CN101010428A

CN101010428A - 胸苷激酶

Info

Publication number: CN101010428A
Application number: CNA2005800286686A
Authority: CN
Inventors: F·萨尔瓦托里; S·马萨; M·拉德里扎尼; S·托马
Original assignee: MolMed SpA
Current assignee: AGC Biologics SpA
Priority date: 2004-06-18
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2025-06-17
Also published as: KR101337210B1; CY1111925T1; IL213084A0; US20140178345A1; EP1781789A2; US10314925B2; ES2372022T3; EP1781789B1; IL179660A0; NL300856I2; WO2005123912A3; SI1781789T1; LTC1781789I2; US8357788B2; US9005945B2; CY2016054I2; KR20070032786A; CN101010428B; AU2005254807B2; WO2005123912A2

Abstract

一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中剪接受体位点的核苷酸没有变化。

Description

胸苷激酶

发明领域

本发明涉及一种编码实质上非剪接的胸苷激酶的核酸及其在治疗中的用途。

发明背景

人们对代谢自杀基因在基因治疗中的用途存在相当大的兴趣。在文献中描述了许多自杀基因，诸如例如编码胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶或胸苷激酶的基因。从治疗的角度来说，在这些基因中，编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-tk)的基因是特别有利的。HSV-tk基因表达下述酶，在与核苷酸类似物更昔洛韦(ganciclovir)组合使用时，所述酶能够特异性地去除处于分裂中的细胞。特别重要的是与应用HSV-tk/更昔洛韦相关的扩大的毒性作用(“旁观者”效应)的存在。这种作用出现在对已经引入胸苷激酶(tk)基因的细胞以及周围的细胞的破坏中。

HSV-tk/更昔洛韦系统的作用机制可以被概述如下：被修饰为表达TK酶的哺乳动物细胞进行第一步更昔洛韦的磷酸化，以产生更昔洛韦单磷酸酯。接着，细胞激酶使这种更昔洛韦单磷酸酯被连续代谢为二磷酸酯，以及接着为三磷酸酯。由此产生的更昔洛韦三磷酸酯进而通过被插入到DNA中产生毒性作用，并且部分抑制细胞DNA聚合酶α，因此造成DNA合成被停止并因此导致细胞死亡(Moolten，1986；Mullen，1994)。

HSV-tk/更昔洛韦系统可以被用于很多种治疗应用中，并且在过去的十年中已经完成了大量临床试验。在基因治疗中使用HSV-tk基因的方法被公开于例如WO90/07936、US 5,837,510、US 5,861,290、WO98/04290、WO 97/37542和US 5,631,236中。

HSV-tk/更昔洛韦系统的一种令人感兴趣的应用是在于防止移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)，GvHD是能够干扰同种异体(allogeneic)骨髓移植结果的疾病，同种异体骨髓移植是多种血液恶性肿瘤的治疗选择。当被移植的干细胞移植物中的T细胞开始攻击受体的身体时，将发生GvHD。从移植物中去除T细胞可防止GvHD，但也会有助于疾病的复发和移植物的排异反应。为抵挡这些效应，可以在同种异体骨髓移植后的一段延迟时间后，通过引入供体T淋巴细胞，对同种异体骨髓移植患者进行治疗。在出现GvHD的情况下，将HSV-tk基因转入供体T淋巴细胞则允许在给药更昔洛韦之后去除T淋巴细胞。在一次试验中，患者接受了去除T细胞的骨髓移植，以及增加剂量的用HSV-tk基因转导过的供体淋巴细胞(Tiberghien等人，2001)。在所有患者中，移植后超过1年的时间都可检测到循环状态下的表达HSV-tk的细胞。在12位患者中有6位患者发生了GvHD并接受了更昔洛韦，这实质上降低了循环状态下被修饰细胞的数目(绝对数目上平均降低了85％)。

已经制造了HSV-tk基因中的突变体，所述突变体提高了该基因的生物活性。这类突变体HSV-tk基因的例子被描述于例如Kokoris等人(1999)，WO 95/30007、US 5,877,010、WO 99/19466和WO 95/14102中。然而，与胸苷激酶/更昔洛韦系统相关的一个严重问题是在HSV-tk转导过的细胞中出现对更昔洛韦的抗性。这是特别重要的，因为随着治疗的进程，对更昔洛韦有抗性的细胞的相对比例会快速地提高。

在用含有HSV-tk基因的反转录病毒载体转导过的成淋巴细胞样人类T细胞系中，对更昔洛韦的抗性的存在被发现与HSV-tk基因中227个碱基对的缺失相关(Fillat等人，2003)。相同的缺失还存在于用该载体转导的人类初级T细胞(primary T cell)中以及接受了被转导的供体T细胞的12位患者中(Garin等人，2001)。WO 01/79502公开：这种缺失的原因被认为相信是：在HSV-tk mRNA中作为剪接位点发挥作用的核苷酸序列的存在，其导致一定比例的携带该基因异常形式的病毒颗粒以及携带全长该基因的其余病毒颗粒的产生。在WO 01/79502以及在Chalmers 2001，Molecular Therapy 4：146-148中公开了胸苷激酶基因的一种突变体，其中所述剪接位点被去除，其降低了胸苷激酶基因的异常形式的产生。然而，该突变体仍然与有害量的基因剪接相关。CD34-tk融合构建体(construct)被公开于Rettig等人，2003中。这些融合构建体含有经修饰的HSV-tk基因。然而，没有证明这些经修饰的基因降低了HSV-tk mRNA的剪接。

因此，存在对下述经修饰的胸苷激酶基因的需要，所述基因不易被进行基因剪接，并解决了与更昔洛韦抗性相关的问题。

发明内容

本发明通过提供一种较之之前所公开的HSV-tk基因能表达更高比例未剪接mRNA的HSV-tk基因，克服了上述的问题。我们已经鉴定出了在之前所鉴定的受体位点上游14个碱基对处的剪接受体位点。我们显示：之前通过修饰前面所鉴定的供体和受体位点来抑制剪接的努力能够激活受体位点以及后续的基因剪接。令人吃惊地，我们证实，在某些特定的核苷酸对HSV-tk基因的修饰提供了能够表达基本上没有剪接mRNA的HSV-tk基因。特别地，我们展示出，在剪接供体位点上的核苷酸中的至少一个的突变会实质上防止剪接。

发明综述

根据本发明的第一个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中对应于剪接供体位点核苷酸的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸替换，并且其中剪接受体位点的核苷酸没有变化。

优选地，与图1中野生型序列(Tk wt)中位置329和330上剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中剪接受体位点的核苷酸没有变化。

在一个实施方式中，位置330的核苷酸被从T变化为C。

根据本发明的第二个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(Tk wt)中位置329和330上剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中所述剪接受体位点的核苷酸没有变化。

在一个实施方式中，对应于图1中野生型序列位置329和330的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

在一个实施方式中，对应于位置330的核苷酸被从T变化为C。

根据本发明的第三个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1中野生型序列(Tk wt)中位置329和330上剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1中野生型序列的位置554和555上剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个，以及与位置662和663上剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个没有变化。

优选地，对应于位置554和555的两个核苷酸都没有变化。

优选地，对应于位置662和663的两个核苷酸都没有变化。

在一个实施方式中，与图1中野生型序列的位置329和330上剪接供体位点核苷酸的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换

在一个实施方式中，位置330的核苷酸被从T变化为C。

根据本发明的第四个方面，提供了一种多核苷酸，其包含图1中的TkMut2序列。

根据本发明的第五个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列的位置329和330上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1的野生型序列的位置541和542上的剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

在一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置329和330上的剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换

在一个实施方式中，与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

在另一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置541和542上剪接供体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

在另一个实施方式中，与位置541上的核苷酸对应的核苷酸被从A变化为T。

在另一个实施方式中，与位置542上的核苷酸对应的核苷酸被从G变化为C。

在另一个实施方式中，与图1中的野生型序列的位置554和555上的剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个也被其它核苷酸所替换，从而不存在剪接位点。

在一个实施方式中，与图1中的野生型序列的位置541和542上的剪接受体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换，从而不存在剪接位点。

在另一个实施方式中，与位置555上的核苷酸对应的核苷酸被从G变化为A。

根据本发明的第六个方面，提供了一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut23序列。

根据本发明的第七个方面，提供了一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut234序列。

根据本发明的第八个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(Tk wt)的位置329和330上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1的野生型序列的位置554和555上剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸被其它核苷酸所替换。

在一个实施方式中，与图1中野生型序列(Tk wt)的位置329和330上的剪接受体核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

在另一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置554和555剪接受体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

优选地，与位置330上的核苷酸对应的核苷酸被从T变化为C。

优选地，与位置555上的核苷酸对应的核苷酸被从G变化为A。

根据本发明的第九个方面，提供了一种多核苷酸，其含有图1中的Tk-Mut24序列。

根据本发明的第十个方面，提供了一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(Tk wt)的位置554和555上剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

在一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置554和555上的剪接供体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

在一个实施方式中，与位置555的核苷酸对应的核苷酸被从G变化为A。

在一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置541和542上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个也被其它核苷酸所替换。

在另一个实施方式中，与图1的野生型序列的位置541和542上的剪接受体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换，从而不存在剪接位点。

根据本发明的第十一个方面，提供了一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut4序列。

根据本发明的第十二个方面，提供了一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut34序列。

优选地，所述的核苷酸替换不改变由所述核苷酸序列所编码的多肽的序列。

根据本发明的第十三个方面，提供了一种载体，其含有本发明的多核苷酸。

优选地，该载体是表达载体。

根据本发明的第十四方面，提供了一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或载体。

根据本发明的第十五个方面，提供了一种药物组合物，其含有本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞以及药学上可以接受的载体。

根据本发明的第十六个方面，提供了一种试剂盒，其包括：

(i)本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物；以及

(ii)基本上(substantially)无毒的试剂，其能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第十七个方面，提供了用于医药的本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。

