JP2014528729A - ウイルスベクター精製システム - Google Patents
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Abstract
本発明はウイルスベクター、特にレトロウイルス科に属するウイルスベクターを精製する新しい方法であって、かかるベクターを生産したパッケージング細胞株における細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子の発現に基づく前記方法に関する。細胞表面マーカーをベクターのウイルスエンベロープに組み込むことにより免疫学的方法による精製が可能になる。【選択図】 なし
Description
本発明はウイルスベクター（VV）、特にレトロウイルス科に属するVVを効率的に精製する方法に関する。さらに特に本発明はパッケージング細胞株における外因性細胞表面マーカーの発現に基づく、免疫学的方法によるVVの精製に関する。
ウイルスベクター（VV）は遺伝物質を標的細胞中に送達するために通常用いられる。現在VVは治療遺伝子を患者に送達する遺伝子治療の施用に用いられている。臨床の施用においては、規制機関が課する要求に適合する高品質のVVを開発することが必要である。特に、大きいウイルス備蓄を得るために大規模生産プロセスで使用するより安全なプロデューサー細胞株を開発することが必要である。一方では、ヒトに投与するための臨床グレードのウイルス粒子の生産に費用効率が高くかつ拡張の可能な精製プロセスが欠かせない。
VV調製物の精製は、ベクター成分、細胞および培地夾雑物、例えば血清による毒性、炎症または免疫応答を防止することが義務付けられている（Baeklandら、2003；Tuschongら、2002）。理想的には、精製プロセスはウイルスの感染性（安定性）の維持、ウイルス粒子の高い回収率、夾雑物（形質導入のDNA、タンパク質およびインヒビターなど）の除去、ウイルス上清濃縮の可能性、および、勿論、プロセスの拡張可能性を確実にする必要がある（Andreatis et al., 1999; Lyddiatt and O’Sullivan, 1998）。
現在、レトロウイルスベクターを精製する色々な手順が色々な技法、特に；遠心分離に基づく方法、膜分離プロセス、クロマトグラフィまたは塩との沈降およびPEGなどのポリマーその他の方法に基づいて開発されている。現在提案されている精製スキームは回収率が低い（およそ30％）（Rodriguesら、2007）。全てのこれらの方法は元来、タンパク質生産のために開発されたものであり、VVの精製用にさらに工夫されている。ウイルス粒子の特殊性と複雑性の故に、最終製品の生物学的活性、特に感染性を維持する一方、高い生産性とハイスループットを得るための精製方法の改善が必要である。
さらなるもっと最近の例がMertenら（2011）により報じられており、これは、Wiskott-Aldrich症候を治療するパイロット遺伝子治療の臨床試験環境で用いるレンチウイルスベクターを大規模かつGMP条件のもとで生産するプロセスを開示している。開示されたプロセスにはレンチウイルス粒子の生産および下流の精製プロセスの両方が含まれる。特にこの精製はいくつかのクロマトグラフィおよび膜に基づくプロセスのステップを組み合わせる多段スキームに基づくものであって、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィが含まれる。生産率に関する結果が非常に良くかつ最終調製物中のDNAおよびタンパク質夾雑物が存在しないにも関わらず、精製プロセスの最終収率は従来開示された方法の範囲内（30％未満）であり、また最終サンプル中のウイルスベクターの感染性が低い。
ウイルスと細胞の両方のタンパク質はウイルス成熟の間、特にいわゆる出芽プロセスの間にウイルスエンベロープ中に組み込まれ、そして宿主細胞から放出される（Arthurら、1992）。例えば、数多くの内因性宿主細胞タンパク質（ヒトリンパ球抗原、（HLA）クラスIおよびII、CD44、補体制御タンパク質その他を含む）はHIV-1エンベロープ中に組み込まれるが、他のもの（例えば、CXCR4、CCR5およびCCR3）は除外されることが示された。この観察に基づいて、細胞型特異的抗原がHIV-1複製細胞起源のマーカーを果たしうることが示唆された。さらに、リンパ球由来とマクロファージ由来の増殖HIVウイルスの間を区別できる免疫磁気ウイルス捕獲アッセイが開発された（Lawnら、2000）。特にLawnらは、CD26と結合できる抗体を用いてT細胞由来のHIVウイルスを単離し、順に、抗CD36抗体を用いて捕獲できるマクロファージ由来のHIV-1から区別できることを示した。CD26およびCD36の両方は、T-細胞およびマクロファージにおけるHIV-1感染の間に過剰発現される内因性宿主細胞タンパク質である。両方のタンパク質はまた、ウイルスエンベロープ中に組み込まれ、こうしてウイルスの選択的単離を可能にする。Lawnらは宿主細胞特異的抗原と結合できる抗体のパネルを試験した後に、成功したものを同定した。興味深いことに、マクロファージによって内因的に高レベルで発現される抗原（CD32、CD64、CD88およびCD89）と結合できるいくつかの抗体は、その代わり、ウイルスを捕獲することができず、従って、宿主細胞表面上のある特定のマーカーの過剰発現はウイルスを捕獲するために必要であるが十分な条件でないことを示す。Lawnらは、宿主により発現された外因性タンパク質をウイルスエンベロープ中に組み込むことに成功しうること、次いで、機能的に活性なウイルス粒子を精製するために用いることを示してない。
特定の改変細胞表面マーカーを用いて、形質導入した細胞を精製することができるのは示されている。特に、WO/9506723はこれらの細胞に細胞表面受容体（すなわち、さらに細胞表面に提示される受容体）をコードする核酸を発現させることにより、真核生物（哺乳動物）細胞をマーキングするプロセスを開示している。この細胞選択プロセスは、前記受容体の細胞内ドメインをコードする領域が完全にまたは部分的に欠失しているかまたは改変されており、その結果、表面に提示される受容体は結合後にその結合パートナーへのシグナル伝達ができない核酸の使用により特徴付けられる。開示したプロセスで使われる細胞表面受容体は、細胞内ドメインが欠失した末端切断型の低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）である。得られる末端切断型細胞表面受容体はΔLNGFRと呼ばれる。ΔLNGFRタンパク質の存在は、モノクローナル抗体と磁性ビーズの使用を介する、遺伝的に改変された細胞のin vitro免疫選別が可能になる。
ΔLNFGRは形質導入した細胞を選択する遺伝子治療で現在使われている末端切断型細胞表面マーカーである。例えば、これはHSV-TK遺伝子治療の手段に使われ、血液学的悪性を治療するための安全な同ハプロタイプ造血幹細胞移植（HSCT）を可能にする。TK治療法は自殺遺伝子HSV-TKとマーカー遺伝子ΔLNGFRの両方を運ぶレトロウイルスベクターを使う（Verzelettiら、1998）。
今まで、ΔLNGF受容体はVVを精製するために使われてない。
臨床応用のために精製VVを生産する必要があるので、VVの良好な回収ならびに安定性の点でも良い品質を有する、十分に安全なベクターの作製を可能にする効率的な精製プロセスを得るためにいくつかの試みがなされている。現在使われている方法は低回収であって、これらは組換えタンパク質生産のために開発されそしてVV精製に適応された下流プロセスに由来するので、いずれの場合にも、ある限界を有する。それ故に、良好な回収と高い感染性を維持して安全なウイルス粒子を得ることを可能にする、遺伝子治療ベクターの大規模生産に用いるVVのための効率的、高速かつ拡張可能な精製方法が必要である。
Baekeland, V., et al. (2003) Optimized lentiviral vector production and purification procedure prevents immune response after transduction of mouse brain. Gene Ther 10: 1933-1940.
