 처리된 T 세포를 사멸시키기에 효과적인 양의 실질적 비독성제를 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 환자의 이식편-대-숙주병을 예방하는 방법이 제공된다.
변이 tk 유전자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포는 바람직하게는 변이 tk 유전자의 존재를 모니터하기 위해 이용될 수 있는 표지 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 표지 유전자는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 발현 벡터에 의해 엔코딩된다. 이러한 표지 유전자의 예는 변형된 저친화성 신경 성장 인자 수용체(ΔLNGFR)이다. 변형되지 않은 NGF 수용체와 이의 리간드의 결합 특성을 보유하는 형질전환된 세포의 표면에서 발현되는 경우, 변형된 LNGFR은 아직 리간드 결합의 결과로서 신호 전달에 영향을 줄 수 없다. 특정 LNGFR 변형의 예는 US 출원 제 08/602,791호에 기재되어 있다.
약제 조성물
약제 조성물은 치료적 유효량의 약학적 활성제를 포함하거나 이로 구성되는 조성물이다. 이는 바람직하게는, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제(이들의 조합물)를 포함한다. 치료용의 허용되는 담체 또는 부형제는 약학 분야에 널리 공지되어 있고, 예를들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 소기의 투여 경로 및 표준 약학적 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 약제 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 임의의 적절한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)을 포함하거나, 이들이 더해질 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체의 예는, 예를들어 물, 염수, 알코올, 실리콘, 왁스, 바셀린(petroleum jelly), 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포솜, 당, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 방향 오일, 지방산 모노글레세리드 및 디글리세리드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
적절한 경우, 약제 조성물은 하기중 임의의 하나 이상에 의해 투여될 수 있다: 흡입, 좌약 또는 페서리의 형태, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말의 형태, 피부 패치의 용도에 의해 국소적으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 함유하는 정제의 형태, 또는 단독으로 또는 부형제와 혼합된 캡슐 또는 오뷸(ovule), 또는 착향제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구적으로, 또는 예를들어 해면체내, 정맥내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 기타 물질, 예를들어 혈액과 등장성인 용액을 제조하기에 충분한 염 또는 모노사카라이드를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 최적으로 사용될 수 있다. 협측 또는 설하 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 포뮬레이팅될 수 있는 정제 또는 로젠지의 형태로 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템에 따라 다양한 조성물/포뮬레이션 요건이 존재할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 약제 조성물은 미니-펌프를 이용하여, 또는 점막 경로, 예를들어 흡입용 비내 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능한 용액에 의해, 또는 조성물이 예를들어 정맥내, 근내 또는 피하 경로에 의한 전달용의 주사가능한 형태에 의해 포뮬레이팅되는 비경구적으로 전달되도록 하기 위해 포뮬레이팅될 수 있다. 대안적으로, 포뮬레이션은 둘 모두의 경로에 의해 절달되도록 고안될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 특징 및 구체예는 이제 하기의 비제한적인 실시예 및 수반되는 도면을 참조로 하여 기재될 것이다:
도 1은 HSV-1 티미딘 키나아제 유전자 (HSV-tk) 변이 TkMut2 (SEQ ID NO: 2), TkMut23 (SEQ ID NO:3), TkMut24 (SEQ ID NO: 4), TkMut34 (SEQ ID NO: 5), TkMut4 (SEQ ID NO: 6) 및 TkMut234 (SEQ ID NO: 7)의 누클레오티드 서열의 다중 정렬을 도시한다. 염기는 야생형 HSV-tk 서열의 ATG 시작 코돈으로부터 넘버링하였다. 서열은 TK 야생형 서열 (TK wt, SEQ ID NO: 1)에 대해 정렬시켰다. 변이의 위치는 정렬 위의 숫자로 나타내었다. 위치(330), (541 및 542), 및 (555)에서의 변이는 각각 2, 3 및 4의 수로 나타내었다.
도 2는 스플라이싱 공통 서열을 도시한다.
도 3은 외생 패키징 세포주 GP+ E86의 상층액 및 SFCMM-3 (Verzelletti, 1998, Human Gene Therapy 9: 2243-2251) 및/또는 TK3 (scSFCMM-3) (Chalmers, 2001) 벡터로 트랜스펙션된 양생 패키징 세포주 gp+ env Am12 (Am12)로부터 제조된 cDNA의 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 4는 SFCMM-3 및/또는 TK3 (scSFCMM-3) 벡터로 형질도입된 말초혈액 림프 구(PBL)에서 PCR 증폭된 HSV-tk를 도시한다.
도 5는 SFCMM-3 대 TK3 (scSFCMM-3)에서의 HSV-tk 유전자의 중요 부분의 서열을 도시한다. SFCMM-3 및 TK3 (scSFCMM-3) 벡터 사이의 상이한 누클레오티드 위치는 사각형으로 테두리를 하였다. SFCMM-3 및 TK3의 스플라이싱된 형태에서 결실된 유전자 단편은 이탤릭체로 나타내었다. 해당하는 스플라이싱 공여 및 수용 부위를 나타내었다.
도 6은 SFCMM-3 벡터로 형질도입된 변이의 개략도를 나타낸다.