根据本发明的第十八个方面，提供了含有本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物以及基本上无毒的试剂的产品，其在对具有需要被破坏的细胞的患者的治疗中同时、分别或连续使用，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第十九个方面，提供了一种破坏细胞的方法，其包括：

(i)将本发明的多核苷酸或载体引入所述细胞；以及

(ii)将所述细胞同时、分别或连续接触基本上无毒的试剂，所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第二十个方面，提供了一种破坏细胞的方法，其包括：

(i)将本发明的多核苷酸或载体引入所述细胞；

(ii)使所述细胞表达胸苷激酶；和

(ii)使所述细胞接触基本上无毒的试剂，所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第二十一方面，提供了一种对具有需要被破坏的细胞的患者进行治疗的方法，其包括：

(i)将本发明的多核苷酸、载体或药物组合物引入所述患者；

(ii)同时、分别或连续将基本上无毒的试剂引入所述患者，所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第二十二个方面，提供了一种对具有需要被破坏的细胞的患者进行治疗的方法，其包括：

(i)将本发明的多核苷酸、载体或药物组合物引入所述患者；

(ii)使所述多核苷酸或载体被所述细胞吸收；

(iii)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

(iv)将基本上无毒的试剂引入所述患者，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第二十三方面，提供了一种对具有需要被破坏的细胞的患者进行治疗的方法，其包括：

(i)从患者或供体细胞移出所述细胞；

(ii)将本发明的多核苷酸或载体在体外引入所述细胞；

(iii)将经修饰的细胞引入所述患者；

(iv)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

(v)向所述患者施予基本上无毒的试剂，所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

根据本发明的第二十四方面，提供了一种防止患者中移植物抗宿主病的方法，其包括：

(i)向经遗传改造的宿主T细胞进行给药，以包括进本发明的多核苷酸或载体；和

(ii)在出现移植物抗宿主病之前，以能通过所述试剂与胸苷激酶的相互作用有效杀死经遗传改造的T细胞的量，向所述宿主施予基本上无毒的试剂。

优选地，在本发明中所使用的基本上无毒的试剂是更昔洛韦、阿昔洛韦(acyclovir)、三氟胸苷、1-[2-脱氧，2-氟，β-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、ara-1、1-β-D-阿糖呋喃基胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿嘧啶、5-碘基-5’-氨基-2，5’-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIV、二脱氧胞嘧啶、Ara C和溴乙烯脱氧尿苷(BVDU)中的任意一种。

根据本发明的第二十五个方面，提供了本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于破坏患者中细胞的药物中的应用。

根据本发明的另一方面，提供了本发明的多核苷酸、载体或宿主细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

详细描述

下面将通过非限制性实施例对本发明的多种优选特征和实施方式进行描述。

除非另有指明，本发明的实施将采用在本领域普通技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学、重组DNA以及免疫学传统技术。在文献中对这些技术进行了解释。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，SecondEdition，Books1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等人(1995以及定期的增刊；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：EssentialTechniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford UniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis ofDNA Methods in Enzymology，Academic Press；以及E.M.Shevach和W.Strober，1992以及定期增刊，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，New York，NY。这些常规文献中的每一份都通过引用并入本文。

HSV-tk基因

本文使用的术语“没有变化”的意思是与野生型序列(Tk wt)相比没有变化。

本文使用的术语“被其它核苷酸替换”的意思是被与野生型序列(Tk wt)不同的核苷酸替换。进行所述替换，使得相应的剪接供体位点或剪接受体位点被除去。

可以从多种胸苷激酶来制备本发明的胸苷激酶突变体。优选地，所述胸苷激酶突变体衍生自Herpesviridae胸苷激酶，包括例如灵长类疱疹病毒和非灵长类疱疹病毒，例如鸟类疱疹病毒。合适的疱疹病毒的代表性例子包括单纯疱疹病毒I型(McKnight等人，1980)、单纯疱疹病毒II型(Swain和Galloway，1983)、带状疱疹病毒(Varicella ZosterVirus)(Davidson和Scott，1986)、绒猴疱疹病毒(Otsuka和Kit，1984)、猫疱疹病毒I型(Nunberg等人，1989)、伪狂犬病病毒(Kit和Kit，美国专利No.4,514,497，1985)、马疱疹病毒I型(Robertson和Whalley，1988)、牛疱疹病毒I型(Mittal和Field，1989)、火鸡疱疹病毒(Martin等人，1989)、马立克氏病病毒(Marek’s disease virus)(Scott等人，1989)、猴类疱疹病毒(herpesvirus saimiri)(Honess等人，1989)和EB病毒(Epstein-Barr virus)(Baer等人，1984)。

这些疱疹病毒可以容易地从商业来源，例如American TypeCulture collection(“ATCC”，Rockville，Maryland)获得。上述疱疹病毒中某些的保藏物可以容易地从ATCC获得例如：ATCC No.VR-539(单纯疱疹病毒I型)；ATCC No.VR-734和VR-540(单纯疱疹病毒II型；ATCC NO.VR-586(带状疱疹病毒)；ATCC No.VR-783(传染性喉气管炎)；ATCC No.VR-624、VR-987、VR-2103、VR-2001、VR-2002、VR-2175、VR-585(马立克氏病病毒)；ATCC No.VR-584B和VR-584B(火鸡疱疹病毒)；ATCC No.VR-631和VR-842(牛疱疹病毒I型)；以及ATCC No.VR-2003、VR-2229和VR-700(马疱疹病毒I型)。还可以从自然存在的来源(例如从被感染的动物)中容易地被分离和鉴定疱疹病毒。

如下文所述，胸苷激酶基因可以被容易地分离，以构建编码含有一处或多处突变的胸苷激酶的核酸分子，与未突变的胸苷激酶相比其大幅减少该基因的剪接。正如这里所使用的，应当理解：“未突变的胸苷激酶”指天然或者野生型胸苷激酶例如由McKnight等人(Nucl.Acids Res.8：5949-5964，1980)所描述的。

应当注意，在本申请中，核苷酸的位置参考图1中的位置引用。然而，在进行这些参考时，应当理解，本发明并不限于图中所列出的确切序列，其还包括其变体和衍生物。因此，要考虑对其它胸苷激酶序列中核苷酸位置的鉴定(即本领域技术人员认为与图1中所确定的位置相对应的位置上的核苷酸)。本领域技术人员能够容易地对相似的序列进行比对，并定位出相同的核苷酸位置。

HSV-tk突变体的构建

可以使用多种技术来构建本发明的胸苷激酶突变体。例如，可以通过合成含有突变序列(其侧翼为能与天然序列的片段相连的限制性位点)的寡核苷酸，在特定的位置引入突变。连接之后，所得到的重新构建的序列编码具有期望氨基酸插入、取代或缺失的衍生物。

或者，可以采用寡核苷酸引导的位点特异性(或片断特异性)诱变方法来提供下述改变的基因，所述基因具有根据所需要的取代、缺失或插入而改变的特定密码子。也可以通过利用与所期望缺失相邻的方便的限制性内切酶位点，来构建胸苷激酶突变体的缺失或截短衍生物。在限制性酶切之后，可填补突出端，重新连接DNA。制备上面所列出的改变的示范性方法由Sambrook等人所公开(Molecular cloning：ALaboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

也可以通过利用PCR诱变、化学诱变、通过强制核苷酸错参(forcednucleotide misincorporation)(例如Liao和Wise，1990)的化学诱变(Drinkwater和Klinedinst，1986)技术，或者通过利用随机诱变的寡聚核苷酸来构建胸苷激酶突变体。

在本发明的一种优选实施方式中，考虑到遗传密码来修饰核苷酸，使得密码子被改变为编码相同氨基酸残基的简并密码子。通过这种方法，可能可以制备感兴趣的蛋白的质编码区域，其编码野生型蛋白质但不含有功能性剪接位点。

剪接位点

在剪接过程中被去除(或“被剪掉”)的RNA部分通常被称作内含子，典型地，通过剪接被连接在一起的内含子两侧的两段RNA被称作外显子(图2)。

剪接供体位点是RNA中的下述位点，其位于在剪接过程中被去除的RNA的5’侧，并且含有被切断并重新连接到剪接受体位点内的核苷酸残基的位点。这样，剪接供体位点是外显子末端和内含子开始处之间的连接，典型地，其末端为二核苷酸GU。在本发明的一种优选实施方式中，剪接供体位点的末端GU二核苷酸(或者相应DNA序列中的GT二核苷酸)之一或者二者均被改变，以除去该剪接位点。

剪接受体位点是RNA中的下述位点，其位于在剪接过程中其被去除的RNA的3’侧，并且含有被切断和重新连接到剪接供体位点内的核苷酸残基的位点。因此，剪接受体位点是内含子末端(典型地，以二核苷酸AG结尾)与下游外显子开始处之间的连接。在本发明的一种优选实施方式中，剪接受体位点的末端AG二核苷酸之一或者二者均被改变，以除去该剪接位点。

多核苷酸

在本发明中所使用的多核苷酸可以包括DNA或者RNA。它们可以是单链或双链的。本领域技术人员将理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能使用常规技术进行下述核苷酸取代，所述取代不影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列，以反映其中将表达多肽的任何特定宿主生物的密码子应用。可以用本领域中可以利用的任何方法对该多核苷酸进行修饰。可以进行这样的修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或者存活期(life span)。

本发明中所使用的多核苷酸可以编码融合蛋白，例如为了辅助所表达多肽的细胞分泌。当例如期望HSV-tk多肽从细胞中表达时，加入靶向序列以将蛋白质靶向到特定的细胞区室或者分泌途径可能是人们所期望的。在本领域中，这类靶向序列已经被广泛分析鉴定。