Tuschong, L., et. al. (2002). Immune response to fetal calf serum by two adenosine deaminase-deficient patients after T cell gene therapy. Hum. Gene Ther. 13: 1605-1610.
Andreadis, S.T., et al. (1999). Large scale processing of recombinant retrovirus for gene therapy. Biotechnolo. Prog. 15: 1-11.
Lyddiatt,A., and O'Sullivan, D.A. (1998). Biochemical recovery and purification of gene therapy vectors. Curr. Opin Biotechnol. 9: 177-185.
Rodrigues, et al. (2007). Purification of retroviral vectors for clinical application: biological implications and technological challenges. J. of Biotech. 127: 520-541.
Martens et al., (2011). Large-Scale manufacture and characterization of a lentiviral vector produced for clinical ex vivo gene therapy application. Hum. Gene Ther 22:343-356.
Arthur, L.O, et al. (1992). Cellular proteins bound to immunodeficiency viruses: implication for pathogenesis and vaccines. Science 258: 1935-1938.
Lawn, S. D., et al. (2000). Cellular compartments of human immunodeficiency virus type 1 replication in vivo: determination by presence of virion-associated host proteins and impact of opportunistic infection. J Virol 74 (1): 139-145
Verzeletti, S., et al. (1998). Herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer for controlled graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia: clinical follow-up and improved new vectors. Hum. Gene Ther, 9(15):2243-51
本発明はVV、特にレトロウイルス科に属するVVの精製の分野に関する。現在VVを精製するために使われる下流プロセスは組換えタンパク質に対して通常応用される方法に基づく。VVは基礎研究および遺伝子治療臨床試験に使われる独特な粒子であり、後者の場合には臨床グレードの生産が必要である。それ故に精製が必須であり、VVの特異性の故に満たすことが必要ないくつかの要件がある。VVは環境条件に感受性があるので精製プロセスは効率的かつ高速であることを必要とし、かつ、臨床応用には大きいバッチが必要であるので拡張可能であることを必要とする。
本発明は、ウイルス粒子を精製する新しい計画であって、細胞原形質膜に包埋された宿主細胞タンパク質をそれらの外側エンベロープ中に組み込むかかる粒子の特性の開発に基づく前記計画を提供する。この精製方法は、VVを生産するパッケージング細胞株における細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子の発現を含むものである。かかるマーカーをパッケージング細胞の細胞膜上に露出させる。ウイルス粒子の生産過程において、成熟期間に出芽プロセスを介して、細胞表面マーカーをウイルスエンベロープに組み込ませる。ウイルスエンベロープ中に組み込まれると、このマーカーは、事実上、ウイルス表面マーカーであるが、本発明者らは前記マーカーを続いて「細胞表面マーカー」と呼ぶことにする。次いでウイルス粒子をかかるマーカーを認識できる抗体と一緒にインキュベートし、免疫学的方法を介して精製する。パッケージング細胞、特にパッケージング上皮細胞にとって外因性である全ての細胞表面タンパク質を、本発明の細胞表面マーカーとして使用することができる。使用できる細胞表面 マーカーは、例えば、CD26、CD36、CD44、CD3、CD25および細胞内ドメインが欠失した低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）である。好ましい実施形態において、精製プロセスに使用される細胞表面マーカーはΔLNGFRである。
開発した精製方法は非常に多彩であって、成熟期間に出芽プロセスを通して宿主細胞膜のタンパク質を組み込むいずれのVV、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アルファウイルス［例えば、セムリキ森林ウイルス（SFV）、Sindibisウイルス（SIN）］、ラブドウイルス［例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）］、およびオルソミキソウイルス［例えばインフルエンザAウイルス］にも適用可能である。さらに本精製方法は生産方法と連結していて、パッケージング細胞株におけるマーカー発現を必要とし、それ故に、生産と下流プロセスを同じ出発物質（パッケージング細胞株）上に構築する集積手法を可能にする。こういう背景で、VVの生産に必要な全てのエレメントならびに精製に必要な細胞表面マーカーをコードするさらなる外因性遺伝子を含有する安定なパッケージング細胞株を作製することが考えられる。この態様は、拡張性と効率の両面にとって特に有用である。
この方法は上清からVVを分離するために、細胞表面マーカーと結合できるリガンドの使用に基づく。好ましくは、リガンドは抗体であって、ウイルス粒子の分離は免疫学的方法により行うことができる。より好ましくは、本方法は免疫磁気選択を利用する。免疫磁気選択を行ういくつかの計器が存在するので、本発明の方法は容易にスケールアップと自動化が可能である。
さらに、本発明の方法は手軽で、非常に高速でかつ極めて効率的であり、その精製効率は現在用いられる方法、例えば、クロマトグラフィ（DEAEおよびSECカラムなどを使う方法）で得られるものよりも高い。
さらに、本発明の精製方法は高い回収率を可能にし、この方法で精製したベクターの力価収率はほとんどの小規模試験において少なくとも85％またはそれよりも高い（120％）ことが示されている。さらに、本発明の方法で精製したレンチウイルスベクターの感染性は相当高い増加が得られている（一過性および安定な生産に対してそれぞれ43％および60％）。かかる力価収率と感染性の増加は、最終結果に影響を与えうる他のステップを考慮に入れることなく、本発明の精製方法の単一の主要ステップ、すなわち、ウイルスベクター-リガンド複合体の分離で達成される。
大規模実験も実施され、非常に良い結果が得られた。実際、ウイルス力価で表した回収は、ウイルスベクター-リガンド複合体の単一ステップ分離で、60％である。分離段階を開始する前に、予備濾過および遠心分離ステップを通して大まかに夾雑物と形質導入インヒビターを除去し、そしてまた、受容体のリガンドとのインキュベーションを通してウイルス上清のウイルス力価を濃縮する。完全な多ステップ精製プロセス後の最終力価収率（ウイルス上清に対する最終精製産物の収穫）は100％超を得る。
これらは、文献に開示された完全な精製プロセスの力価収率が30％程度（Rodriguesら、2007）または大規模生産の場合にはそれ未満（Mertenら、2011）であることを考えると非常に良い結果である。さらに、本発明の方法により大規模で精製したVVは、感染性の3倍増加、すなわち、同じ方法により小規模で得たよりさらに高い増加をもたらす。これは非常に重要でかつ予想しなかった利点である、というのは、前記文献（Mertenら、2011）は通常の方法による精製に対してさらなる感染性の低下を報じているからである。
本発明の説明
本発明の第1の態様によれば、ウイルスベクターを精製する方法であって：