도 7은 도 1에 도시된 HSV-tk 변이를 포함하는 재조합 플라스미드 유래 형태인 SFCMM-3로 일시적으로 트랜스펙션된 E86 세포의 상층액으로부터 유래된 cDNA의 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 8은 도 7에 기재된 E86 배양으로부터 수집된 상층액으로 형질도입된 Am12 배양물의 상층액으로부터 유래된 cDNA의 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 9는 도 8에 기재된 Am12 배양물로부터 수집된 상층액으로 형질도입된 CEM A301 세포로부터 유래된 DNA의 TKA1/TKB1 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 10은 도 8에 기재된 Am12 배양물로부터 수집된 상층액으로 형질도입된 CEM A301 세포로부터 유래된 DNA의 TKY1/TKY2 및 TKZ1/TKZ2 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 11은 도 8에 기재된 Am12 배양물로부터 수집된 상층액으로 형질도입된 PBL로부터 유래된 DNA의 TKA1/TKB1 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
도 12는 도 8에 기재된 Am12 배양물로부터 수집된 상층액으로 형질도입된 PBL로부터 유래된 DNA의 TKZ1/TKZ2 HSV-tk PCR 생성물을 도시한다.
실시예 1 - SFCMM-3#35 상층액 및 형질도입된 세포에서의 HSV-tk의 스플라이싱된 형태의 상대 빈도
스플라이싱된 형태의 상대 빈도(스플라이싱된 형태 대 스플라이싱된 형태 + 스플라이싱되지 않은 형태의 %)를 택맨(TaqMan) 7700 시스템을 이용하여 각각의 HSV-tk 형태에 대해 특이적인 두개의 정량 리얼-타임 PCR(상층액으로부터의 RNA) 또는 PCR(형질도입된 림프구로부터의 DNA)로 측정하였다.
재료 및 방법
SFCMM-3 레트로바이러스 벡터
GP+envAm12 (Am12)에 의해 유래된 생산자 세포주인 SFCMM-3 클론 35(Am12/SFCMM-3#35)를 2 mM 글루타민 및 10%의 방사선 조사된 FBS (Hyclone)를 함유하는 DMEM (Cambrex) 배지에서 5일 동안 확장시켰다. 33℃에서 24시간의 세포 인큐베이션 후에 2 mM 글루타민으로 보충된 X-VIVO 15 배지 (Cambrex)에서 컨플루언트(confluent) 플라스크로부터 레트로바이러스 상층액을 수거하였다. 바이러스 함유 상층액을 여과하고, 추가의 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.
T 세포 형질도입
말초혈액 단핵세포를 건강한 공여자로부터 수집하고, 림포프렙(Lymphoprep, Nycomed) 상에서 원심분리에 의해 분리하였다.
말초혈액 림프구(PBL)를 OKT3 (30 ng/ml) (Orthoclone)으로 자극시키고, 3% 자가 혈장, 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI (Hyclone)에서 배양하고, 재조합 인간 인터루킨 2,600 IU/ml (Proleukin)을 보충하였다. PBL의 형질도입을 OKT3-자극된 PBL 상에서 레트로바이러스 벡터 입자(Am12/SFCMM-3#35으로부터의 상층액)를 원심분리시킴으로써 수행하였다. OKT3 자극 2일 및 3일 후에 두번의 원심분리 사이클을 수행하였다.
형질도입기 후, 림프구를 수집하고, 세포 표면 표지로 사용되는 ΔLNGFR 분자를 이용하여 FACS 분석에 의해 실제로 형질도입된 세포의 %를 측정하였다. 이후, 형질도입된 세포를 자기 비드 (Dynabeads)가 컨쥬게이션된 항체에 의해 분류하고, 몇일 동안 배양하여 확장시킨 후, 총 10일의 배양후 동결시켰다.
샘플 제조
제품 프로토콜에 따라 키아앰프 DNA 미니 키트(QIAamp DNA Mini kit, Qiagen)를 이용하여 1-2X106 개의 세포로부터 DNA를 정제시키고, OD260에서 측정하여 수율을 결정하였다. 제품 프로토콜에 따라 키아앰프 바이럴 RNA 미니 키트(QIAamp Viral RNA Mini Kit, Qiagen)를 이용하여 140 ㎕의 상층액으로부터 RNA를 정제하였다. 13.5 ㎕의 정제된 RNA를 20분 동안 25℃에서 DNase 처리시키고, 5분 동안 95℃에서 DNase를 불활성화시켰다. 이후, DNase 처리된 RNA의 반을 M-MLV 역전사효소 (Invitrogen) 및 올리고 dT를 이용하여 1시간 동안 42℃에서 역전사시켰다. 합성된 cDNA를 리얼-타임 PCR에 사용하기 전에 5배로 희석시켰다.
리얼 타임 PCR에 의한 스플라이싱된 형태의 정량
HSV-tk의 스플라이싱된 형태 및 트렁케이션된 형태를 pCR2.1 TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝함으로써 DNA 표준 곡선을 작성하였다. 프라이머 익스프레스(Primer ExpressTM) 1.5 소프트웨어 (PE Applied Biosystems)를 이용하여, HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태 및 스플라이싱된 형태를 선택적으로 증폭하고 검출할 수 있는 두개의 상이한 세트의 프라이머 및 프로브를 고안하였다. TaqMan/ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템을 이용하여, 각각의 HSV-tk 형태에 대해 특이적인 두개의 정량 리얼 타임 PCR을 구성하였다.
HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태에 특이적인 정량 리얼 타임 PCR을 구성하기 위해, 프라이머 및 프로브를 HSV-tk 유전자의 스플라이싱되지 않은 영역에서 고안하였다. 스플라이싱되지 않은 형태에 대한 리얼 타임 PCR을 상기 기재된 바와 같이 제조된 100-500 ng의 유전체 DNA 또는 10 ㎕의 cDNA, 1X 택맨 유니버셜 PCR 마스터 믹스(TaqMan Universal PCR Master Mix, PE Applied Biosystems), 두개의 프라이머 TKwtfor (5'-CGG CGG TGG TAA TGA CAA G-3') 및 Tkwtrev (5'- GCG TCG GTC ACG GCA TA-3')의 각각 300 nM 및 200 nM의 TKwt MGB 프로브 (5'- FAM CCA GAT AAC AAT GGG C-3')를 함유하는 25 ㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다.
스플라이스 이음부를 포함하는 TaqMan 프로브를 HSV-tk 스플라이싱된 형태를 선택적으로 검출하기 위해 고안하였다. TK 스플라이싱된(트렁케이션된) 형태에 대해 특이적인 정량 리얼 타임 PCR을 상기 기재된 바와 같이 제조된 100-500 ng의 유전체 DNA 또는 10 ㎕의 cDNA, 1X 마스터 믹스 (PE Applied Biosystems), 두개의 프 라이머 TKSP18 (5'- GGA TGA GGG CCA CGA A-3') 및 TKSP16 (5'- CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC A- 3')의 각각 300 nM 및 200nM의 택맨(Taq Man) 프로브 PSP10 (5' FAM -CCA GCA CGG CCC TGG TCG- TAMRA 3')를 함유하는 25 ㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다. 열 사이클링 조건은 다음과 같았다: 2분 동안 50℃에서 UNG의 최초 활성화 후, 15분 동안 95℃에서 택 골드(Taq Gold)의 활성화 및 UNG를 불활성화시켰다. 이후, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃에서 40주기의 증폭을 수행하였다. 둘 모두의 PCR을 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템 (ABI Prism 7700 Sequence Detection Systems, Applied Biosystems)을 이용하여 마이크로앰프 옵티컬 96-웰 반응 플레이트 (MicroAmp optical 96-well reaction plates, Applied Biosystems)에서 동시에 수행하였다. 평균 기준 형광을 PCR 주기 3 내지 15로 계산하고, Ct를 리포터 염료의 표준화된 형광 강도가 0.05가 되는 PCR 사이클로 정의하였다. 공지된 카피수(반응당 106 내지 4 카피)를 지닌 두개의 표준 곡선을 DNA 양의 최초 입력의 대수에 대한 Ct 값을 플로팅함으로써 각각의 택맨(TaqMan) 분석에서 생성하였다. 표준 희석액 및 cDNA 샘플을 이중 및 삼중으로 각각 분석하였다. 둘 모두의 PCR은 유효하였고, 연장된 동적 구역(6 log), 높은 민감도(< 10 카피수/반응), 우수한 재현성(CV<5%) 및 반복성(CV<5%)을 나타내었다.
결과
결과를 표 1에 나타내었다. SFCMM-3 벡터 상층액의 6개의 임상 등급 로트(lot), 뿐만 아니라 형질도입된 림프구의 9개의 제조물을 분석하였다. 스플라이싱 된 형태의 상대 빈도는 SFCMM-3 상층액의 모든 6개의 임상 등급의 로트(1.12 +/- 0.75, 범위 0.65-2.60), 뿐만 아니라 SFCMM-3 상층액으로 형질도입된 T 림프구의 9개의 제조물(1.89 +/- 1.22, 범위 0.84- 4.00)에서 5% 미만이었다.
실시예 2 - scSFCMM-3 상층액 및 형질도입된 세포에서의 스플라이싱된 TK의 변형체
재료 및 방법
scSFCMM-3 레트로바이러스 벡터 및 생산자 세포주
벡터 DNA TK3 (TK3 Molmed and TK3 are different preparations of the same plasmid scSFCMM-3, described in: Chalmers 2001, Molecular Therapy 4: 146-148)를 칼슘 포스페이트 동반침전에 의해 외생 패키징 세포주 GP+ E-86 (E86)로 트랜스펙션시켰다. E86 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 수득된 상층액을 여과한 후, Am12 세포주를 감염시키기 위해 사용하였다. TK3를 함유하는 세포의 단편을 면역자기 선택을 이용하여 분리시키고, 생성된 Am12/TK3 벌크 배양물을 확장시켰다. Am12/TK3 벌크 배양물을 제한 희석시킨 후, 클론 #53, #71 및 #80을 높은 성장력 및 T 림프구에서의 형질도입 효율에 기초하여 선택하였다.
Am12/TK3 클론을 2 mM 글루타민 및 10%의 방사선 조사된 FBS (Hyclone)를 함유하는 DMEM (Cambrex)에서 확장시켰다. 33℃에서 세포의 24시간의 인큐베이션 후 2 mM 글루타민이 보충된 X-VIVO 15 배지 (Cambrex)에서 레트로바이러스 상층액을 수거하였다. 바이러스 함유 상층액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고, 추가 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.