多核苷酸，例如DNA多核苷酸可通过重组、合成或者通过本领域技术人员可以利用的任何方法来制备。还可通过标准的技术对它们进行克隆。

通常使用重组方法来制备较长的多核苷酸，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将包括制备一对引物(例如大约15～30个核苷酸)，其侧翼是期望被克隆的肽靶向序列区域，将所述引物与从动物或者人类细胞获得的mRNA或cDNA进行接触，在能够扩增出所期望区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增出的片断(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增出的DNA。引物可以被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得扩增出的DNA能够被克隆入合适的克隆载体中。

应当认识到，本发明的多核苷酸可以仅含针对突变体胸苷激酶的编码区域。但是，多核苷酸还以可操作连接的方式含有下述核酸部分将是优选的，所述核酸部分允许在靶细胞内高效翻译编码序列。多核苷酸(以DNA的形式存在时)还以可操作连接的方式含有下述启动子和下述核酸部分将是更加优选的，所述启动子允许对编码区域进行转录，所述核酸部分允许在靶细胞内高效翻译编码序列。

蛋白质

本文所用的术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多-多肽复合物，其中每种成分多肽以共价或非共价方式连接。本文所用的术语“多肽”和“肽”指下述聚合物，其中单体是氨基酸，它们通过肽键或二硫键被连接在一起。术语亚基和结构域也指具有生物学功能的多肽和肽。

变体、衍生物、类似物、同源物和片段

除了前面所提到的具体蛋白质和核苷酸外，本发明还包括其变体、衍生物、类似物、同源物和片段的用途。

在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是下述序列，其中残基(无论是氨基酸或核酸残基)的特定序列被以使得所考虑的多肽或多核苷酸保持其至少一种其内源性功能的方式所修饰。可通过增加、缺失、取代修饰置换和/或变化天然出现的蛋白质中的至少一个残基，来获得变体序列。

本文所用的与本发明的蛋白质或者多肽相关的“衍生物”包括对其序列或者来自其序列的一个(或者多个)氨基酸残基的任何取代、变化、修饰、置换、缺失和/或增加，只要所得到的蛋白质或多肽保持其内源性功能的至少一种即可。

本文所用的与多肽或者多核苷酸相关的术语“类似物”包括任何模拟物，即具有其所模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源性功能的化合物。

典型地，可进行氨基酸取代，例如1、2或3～10或20个取代，只要所经修饰的序列保持所需要的活性或能力即可。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。

用于本发明的蛋白质还可以具有氨基酸残基的下述缺失、插入或者取代，它们产生沉默变化，导致功能等价蛋白质的产生。以极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或残基的两亲性特征方面的相似性为基础，可以进行有意的(deliberate)氨基酸取代，只要转运或调节功能被保留。例如带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有相似的亲水性值、具有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可以进行保守取代，例如根据下表进行。在第二列中相同格中的氨基酸，以及优选地，第三列中相同行中的氨基酸可以互相取代。

脂肪族的	非极性	GAP
		GAP	ILV
		极性-不带电荷	ILV	CSTM
	NQ			CSTM
	NQ		极性-带电荷	DE
	KR			DE
	KR	芳香族的			HFWY

″片段”也是变体，典型地，该术语指在功能上或者例如在检验中令人感兴趣的多肽或多核苷酸的选定片段。因此“片段”指是全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

这类变体可以使用标准重组DNA技术例如定点诱变来制备。在将被制造插入的位置，合成的DNA编码该插入以及插入位点两侧对应于天然存在的序列的5’和3’侧翼区。该侧翼区将含有对应于天然出现序列中位点的方便的限制性位点，使得该序列可以被合适的酶所切割，并且合成DNA被连接到该切割处。接着根据本发明，表达该DNA，产生所编码的蛋白质。这些方法只是对在DNA序列操作领域中所已知的许多标准技术的示例，也可以使用其它已知技术。

多核苷酸变体将优选含有经过密码子优化的序列。密码子优化是本领域中作为增强RNA稳定性进而增强基因表达的方法已知的。遗传密码的冗余表示若干个不同的密码子可以编码相同的氨基酸。例如，亮氨酸、精氨酸和丝氨酸每种都被6种不同的密码子所编码。不同的生物体在它们使用不同密码子的方面展示出了偏好。例如病毒(诸如HIV)使用大量稀有密码子。通过改变核苷酸序列以使稀有密码子被相应的常用哺乳动物密码子所替换，序列在哺乳动物靶细胞中的表达能获得增加。哺乳动物细胞以及多种其它生物体的密码子应用表是本领域中已知的。优选地，所述序列的至少一部分是经密码子优化的。更优选地，所述序列是全面经密码子优化的。

载体

正如本领域中所熟知的，载体是允许或者辅助将实体从一种环境转入其它环境的工具。根据本发明，以示例的方式，在重组DNA技术中所使用的某些载体能够使实体(例如DNA片段(例如异源DNA片断，例如异源cDNA片断))转入宿主内和/或靶细胞内，以达到复制含有本发明中所使用核苷酸序列的载体和/或表达本发明所使用蛋白质的目的。在重组DNA技术中所使用的载体的例子包括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。

本发明中使用的多核苷酸优选被并入到载体中。优选地，用于本发明中的载体中的多核苷酸被可操作地连接到控制序列上，所述控制序列能提供宿主细胞对编码序列的表达，即该载体是表达载体。术语“可操作地连接”指所述组分以使其以它们预期的方式发挥作用的关系存在。被“可操作地连接”到编码序列上的调控序列是以下述方式连接的，所述方式使得能在与控制序列兼容的条件下获得所述编码序列的表达。

所述控制序列可以被修饰，例如通过加入另外的转录调控元件，以使由控制序列所引导的转录水平应答于转录调节剂(modulator)。

载体可以被转化或转染入合适的宿主中，以提供tk基因产物的表达。该过程可以包括：在能提供载体对编码该蛋白的编码序列的表达的条件下，培养用上述表达载体转化过的宿主细胞，以及可选地回收所表达的蛋白质。

在本发明中所使用的载体可以为例如质粒或病毒载体，其被提供有复制起点，以及可选地用于表达多核苷酸的启动子，以及可选地该启动子的调节子。所述载体可以含有一种或者多种可选择的标记物基因，和/或可追踪的标记物如GFP。载体可用于例如转染或转化宿主细胞。

用于本发明的、与编码蛋白质的序列可操作地连接的控制序列包括启动子/增强子以及其它表达调控信号。这些控制序列可以被选择为与表达载体被设计为用于其中的宿主细胞兼容。术语“启动子”是本领域中所熟知的，其包括大小和复杂性范围为从最小程度的启动子至包括上游元件和增强子的启动子的核酸区域。

典型地，启动子选自在哺乳动物细胞中发挥功能的启动子，尽管也可以使用原核启动子和在其它真核细胞中发挥功能的启动子。典型地，启动子源自病毒或真核基因的启动子序列。例如，其可以是源自将发生表达的细胞基因组的启动子。关于真核启动子，它们可以是以普遍方式发挥功能的启动子(例如α-肌动蛋白、β-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)或者是以组织特异性的方式发挥功能的启动子(例如丙酮酸激酶基因的启动子)。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人类细胞肥大病毒(CMV)IE启动子。

对启动子而言，可诱导的同样是有利的，这样异源基因的表达水平能够在细胞的生命期内被调节。可诱导指使用该启动子所得到的表达水平可以被调节。

另外，可以被通过加入另外的调控序列，例如增强子序列，对这些启动子中的任何而修饰。也可以使用嵌合启动于，其包括来自上述两种或更多种不同启动子的序列元件。

优选地，所述病毒载体优先转导某种细胞类型或某些细胞类型。

反转录病毒载体

在一个实施方式中，在本发明中所使用的载体是下述基于反转录病毒的载体，其已经经过遗传改造，使得：一旦病毒进入靶细胞，其不能够复制及产生后代有传染性的病毒颗粒。有许多种在组织培养条件和活体生物条件下被广泛使用以运送基因的反转录病毒。例子包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、消暑乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤浪肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、埃布尔森鼠白血病病毒(A-MLV)、禽类髓细胞组织增生病毒-29(MC29)以及禽类成红血细胞增多症(AEV)以及所有其它反转录病毒(retroviridiae)，包括慢病毒(lentiviruses)。反转录病毒的详细列表可以在Coffin等人，1997，“反转录病毒(retroviruses)”，Cold Spring Harbour Laboratory PressEds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763中发现。

反转录病毒基因组的基本结构是5’LTR和3’LTR，在其之间或在其内部定位有使得基因组能被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合入宿主细胞基因组的整合位点以及编码包装组分的gag、pol和env基因-它们是病毒颗粒装配所必需的多肽。更复杂的反转录病毒具有额外的特征，例如HIV中的rev和RRE序列，其能够使整合的前病毒RNA转录子从被感染的靶细胞的细胞核向细胞质高效输出。

在前病毒中，这些基因两个末端侧翼是被称作长末端重复(LTR)的区域。所述LTR负责前病毒的整合和转录。LTR还可以作为增强子-启动子序列，并控制这些病毒基因的表达。通过位于病毒基因组5’末端的psi序列，发生用壳体包裹反转录病毒RNA的过程。

LTR自身是相同序列(idetical sequence)，其可以被分成被称作U3、R和U5的三种元件。U3源自RNA的3’末端所特有的序列。R源自在RNA的两个末端都重复的序列，U5源自RNA的5’末端所特有的序列。三种元件的大小在不同的反转录病毒中可以有相当大的变化。

在缺陷型反转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可不存在或者没有功能。在RNA两末端的R区是重复的序列。U5和U3分别代表在RNA基因组的5’和3’末端所特有的序列。

更优选地，所述病毒载体是靶向载体，其具有与原始病毒相比被改变的组织趋向性，这样所述载体能靶向到特定的细胞。这可以通过修饰反转录病毒Env蛋白来获得。优选地，所述包膜蛋白是无毒的包膜，或者是在初级(primary)靶细胞中以无毒的量产生的包膜，例如MMLV两栖包膜或者被修饰的两栖包膜。