i. パッケージング細胞株に細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子および目的の遺伝子（GOI）を導入するステップ、
ii. こうして得たプロデューサー細胞株を培養するステップ、
iii. 細胞表面マーカーをその外側エンベロープ上に持つウイルスベクター粒子を含有する上清を採集するステップ、
iv. 前記上清を細胞表面マーカーと結合可能なリガンドと一緒にインキュベートするステップ、
v. リガンド−ウイルスベクター複合体を分離するステップ、
vi. 精製したウイルスベクター粒子を得るステップ、
を含むものである、前記方法を提供する。
本発明の第1の態様によれば、ウイルスベクターを精製する方法であって：
i. パッケージング細胞株に細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子および目的の遺伝子（GOI）を導入するステップ、
ii. こうして得たプロデューサー細胞株を培養するステップ、
iii. 細胞表面マーカーをその外側エンベロープ上に持つウイルスベクター粒子を含有する上清を採集するステップ、
iv. 前記上清を細胞表面マーカーと結合可能なリガンドと一緒にインキュベートするステップ、
v. リガンド−ウイルスベクター複合体を分離するステップ、
vi. 精製したウイルスベクター粒子を得るステップ、
を含むものである、前記方法を提供する。
本発明の他の態様においては、細胞表面マーカーを外側エンベロープ上に持つウイルスベクター粒子を含有する上清を濾過し、場合によっては、濃縮し、次いで細胞表面マーカーと結合可能なリガンドとインキュベートする。
好ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター［例えば、セムリキ森林ウイルス（SFV）、Sindibisウイルス（SIN）から得たベクター］、ラブドウイルスベクター［例えば、水疱性口内炎ウイルス（VSV）由来のベクター］、およびオルソミクソウイルスベクター［例えば、インフルエンザAウイルス由来のベクター］である。より好ましくは、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
一実施形態において、細胞表面マーカーはパッケージング細胞株に外因性であるいずれかの細胞表面マーカーであり、パッケージング細胞株は好ましくは上皮パッケージング細胞株である。好ましくは、細胞表面マーカーはCD26、CD36、CD44、CD3、CD25およびΔLNGFRから選択される。
より好ましくは、細胞表面マーカーはΔLNGFRである。
本発明の一態様において、細胞表面マーカーの発現は一過性である。
本発明の他の態様において、細胞表面マーカーの発現は安定している。
一実施形態において、GOIと細胞表面マーカーは同じトランスベクター中に発現される。
他の実施形態において、GOIおよび細胞表面マーカーは別々のベクターにおいて発現される。
好ましくは、リガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド、ペプチドミメチック、抗体、抗体フラグメント、アフィボディから選択される化学的または生物学的エンティティーである。
本発明のさらなる態様において、リガンドは上清から分離できる一成分と連結している。
好ましくは、リガンドは抗体である。
より好ましくは、抗体は磁性ビーズと結合していて、分離は抗体−ウイルスベクター複合体を含有する溶液に磁場を適用することにより行う。
好ましくは、ウイルスベクターはその磁場を除くことによって得られる。
より好ましくは、抗体-ウイルスベクター複合体の分離はカラム上で行い、ウイルスベクターは磁場を除いてカラムから流出させることにより得られる。
一実施形態において、ウイルスベクターは抗体から、細胞表面マーカー抗体結合を切断することにより得る。
本発明の他の態様においては、前記パッケージング細胞株により生産されるウイルスベクターの精製に使用するための、パッケージング細胞株に発現される外因性細胞表面マーカーを提供する。
好ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター［例えば、セムリキ森林ウイルス（SFV）、Sindibisウイルス（SIN）から得られるベクター］、ラブドウイルスベクター［例えば、水疱性口内炎ウイルス（VSV）由来のベクター］、およびオルソミクソウイルスベクター［例えば、インフルエンザAウイルスベクター由来のベクター］である。より好ましくはウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
細胞表面マーカーはパッケージング細胞株に対して外因性、好ましくは上皮パッケージング細胞に対して外因性である。好ましくは、細胞表面マーカーはCD26、CD36、CD44、CD3、CD25およびΔLNGFRから選択される。
より好ましくは細胞表面マーカーはΔLNGFRである。
本発明の一態様において、細胞表面マーカーの発現は一過性である。
本発明の他の態様において、細胞表面マーカーの発現は安定している。
本発明の詳細な説明
本発明の好ましい特徴と実施形態の詳細な説明を非限定の実施例を用いて記載する。
本発明の好ましい特徴と実施形態の詳細な説明を非限定の実施例を用いて記載する。
本発明は、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技法を使いうる当業者により実施に移すことができる。かかる技法の全ては公開された文献に開示されかつ説明されたものである。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F.M. et al. (1995および定期補充版；Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)； Current Protocols in Immunology, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)； B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons； J . M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice； Oxford University Press； M. J . Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press；およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これらの文献の全ては参照により本明細書に組み込まれる。
精製方法
本発明は新しいVV精製方法を提供する。好ましくは、本発明はVV精製方法に関するものであって、前記VVは、γレトロウイルス（原型：Moloneyマウス白血病ウイルス、Mo-MLV）、レンチウイルス（原型：HIV）、アルファウイルス［例えばセムリキ森林ウイルス（SFV）、Sindibisウイルス（SIN）］、ラブドウイルス［例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）］、およびオルソミキソウイルス［インフルエンザAウイルス］を含むものである。提案した精製方法はウイルスの成熟期の1つに基づく。ウイルス粒子は宿主細胞から出芽プロセスを通して分泌され、そのプロセスによりウイルスのカプシドはウイルス生産細胞由来の原形質膜で包まれる。そうすることで、ウイルスはその外側エンベロープに、細胞原形質膜に通常、包埋されるいくつかの宿主細胞タンパク質を組み込む。
本発明は新しいVV精製方法を提供する。好ましくは、本発明はVV精製方法に関するものであって、前記VVは、γレトロウイルス（原型：Moloneyマウス白血病ウイルス、Mo-MLV）、レンチウイルス（原型：HIV）、アルファウイルス［例えばセムリキ森林ウイルス（SFV）、Sindibisウイルス（SIN）］、ラブドウイルス［例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）］、およびオルソミキソウイルス［インフルエンザAウイルス］を含むものである。提案した精製方法はウイルスの成熟期の1つに基づく。ウイルス粒子は宿主細胞から出芽プロセスを通して分泌され、そのプロセスによりウイルスのカプシドはウイルス生産細胞由来の原形質膜で包まれる。そうすることで、ウイルスはその外側エンベロープに、細胞原形質膜に通常、包埋されるいくつかの宿主細胞タンパク質を組み込む。