T 세포 형질도입
말초혈액 단핵세포를 여러 건강한 공여자로부터 수집하고, 림포프렙 (Nycomed)상에서 원심분리하여 분리시켰다.
말초혈액 림프구(PBL)를 OKT3 (30 ng/ml) (Orthoclone)으로 자극시키고, 3%의 자가 혈장, 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI (Hyclone)에서 배양하고, 재조합 인간 인터루킨 2,600 IU/ml (Proleukin)을 보충하였다. PBL의 형질도입을 OKT3-자극된 PBL 상에서 레트로바이러스 벡터 입자의 원심분리에 의해 수행하였다. OKT3 자극 2일 및 3일 후 두번의 원심분리 사이클을 수행하였다.
형질도입기 후, PBL을 수집하고, 세포 표면 표지로 사용되는 ΔLNGFR 분자를 이용하여 FACS 분석에 의해 실제로 형질도입된 세포의 %를 평가하였다. 이후, 형질도입된 세포를 자기 비드 (Dynabeads)에 컨쥬게이션된 항체로 분류하고, 몇일 동안 배양하여 확장시키고, PCR 분석을 위한 펠레트를 제조하였다.
중합효소 연쇄반응
벌크 생산자 세포주(Am12/TK3 Bulk 2) 뿐만 아니라 제한 희석에 의해 수득한 단일 생산자 세포주 클론(Am12/TK3 #53, #71 및 #80)을 분석하였다. 감염성 바이러스 입자를 함유하는 배양 상층액으로부터 RNA를 추출하였다.
HTK4+ (5'- TTC TCT AGG CGC CGG AAT TCG TT- 3') 및 HTK2- (5'- ATC CAG GAT AAA GAC GTG CAT GG-3') 프라이머 또는 TKA1 (5'- CGT ACC CGA GCC GAT GAC TT-3') 및 TKB1 (5'-TGT GTC TGT CCT CCG GAA GG-3') 프라이머를 이용하여 RT-PCR 을 수행하였다. 10 ㎕의 RNA DNase-처리된, 1.5 mM의 MgCl2 (PE Applied Biosystems)를 지닌 1X RT-PCR 완충용액, 200 μM의 각각의 데옥시누클레오티드(dNTP), 200 nM의 각각의 프라이머, 5 mM의 디티오트레이톨(DTT), 20 U의 RNase 억제제, 1 ㎕의 타이탄 효소 믹스(Titan Enzyme mix)를 함유하는 50 ㎕의 반응 혼합물에서 타이탄 원 튜브 RT-PCR 시스템(Titan One tube RT-PCR System, Roche)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
Am12/SFCMM-3 #35로부터의 상층액 및 SFCMM-3 형질도입된 림프구로부터의 DNA를 대조군으로 사용하였다. RT-대조군을 또한 동시에 영동시켰다.
RT-PCR 사이클링 프로파일은 50℃에서 30분 동안 첫번째 역전사 단계, 94℃에서 2분 동안의 변성 단계 후, 95℃에서 30초 동안의 변성, 60℃에서 30초 동안의 어닐링 및 68℃에서 1분 30초 동안의 신장의 40사이클, 및 68℃에서 10분 동안의 1회의 최종 신장 단계로 구성된다. 증폭된 생성물의 10 ㎕를 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
SFCMM-3 또는 TK3 벡터로 형질도입된 여러 공여자의 PBL로부터 유전체 DNA를 추출하였다. PCR을 100-500 ng의 유전체 DNA, 1.5 mM의 MgCl2를 지닌 1X PCR 완충용액(Applied Biosystems), 200 μM의 각각의 dNTP, 1600 nM의 각각의 프라이머 TK2S (5'- CCA TAG CAA CCG ACG TAC G-3') 및 TKAS (5'- GAA TCG CGG CCA GCA TAG C-3')를 함유하는 25㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다. PCR 사이클링 프로파일은 94℃에서 15분 동안의 첫번째 변성 단계 후, 95℃에서 1분 동안의 변성, 65℃에서 30초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1분 동안의 신장의 38주기, 및 72℃에서 10분 동안의 1회의 최종 신장 단계로 구성된다. 10 ㎕의 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다.
동일한 샘플에서, PCR을 100 - 500 ng의 유전체 DNA, 1.5 mM의 MgCl2를 지닌 1X PCR 완충용액(Applied Biosystems), 200 μM의 각각의 dNTP, 300 nM의 각각의 프라이머 HTK4+ (5'- TTC TCT AGG CGC CGG AAT TCG TT-3') 및 HTK2- (5'- ATC CAG GAT AAA GAC GTG CAT GG-3'), 1.25 U의 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold, Applied Biosystems)를 함유하는 25 ㎕의 반응 혼합물에서 수행하였다. PCR 사이클링 프로파일은 94℃에서 15분 동안의 첫번째 변성 단계 후, 95℃에서 30초 동안의 변성, 60℃에서 50초 동안의 어닐링 및 72℃에서 1분 동안의 신장의 40주기, 및 72℃에서 10분 동안의 1회의 최종 신장 단계로 구성된다. 10 ㎕의 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다.
TK3 스플라이싱된 형태의 cDNA 서열 분석
Am12/TK3#53 상층액으로부터의 HTK4+/HTK2-프라이머로 증폭된 생성물의 아래쪽의 밴드를 자동화 형광 DNA 서열분석 장치를 이용하여 서열분석하였다. 서열 분석은 PRIMM (Milan, Italy)으로 수행하였다.