优选地，所述包膜是能够转化人类细胞的。适当的env基因的例子包括但不限于VSV-G、MLV两栖env诸如4070A env、RD114猫白血病病毒env或来自流感病毒的血细胞凝集素(HA)。Env蛋白质可以是能够结合有限数目的人类细胞类型上的受体的，并可以是经工程改造的含有靶向部分的包膜。env和gag-pol编码序列从在所选择的包装细胞系中有活性的启动子以及可选地，增强子转录，转录单元由多聚腺嘌呤化信号终止。例如，如果该包装细胞是人类细胞，则来自人细胞肥大病毒主要即刻早期(hCMV-MIE)基因和来自SV40病毒的多聚腺嘌呤化信号的合适启动子-增强子组合可以被使用。其它合适的启动子和多聚腺嘌呤化信号是本领域中已知的。

MLV

优选地，本发明中所使用的反转录病毒载体是鼠白血病病毒(MLV)载体。从两栖莫洛尼白血病病毒(MLV-A)获得的反转录病毒载体在世界范围内的临床方案中是通常使用的。这些病毒使用细胞表面磷酸转运受体，以进入并接着永久整合入增殖中的细胞染色体。接着，所述基因在细胞的生命期中被保持。在基于MLV的构建体上的基因活性是容易被控制的，并长时间有效。使用这些基于MLV的系统进行的临床试验已显示：它们能够被很好地忍受而没有不利的副作用。

用于本发明的MLV载体的例子是源自SFCMM-3的载体，其携带自杀基因HSV-tk和标记物基因ΔLNGFR(Verzeletti 98，Human GeneTherapy 9：2243)。在制备SFCMM-3的过程中所使用的原始载体是LXSN(Miller等人Improved retroviral vectors for gene transfer andexpression.BioTechniques 7：980-990，1989)(Genebank索取号#28248)。LXSN载体通过下述过程被修饰：将HSV-tk基因插入到唯一的HpaI位点(“平末端切割”)，使用Hind III和Nae I消化去除neo基因，以及在该位点插入编码ΔLNGFR的cDNA。

慢病毒载体

在一个实施方式中，本发明的载体可以是慢病毒载体。慢病毒载体是一组更大的反转录病毒载体的一部分。慢病毒的详细列表可以在Coffin等人(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)中发现。简单地说，慢病毒可以被分为灵长类组和非灵长类组。灵长类慢病毒载体包括但不限于：人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病源——人类免疫缺陷病毒(HIV)，和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原形“缓慢病毒(slow virus)”梅迪和维斯纳(visna/maedi)病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)以及更近来所描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。

慢病毒家族和其它类型反转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染处于分裂中的和不处于分裂的细胞的能力(Lewis，1992；Lewis andEmerman，1994)。相反，其它的反转录病毒(例如MLV)不能够感染不处于分裂中的或者分裂缓慢的细胞，例如构成例如肌肉、脑、肺和肝组织的细胞。由于慢病毒能够转导最终分化的/初级细胞，所以利用慢病毒筛选策略能够在初级靶不处于分裂中的或者缓慢分裂的宿主细胞中进行文库选择。

腺病毒载体

在另一个实施方式方式中，本发明的载体可以是腺病毒载体。腺病毒载体是双链、线性DNA病毒，其不经历RNA中间体。存在超过50种的不同人类腺病毒血清型，根据基因序列的同源性，其被分成6个亚组。腺病毒的天然靶是呼吸道和肠胃上皮，通常其只引发温和症状。血清型2和5(具有95％的序列同源性)是腺病毒载体系统中最常使用的，并且通常与年轻人的上呼吸道感染有关。

腺病毒是没有包膜的规则二十面体。典型的腺病毒包括壳体包裹的140nm DNA病毒。该病毒的二十面体对称是由152个壳粒构成的：240个六邻体(hexon)和12个五邻体(penton)。颗粒的核含有36kb线性双链DNA，其在5’末端与作为用于DNA复制的引物的末端蛋白(TP)共价连接。该DNA具有反向末端重复(ITR)，其长度随血清型变化。

腺病毒是双链DNA无包膜的病毒，其能够在体内和体外转导宽范围的人类和非人类来源的细胞类型。这些细胞包括呼吸道上皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、心肌细胞、关节滑膜细胞、初级哺乳动物上皮细胞和有丝分裂后最终分化的细胞，例如神经元。

腺病毒载体也能够转导不处于分裂中的细胞。这对于下述疾病(例如囊肿性纤维化)是非常重要的，所述疾病中，在肺上皮中所感染的细胞具有缓慢的更新速率。事实上，许多试验正在进行，它们利用了腺病毒介导的、囊肿性纤维化转运蛋白(CFTR)向患有成人囊肿性纤维化的病人的肺中的转移。

腺病毒已经被用作为基因治疗和表达异源基因的载体。大基因组(36kb)能够容纳高达8kb的外源插入DNA，并能够在补体细胞系(complementing cell lines)中高效复制，产生高达10¹²的效价。因此，腺病毒是用于研究基因在初级非复制细胞中表达的最佳系统之一。

来自腺病毒基因组的病毒基因或外源基因的表达不需要正在复制中的细胞。腺病毒载体通过受体介导的内吞作用进入细胞。一旦在细胞中，腺病毒载体很少整合进宿主染色体。取而代之的是：其作为线性染色体在宿主细胞核中游离地发挥作用(独立于宿主染色体)。因此，使用重组腺病毒能减轻与随机整合入宿主染色体有关的问题。

痘病毒载体

根据本发明可以使用痘病毒载体，因为DNA大片段容易被克隆进其基因组中，通过重组被削弱的牛痘变体已经被描述(Meyer，等人，1991；Smith and Moss，1983)。

痘病毒载体的例子包括但不限于野兔痘病毒：Upton，等人，1986，(Shope纤维瘤病毒)；山羊痘病毒：Gershon，等人，1989，(Kenya羊-1)；正痘病毒：Weir，等人，1983，(牛痘)；Esposito，等人，1984，(猴痘和天花病毒)；Hruby，等人，1983，(牛痘)；Kilpatrick，等人，1985，(Yaba猴肿瘤病毒)；禽痘病毒：Binns，等人，(1988)(鸟痘)；Boyle，等人，1987，(鸟痘)；Schnitzlein，等人，1988，(鸟痘、鹌鹑痘)；昆虫痘(Lytvyn，等人，1992。

痘病毒载体被广泛用作为在真核细胞中表达感兴趣的基因的载体。特别地，它们容易在多种宿主细胞中克隆和繁殖，使得：特别地，可广泛使用痘病毒载体用于表达外源蛋白质和作为疫苗抗原的运送载体(Moss，1991)。

牛痘病毒载体

本发明的载体可以是牛痘病毒载体例如MVA或NYVAC。最优选的是牛痘株：被修饰的病毒Ankara(MVA)或者源自其的病毒株。牛痘载体的替换物包括禽痘(avipox)载体，例如被称作ALVAC的鸟痘(fowlpox)或金丝雀痘(canarypox)，以及从其衍生的病毒株，它们能够在人类细胞中感染和表达重组蛋白质，但不能够复制。

运送系统

本发明还提供了用于本发明的突变体tk多核苷酸的运送系统。

本发明的运送系统可以是病毒或非病毒运送系统。非病毒运送机制包括但不限于脂介导的转染、脂质体、免疫脂质体、Lipofectin、阳离子表面亲和(CFA)及其组合。

可以通过任何合适的基因运送载体(GDV)将多核苷酸运送到靶细胞。这包括但不限于：DNA，其被配方在脂类或蛋白质复合物中，或者作为裸露的DNA通过注射或生物射弹(biolistic)施予，病毒，例如反转录病毒、腺病毒、慢病毒、干病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、鼠白血病病毒、西门利克森林病毒(semliki forest viruse)和杆状病毒。或者，通过细胞运送多核苷酸，例如单细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或造血干细胞。特别地，使用依赖细胞的运送系统。在该系统中，编码TK蛋白质的多核苷酸被离体(ex vivo)导入一个或者多个细胞中，接着被导入到患者中。

本发明的试剂可以单独施予，但通常可以作为药物组合物施予。

宿主细胞

本发明的载体和多核苷酸可以被引入宿主细胞中，以达到对载体/多核苷酸进行复制和/或对本发明多核苷酸编码的TK加以表达的目的。宿主细胞可以是细菌细胞或真核细胞例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞。

宿主细胞可以是用于包装或者繁殖病毒的细胞，例如本领域中所熟知的反转录病毒包装细胞系。

宿主细胞可以是期望被破坏的动物或患者(无论人类或动物)的细胞。本发明的多核苷酸和载体能够用于靶向将被破坏的细胞。表达TK的细胞可以与能被TK转化成毒性形式的基本无毒的试剂进行接触。

破坏细胞的方法

在本发明的一个方面，提供了一种破坏细胞的方法，其包括：

(i)向所述细胞中导入本发明的多核苷酸或载体；

(ii)使所述细胞表达胸苷激酶；和

将所述细胞与能被TK转化成毒性形式的基本上无毒的试剂接触。

将多核苷酸或载体导入细胞中以及将细胞与基本上无毒的试剂进行接触，可以接任何顺序进行。将被破坏的细胞可以是在体外的，例如在培养物中生长的细胞，或者它们可以是动物的一部分的细胞。期望被破坏的细胞的代表性例子是T细胞，自身免疫细胞，肿瘤细胞，不表达或不正确表达特定基因的细胞，以及被细菌、病毒或其它细胞内寄生物所感染的细胞。