一過性または安定なパッケージング系により生産されたVVは同じ方式でパッケージング細胞から放出される。本発明の方法は、VVが外因性宿主原形質膜タンパク質に対する抗体を用いることにより特異的に精製できるという仮説に基づく。
本発明の第1の態様によれば、パッケージング細胞中の細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子の発現に基づくVVの精製方法が提供される。細胞表面マーカーは細胞膜上に発現されるパッケージング細胞にとって外因性のタンパク質である。発現すると、かかるマーカーは細胞膜上に載せられ、それ故に、VVの成熟の間、前記パッケージング細胞により生産されたVVの外側エンベロープ上に載せられる。本発明の方法によれば、エンベロープ上に細胞表面マーカーを包埋するウイルス粒子を含有する上清を採集してかかるマーカーを認識できるリガンドと一緒にインキュベートする。場合によっては、特に大規模なVV精製については、大きい体積を取扱いかつ精製し、上清を濾過しかつ濃縮し、次いで再懸濁しそしてリガンドとインキュベートしなければならない。全てのこれらの予備ステップは夾雑物および形質導入インヒビターの大まかな除去が可能であり、それ故に、中間調製物において観察されるウイルス力価の濃縮に、そして、その結果、精製ウイルス粒子の最終力価に寄与する。これらの予備ステップの後、リガンド-VV複合体は培地から分離され、次いでVVが得られる。分離期は本発明の精製方法の主要ステップである。リガンドと細胞表面マーカー間の結合を切断すると、VVをリガンドから分離することができる。
好ましい実施形態において、リガンドは抗体である。
本発明の方法は5つの主要ステップに総括することができる；
1)VV用のパッケージング細胞株における細胞表面マーカーの発現、
2)ウイルス粒子の生産、
3)細胞表面マーカーを認識できるリガンドとのインキュベーション、
4)リガンド-受容体複合体の分離、および
5)精製ウイルス粒子の回収。
1)VV用のパッケージング細胞株における細胞表面マーカーの発現、
2)ウイルス粒子の生産、
3)細胞表面マーカーを認識できるリガンドとのインキュベーション、
4)リガンド-受容体複合体の分離、および
5)精製ウイルス粒子の回収。
マーカーの発現とウイルス粒子の生産
本発明の精製方法は、パッケージング細胞株におけるVVに対する外因性細胞表面マーカーの発現に基づく。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーは上皮パッケージング細胞にとって外因性である。好ましくは、細胞表面マーカーはCD26、CD36、CD44、CD3、CD25および細胞内ドメインの無い末端切断型低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）から選択される。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーはΔLNGFRである。細胞表面マーカーの発現はいくつかの手段で得ることができる。本発明の一態様において、細胞表面マーカーは一過性でパッケージング細胞に発現されてもよい。一実施形態において、細胞表面マーカーと治療遺伝子の両方は同じトランスファーベクターで発現される。他の実施形態において、細胞表面マーカーと治療遺伝子は別のベクターに発現される。
本発明の精製方法は、パッケージング細胞株におけるVVに対する外因性細胞表面マーカーの発現に基づく。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーは上皮パッケージング細胞にとって外因性である。好ましくは、細胞表面マーカーはCD26、CD36、CD44、CD3、CD25および細胞内ドメインの無い末端切断型低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）から選択される。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーはΔLNGFRである。細胞表面マーカーの発現はいくつかの手段で得ることができる。本発明の一態様において、細胞表面マーカーは一過性でパッケージング細胞に発現されてもよい。一実施形態において、細胞表面マーカーと治療遺伝子の両方は同じトランスファーベクターで発現される。他の実施形態において、細胞表面マーカーと治療遺伝子は別のベクターに発現される。
本発明の他の態様において、細胞表面マーカーの発現は安定である。本発明はそれ故に、VVの生産に必要な全ての構造エレメント、例えば、ウイルスのgag/pol、rev、任意に、tatならびに目的のエンベロープタンパク質を細胞表面マーカーと一緒に含有するパッケージング細胞株を提供する。一実施形態においては、全てのこれらの遺伝子は安定なパッケージング細胞株中に安定して組み込まれる。他の実施形態においては、VVの生産に必要なエレメントは一過性で発現される。パッケージング細胞株を用いてVVを生産し、さらにGOIを含有するトランスファーベクターを導入することができる。
このパッケージング細胞株は集積した技術的解決を提供するものであって、VV生産に必要な全てのエレメントを含有し、迅速、安全かつ効率的な精製方法を可能にする。
トランスファーベクターの導入だけでなく、その生産が、安定して組み込まれたまたは一過性で発現される細胞表面マーカーを含有するパッケージング細胞株を培養することによって得られる。ウイルス粒子は出芽プロセス期間にそのエンベロープ中に細胞表面マーカーを組込み、それらは上清中に放出される。精製ウイルス粒子は上記の外因性細胞表面マーカーの存在を利用することによって得られるであろう。
他の実施形態においては、VVの生産に必要な全ての構造エレメント、例えば、ウイルスのgag/pol、rev、任意にtat、目的のエンベロープタンパク質およびそのGOIを細胞表面マーカーと一緒に含有するプロデューサー細胞株が提供される。プロデューサー細胞株の培養後に、細胞表面マーカーを含有するウイルス粒子が上清中に放出され、これらは上記の外因性の細胞表面マーカーの存在を利用して精製される。
リガンドとのインキュベーションおよびリガンド-細胞表面マーカー複合体の分離
エンベロープ中に組み込まれた細胞表面マーカーを含有するウイルス粒子は単離することができる。本発明の精製方法によれば、VVを含有する上清を、細胞表面マーカーを認識できるリガンドと一緒にインキュベートする。他の実施形態においては、VVを含有する上清を最初に濾過し、濃縮し、次いでリガンドと一緒にインキュベートする。そのリガンドを、上清からの分離を可能にする他の構造物に連結し、究極的にリガンド-VV複合体を単離する。本発明に用いることができるリガンドは化学または生物学的エンティティーであって、限定されるものでないが、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド、ペプチドミメチック、抗体、抗体フラグメント、アフィボディが含まれる。
エンベロープ中に組み込まれた細胞表面マーカーを含有するウイルス粒子は単離することができる。本発明の精製方法によれば、VVを含有する上清を、細胞表面マーカーを認識できるリガンドと一緒にインキュベートする。他の実施形態においては、VVを含有する上清を最初に濾過し、濃縮し、次いでリガンドと一緒にインキュベートする。そのリガンドを、上清からの分離を可能にする他の構造物に連結し、究極的にリガンド-VV複合体を単離する。本発明に用いることができるリガンドは化学または生物学的エンティティーであって、限定されるものでないが、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド、ペプチドミメチック、抗体、抗体フラグメント、アフィボディが含まれる。
好ましくは、リガンドは抗体であり、そして本発明の方法は抗体-VV複合体を分離する免疫選択のステップを含むものである。この事例においては、エンベロープ上に細胞表面マーカーを含有するVVを、抗-細胞表面マーカー抗体との反応性に基づいて選択することができる。
より好ましくは、本発明の方法は免疫磁気選択を含むものである。免疫磁気選択は、磁石を用いて抗原構造の分離を可能にする、抗体の常磁性ミクロスフェア（ビーズ）とのカップリングを意味する。例えば、細胞表面マーカーをエンベロープ中に組み込んだVVを含有する上清を、一次IgG抗-細胞表面受容体抗体と一緒にインキュベートしてもよい。レトロウイルス上清を次いで、抗IgG二次抗体でコーティングした免疫磁性ビーズと一緒にインキュベートし、そして磁石を適用してマーカーを運ぶレトロウイルスベクターを分離してもよい。レトロウイルス上清から分離した後に、単離したベクターを磁場から取り出して回収してもよい。あるいは、抗-細胞表面受容体抗体を磁性ビーズと直接結合してもよい。この場合、1回のインキュベーションステップ直後に磁場を溶液に適用する。