결과
배양물 상층액의 RNA로부터의 HSV-tk RT-PCR
두개의 PCR 생성물을 Am12 및 E86 패키징 세포주에 의해 생성된 SFCMM-3 및 TK3 벡터로부터의 RNA를 분석하여 검출하였다(도 3). TK3 벡터는 기재된 scSFCMM-3 벡터에 해당한다(Chalmers, 2001). 보다 큰 생성물(상부 밴드)은 모든 샘플에서 HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태(HTK4+/HTK2- 프라이머를 지닌 1020개의 염기쌍(bp); TKA1/TKB1 프라이머를 이용하여 401 bp)에 해당한다. SFCMM-3샘플에서의 보다 작은 생성물(하부 밴드)의 크기는 227 bp가 결실된 기재된 스플라이싱된 형태에 해당한다(Garin 2001, Blood 97:122-129).
반대로, TK3 샘플에서의 보다 작은 생성물의 크기는 약간 더 크고, 이는 보다 작은 단편이 결실된 상이한 스플라이싱된 형태의 존재를 암시하며; SFCMM-3 및 TK3 샘플 사이의 이러한 차이는 TK2S/TKAS 프라이머를 이용하여 특히 명백하다. 추가로, HTK4+/HTK2- 프라이머를 이용하여 관찰된 중간 생성물은 단지 가능한 PCR 인공물로 간주된다.
형질도입된 림프구로부터의 DNA에 대한 HSV-tk PCR
두개의 PCR 생성물을 SFCMM-3 및 TK3 형질도입된 PBL로부터의 DNA를 분석하여 검출하였다(도 4). 보다 큰 생성물(상부 밴드)는 HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태(TK2S/TKAS 프라이머를 이용하여 644 bp; HTK4+/HTK2- 프라이머를 이용하여 1020 bp)에 해당한다. SFCMM-3 샘플 내의 보다 작은 밴드(기재된 스플라이싱된 형태에 해당함)의 크기는 TK2S/TKAS 프라이머를 이용하여 417 bp 및 HTK4+/HTK2- 프라이머를 이용하여 793 bp이다.
SFCMM-3 대 TK3의 HSV-tk 유전자의 중요 부분의 서열
SFCMM-3 대 TK3의 HSV-tk 유전자의 중요 부분의 서열을 도 5에 도시하였다. SFCMM-3 및 TK3의 스플라이싱된 형태에서 결실된 유전자 단편을 이탤릭체로 나타내었다. 해당하는 스플라이싱 공여 및 수용 부위에 밑줄을 그었다.
서열 데이터는 상이한 스플라이싱된 형태가 SFCMM-3 (227 bp 결실) 및 TK3 (214 bp 결실) 샘플에서 발생하였음을 확증한다. 둘 모두의 경우에서 예상되는 바와 같이, GU 및 AG 디누클레오티드는 각각 결실된 서열의 5' 및 3' 가장자리에 존재한다.
실시예 3 - 부위 특이적 돌연변이유발에 의한 스플라이싱의 제거
재료 및 방법
야생형 SFCMM-3 벡터로부터 출발하여, HSV-tk 유전자 내의 상이한 변이를 이용한 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 재조합 플라스미드를 제조하였다(도 6). 3개-염기 퇴화 변이를 도입시키고, 이에 따라 모든 경우에서, HSV-tk 효소의 야생형 아미노산 서열을 보존시켰다.
부위 특이적 돌연변이유발
pcDNA3.1-tk 플라스미드를 생성시키기 위해, SFCMM-3 플라스미드를 EcoRI 및 XhoI으로 분해시키고, EcoRI/XhoI 단편을 EcoRI/XhoI 분해된 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 라이게이션시켰다.
pcDNA3.1-tk 플라스미드로부터, 퀵체인지(QuickChange) 부위 특이적 돌연변이유발 키트 (Stratagene)를 이용하여 부위 특이적 돌연변이유발시킴으로써 모든 HSV-tk 변이를 생성시켰다. 요망되는 변이를 도입시키기 위해 사용되는 올리고누클레오티드 프라이머는 벡터의 반대 가닥에 각각 상보적이었다. 센스 프라이머의 서열을 하기 표에 나타내었다:
a 누클레오티드 변이의 위치는 굵은 글씨의 밑줄로 나타내었다.
b 수는 각각의 SFCMM-3 HSV-tk 플라스미드 클론 변이의 수를 의미한다.
생성된 벡터를 서열분석하여 정확한 누클레오티드 치환을 확인하였다. 이후, HSV-tk 변이된 단편을 EcoRI 및 XhoI으로 분해하여 pcDNA3.1으로부터 분리한 후, SFCMM-3 플라스미드로 클로닝하여 SFCMM-3 HSV-tk 변이를 생성시켰다.
SFCMM-3 HSV-tk 변이의 서열 확인(도 1) 후, 각각의 타입의 하나의 플라스미드 클론을 E86 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키기 위해 사용하였다. SFCMM-3 및 TK3 플라스미드를 대조군으로 사용하였다. E86 배양물로부터 상층액을 수집하고, 실시예 2의 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 양생 패키징 세포주 Am12를 안정적으로 형질도입시키기 위해 사용하였다. 생성된 세포 집단을 ΔLNGFR 발현을 위해 선택하였다.
