CN101812127A

CN101812127A - 微管结合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101812127A
Application number: CN 200910077798
Authority: CN
Inventors: 姚雪彪; 姜恺; 王建宇; 王志凯
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: CN101812127B

Abstract

本发明公开了一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。本发明公开的微管结合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制MCAK蛋白解聚微管的活性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的蛋白通过与EB1和MCAK的相互作用参与微管正向末端动态性的调控，通过抑制MCAK蛋白的微管解聚活性来稳定微管。将所述微管结合蛋白基因的小干扰RNA的编码基因导入宿主，MCAK的微管定位将受到严重影响。本发明的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

微管结合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

微管是高度动态性的纤维状细胞骨架结构，在细胞有丝分裂、细胞迁移、细胞极化过程中均起到关键作用。微管的生长及收缩均是由一系列微管结合蛋白调控的。微管动态性的失调将导致细胞无法精确的进行有丝分裂，危及生物体的生存与健康。

微管结合蛋白中有一类蛋白特异结合在生长中的微管正向末端，如EB1/2/3，CLIP-115/170，CLASP1/2，p150Glued，adenomatous polyposis coli(APC)，MCAK，ACF7，LIS1，Melanophilin and STIM1。这些蛋白是如何组织起来并调控微管动态性还不为人知。这些蛋白大多数都与EB1直接相互作用。

EB1是EB家族的3个成员之一，属于一种微管末端结合蛋白，可以位于生长中的微管的正端。EB1可能促进微管的“搜寻和捕获”，并与保持染色体的稳定性有关。研究表明，EB1具有延长微管的作用，EB1的高表达表明能加强微管的稳定性。另外，有研究证明，EB1可以通过其C-端酪氨酸残基与CLIP170和CLIP115这两种微管末端结合蛋白发生相互作用，当EB1过量表达而均匀的沿着微管分布时，将减慢胞质连接蛋白CLIPs(cytoplasmic linker protein)的分裂。APC(腺瘤性息肉蛋白)存在一个非常保守的EB1结合区域。EB1蛋白在人类细胞中可以同APC蛋白发生相互作用，使APC结合到微管的末端。最近有研究表明EB1可调节APC与β-catenin(β-连接素)的相互作用。β-catenin是WNT信号通路上的主要蛋白，而APC具有降低β-catenin的作用。当EB1高表达时，可能加强了APC与β-catenin的相互作用，促进了β-catenin的降解，从而降低了胞浆中β-catenin的浓度，WNT信号通路受阻，从而防止肿瘤的发生，在胚胎细胞中，APC的这种功能表现为胚胎细胞分裂被抑制而导致染色体分离异常。

从mRNA水平和蛋白水平对EB1在胚胎细胞/组织中的表达分析发现，EB1在染色体数目异常胚胎细胞/组织中的表达明显高于其在染色体数目正常的胚胎细胞/组织中的表达。可以推测：高表达的EB1指引微管向染色体方向生长的能力得到加强，微管附着到染色体着丝粒的能力也得到加强，但由于纺锤体微管牵引染色体向细胞两极移动的过程是通过纺锤体微管主动解聚，纺锤体微管缩短所至，因此当EB1表达增加，EB1稳定微管的作用得到加强，此时微管不易被解聚，使染色体不能因为微管的牵引作用而向细胞的两极移动(即细胞分裂后期延长)，导致细胞分裂障碍和染色体分离异常。

MCAK蛋白(有丝分裂着丝点结合马达蛋白，Mitotic centromere-associated kinesin)是kinesin-13蛋白家族中的一员，它能通过ATP水解催化微管末端解聚，是一种微管解聚酶。MCAK在体内以二聚体的形式存在，当MCAK高表达时，会造成微管解聚，染色体不能正常分离。微管的体外聚合/解聚实验也表明，在ATP存在的条件下，当加入一定浓度的MCAK蛋白时，微管的解聚速率提升了100倍左右。另有研究显示反义寡核苷酸诱导的MCAK低表达会导致部分染色体分离滞后，表明MCAK在有丝分裂过程中起到非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供了一种微管结合蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的微管结合蛋白蛋白，名称为TIP150，来源于人，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制MCAK解聚微管的活性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由1368个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第862-988位氨基酸残基为EB1结合区域，自N端第989-1368位氨基酸残基为coiled-coil结构域。

所述一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指将序列1的EB1结合区域和coiled-coil结构域外的氨基酸进行取代和/或缺失和/或添加。

为了使(a)中的TIP150便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep--tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep--tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TIP150可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TIP150的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第1至4107位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述TIP150蛋白的编码基因(TIP150)也属于本发明的保护范围。

所述TIP150蛋白的编码基因(TIP150)为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的序列2由4107个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列为自5’末端第1-4104位核苷酸，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’末端第2584-2964位核苷酸编码EB1结合区域，自5’末端第2965-4104位核苷酸编码coiled-coil结构域

含有所述编码基因(TIP150)的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述编码基因(TIP150)的重组表达载体。