治疗

应当认识到，本文提到的治疗包括治愈性的、缓解性的和预防性的治疗。对哺乳动物的治疗是特别优选的。对人类的治疗和兽医治疗都在本发明的范围内。

在本发明的一个方面，提供了一种对具有需要被破坏的细胞的患者进行治疗的方法，其包括：

(i)将本发明的多核苷酸、载体或药物组合物引入患者中；

(ii)使所述多核苷酸或表达载体被所述细胞吸收；

(iii)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

(iv)将能被胸苷激酶转化成毒性形式的基本上无毒的试剂引入患者。

在本发明的另一方面，提供了一种对具有需要被破坏的细胞的患者进行治疗的方法，其包括：

(i)从患者或者供体细胞中取出细胞；

(ii)在体外将本发明的多核苷酸或表达载体引入所述细胞中；

(iii)将被修饰的细胞引入患者中；

(iv)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

向患者施予能被胸苷激酶转化成毒性形式的基本上无毒的试剂。

可以通过本发明的多核苷酸、载体和方法治疗的疾病的代表性例子包括下述疾病，例如癌症、眼角膜细胞增多、前列腺肥大、甲状腺功能亢进、多种内分泌疾病、自体免疫疾病、再狭窄、HIV和AIDS、肝炎等多种病毒性疾病和细胞内寄生虫疾病。

本发明的多核苷酸、载体和方法可用于同种异体骨髓移植之后的治疗过程。同种异体骨髓移植是许多血液恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的治疗选择。移植同种异体骨髓，特别是当与高剂量的化放疗一起使用时，已展示出：产生了与自体或同源移植物相比而言好的结果。

在进行同种异体骨髓移植时，可以从移植物中去除同种反应活性T淋巴细胞，以防止移植物抗宿主病(GvHD)。当被移植的干细胞移植物中的T细胞开始攻击受体的身体时，发生GvHD。然而，这样的细胞去除过程将提高疾病复发、移植物排斥和病毒感染的再活化的发生率。为了抵挡这些作用，可以通过在同种异体骨髓移植后的一段延迟时间后，引入供体T淋巴细胞，对同种异体骨髓移植患者进行治疗。然而，在同种异体骨髓移植之后延迟引入供体T淋巴细胞的治疗期望会受到GvHD的限制， GvHD是该治疗的常见和潜在的致死并发症。这个问题已通过下述方法解决：向患者施予被遗传改造为包括编码“自杀基因”的多核苷酸的患者T细胞。在这方面，可以使用编码突变体TK的、本发明多核苷酸和载体。

由此，在本发明的一个方面，提供了一种预防患者中移植物抗宿主病的方法，其包括：

(i)向宿主施予被遗传改造为包括本发明多核苷酸或载体的T细胞；和

(ii)在发生移植物抗宿主病之前，以能够通过所述试剂与胸苷激酶的相互作用有效杀死能在所述患者中提供移植物抗宿主病作用的经遗传改造的T细胞的量，向所述宿主施予基本上无毒的试剂。

含有编码突变体tk基因的多核苷酸或载体的细胞优选包括可用于监测突变体tk基因出现的标记基因。优选地，所述标记基因由本发明的多核苷酸或表达载体编码。一种这类标记物基因的例子是经修饰的低亲和力神经生长因子受体(ΔLNGFR)。当在被转导的细胞表面表达时，经修饰的ΔLNGFR保留了相应的未经修饰NGF受体与其配体的结合性能，而不能影响作为配体结合结果的信号传导。具体的ΔLNGFR修饰的例子被描述于美国申请No.08/602,791中。

药物组合物

药物组合物是含有药学有效量的药学活性试剂或由药学有效量的药学活性试剂组成的组合物。其优选包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂是制药领域中熟知的，并被描述于例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。对药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据所期望的施予路线和标准药物实践来选择。药物组合物可以包括(或另外包括)赋形剂或稀释剂、任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、增溶剂。

药学上可接受的载体的例子包括例如水、盐溶液、乙醇、硅树脂、、蜡、凡士林油、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、凝胶、乳糖、淀粉糖、硬脂酸镁、云母、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香精油(perfume oil)、脂肪酸单甘油酯和二甘油脂、石油烃脂肪酸酯(petroethral fatty acid ester)、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

在适当的情况下，所述药物组合物可以通过下列的一种或者多种方式施予：吸入，以栓剂或阴道栓剂的形式施予，以洗液、溶液、乳膏、药膏或爽身粉的形式进行局部施予，以含有赋形剂(如淀粉或乳糖)的药片的形式口服，或者以胶囊或胚珠(ovule)单独施予或与赋形剂混合的形式施予，或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式施予，或者它们可以经非肠道注射例如腔内、静脉内、肌肉内或皮下注射。对于经非肠道给药，所述组合物可以最好以可以含有其它物质(如，能够使该溶液与血液等渗的足够的盐或单糖)的无菌水溶液的形式进行使用。对于口腔施予或者舌下给药，所述组合物可以被以能通过传统方法配制的药片或锭剂的形式施予。

取决于不同的运送系统，可以有不同的组合物/制剂的需求。举例而言，本发明的药物组合物可以被配制为：使用迷你泵或者通过粘膜路线运送，例如作为鼻喷雾或者用于吸入或摄取溶液的气雾剂，或者通过非肠道给药，其中所述组合物以注射的形式配制以运送，例如静脉内、肌肉内或皮下路线。或者，所述制剂可以被设计为通过两种路线运送。

下面将参考附图，以及通过非限制性的实施例来描述本发明的其它优选特征和实施方式，附图中：

图1展示了HSV-1胸苷激酶基因(HSV-tk)突变体(TkMut2(SEQID NO 2)、TkMut23(SEQ ID NO：3)、TkMut24(SEQ ID NO：4)、TkMut34(SEQ ID NO：5)、TkMut4(SEQ ID NO：6)和TkMut234(SEQID NO：7)的核苷酸序列的多条比对。从野生型HSV-tk序列的ATG起始密码子对碱基进行编号。将序列与TK wt序列(TK wt，SEQ ID NO：1)进行比对。通过对比上面的数字，指示了突变的位置。位置(330)、(541和542)以及(555)的突变分别由数字2、3和4表示。

图2表示剪接共有(consensus)序列。

图3展示了从用SFCMM-3(Verzelletti，1998，Human GeneTherapy 9：2243-2251)和/或TK3(scSFCMM-3)(Chalmers，2001)载体转染的echotropic包装细胞系GP+E86和来自双嗜性(amphotropic)包装细胞系的上清液制备的cDNA的HSV-tk PCR产物。

图4展示了在用SFCMM-3和/或TK3(scSFCMM-3)载体转导的上皮血淋巴细胞(PBL)中PCR扩增出的HSV-tk。

图5展示了SFCMM-3与TK3(scSFCMM-3)相比中HSV-tk基因的关键部分的序列。SFCMM-3和TK3(scSFCMM-3)载体之间不同的核苷酸位置被方框框起来。在SFCMM-3和TK3的被剪接型中缺失的基因部分以斜体表示。相应的剪接供体和受体位点被指出。

图6展示了对导入SFCMM-3载体的突变的示范性总结。

图7展示了源自E86细胞的上清液的cDNA的HSV-tk PCR产物，其中E86经过了从含有图1中所示的HSV-tk突变体的SFCMM-3获得的重组质粒的转染。

图8展示了源自Am12培养物上清液的cDNA的HSV-tk PCR产物，其中Am12培养物已用从图7所描述的E86培养物收集的上清液转导过。

图9展示了源自CEM A301细胞的DNA的TKA1/TKB1 HSV-tkPCR产物，其中CEM A301细胞已用从图8所描述的Am12培养物收集的上清液转导过。

图10展示了源自CEM A301细胞的DNA的TKY1/TKY2和TKZ1/TKZ2 HSV-tk PCR产物，其中CEM A301细胞已用从图8所描述的Am12培养物收集的上清液转导过。

图11展示了来自PBL的DNA的TKA1/TKB1 HSV-tk PCR产物，其中PBL已用从图8所描述的Am12培养物收集的上清液转导过。

图12表示源自PBL的DNA的TKZ1/TKZ2 HSV-tk PCR产物，其中PBL已用从图8所描述的Am12培养物收集的上清液转导过。

实施例1-SFCMM-3#35上清液和被转导细胞中HSV-tk的被剪接形式的相对频率

通过使用TaqMan 7700系统，用特异于每种HSV-tk形式的两种定量实时RT-PCR(来自上清液的RNA)或PCR(来自被转导的淋巴细胞)对剪接形式的相对频率(被剪接形式/(被剪接加未被剪接)的百分比)进行评估。

材料和方法

SFCMM-3反转录病毒载体

GP+envAm12(Am12)-衍生的生产细胞系(producer cell line)，SFCMM-3克隆35(Am12/SFCMM-3#35)在DMEM(Cambrex)培养基中被铺展(expand)了5天，其中所述DMEM(Cambrex)培养基含有2mM谷氨酰胺和10％经辐射的FBS(Hyclone)。在33℃下温育细胞24小时后，从汇合(confluent)的瓶中收集补充有2mM谷氨酰胺的X-VIVO15培养基(Cambrex)中的反转录病毒上清液。对含有病毒的上清液进行过滤，并存储在-80℃下直到进一步的应用。

T细胞转导

从健康的供体收集外周血单核细胞，并通过在Lymphoprep(Nycomed)上离心进行分离。

使用OKT3(30ng/ml)(Orthoclone)对外周血淋巴细胞(PBL)进行刺激，并在RPMI(Hyclone)中进行培养，所述RPMI含有3％的自体血浆、2mM谷氨酰胺并补充有重组人白介素2,600IU/ml(Proleukin)。对PBL的转导是通过对反转录病毒颗粒(来自Am12/SFCMM-3#35的上清液)进行离心在经OKT3刺激的PBL上进行的。在OKT3刺激后的第二天和第三天进行两次离心循环。

在转导期之后，收集白细胞，并通过FACS分析，借助作为细胞表面标记物的ΔLNGFR分子，评估实际被转导的细胞的百分比。接着通过桥联到磁珠(Dynabeads)上的抗体对经转导的细胞进行拣选，在培养物中铺展几天，并在总共培养10天后冷冻。