감염성 레트로바이러스 입자를 함유하는 E86 및 Am12 배양 상층액으로부터 RNA를 추출하였다. 실시예 2의 재료 및 방법 섹션에 기재된 프로토콜에 따라 TKA1 및 TKB1 프라이머를 이용하여 E86 및 Am12 상층액으로부터의 RNA에 대해 RT-PCR 반응을 수행하였다.
CEM A301 세포주 및 PBL의 형질도입 및 PCR 분석
CEM A301 세포를 10% FBS (Hyclone) 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640 (Hyclone)에서 배양하였다. CEM A301 세포를 SFCMM-3 HSV-tk 변이 2 및 234를 함유하는 Am12 배양물 상층액으로 감염시켰다. 형질도입 하루 전에 5X105 세포/ml를 배양하였다. 이후, 세포에 대해 레트로바이러스 벡터 입자의 1회의 원심분리 사이클에 의해 형질도입을 수행하였다. 형질도입기 후, 세포를 수집하고, FACS 분석에 의해 실제 형질도입된 세포의 %를 평가하였다. 세개의 상이한 공여체로부터의 PBL을 SFCMM-3 HSV-tk 변이 2 및 SFCMM-3를 함유하는 Am12 상층액으로 형질도입시켰다(실시예 2의 재료 및 방법에 기재된 바에 따름).
이후, 형질도입된 세포를 ΔLNGFR 발현에 대해 분류하고, 몇일 동안 배양하여 확장시켰다.
PCR 분석을 위한 펠레트를 형질도입된 선택되지 않은 세포 및 실시예 2의 재 료 및 방법에 기재된 형질도입된 선택된 세포로부터 제조하였다. 유전체 DNA를 펠레트 세포로부터 추출하고, PCR 반응을 100-500 ng의 유전체 DNA, 1.5 mM의 MgCl2를 지닌 1X PCR 완충용액(Applied Biosystems), 200 nM의 각각의 dNTPs, 300 nM의 각각의 프라이머, 1.25 유닛의 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold, Applied Biosystems)를 함유하는 25 ㎕의 반응 혼합물에서 TKA1 및 TKB1 또는 TKY1 및 TKY2 또는 TKZ1 및 TKZ2 프라이머 (하기 표에 나타낸 바와 같음)를 이용하여 수행하였다. PCR 사이클링 프로파일은 94℃에서 15분 동안의 첫번째 변성 단계 후, 94℃에서 30초 동안의 변성, 60℃에서 50초 동안의 어닐링, 72℃에서 1분 동안 신장의 40주기, 72℃에서 10분 동안의 1회의 최종 신장 단계로 구성된다. 10 ㎕의 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
결과
E86 상층액의 HSV-tk 변이의 스플라이싱 특성
HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태(401 bp)에 해당하는 보다 큰 생성물(상부 밴드)는 네거티브 대조군(트랜스펙션되지 않은 E86 세포인 E86 C-으로부터의 상층액)을 제외하고 모든 샘플에서 발견되었다(도 7).
SFCMM-3 및 TK3 벡터에 관하여, 보다 작은 생성물(하부 밴드)는 E86 패키징 세포주에 의해 생성된 모든 변이 벡터로부터의 RNA에서 덜 풍부하였다.
Am12 상층액의 HSV-tk 변이의 스플라이싱 특성
HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태는 네거티브 대조군(감염되지 않은 세포인 Am12 C- 및 H2O으로부터의 상층액)을 제외하고 모든 샘플에서 검출되었다(도 8). 아래쪽의 밴드는 각각 TK3 및 SFCMM-3 샘플의 아래쪽의 밴드에 해당하는 TkMut4 (변이 4) 및 TkMut34 (변이 3+4) 변이에서 검출된다. 에티디움 브로마이드 신호의 강도는 TK3 및 SFCMM-3에 비해 작았고, 이는 스플라이싱된 생성물이 변이 내에 보다 적게 존재하는 것을 나타낸다. 이러한 밴드는 TkMut2 (변이 2), TkMut234 (변이 2+3+4) 및 TkMut24 (변이 2+4) 변이에서 검출되지 않는다. 게다가, 약 100 및 200 bp의 두개의 매우 약한 밴드가 TkMut2, TkMut234 및 TkMut24 변이에서 검출된다.
형질도입된 CEM A301 세포 및 PBL의 HSV-tk 변이의 스플라이싱 특성
TkMut2 및 TkMut234 변이 및 SFCMM-3 및 TK3 상층액으로 형질도입된 CEM A301으로부터의 유전체 DNA를 TKA1/TKB1 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 분석하였다. HSV-tk (401 bp)의 스플라이싱되지 않은 형태는 네거티브 대조군(형질도입되지 않은 세포인 CEM NT 및 H20)을 제외한 모든 샘플에서 검출된다(도 9). 아래쪽의 밴드가 TK3 및 SFCMM-3 사전선택(preselection) 및 사후선택(postselection) 샘플에서 검출되고, 이는 HSV-tk 유전자의 스플라이싱된 형태에 해당한다. 선택 전 및 후에, TkMut2 및 TkMut234 변이로 형질도입된 CEM에서 아래쪽의 밴드는 관찰되지 않는다.