本発明で使う常磁性ミクロスフェアは当技術分野において公知であり、これらは市販のMACS(登録商標)マイクロビーズ（MiltenyiBiotec社）のような50nmの小サイズから市販のDynabeads(登録商標)（Invitrogen社）のようなより大きい0.5〜500μmの範囲のサイズを有するポリマー粒子である。常磁性ミクロスフェアを、VVエンベロープ中に組み込まれた細胞表面マーカーと結合することができる目的の特異的抗体と直接または間接に結合させてもよい。抗体の常磁性ビーズとの結合方法は当技術分野において公知であり、例えば、架橋、官能基との共有結合の形成、ビオチン-アビジン系、その他が含まれる。VVのウイルス上清からの分離は、常磁性ビーズと結合しかつ細胞表面マーカーと連結した抗体から成る複合体を含有する溶液に磁場を適用することによって得られるであろう。
本発明の好ましい態様において、免疫磁気選択はカラム上で実施される。特に、VVを含有する上清を、細胞表面マーカーを認識できる抗体（かかる抗体は常磁性ビーズと結合されている）と一緒に直接インキュベートしてもよい。他の実施形態においては、VVを含有する上清を最初に濾過しそして、場合によっては、濃縮し、次いで先に記載したようにインキュベートする。インキュベーションの後、上清またはその濾過しかつ任意に濃縮した溶液を磁気分離器中に置かれたカラムに適用して、磁場の所為でカラム中に残るウイルス粒子の不純物を除去しかつ分離する。
精製粒子の回収
本発明の方法によれば、プロセスの最終段階は精製ウイルス粒子の回収である。かかる回収は、ウイルス粒子を磁場から取り出すことによって得られる。もし精製をカラム上で行うのであれば、回収は磁場から取り出すことによって達成される。ウイルスベクターを、次いでリガンドと細胞表面マーカーの間の結合を切断することによりリガンドから分離してもよい。前記結合を切断する方法は当技術分野で公知であり、それには置換リガンドまたは酵素を含有する適当な溶液の使用が含まれる。リガンドおよび受容体の性質ならびにそれらの結合によって適当な方法が使われる。
本発明の方法によれば、プロセスの最終段階は精製ウイルス粒子の回収である。かかる回収は、ウイルス粒子を磁場から取り出すことによって得られる。もし精製をカラム上で行うのであれば、回収は磁場から取り出すことによって達成される。ウイルスベクターを、次いでリガンドと細胞表面マーカーの間の結合を切断することによりリガンドから分離してもよい。前記結合を切断する方法は当技術分野で公知であり、それには置換リガンドまたは酵素を含有する適当な溶液の使用が含まれる。リガンドおよび受容体の性質ならびにそれらの結合によって適当な方法が使われる。
効率、スケールアップおよび自動化
本発明の方法は極めて効率的であり、そして単純かつ高速である。現在提案されている精製方法は約30％の回収が可能である。注目すべきこととして、本発明の方法は、小規模のほとんどの実験で少なくとも85％またはもっと高い（120％）の力価を得ることが可能である。力価収率は、この場合、本発明の方法の主要ステップ：ウイルスベクター-リガンド複合体の分離について計算される。上記の力価収率は、外因性受容体のリガンドと一緒にインキュベートした未精製粒子の力価と精製粒子の力価の間の比から得られる。小規模実験における未精製粒子は予備濾過ステップを通してのVV上清から得られ、次いで外因性受容体のリガンドとインキュベートする。これらの結果は、本発明の方法によるウイルス力価を用いる回収が非常に高いことを示す。
本発明の方法は極めて効率的であり、そして単純かつ高速である。現在提案されている精製方法は約30％の回収が可能である。注目すべきこととして、本発明の方法は、小規模のほとんどの実験で少なくとも85％またはもっと高い（120％）の力価を得ることが可能である。力価収率は、この場合、本発明の方法の主要ステップ：ウイルスベクター-リガンド複合体の分離について計算される。上記の力価収率は、外因性受容体のリガンドと一緒にインキュベートした未精製粒子の力価と精製粒子の力価の間の比から得られる。小規模実験における未精製粒子は予備濾過ステップを通してのVV上清から得られ、次いで外因性受容体のリガンドとインキュベートする。これらの結果は、本発明の方法によるウイルス力価を用いる回収が非常に高いことを示す。
ウイルス粒子は極めて不安定でありかつ環境条件に感受性がある。特に、VVのエンベロープ上の細胞表面マーカーの存在は、原則として、かかるエンベロープの組成ならびに構造およびウイルスエンベロープタンパク質の利用可能性に影響を与え、順に、ベクターの指向性に影響を与え、究極的に、ウイルス力価および感染性に問題を生じる。本発明の方法を用いると、対照的に、力価は影響を受けないかもしくは増加すらして、注目すべきは、かかる方法で精製したレンチウイルスの感染性は小規模試験で増加する（一過性および安定な生産について、それぞれ43％および60％）。ベクターの指向性および感染性に恐らく負の影響を与えうる構造エレメントが存在する故に、これらの結果は驚くべきことである。
本発明のさらなる利点は、簡単にスケールアップしかつ自動化できることである。VVを免疫磁気選択を用いて精製する場合を考えると、自動選択できる機器（例えば、CliniMacs(登録商標) Plus Instrument（Miltenyi Biotec社））を使うことが可能である。かかる機器は固体支持体、例えばカラム上の液交換および磁場の発生を介する免疫磁気選択を行うことができなければならない。自動化は大量のVVストックの生産を助け、大量のウイルス上清の精製を可能にする。本発明の方法によるVVの大規模精製は主な特異的分離ステップで少なくとも60％力価収率（受容体のリガンドと一緒にインキュベートした未精製粒子-対-精製粒子の力価）を得ることを可能にする。大規模実験においては、予備精製ステップ：濾過、任意に濃縮を介して、VV上清から未精製粒子を得て、次いで、これを外因性受容体のリガンドと一緒にインキュベートする。これらのステップはそれぞれ夾雑物および形質導入インヒビターの大まかな除去を生じて、分離処理を受けるサンプルのウイルス力価の濃縮進行を伴う。大規模の全体プロセスの力価収率（収穫ウイルスの力価-対-精製粒子の力価）は100％超を得る。これらは、VVの全体の精製プロセスの力価収率は30％程度（Rodriguesら、2007）、または大規模生産の場合にはさらにそれ未満（Mertenら、2011）であると報じられていることを考えると、非常に重要な結果である。本発明の方法による大規模精製はVVの感染性の増加を可能にし、分離後の未精製分子より約3倍を超える感染性をもたらす。さらに、本発明の精製方法で得た調製物の品質のアイディアを抱くために、SalmonおよびTrono、2006が報じた、レンチウイルス感染性粒子数（ウイルス力価から誘導しうる形質移入単位）-対-全物理的粒子（p24Gagのlngが107に対応する通常の式から取得しうる）を数えることも可能である。注目すべき興味深いことは、例えば、表4の実験2に示したように、本発明の方法を用いると、5,318個の全物理的粒子のうち１個の感染性粒子を含有する上清（非常に乏しい出発物質）から出発して、250個の全物理的粒子のうち1個の感染性粒子を含有する精製調製物を得ることが可能であり、LV調製の品質と感染性の点で非常に優れた濃縮であることを示す。
本発明のさらに好ましい特徴と実施形態をここで非限定の実施例を用いてまた添付せる図面を参照して記載しよう。
実施例１：VVの生産
MLVレトロウイルスベクター（RV）の安定生産
マウスNIH-3T3由来の、e4070-偽型AM12-SFCMM-TKクローン48パッケージング細胞をDMEM（Dulbecco改変Eagle培地）（BioWhittaker(登録商標), Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. Walkersville, MD）またはX-VIVO 15に10％FBS（BioWhittaker(登録商標)）および2mMグルタミンを補充した培地で、37℃、5％CO2大気中で増殖した。ORFのヌクレオチド330における単一サイレント突然変異を特徴とするHSV-TK遺伝子の改変型をコードする構築物SFCMM-3 Mut2の形質導入後に、AM12-SFCMM-TKクローン48を得た（WO2005/123912）。形質導入した細胞を、Am12-SFCMM-3Mut2細胞の抗-ΔLNGFR mAbを用いることにより免疫選択し、次いで限定希釈（0.3細胞/ウエル）によりクローニングした。AM12-SFCMM-TKクローン48はSFCMM-3Mut2ベクターの2コピーを含有する。GMP-グレードのレトロウイルスベクター上清ロットを、ローラーボトルでまたは充填床32リットルのバイオリアクターで、X-VIVO 15培地中で、1％グルタミン、10％PBSおよびイソロイシン/トリプトファン/Naクエン酸の存在のもとで生産した。