样品制备

通过使用QIAamp Mini试剂盒(Qiagen)，根据厂商提供的方案，从1～2×10⁶个细胞来纯化DNA，并通过测量OD₂₆₀确定其产率。通过使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)，根据厂商提供的方案，从140μl上清纯化RNA。首先在25℃下对13.5μl纯化的RNA进行20分钟的DNase处理，并95℃处理5分钟使DNase失活。然后在42℃下使用M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)和Oligo dT，对经过DNase处理的RNA中的一半进行1小时的反转录。在用于实时PCR之前，对所合成的cDNA进行5倍稀释。

通过实时PCR对被剪接形式的定量

已经通过将HSV-tk的未被剪接的和经截短形式亚克隆进pCR2.1TOPO载体(Invitrogen)，制备了DNA标准曲线。已经使用PrimerExpress^TM 1.5软件(PE Applied Biosystems)设计了两组不同的引物和探针，其能够选择性地扩增和检测HSV-tk的未被剪接和被剪接形式。使用TaqMan 7700序列检测系统，设定特异于每种HSV-tk形式的两种定量实时RT-PCR。

为了建立特异于HSV-tk未被剪接形式的定量实时PCR，引物和探针被设计在HSV-tk基因的被剪接区。针对被剪接形式的实时PCR在25μl的反应混合物中进行，所述反应混合物含有100-500ng基因组DNA或10μl上面所制备的cDNA、1XTaqMan Universal PCR MasterMix(PE Applied Biosystems)、每种都是300nM的两种引物TKwtfor(5′-CGG CGG TGG TAA TGA CAA G-3′)和Tkwtrev(5′-GCG TCGGTC ACG GCA TA-3′)、以及200nM TKwt MGB探针(5′-FAM CCAGAT AAC AAT GGG C-3′)。

包含剪接连接处的TaqMan探针被设计为能选择性地检测HSV-tk的被剪接形式。针对TK的被剪接(被截短)形式的定量实时PCR在25μl的反应混合物中进行，所述反应混合物含有100-500ng基因组DNA或10μl上面所制备的cDNA、1X Master Mix(PE AppliedBiosystems)、每种都是300nM的两种引物TKSP18(5′-GGA TGA GGGCCA CGA A-3′)和TKSP16(5′-CGA ACA TCT ACA CCA CAC AACA-3′)以及200nM Taq Man探针PSP10(5′FAM-CCA GCA CGG CCCTGG TCG-TAMRA 3′)。热循环条件如下：在50℃，2分钟起始UNG的活化，接着95℃，15分钟活化Taq Gold并使UNG失活。随后进行40个扩增循环：95℃，15秒和60℃，1分钟。使用ABI Prism 7700Sequence Detection Systems(Applied Biosystems)，在MicroAmp光学96孔反应板(Applied Biosystems)中平行进行两项PCR。从第3～15个PCR循环计算平均基线荧光，Ct被定义为报告染料(reporter dye)经过标准化后的荧光强度达到0.05的PCR循环。通过将Ct值对起始输入DNA量的对数值进行作图，在每项TaqMan检验中产生了具有已知拷贝数目(10⁶～4个拷贝/反应)的两条标准曲线。分别以两次和三次重复对标准稀释液和cDNA样品进行分析。两个PCR都被证实有效，它们表现出扩大的动力学范围(6log)、高灵敏度(＜10个拷贝/反应)、良好的再现性(CV＜5％)和可重复性(CV＜5％)。

结果

结果展示于表1中。对6份临床级别的SFCMM-3载体上清液以及9份被转导的淋巴细胞制备物进行分析。

在全部6份临床级别的SFCMM-3上清液中(1.12+/-0.75，范围0.65-2.60)以及在9份被SFCMM-3上清液转导的T淋巴细胞制备物中(1.89+/-1.22，范围0.84-4.00)，被剪接形式的相对频率低于5％。

实施例2-scSFCMM-3上清液和被转导细胞中被剪接TK的变体材料和方法

scSFCMM-3反转录病毒载体和生产细胞系

通过磷酸钙共沉淀法，将载体DNA TK3(TK3 Molmed和TK3是相同质粒scSFCMM-3的不同制备物，其被描述于Chalmers 2001，Molecular Therapy 4：146-148中)转染进echotropic包装细胞系GP+E-86(E86)中。过滤从对E86细胞的瞬时转染获得的上清液，然后将其用于感染Am12细胞系。通过使用免疫磁力选择分离含有TK3的细胞部分，并将所得到的大量培养物进行铺展。在对Am12/TK3大量培养物进行有限次稀释后，基于高生长能力和对T淋巴细胞的转导效率，选出克隆#53、#71和#80。

将Am12/TK3克隆铺展在含有2 mM谷氨酰胺和10％经辐射的FBS(Hyclone)的DMEM(Cambrex)中。在33℃下温育细胞24小时后，从汇合的瓶中收集补充有2mM谷氨酰胺的X-VIVO 15培养基(Cambrex)中的反转录病毒上清液。使用0.22μm的过滤器对含有病毒的上清液进行过滤，并存储在-80℃下直到进一步的应用。

T细胞转导

从若干健康的供体收集外周血单核细胞，并通过在Lymphoprep(Nycomed)上的离心进行分离。

使用OKT3(30ng/ml)(Orthoclone)对外周血淋巴细胞(PBL)进行刺激，并在RPMI(Hyclone)中进行培养，所述RPMI含有3％的自体血浆、2mM谷氨酰胺并补充有重组人白介素2,600IU/ml(Proleukin)。对PBL的转导是通过对反转录病毒颗粒(来自Am12/SFCMM-3#35的上清液)离心在经OKT3刺激的PBL上进行的。在OKT3刺激后的第二天和第三天进行两次离心循环。

在转导期之后，收集白细胞，并通过FACS分析，借助作为细胞表面标记物的ΔLNGFR分子来评估实际被转导的细胞的百分比。接着通过桥联到磁珠(Dynabeads)上的抗体对经转导的细胞进行拣选，在培养物中铺展几天，并制备沉淀用于PCR分析。

聚合醇链式反应

对大量生产细胞系(Am12/TK3 Bulk 2)以及经有限次稀释(Am12/TK3#53、#71和#80)获得的单生产细胞克隆进行分析。从含有传染性病毒颗粒的培养物上清液提取RNA。

使用HTK4+(5′-TTC TCT AGG CGC CGG AAT TCG TT-3′)和HTK2-(5′-ATC CAG GAT AAA GAC GTG CAT GG-3′)引物，或TKA1(5′-CGT ACC CGA GCC GAT GAC TT-3′)和TKB1(5′-TGTGTC TGT CCT CCG GAA GG-3′)引物进行RT-PCR。使用Titan Onetube RT-PCR System(Roche)在50μl反应混合物中进行RT PCR，所述反应混合物含有10μl经过DNase处理的RNA，具有1.5mM MgCl₂(PE Applied Biosystems)、200nM每种脱氧核苷酸(dNTP)、200nM每种引物、5mM二硫苏糖醇(DTT)、20U RNase抑制剂、1μl Titan Enzyme混合物的1X RT-PCR缓冲液。

将来自Am12/SFCMM-3#35的上清液和来自经SFCMM-3转导的淋巴细胞的DNA作为对照。RT-对照也被平行进行。

RT-PCR循环方案由以下步骤构成：首先在50℃下进行30分钟反转录步骤，在94℃进行2分钟变性步骤，接着是40个95℃变性30秒、60℃退火30秒以及68℃延伸1分钟的循环，以及最后在68℃下进行一个延伸10分钟的最后步骤。通过琼脂糖凝胶电泳对10微升扩增产物进行分析。

从经SFCMM-3或TK3载体转导的若干供体的PBL提取基因组DNA。在25μl的反应混合物中进行PCR，所述反应混合物含有100-500ng基因组DNA，具有1.5mM MgCl₂(Applied Biosystems)、200nM每种dNTP、1600nM每种引物TK2S(5′-CCA TAG CAA CCG ACGTAC G-3′)和TKAS(5′-GAA TCG CGG CCA GCA TAG C-3′)的1XPCR缓冲液。RT-PCR循环方案征由以下步骤构成：首先在在94℃15分钟进行变性步骤，接着是38个95℃变性1分钟、65℃退火30秒以及72℃延伸1分钟的循环，以及在72℃下延伸10分钟的最后一个步骤。通过琼脂糖凝胶电泳对10微升扩增产物进行分析。

在25μl的反应混合物中对相同的样品进行，所述反应混合物含有100-500ng基因组DNA，具有1.5mM MgCl₂(Applied Biosystems)、200nM每种dNTP、300nm每种引物HTK4+(5′-TTC TCT AGG CGCCGG AAT TCG TT-3′)和HTK2-(5′-ATC CAG GAT AAA GAC GTGCAT GG-3′)和1.25U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)的1X PCR缓冲液。该PCR循环方案由以下步骤构成：首先在在94℃15分钟进行变性步骤，接着是40个95℃变性30分钟、65℃退火50秒以及72℃延伸1分钟的循环，以及在72℃下延伸10分钟的最后一个步骤。通过琼脂糖凝胶电泳对10微升扩增产物进行分析。

对TK3被剪接形式的cDNA序列分析

通过使用自动荧光DNA测序设备，对用HTK4+/HTK2-引物从Am12/TK3#53上清液所扩增的产物的靠下条带进行测序。通过PRIMM(Milan，Italy)进行测序。

结果

对来自培养物上清液的RNA进行HSV-tk RT-PCR

检测两种PCR产物，以分析来自由Am12和E86包装细胞系所产生的SFCMM-3和TK3的RNA(图3)。TK3载体对应于所描述的scSFCMM-3载体(Chalmers，2001)。所有样品中，主要的产物(靠上的条带)对应于HSV-tk的未剪接形式(使用HTK4+/HTK2-引物得到的1020对碱基对(bp)；使用TKA1/TKB1引物得到的401bp)。在SFCMM-3样品中较小产物(靠下的条带)对应于所述的被剪接形式，其中检测到了227bp(Garin 2001，Blood 97：122-129)。