HSV-tk 유전자의 다양한 영역에서 발생하는 대안적 스플라이싱 이벤트의 가능성을 배제시키기 위해, TkMut2 및 SFCMM-3 상층액으로 형질도입된 CEM A301의 보다 광범위한 분석을 TKY1/TKY2 및 TKZ1/TKZ2 프라이머를 이용하여 수행하였다.
HSV-tk의 스플라이싱되지 않은 형태(각각 542 bp 및 1149 bp)는 모든 샘플에서 검출된다(도 10). 아래쪽의 밴드가 SFCMM-3 사전선택 및 사후선택 샘플에서 검출되고, 이는 HSV-tk 유전자의 스플라이싱된 형태에 해당한다. TKY1/TKY2 및 TKZ1/TKZ2 PCR 프라이머중 어떤 것을 이용하여도 TkMut2로 형질도입된 CEM에서는 아래쪽의 밴드가 관찰되지 않았다.
SFCMM-3 및/또는 TkMut2 상층액으로 형질도입된 세개의 상이한 공여체(Donl, Don2, Don3)의 PBL로부터의 유전체 DNA를 TKA1/TKB1 프라이머를 이용하는 PCR로 분석하였다. HSV-tk (401 bp)의 스플라이싱되지 않은 형태가 모든 샘플에서 검출된다(도 11). 보다 적은 밴드가 SFCMM-3 샘플에서 검출되고, 이는 HSV-tk 유전자의 스플라이싱된 형태에 해당한다. TkMut2으로 형질도입된 PBL에서 아래쪽의 밴드는 관찰되지 않았다. 전장의 HSV-tk 유전자(1149 bp)를 포함하는 TKZ1/TKZ2 프라이머를 이용하여 동일한 결과가 수득되었고(도 12), 따라서 이는 도입된 변이가 다양한 스플라이싱 변형체를 생성할 수 있는 가능성을 배제한다.
종합적인 이러한 발견들은 도입된 변이가 형질도입된 CEM 및 형질도입된 림프구에서 임의의 HSV-tk 유전자의 스플라이싱된 형태를 완전히 없애거나, 적어도 매우 현저하게 감소시키는 것을 나타낸다.
표 1. SFCMM-3 상층액 및 형질도입된 PBL에 대한 HSV-tk 형질도입된 형태의 분석
| SFCMM-3 벡터 상층액 Lot 수 | 스플라이싱된 HSV-tk/스플라이싱되지 않은 HSV-tk + 스플라이싱된 HSV-tk(%) | |
| RNA(상층액) | DNA(형질도입된 PBL) | |
| 50.302-22 | 0.65 | 0.84 |
| 1.25 | ||
| 50.302-23 | 0.65 | 1.50 |
| 50.302-24 | 0.98 | 1.58 |
| 50.302-26 | 0.72 | 1.00 |
| 0.92 | ||
| 2.02 | ||
| 02/047 | 1.10 | 3.86 |
| 03/087 | 2.60 | 4.00 |
| 평균 | 1.12 | 1.89 |
| sd | 0.75 | 1.22 |
| n | 6 | 9 |
| 최소값 | 0.65 | 0.84 |
| 최대값 | 2.60 | 4.00 |
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 본 발명에 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정의 바람직한 구체예와 관련하여 기재되나, 청구되는 본 발명은 이러한 특정 구체예로 과도하게 제한되는 것이 아님이 이해되어야 한다. 또한, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 모드의 다양한 변이는 하기의 청구의 범위의 범위에 속한다.
참조문헌
SEQUENCE LISTING
SFCMM-3
CCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCA
GATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATGTCGGGGG
GGAGGCTGGGAGTTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCC
CATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCA
GGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACAAACATCGTGTT
TK3
CCGCCTCGACCAAGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCA
GATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATGTCGGGGG
GGAGGCTGGGAGTTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCC
CATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGATACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCA
AGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACAAACATCGTGTT
Claims (53)
- 스플라이스(splice) 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드가 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 1항에 있어서, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 도 1의 야생형 서열의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드가 T에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되 고, 스플라이스 수용 부위의 누클레오티드가 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 5항에 있어서, 위치 329 및 330에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드가 T에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 스플라이스 공여 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상 및 도 1의 야생형 서열의 위치 662 및 663의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 변경되지 않은, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 8항에 있어서, 위치 554 및 555에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 변경되지 않음을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 위치 662 및 663에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 변경되지 않음을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 8항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 위치 329 및 330에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 8항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드가 T에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut2 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 누클레오티드(들)에 해당하는 스플라이스 수용 부위 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항에 있어서, 위치 541 및 542에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 위치 329 및 330에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항 내지 제 16항중 어느 한 항에 있어서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드가 T에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항 내지 제 17항중 어느 한 항에 있어서, 위치 541에 해당하는 누클레오티드가 A에서 T로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 위치 542에 해당하는 누클레오티드가 G에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 14항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또한 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않음을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 20항에 있어서, 위치 555에 해당하는 누클레오티드가 G에서 A로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut23 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut234 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330의 누클레오티드(들)에 해당하는 스플라이스 수용 부위 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체되고, 도 1의 야생형 서열의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 24항에 있어서, 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 329 및 330에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 위치 330에 해당하는 누클레오티드가 T에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 24항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서, 위치 555에 해당하는 누클레오티드가 G에서 A로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut24 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 야생형 서열(Tk wt)의 위치 554 및 555의 스플라이스 수용 부위 누클레오티드에 해당하는 누클레오티드중 하나 이상이 또 다른 누클레오티드로 대체된, 티미딘 키나아제를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 29항에 있어서, 위치 555에 해당하는 누클레오티드가 G에서 A로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 도 1의 야생형 서열의 위치 541 및 542의 누클레오티드에 해당하는 스플라이스 수용 부위 누클레오티드중 하나 이상이 또한 또 다른 누클레오티드로 대체됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 31항에 있어서, 위치 541 및 542에 해당하는 둘 모두의 누클레오티드가 또 다른 누클레오티드로 대체되어, 스플라이스 부위가 존재하지 않음을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 위치 541에 해당하는 누클레오티드가 A에서 T로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 31항 내지 제 33항중 어느 한 항에 있어서, 위치 542에 해당하는 누클레오티드가 G에서 C로 변경됨을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut4 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 도 1의 TkMut34 서열을 포함하는 폴리누클레오티드.