MLVレトロウイルスベクター（RV）の安定生産
マウスNIH-3T3由来の、e4070-偽型AM12-SFCMM-TKクローン48パッケージング細胞をDMEM（Dulbecco改変Eagle培地）（BioWhittaker(登録商標), Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. Walkersville, MD）またはX-VIVO 15に10％FBS（BioWhittaker(登録商標)）および2mMグルタミンを補充した培地で、37℃、5％CO2大気中で増殖した。ORFのヌクレオチド330における単一サイレント突然変異を特徴とするHSV-TK遺伝子の改変型をコードする構築物SFCMM-3 Mut2の形質導入後に、AM12-SFCMM-TKクローン48を得た（WO2005/123912）。形質導入した細胞を、Am12-SFCMM-3Mut2細胞の抗-ΔLNGFR mAbを用いることにより免疫選択し、次いで限定希釈（0.3細胞/ウエル）によりクローニングした。AM12-SFCMM-TKクローン48はSFCMM-3Mut2ベクターの2コピーを含有する。GMP-グレードのレトロウイルスベクター上清ロットを、ローラーボトルでまたは充填床32リットルのバイオリアクターで、X-VIVO 15培地中で、1％グルタミン、10％PBSおよびイソロイシン/トリプトファン/Naクエン酸の存在のもとで生産した。
レンチウイルスベクター（LV）の安定な生産
ヒトHEK-293Tおよびその誘導体RD2-MolPack-Chim3パッケージング細胞を、10％FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地（DMEM）中で増殖した。RD2-MolPack-Chim3.14およびChim3.25クローンは抗-HIV遺伝子治療手法用の第2世代LVを安定して生産する。組込みベクターを用いるパッケージング構築物とトランスファーベクターの逐次組込みによって、このクローンを得た。概略を述べると、HEK-293T細胞をアデノ随伴ウイルス（AAV）Rep-78タンパク質をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトし、次いで、ハイブリッドバキュロウイルス-AAVベクター［このバキュロウイルスの主鎖はAAV逆方向末端反復（ITR）配列に隣接したHIV-1構造gag、pol、調節revおよびhygro-耐性遺伝子を発現する組込みカセットを含有する］に感染させた（国際特許出願WO 2012/028680）。Rep78が介在するITR-隣接カセットのHEK-293Tゲノム中への組込みを可能にするこの系はPK-7と名付けた第1中間体クローンを作製した。PK-7クローンからRD2-MolPack-Chim3.14およびChim3.25パッケージングクローン（国際特許出願WO2012/028681）を、HIV-1調節tatおよびキメラRD114-TRエンベロープを発現するSIN-LV遺伝子ならびに抗-HIV VifドミナントネガティブなトランスジーンChim3を発現するTat-依存性LVベクターの逐次組込みを介して取得した。クローンは細胞を96-ウエルプレートに限定希釈（0.1〜0.3細胞/ウエル）にて播種することによって取得した。各細胞型クローニング実験について、少なくとも5〜10の個々のクローンを光学顕微鏡下の可視検査により選択し、徐々に拡大した。RD2-MolPack-Chim3由来のLVをT25またはT75フラスコの小規模培養によりおよびT162フラスコの大規模培養により得た。
ヒトHEK-293Tおよびその誘導体RD2-MolPack-Chim3パッケージング細胞を、10％FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地（DMEM）中で増殖した。RD2-MolPack-Chim3.14およびChim3.25クローンは抗-HIV遺伝子治療手法用の第2世代LVを安定して生産する。組込みベクターを用いるパッケージング構築物とトランスファーベクターの逐次組込みによって、このクローンを得た。概略を述べると、HEK-293T細胞をアデノ随伴ウイルス（AAV）Rep-78タンパク質をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトし、次いで、ハイブリッドバキュロウイルス-AAVベクター［このバキュロウイルスの主鎖はAAV逆方向末端反復（ITR）配列に隣接したHIV-1構造gag、pol、調節revおよびhygro-耐性遺伝子を発現する組込みカセットを含有する］に感染させた（国際特許出願WO 2012/028680）。Rep78が介在するITR-隣接カセットのHEK-293Tゲノム中への組込みを可能にするこの系はPK-7と名付けた第1中間体クローンを作製した。PK-7クローンからRD2-MolPack-Chim3.14およびChim3.25パッケージングクローン（国際特許出願WO2012/028681）を、HIV-1調節tatおよびキメラRD114-TRエンベロープを発現するSIN-LV遺伝子ならびに抗-HIV VifドミナントネガティブなトランスジーンChim3を発現するTat-依存性LVベクターの逐次組込みを介して取得した。クローンは細胞を96-ウエルプレートに限定希釈（0.1〜0.3細胞/ウエル）にて播種することによって取得した。各細胞型クローニング実験について、少なくとも5〜10の個々のクローンを光学顕微鏡下の可視検査により選択し、徐々に拡大した。RD2-MolPack-Chim3由来のLVをT25またはT75フラスコの小規模培養によりおよびT162フラスコの大規模培養により得た。
LVの一過性の生産
次のプラスミドの一過性の同時形質移入により、HEK-293T細胞から生産した偽型LVを得た：パッケージング構築物CMV-GPRT、VSV-G構築物、および2nd-gen.PΔN-Chim3トランスファーベクター（国際特許出願WO 2012/028681）。パッケージング：エンベロープ：トランスファーベクターの比は6.5：3.5：10μg DNAに対応した。一過性の形質導入は製造業者（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN）の取扱説明書に従い、標準Ca2+-PO4法またはFugeneTM6系で実施した。上清を形質導入後48時間に収穫し、0.45μmフィルターを通して濾過した。
次のプラスミドの一過性の同時形質移入により、HEK-293T細胞から生産した偽型LVを得た：パッケージング構築物CMV-GPRT、VSV-G構築物、および2nd-gen.PΔN-Chim3トランスファーベクター（国際特許出願WO 2012/028681）。パッケージング：エンベロープ：トランスファーベクターの比は6.5：3.5：10μg DNAに対応した。一過性の形質導入は製造業者（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN）の取扱説明書に従い、標準Ca2+-PO4法またはFugeneTM6系で実施した。上清を形質導入後48時間に収穫し、0.45μmフィルターを通して濾過した。
実施例２：抗-LNGFR AbによるVVの小規模精製
VVの小規模精製は次の通り行った。VVを含有する上清を、1:5（vol/vol）で0.5％BSAを含有するPBSを用いて希釈し、次いで0.45μmフィルターで濾過した。1〜5mlの希釈した上清を、抗-LNGFR Abと結合したマイクロビーズ懸濁液（CD271マイクロビーズ：Miltenyi Biotec, GmbH, Germany cat. #130-091-330）と1：40の比（vol/vol）にてインキュベートした。サンプルを次いで室温（RT）にて30分間回転ホイール上でインキュベートした。磁気標識したサンプルを磁気分離器内に置かれたカラムに供給した（Miltenyl, MS Columns cat. #130-042-201）。流通物を分析用に採集し、そして0.5mlの洗浄バッファー（2％FCSおよび0.5％BSAを含有するPBS）で3回洗浄を実施し、そのカラムを磁気分離器から取出し、そして精製VVを回収した。