相反，TK3样品中次要产物的大小稍微大些，这暗示存在不同剪接形式，其中较小片段缺失；SFCMM-3和TK3样品之间的这种区别在使用TK2S/TKAS引物时特别明显。另外，仅使用HTK4+/HTK2-引物时观察到的中间产物被认为是可能的PCR人造伪产物。

对来自被转导的淋巴细胞的DNA的HSV-tk PCR

检测两种PCR产物，以分析来自经SFCMM-3和TK3转导的PBL的DNA(图3)。主要的产物(靠上的条带)对应于HSV-tk的未剪接形式(使用TK2S/TKAS引物得到的644bp；使用HTK4+/HTK2-引物得到的1020bp)。在SFCMM-3样品中靠下条带(对应于所描述的被剪接形式)的大小为：使用TK2S/TKAS引物时，417bp，使用HTK4+/HTK2-引物时，793bp。

SFCMM-3与TK3相比时HSV-tk基因关键部分的序列

图5中展示了SFCMM-3与TK3相比时HSV-tk基因关键部分的序列。SFCMM-3和TK3的被剪接形式中所缺失的基因部分用斜体表示。相应的剪接供体和受体位点被标记下划线。

序列数据确认了在SFCMM-3(227bp缺失)和TK3(214bp缺失)样品中产生了不同的被剪接形式。正如所期待的，两种情况下，GU和AG二核苷酸都分别出现在所缺失序列的5’和3’末端。

实施例3-通过定点诱变消除剪接

材料和方法

从野生型SFCMM-3载体开始，通过定点诱变制备在HSV-tk基因中具有不同突变的重组质粒(图6)。三碱基简并变化被引入，所以在所有情况中都保留了HSV-tk酶的野生氨基酸序列。

定点诱变

为了产生pcDNA3.1-tk质粒，使用EcoRI和XhoI对SFCMM-3质粒进行消化，并将EcoRI/XhoI片段连接到EcoRI/XhoI消化过的pcDNA3.1(Invitrogen)上。

从pcDNA3.1-tk质粒，使用QuickChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，通过定点诱变产生了所有的HSV-tk突变体。用于引入所期望的突变的寡核苷酸引物与载体的反向链互补。在下表中报道了正义引物的序列：

突变位置	寡核苷酸序列^a	所产生的突变体	质粒克隆^b
突变位置	寡核苷酸序列^a	所产生的突变体	质粒克隆^b
t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′	TkMut2	10.1
t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′	TkMut2	10.1
t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′	TkMut24	177.3
t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′			g555a	5′ATGACCCCCCAAGCCGTGCTGGCG-3′
				g555a	5′ATGACCCCCCAAGCCGTGCTGGCG-3′
		a541t/g542c/g555a	5′-TACCTTATGGGCTCCATGACCCCCCAAGCCGTGC-3′	TkMut34	57.1
		a541t/g542c/g555a	5′-TACCTTATGGGCTCCATGACCCCCCAAGCCGTGC-3′	TkMut34	57.1
		g555a	5′-ATGACCCCCCAAGCCGTGCTGGCG-3′	TkMut4	19.1
		g555a	5′-ATGACCCCCCAAGCCGTGCTGGCG-3′	TkMut4	19.1
		t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′	TkMut234	171.1
a541t/g542c/g555a	5′-TACCTTATGGGCTCCATGACCCCCCAAGCCGTGC-3′	t330c	5′-CCTCGACCAGGGCGAGATATCGGCCG-3′

^a核苷酸突变的位置以黑体下划线表示。

^b数字代表每个SFCMM-3 HSV-tk质粒克隆突变体的号码。

对所得到的载体进行测序以验证正确的核苷酸取代。接着通过EcoRI和XhoI消化从pcDNA3.1中去除HSV-tk突变的片段，接着克隆进SFCMM-3质粒，以产生SFCMM-3 HSV-tk突变体。

在对SFCMM-3 HSV-tk突变体进行序列确认后(图1)，每种类型取一种质粒克隆用于瞬时转染E86细胞。将SFCMM-3和TK3质粒用作对照。从E86培养物中收集上清液，以稳定转导在实施例2的材料和方法部分中所描述的双嗜性包装细胞系Am12。针对ΔLNGFR的表达对所得到的细胞群加以选择。

从含有感染性反转录病毒颗粒的E86和Am12培养物上清液中提取RNA。使用TKA1和TKB1引物根据实施例2的材料和方法部分所描述的方案在来自86和Am12上清的RNA上进行RT-PCR反应。

对CEMA301细胞系和PBL的转导和PCR分析

在补充有10％FBS(Hyclone)和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640(Hyclone)中培养CEM A301细胞。使用含有SFCMM-3 HSV-tk突变体2和234的Am12培养物上清液感染CEM A301细胞。在转导前一天，培养5×10⁵细胞/ml。接着通过对反转录病毒载体颗粒的一次离心循环对细胞进行转导。在转导期之后，收集细胞，并通过FACS分析实际被转导的细胞的百分比。使用含有SFCMM-3 HSV-tk突变体2以及SFCMM-3的Am12上清液对来自不同供体的PBL进行转导(如实施例2的材料和方法部分中所描述的)。

接着针对ΔLNGFR的表达对经转导的细胞进行拣选，并在培养物中铺展数天。

从实施例2的材料和方法部分所描述的被转导未被选择的细胞以及从被转导被选择的细胞制备用于PCR分析的沉淀。从沉淀的细胞提取基因组DNA，并使用TKA1和TKB1或TKY1和TKY2或TKZ1和TKZ2引物(如下表所示)在25μl的反应混合物中进行PCR反应，所述反应混合物含有100-500ng基因组DNA，具有1.5mM MgCl₂(AppliedBiosystems)、200nM的每种dNTP、300nM的每种引物、1.25单位AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)的1X RT-PCR缓冲液。RT-PCR循环方案由以下步骤构成：首先在94℃进行变性15分钟步骤，接着是40个94℃变性30秒、60℃退火50秒以及72℃延伸1分钟的循环，以及在72℃下延伸10分钟的最后一个步骤。通过琼脂糖凝胶电泳对10微升扩增产物进行分析。

引物名称	引物序列	PCR产物长度(未剪接的HSV-tk)
引物名称	引物序列	PCR产物长度(未剪接的HSV-tk)	TKA1TKB1	5′-CGT ACC CGA GCC GAT GAC TT-3′5′-TGT GTC TGT CCT CCG GAA GG-3′	401bp
TKY1TKY2	5’-TTA TAT AGA CGG TCC TCA CGG G-3’5’-CCA GCA TAG CCA GGT CAA GC-3’	542bp	TKA1TKB1		401bp
TKY1TKY2		542bp	TKZ1TKZ2	5’-GCC ACC ATG GCT TCG TAC-3’5’-CGA GTT AAT TCT CAG TTA GCC TCC-3’	1149bp

结果

E86上清液中HSV-tk突变体的剪接特性

在除了阴性对照(来自未被转染的E86细胞、E86 C-的上清液)之外的所有样品中都检测到了对应于HSV-tk非剪接形式的(401bp)的主要产物(靠上的条带)。

在来自于所有突变体载体的RNA中，与SFCMM-3和TK3载体相比，E86包装细胞系所产生的次要产物(靠下的条带)量较少。

Am12上清液中HSV-tk突变体的剪接特性

在除了阴性对照外(来自未感染细胞、Am12 C-和H₂O)之外的所有的样品中都检测到了HSV-tk的未剪接形式(图8)。在TkMut4(突变4)和TkMut34(突变3+4)突变体检测到了靠下的条带，其分别对应TK3和SFCMM-3样品的靠下的条带。溴化乙啶信号的强度比TK3和SFCMM-3低，这说明被剪接的产物在突变体中所出现得要少。该条带在TkMut2(突变2)、TkMut234(突变2+3+4)和TkMut24(突变2+4)突变体中没有被检测到。事实上，在TkMut2、TkMut234和TkMut24突变体中检测到了大约100和200bp的两条非常弱的条带。

经转导的CEMA301细胞和PBL中HSV-tk突变体的剪接特性

通过使用TKA1/TKB1引物进行PCR，对来自经TkMut2和TkMut234突变体以及SFCMM-3和TK3上清液转导的CEM A301的基因组DNA进行分析。在除了阴性对照外(未被转导的细胞、CEM NT和H₂O)之外的所有样品中都检测到了HSV-tk的未剪接形式(401bp)(图9)。在TK3和SFCMM-3预选和选择后样品中检测到了靠下的条带，其对应于HSV-tk基因的被剪接形式。在选择前和选择后，在经TkMut2和TkMut234突变体转导的CEM中都没有观察到靠下的条带。

为了排除在HSV-tk基因的不同区域发生替代性剪接事件的可能性，使用TKY1/TKY2和TKZ1/TKZ2引物，对被TkMut2和SFCMM-3上清液进行了更加广泛的分析。

在所有的样品中都检测到了HSV-tk的未剪接形式(分别542bp和1149bp)(图10)。在预选和选择后样品SFCMM-3中检测到了靠下的条带，其对应于HSV-tk基因的被剪接形式。使用TKY1/TKY2或使用TKZ1/TKZ2 PCR引物都没有在经TkMut2转导的CEM中观察到靠下的条带。

通过使用TKA1/TKB1引物进行PCR，对经SFCMM-3和/或TkMut2上清液转导的三种不同供体(Don1、Don2和Don3)的PBL的基因组DNA进行分析。在所有的样品中都检测到了HSV-tk的未剪接形式(401bp)(图11)。在SFCMM-3样品中检测到了靠下的条带，其对应于HSV-tk基因的被剪接形式。在经TkMut2转导的PBL中没有观察到靠下的条带。使用TKZ1/TKZ2引物得到了相同的结果(图12)，其包括全长的HSV-tk基因，这样排除了引入的突变可能产生不同的剪接变体的可能性。