- 제 1항 내지 제 36항중 어느 한 항에 있어서, 대체 누클레오티드가 상기 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 서열을 변화시키지 않음을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
- 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드 또는 제 38항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터, 또는 제 39항에 정의된 숙주 세포, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물.
- (ⅰ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드; 또는 제 38항에 정의된 벡터, 또는 제 39항에 정의된 숙주 세포, 또는 제 40항에 정의된 약제 조성물; 및(ⅲ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 포함하는 키트.
- 약제로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터, 제 39항에 정의된 숙주 세포 또는 제 40항에 정의된 약제 조성물.
- 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자의 치료에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터, 제 39항에 정의된 숙주 세포 또는 제 40항에 정의된 약제 조성물, 및 실질적 비독성제를 함유하는 생성물로서, 실질적 비독성제가 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 생성물.
- (ⅱ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 또는 제 38항에 정의된 벡터를 세포에 도입시키고, (ⅱ) 상기 세포를 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제와 동시적, 개별적 또는 순차적으로 접촉시키는 것을 포함하여 세포를 파괴하는 방법.
- (ⅰ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 또는 제 38항에 정의된 벡터를 세포에 도입시키고; (ⅱ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅲ) 상기 세포를 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제와 접촉시키는 것을 포함하여 세포를 파괴하는 방법.
- (ⅰ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터 또는 제 40항에 정의된 약제 조성물을 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자에게 도입시키고; (ⅱ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 상기 환자에 동시적, 개별적 또는 순차적으로 도입시키는 것을 포함하여 상기 환자를 치료하는 방법.
- (ⅰ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터 또는 제 40항에 정의된 약제 조성물을 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자에 도입시키고; (ⅱ) 상기 폴리누클레오티드 또는 벡터를 상기 세포에 흡수시키고; (ⅲ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅳ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 상기 환자에게 도입시키는 것을 포함하여 상기 환자를 치료하는 방법.
- (ⅰ) 파괴를 요하는 세포를 지닌 환자로부터의 상기 세포 또는 공여 세포를 분리하고; (ⅱ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 또는 제 38항에 따른 벡터를 생체 외에서 상기 세포로 도입시키고; (ⅲ) 변형된 세포를 상기 환자에 도입시키고; (ⅳ) 상기 세포에서 티미딘 키나아제를 발현시키고; (ⅴ) 티미딘 키나아제에 의해 독성제로 전환되는 실질적 비독성제를 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하여 상기 환자를 치료하는 방법.
- (ⅰ) 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드 또는 제 38항에 따른 벡터를 포함하도록 유전공학 처리된 T 세포를 숙주에 투여하고; (ⅱ) 티미딘 키나아제와의 상호작용을 통해 상기 유전공학 처리된 T 세포를 사멸시키기에 충분한 양의 실질적 비독성제를 이식편-대-숙주병이 발병하기 전에 상기 숙주에 투여하는 것을 포함하여, 환자의 이식편-대-숙주병을 예방하는 방법.
- 실질적 비독성제가 갠시클로버(ganciclovir), 아시클로버(acyclovir), 트리플루로티미딘, 1-[2-데옥시, 2-플루오로, β-D-아라비노 푸라노실]-5-요오도우라실, 아라-A, 아라 1, 1-β-D 아라비노 푸라노실 티민, 5-에틸-2'데옥시우린, 5-요오도-5'-아미노-2, 5'-디데옥시우리딘, 요오독스우리딘, AZT, AIV, 디데옥시시티딘, 아라 C 및 브로모비닐 데옥시우리딘(BVDU)중 어느 하나인, 제 43항에 따른 생성물 또는 제 44항 내지 제 49항중 어느 한 항에 따른 방법.
- 환자의 세포를 파괴하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터 또는 제 39항에 정의된 숙주 세포의 용도.
- 암 치료용 약제의 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터 또는 제 39항에 정의된 숙주 세포의 용도.
- 이식편-대-숙주병을 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 37항중 어느 한 항에 정의된 폴리누클레오티드, 제 38항에 정의된 벡터 또는 제 39항에 정의된 숙주 세포의 용도.
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2018
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