使用TIP150构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

本发明还保护扩增所述基因的引物。

所述引物具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸和序列表中的序列4所示的核苷酸。

本发明还提供了一种抑制所述基因(TIP150)的表达的方法，是将抑制所述基因的小干扰RNA导入宿主，从而抑制所述基因的表达。

所述小干扰RNA具体可为正义链为序列表中的序列5、反义链为序列表中的序列6的双链RNA。

所述蛋白、所述基因可应用于制备抑制肿瘤增殖的药物和/或制备抑制MCAK蛋白的解聚微管活性的药物。

本发明还保护一种抑制MCAK蛋白的解聚微管活性和/或抑制肿瘤增殖的药物，它的活性成分是所述TIP150蛋白、所述TIP150基因和所述重组表达载体中的至少一种。

所述MCAK蛋白具体可为人MCAK蛋白。所述MCAK蛋白具体可为GenBank Accession Number NP 006836所示的蛋白质。

本发明提供了一个分子量为150kD的微管结合蛋白，它在整个细胞周期定位在生长中的微管正向末端(+TIP)，因此将其命名为TIP150。生化实验表明TIP150直接与EB1相互作用。如果siRNA敲除EB1，则TIP150的微管定位消失。说明TIP150需要通过与EB1结合才能定位到微管正向末端。TIP150还与MCAK蛋白相互作用，点突变实验表明它们之间的相互作用受Aurora B激酶调控。siRNA敲除TIP150后不会影响EB1的微管定位，但会严重减弱MCAK蛋白的微管定位，从而可能影响到微管的动态性。免疫荧光实验表明TIP150对MCAK蛋白的解聚微管活性有明显抑制作用，从而稳定微管。以上实验说明，本发明TIP150蛋白是一个重要的微管正向末端结合蛋白，并且参与调控微管的动态性，可以作为活性成分制备调控肿瘤细胞增殖的药物，本发明所涉及的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为TIP150氨基酸序列的结构分析结果。

图2为TIP150各缺失突变体示意图。

图3为TIP150与EB1相互作用体外pull-down检测结果。

图4为TIP150与EB1相互作用区域鉴定结果。

图5为GFP-TIP150及其缺失突变体在HeLa细胞中定位的免疫荧光检测结果；绿色信号表示TIP150及其5种缺失突变体，红色表示EB1抗体染色的EB1，Merge表示将上述2种颜色的通道融合结果。

图6为TIP150基因siRNA对TIP150基因在细胞内表达的抑制作用的检测结果。

图7为TIP150与MCAK相互作用的免疫沉淀鉴定结果。

图8为TIP150与MCAK相互作用区域鉴定结果。

图9为实施例7中处理一的免疫荧光检测结果。

图10为实施例7中处理二的免疫荧光检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中的实验方法可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

实施例1、微管结合蛋白TIP150编码基因的获得

以人宫颈癌HeLa细胞(Stratagene，Cat.No.937248)的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：

上游引物：5’-gcgaattctatgagcgtcccagtgg-3’(序列表的序列3)；

下游引物：5’-gcgtcgactcatctgggtgttgtgc-3’(序列表的序列4)。

用EcoRI和SalI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pMD18-T(TaKaRa公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pMD-TIP150。

对pMD-TIP150进行测序，测序结果表明：人TIP150基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。序列表中的序列2由4107个核苷酸组成，其编码序列为5’端第1-4104位碱基，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

对TIP150蛋白的氨基酸残基序列进行结构域分析，分析结果如图1所示。TIP150蛋白(序列表的序列1)中，自氨基端(N端)第862-988位氨基酸残基为EB1结合区域，自N端第989-1368位氨基酸残基为coiled-coil结构域。TIP150基因(序列表的序列2)中，自5’端第2584-2964位核苷酸编码EB1结合区域，自5’端第2965-4104位核苷酸编码coiled-coil结构域。

实施例2、TIP150和EB1及其缺失突变体的表达载体的构建

一、GFP-TIP150的构建

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-TIP150，将酶切产物与同样酶切的pEGFP-C1(Clontech，Cat.No.6084-1)进行连接，得到GFP-TIP150。

二、MBP-TIP150的构建

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-TIP150，将酶切产物与同样酶切的pMAL-c2x(New England Biolabs，Cat.No.N8076S)进行连接，得到MBP-TIP150。

三、flag-TIP150的构建

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-TIP150，将酶切产物与同样酶切的p3XFLAG-myc-CMV-24(Sigma，Cat.No.E6151)进行连接，得到flag-TIP150。

四、GST-EB1的构建

以人宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：

上游引物：5’-gcgaattctatggcagtgaacgtatac-3’；

下游引物：5’-gcgtcgacttaatactcttcttgctc-3’。

用EcoRI和SalI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pMD18-T连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明得了到含有目的片段(EB1基因)的重组质粒，命名为pMD-EB1。

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-EB1，将酶切产物与同样酶切的pGEX-6P-1(Amershanm.Biosciences公司，Cat.No.27-4597-01)进行连接，得到GST-EB1。