所有的这些发现都表明：所引入的突变消除了或者至少非常显著地降低了在经转导的CEM以及在经转导的淋巴细胞中任何被剪接形式的HSV-tk基因。

表1针对SFCMM-3上清液和经转导的PBL分析被剪接形式的HSV-tk

上面说明书中所提到的所有出版物都通过引用并入本文。对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明范围和精神的情况下，对本发明所述方法和系统进行的多种修饰和变化是显而易见的。尽管已经根据具体的优选实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解，所要求权利的本发明不应当被不适当地限定为这些具体实施方式。事实上，对于生物化学、生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的、对用于开展本发明的所述模式的多种修饰都被认为在后面权利要求的范围内。

参考文献

Moolten，Cancer Res.46，p5276(1986)

Mullen，Pharmac.Ther.63，p199(1994)

Marini等人，Gene Therapy 2，p655(1995)

Kokoris等人，Gene Terapy 6，p1415-1426(1999)

Fillat等人，Current.Gene Therapy 3，p13 2003

Tiberghien等人，Blood97，p63(2001)

Garin等人，Blood97，p122(2001)

Chalmers，Molecular Therapy 4 p146(2001)

Rettig等人，Molecular Therapy 8，p29(2003)

McKnight等人，Nuc.Acids Res8，p5949(1980)

Swain和Galloway，J.Virol.46，p1045(1983)

Davidson和Scott，J.Gen.Virol.67，p1759(1986)

Otsuka和Kit，Virology 135，p316-330，(1984)

Nunberg等人，J.Virol.63 p3240(1989)

Robertson和Whalley，Nuc. Acids Res.16 p11303(1988)

Mittal和Field，J.Virol 70 p2901(1989)

Martin等人，J.Virol.63 p2847(1989)

Scott等人，J.Gen.Virol.70p3055(1989)

Honess等人，J.Gen.Virol.70 p3003(1989)

Baer等人，Nature(London)310p207(1984)

McKnight等人，Nucl.Acids Res.8p5949(1980)

Drinkwater和Klinedinst，PNAS 83p3402(1986)

Liao和Wise Gene 88p107(1990)

Horwitz等人，Genome 3 p112(1989)

Lewis 等人，EMBO.J 11 p3053(1992)

Lewis和Emerman J.Virol.68 p510(1994)

Meyer，等人，J.Gen.Virol.72 p1031(1991)

Smith和Moss Gene，25 p21(1983)

Upton，等人，J.Virology 60 p920(1986)

Gershon，等人，J.Gen.Virol.70 p525(1989)

Weir，等人，J.Virol.46 p530(1983)

Esposito，等人，Virology135 p561(1984)

Hruby，等人，PNAS，80 p3411(1983)

Kilpatrick，等人，Virology 143 p399(1985)

Binns，等人，J.Gen.Virol 69 p1275(1988)

Boyle，等人，Virology 156 p355(1987)

Schnitzlein，等人，J.Virological Method，20 p341(1988)

LytVyn，等人，J.Gen.Virol.73 p3235(1992)

Moss Science 252 p1662(1991)

Verzeletti，Hum.Gene Therapy 9 p2243(1998)

Chalmers，Mol.Therapy 4 p146(2001)

Claims

1.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸替换，并且其中剪接受体位点的核苷酸没有变化。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中与图1中野生型序列(Tkwt)中位置329和330上的剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中与图1中野生型序列的位置329和330上的剪接供体位点核苷酸对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

4.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

5.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1中野生型序列(Tk wt)中位置329和330上的剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中剪接受体位点的核苷酸没有变化。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中与位置329和330对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

7.根据权利要求5或6所述的多核苷酸，其中与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

8.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1中野生型序列(Tk wt)中位置329和330上的剪接供体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1中野生型序列的位置554和555上的剪接受体位点对应的核苷酸中的至少一个，以及与位置662和663上的剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个没有变化。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中与位置554和555对应的核苷酸都没有变化。

10.根据权利要求8或9所述的多核苷酸，其中与位置662和663对应的两个核苷酸都没有变化。

11.根据权利要求8～10中任一项所述的多核苷酸，其中与位置329和330对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的多核苷酸，其中与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

13.一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut2序列。

14.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(TK wt)的位置329和330上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1的野生型序列的位置541和542上的剪接受体位点对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中与位置541和542对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

16.根据权利要求14或15所述的多核苷酸，其中与位置329和330对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

17.根据权利要求14～16中任一项所述的多核苷酸，其中与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

18.根据权利要求14～17中任一项所述的多核苷酸，其中与位置541对应的核苷酸被从A变化为T。

19.根据权利要求14～18中任一项所述的多核苷酸，其中与位置542对应的核苷酸被从G变化为C。

20.根据权利要求14～19中任一项所述的多核苷酸，其中与图1中的野生型序列的位置554和555上的剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其他核苷酸所替换，从而不存在剪接位点。

21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中与位置555对应的核苷酸被从G变化为A。

22.一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut23序列。

23.一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut234序列。

24.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(Tk wt)的位置329和330上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换，并且其中与图1的野生型序列的位置554和555上的核苷酸的剪接受体位点对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中与图1中野生型序列(Tk wt)的位置329和330对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换。

26.根据权利要求24或25所述的多核苷酸，其中与位置330对应的核苷酸被从T变化为C。

27.根据权利要求24～26任一项所述的多核苷酸，其中与位置555对应的核苷酸被从G变化为A。

28.一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut24序列。

29.一种多核苷酸，其含有编码胸苷激酶的核苷酸序列，其中与图1的野生型序列(Tk wt)的位置554和555上的核苷酸的剪接受体位点核苷酸对应的核苷酸中的至少一个被其它核苷酸所替换。

30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中与位置555对应的核苷酸被从G变化为A。

31.根据权利要求29或30所述的多核苷酸，其中与图1的野生型序列的位置541和542上的核苷酸对应的剪接受体位点核苷酸中的至少一个也被其它核苷酸所替换。

32.根据权利要求31所述的多核苷酸，其中与位置541和542对应的两个核苷酸都被其它核苷酸所替换，这样没有出现剪接位点。

33.根据权利要求31或32所述的多核苷酸，其中与位置541对应的核苷酸被从A变化为T。

34.根据权利要求32～33中任一项所述的多核苷酸，其中与位置542对应的核苷酸被从G变化为C。

35.一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut4序列。

36. 一种多核苷酸，其含有图1中的TkMut34序列。

37.根据权利要求1～36中任一项所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸替换不改变由所述核苷酸序列所编码的多肽序列。

38.一种载体，其含有前面权利要求中任一项所述的多核苷酸。

39.一种宿主细胞，其含有权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，或者权利要求38所述的载体。

40.一种药物组合物，其含有权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，或者权利要求38所述的载体或者权利要求39所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体。

41.一种试剂盒，其含有：

(i)权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，或者权利要求38所述的载体或者权利要求39所述的宿主细胞或者权利要求40所述的药物组合物；和

(ii)基本上无毒的试剂，其能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

42.用于医药的权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，权利要求38所述的载体，权利要求39所述的宿主细胞或权利要求40所述的药物组合物。

43.含有权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，权利要求38所述的载体，权利要求39所述的宿主细胞或权利要求40所述的药物组合物和基本上无毒的试剂的产品，其在对具有需要被破坏的细胞的患者的治疗中同时、分别或连续使用，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

44.一种破坏细胞的方法，其包括：

(i)将在权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸，权利要求38所述的载体引入所述的细胞；和

(ii)将所述细胞同时、分别或连续接触基本上无毒的试剂，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

45.一种破坏细胞的方法，其包括：

(i)将在权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸或权利要求38所述的载体引入所述的细胞；

(ii)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

(iii)将所述细胞接触基本上无毒的试剂，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

46.一种治疗具有需要被破坏的细胞的患者的方法，其包括：

(i)将在权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸、权利要求38所述的载体或权利要求40所述的药物组合物引入所述患者；

(ii)将所述患者同时、分别或连续接触基本上无毒的试剂，其中所述基本上无毒的试剂能被胸苷激酶转化为毒性试剂。

47.一种治疗具有需要被破坏的细胞的患者的方法，其包括：

(ii)使所述多核苷酸或载体被所述细胞吸收；

(iii)使所述细胞表达胸苷激酶；以及

(iv)将基本上无毒的试剂引入所述患者，其中所述基本上无毒的试剂被胸苷激酶转化为毒性试剂。

48.一种治疗具有需要破坏的细胞的患者的方法，其包括：

(i)从患者或者供体细胞取出所述细胞；

(ii)将在权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸或权利要求38所述的载体离体引入所述细胞；

(iii)将所述经修饰的细胞引入到所述患者；

(iv)使所述细胞表达胸苷激酶；和

(v)向所述患者施予基本上无毒的试剂，其中所述基本上无毒的试剂被胸苷激酶转化为毒性试剂。

49.一种预防患者中移植物抗宿主病的方法，其包括：

(i)向经遗传改造的宿主T细胞进行给药，以包括权利要求1～37中任一项所述的多核苷酸或权利要求38所述的载体；和

(ii)在出现移植物抗宿主病之前，以通过所述药物与胸苷激酶的相互作用能有效杀死经遗传改造的T细胞的量，对所述宿主施予基本上无毒的试剂。

50.根据权利要求43所述的产品，或者根据44～49中任一项所述的方法，其中所述基本上无毒的试剂是更昔洛韦、阿昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧，2-氟，β-D-阿糖呋喃基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、ara-1、1-β-D-阿糖呋喃基胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿嘧啶、5-碘基-5’-氨基-2，5’-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIV、二脱氧胞嘧啶、Ara C和溴乙烯脱氧尿苷(BVDU)中的任意一种。

51.利要求1～37中任一项所述的多核苷酸、权利要求38所述的载体或权利要求39所述的宿主细胞在制备用于破坏患者中细胞的药物中的应用。

52.利要求1～37中任一项所述的多核苷酸、权利要求38所述的载体或权利要求39所述的宿主细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

53.利要求1～37中任一项所述的多核苷酸、权利要求38所述的载体或权利要求39所述的宿主细胞在制备用于预防移植物抗宿主病的药物中的应用。