VVの小規模精製は次の通り行った。VVを含有する上清を、1:5（vol/vol）で0.5％BSAを含有するPBSを用いて希釈し、次いで0.45μmフィルターで濾過した。1〜5mlの希釈した上清を、抗-LNGFR Abと結合したマイクロビーズ懸濁液（CD271マイクロビーズ：Miltenyi Biotec, GmbH, Germany cat. #130-091-330）と1：40の比（vol/vol）にてインキュベートした。サンプルを次いで室温（RT）にて30分間回転ホイール上でインキュベートした。磁気標識したサンプルを磁気分離器内に置かれたカラムに供給した（Miltenyl, MS Columns cat. #130-042-201）。流通物を分析用に採集し、そして0.5mlの洗浄バッファー（2％FCSおよび0.5％BSAを含有するPBS）で3回洗浄を実施し、そのカラムを磁気分離器から取出し、そして精製VVを回収した。
実施例３：力価計算
VV力価は、SupT1細胞について、1サイクルの遠心播種（spinoulation）により、1,240×gにて1時間、ポリブレン8μg/ml（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）の存在のもとで形質導入することにより計算した。形質導入効率は、ΔLNFGR発現のフローサイトメトリー分析（FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA）により、Porcellini et al., 2009 & 2010に記載のように、FlowJoソフトウエア（Tree Star, Inc., Ashland, OR）を用いてモニタリングした。5〜20％の範囲の陽性細胞の形質導入値だけを用いて、式：TU=［細胞数×（％陽性細胞/100）］/vol sup（mlで）によって力価を計算した。
VV力価は、SupT1細胞について、1サイクルの遠心播種（spinoulation）により、1,240×gにて1時間、ポリブレン8μg/ml（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）の存在のもとで形質導入することにより計算した。形質導入効率は、ΔLNFGR発現のフローサイトメトリー分析（FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA）により、Porcellini et al., 2009 & 2010に記載のように、FlowJoソフトウエア（Tree Star, Inc., Ashland, OR）を用いてモニタリングした。5〜20％の範囲の陽性細胞の形質導入値だけを用いて、式：TU=［細胞数×（％陽性細胞/100）］/vol sup（mlで）によって力価を計算した。
実施例４：小規模調製における精製-対-未精製VVの効力の分析
表1、および表2に総括したように、色々な様式と異なるエンベロープを持つ偽型により生産した3つの型のVVを用いて、いくつかの実験を実施した。Chim3トランスジーンを発現する第2世代LVは、実施例１に報じたように、安定なパッケージング細胞株RD2-MolPack-Chim3.14からまたはHEK-293T細胞の一過性形質導入により生産した。第1の条件では、LVはネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインおよびA-MLVenv 4070Aの細胞質テール（tail（TR））から作られたキメラRD114-TRエンベロープを持つ偽型（Sandrin ら, 2002）であるのに対して、第2の条件では水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G（VSV-G）エンベロープを持った。γRVはAM12-SFCMM-TKクローン48から生産され、MLV e4070エンベロープを運んだ。
表1、および表2に総括したように、色々な様式と異なるエンベロープを持つ偽型により生産した3つの型のVVを用いて、いくつかの実験を実施した。Chim3トランスジーンを発現する第2世代LVは、実施例１に報じたように、安定なパッケージング細胞株RD2-MolPack-Chim3.14からまたはHEK-293T細胞の一過性形質導入により生産した。第1の条件では、LVはネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインおよびA-MLVenv 4070Aの細胞質テール（tail（TR））から作られたキメラRD114-TRエンベロープを持つ偽型（Sandrin ら, 2002）であるのに対して、第2の条件では水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G（VSV-G）エンベロープを持った。γRVはAM12-SFCMM-TKクローン48から生産され、MLV e4070エンベロープを運んだ。
各実験は次の条件で行った：1）希釈した上清体積（PBS/2％ FCS/0.5％ BSAで1：5に希釈した上清の1ml）； 2）上清：マイクロビーズ懸濁液比（vol：vol）1：40； 3）磁性ビーズ（CD271マイクロビーズ）と直接結合した抗-LNGFR Ab。分析の出力は、未精製の磁気標識したVVのそれと比較した精製VVのパーセントの力価収率（図3A）およびパーセントの感染性の増分（図3B）両方に対応する。力価計算はSupT1細胞について、実施例３に詳しく記載した通り実施した。注目すべきこととして、安定して生産されたLVに対する収率は優れて100％（平均で121％）であり、一過性に生産されたLVのそれは90％であった。これは、LVの精製がそれに載せられたエンベロープの型に関わらず、力価の値を低下する血清タンパク質または他の夾雑物を除去する上で非常に有効であることを意味する。γRVの精製収率はLVのそれ（85％）よりわずかに劣る。さらに、本発明の方法で精製したレンチウイルスベクターの感染性は相当な増加が得られた（一過性および安定した生産のそれぞれに対して43％および60％）。
実施例５：抗-LNGFRによるVVの大規模精製
VVの大規模精製を次の通り実施した。LVを含有する濾過した上清（0.45μm）（800ml）を低速度（3,400×g）にて16時間、+4℃にて冷凍ベンチトップ遠心分離機で8倍濃縮した。VVペレットを100mlバッファーPBS/EDTA 0.5％ヒト血清アルブミン（HSA）に再懸濁し、次いで抗-LNGFR Abと結合したマイクロビーズ懸濁液（CD271 Microbeads, Miltenyi Biotec, cat. #130-091-330）と一緒に、1:40（vol/vol）比にて150-mlトランスファーバッグ（Miltenyi Biotec cat. #183-01）中でインキュベートした。そのサンプルを次いで室温にて30分間、軌道式シェーカーでインキュベートした。磁気標識したサンプルをCliniMacs(登録商標) Plus Instrumentに装填して自動分離プログラムEnrichment 3.2をスタートした。精製したLVを40ml回収し、アリコートを効力計算により精製性能について評価した。
VVの大規模精製を次の通り実施した。LVを含有する濾過した上清（0.45μm）（800ml）を低速度（3,400×g）にて16時間、+4℃にて冷凍ベンチトップ遠心分離機で8倍濃縮した。VVペレットを100mlバッファーPBS/EDTA 0.5％ヒト血清アルブミン（HSA）に再懸濁し、次いで抗-LNGFR Abと結合したマイクロビーズ懸濁液（CD271 Microbeads, Miltenyi Biotec, cat. #130-091-330）と一緒に、1:40（vol/vol）比にて150-mlトランスファーバッグ（Miltenyi Biotec cat. #183-01）中でインキュベートした。そのサンプルを次いで室温にて30分間、軌道式シェーカーでインキュベートした。磁気標識したサンプルをCliniMacs(登録商標) Plus Instrumentに装填して自動分離プログラムEnrichment 3.2をスタートした。精製したLVを40ml回収し、アリコートを効力計算により精製性能について評価した。
実施例６：大規模分離における精製-対-未精製VVの効力の分析
安定なパッケージング細胞株RD2-MolPack-Chim3.25から生産したChim3トランスジーンを発現する第2世代LVを用いて、2つの実験を実施した。結果を表3および4に総括した。各実験は実施例５に記載の通り行った。分析の出力は、精製LVの力価収率のパーセントおよび感染性増分のパーセント両方に対応し、磁性ビーズに結合した抗-LNGFR Abと結合した未精製ウイルス粒子のそれと比較したもの（表3）、または、上清のそれと比較したもの（表4）である。力価計算は実施例３に開示したSupT1細胞について実施した。大規模精製の力価収率（表3、EL/投入）はウイルスベクター-リガンド複合体分離の単一ステップで60％程度であった。分離ステップをスタートする前に、ウイルス上清のウイルス力価は、大まかに夾雑物および形質導入インヒビターを消去する予備濾過と遠心分離ステップおよびまた受容体のリガンドと一緒のインキュベーションを通して濃縮される。完全な多ステップ精製プロセス後の最終力価収率（収穫ウイルス上清-対-最終精製産物）（表4、EL/Sup）は100％超：実験1では118％および実験2では231％である。最も重要なこととして、精製粒子の感染性は未精製物に対して劇的に3倍増加し、小規模実験と比較してさらに高い濃縮であって、大規模および自動化はVVの機能性で表したプロセスの収率をさらに増加することを示す。
安定なパッケージング細胞株RD2-MolPack-Chim3.25から生産したChim3トランスジーンを発現する第2世代LVを用いて、2つの実験を実施した。結果を表3および4に総括した。各実験は実施例５に記載の通り行った。分析の出力は、精製LVの力価収率のパーセントおよび感染性増分のパーセント両方に対応し、磁性ビーズに結合した抗-LNGFR Abと結合した未精製ウイルス粒子のそれと比較したもの（表3）、または、上清のそれと比較したもの（表4）である。力価計算は実施例３に開示したSupT1細胞について実施した。大規模精製の力価収率（表3、EL/投入）はウイルスベクター-リガンド複合体分離の単一ステップで60％程度であった。分離ステップをスタートする前に、ウイルス上清のウイルス力価は、大まかに夾雑物および形質導入インヒビターを消去する予備濾過と遠心分離ステップおよびまた受容体のリガンドと一緒のインキュベーションを通して濃縮される。完全な多ステップ精製プロセス後の最終力価収率（収穫ウイルス上清-対-最終精製産物）（表4、EL/Sup）は100％超：実験1では118％および実験2では231％である。最も重要なこととして、精製粒子の感染性は未精製物に対して劇的に3倍増加し、小規模実験と比較してさらに高い濃縮であって、大規模および自動化はVVの機能性で表したプロセスの収率をさらに増加することを示す。
（参考文献）
Claims (16)
- ウイルスベクターを精製する方法であって、
i. パッケージング細胞株に細胞表面マーカーをコードする外因性遺伝子および目的の遺伝子を導入するステップ、
ii. こうして得たプロデューサー細胞株を培養するステップ、
iii. 外側エンベロープ上に細胞表面マーカーを有するウイルスベクター粒子を含有する上清を回収するステップ、
iv. 前記上清を、細胞表面マーカーと結合できるリガンドと一緒にインキュベートするステップ、
v. リガンド−ウイルスベクター複合体を分離するステップ、および
vi. 精製したウイルスベクター粒子を得るステップ
を含むものである前記方法。 - ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、およびオルソミクソウイルスベクターから選択される、請求項１に記載の方法。
- 細胞表面マーカーがCD26、CD36、CD44、CD3、CD25または末端切断型低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）から選択される、請求項１または２に記載の方法。
- 細胞表面マーカーが末端切断型低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞表面マーカーの発現が一過性である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞表面マーカーの発現が安定している、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
- 目的の遺伝子と外因性遺伝子が同じトランスファーベクターにおいて発現される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
- 目的の遺伝子と外因性遺伝子が別々のベクターにおいて発現される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
- リガンドがアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド、ペプチドミメチック、抗体、抗体フラグメント、アフィボディから成る群より選択される化学的または生物学的エンティティーである、請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法。
- リガンドが上清から分離できる成分と連結している、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
- リガンドが磁性ビーズと結合した抗体であって、分離が抗体−ウイルスベクター複合体を含有する溶液に磁場を適用することによって得られる、請求項９または１０に記載の方法。
- 磁場を除くことによって精製VVを得る、請求項１１に記載の方法。
- 抗体−ウイルスベクター複合体の分離がカラム上で実施される、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の方法。
- パッケージング細胞株において発現される外因性細胞表面マーカーであって、前記パッケージング細胞株により生産されるウイルスベクターを精製するために用いられる上記外因性細胞表面マーカー。
- CD26、CD36、CD44、CD3、CD25または末端切断型低神経成長因子受容体（ΔLNGFR）から選択される、請求項１４に記載の外因性細胞表面マーカー。
- 前記マーカーがΔLNGFRである、請求項１４または１５に記載の外因性細胞表面マーカー。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2006503878A (ja) * | 2002-10-21 | 2006-02-02 | モルメド スパ | 抗原デリバリーシステムとして使用される抗原が形質導入されたｔ細胞 |
| JP2006071437A (ja) * | 2004-09-01 | 2006-03-16 | Hjl Inc | 血液細胞の新規分類法ならびにそれを利用したテイラーメード治療および予防 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IT1261847B (it) | 1993-09-01 | 1996-06-03 | San Romanello Centro Fond | Metodo per marcare cellule eucariote. |
| JPH09511405A (ja) * | 1994-09-08 | 1997-11-18 | ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | レトロウイルスベクターハイブリッド及びその遺伝子転移のための使用 |
| US5837520A (en) * | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
| WO2001085928A1 (fr) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Mitsubishi Pharma Corporation | Procede de preparation de vecteur de virus |
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| JP2006071437A (ja) * | 2004-09-01 | 2006-03-16 | Hjl Inc | 血液細胞の新規分類法ならびにそれを利用したテイラーメード治療および予防 |
| JP2007105033A (ja) * | 2005-09-13 | 2007-04-26 | Takara Bio Inc | レトロウィルス産生用無血清培地 |
Non-Patent Citations (1)
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| YE KAIMING, JOURNAL OF VIROLOGY, vol. V78 N18, JPN6016029301, September 2004 (2004-09-01), pages 9820 - 9827, ISSN: 0003370005 * |
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