五、Myc-MCAK的构建

上游引物：5’-gcgaattctatggccatggactcgt-3’；

下游引物：5’-gcgtcgactcactggggccgtttc-3’。

用EcoRI和SalI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pMD18-T连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，进行测序，结果表明得到了含有目的片段(GenBank Accession NumberNP_006836所示蛋白的编码基因)的重组质粒，命名为pMD-MCAK。

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-MCAK，将酶切产物与限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切的载体pcDNA3.1/Myc-His A(Invitrogen，Cat.No.V800-20)进行连接，得到Myc-MCAK。

六、GFP-MCAK的构建

用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切pMD-MCAK，将酶切产物与同样酶切的pEGFP-C1进行连接，得到GFP-MCAK。

七、TIP150的缺失突变体的构建

1、TIP150的缺失突变体基因的获得

所有TIP150的缺失突变体基因都是通过设计引物对pMD-TIP150进行PCR获得的(如图2所示)。

根据TIP150的核苷酸序列，PCR构建11段不同长度的缺失突变体基因(deletions)：

DNA片段1：序列1自5’端第1-2400位核苷酸，编码自N端第1-800位氨基酸残基，将其命名为TIP150-N。引物对：5’-gcgaattctatgagcgtcccagtgg-3’；5’-gcgtcgactggtgggtggatggc-3’。

DNA片段2：序列1自5’端第2401-4104位核苷酸，编码自N端第801-1368位氨基酸残基，将其命名为TIP150-C。引物对：5’-gcgaattctggacccataacaacagc-3’；5’-gcgtcgactcatctgggtgttgtgc-3’。

DNA片段3：序列1自5’端第2401-3450位核苷酸，编码自N端第801-1150位氨基酸残基，将其命名为TIP150-C1。引物对：5’-gcgaattctggacccataacaacagc-3’；5’-gcgtcgacgttattttccatctcta-3’。

DNA片段4：自5’端第2941-4104位核苷酸，编码自N端第981-1368位氨基酸残基，将其命名为TIP150-CC。引物对：5’-gcgaattcttttccgcccaagccgg-3’；5’-gcgtcgactcatctgggtgttgtgc-3’。

DNA片段5：自5’端第2401-2940位碱基，编码自N端第801-980位氨基酸残基，将其命名为TIP150-P。PCR引物对：5’-gcgaattctggacccataacaacagc-3’；5’-gcgtcgaccccatttcgagctgcc-3’。

DNA片段6：自5’端第2401-2700位核苷酸，编码自N端第801-900位氨基酸残基，将其命名为TIP150-P1。引物对：5’-gcgaattctggacccataacaacagc-3’；5’-gcgtcgacgtccttagaaggcagag-3’。

DNA片段7：自5’端第1-1440位核苷酸，编码自N端第1-480位氨基酸残基，将该片段命名为TIP150-N1。引物对：5’-gcgaattctatgagcgtcccagtgg-3’；5’-gcgtcgaccttgttctctccaacag-3’。

DNA片段8：自5’端第1441-2400位核苷酸，编码自N端第481-800位氨基酸残基，将其命名为TIP150-N2。引物对：5’-gcgaattcacggaggtgcctgagc-3’；5’-gcgtcgactggtgggtggatggc-3’。

DNA片段9：自5’端第1441-1920位核苷酸，编码自N端第481-640位氨基酸残基，将其命名为TIP150-N3。引物对：5’-gcgaattcacggaggtgcctgagc-3’；5’-gcgtcgaccacatgcttgggcttg-3’。

DNA片段10：自5’端第1921-2400位核苷酸，编码自N端第641-800位氨基酸残基，将其命名为TIP150-N4。引物对：5’-gcgaattcaggcccaagatcatcac-3’；5’-gcgtcgactggtgggtggatggc-3’。

DNA片段11：自5’端第1-2400和2941-4104位核苷酸，编码自N端第1-800和981-1368位氨基酸残基，将其命名为TIP150-ΔP。引物对(两条引物不带任何酶切位点，这个突变体是缺失中间一部分，801-980氨基酸残基的编码序列，PCR产物自连得到pMD-TIP150-ΔP，该pMD-TIP150-ΔP携带TIP150-ΔP)：5’-tttccgcccaagccgg-3’；5’-tggtgggtggatggc-3’。

2、TIP150的缺失突变体的构建

(1)GFP-TIP150缺失突变体的构建

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N，将酶切后的TIP150-N插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-N。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-C，将酶切后的TIP150-C插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-C。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-C1，将酶切后的TIP150-C1插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-C1。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-CC，将酶切后的TIP150-CC插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-CC。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-P，将酶切后的TIP150-P插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-P。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-P1，将酶切后的TIP150-P1插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-P1。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N1，将酶切后的TIP150-N1插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-N1。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N2，将酶切后的TIP150-N2插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-N2。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N3，将酶切后的TIP150-N3插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-N3。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N4，将酶切后的TIP150-N4插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-N4。

用EcoRI和SalI酶切pMD-TIP150-ΔP，将酶切后的TIP150-ΔP插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-TIP150-ΔP。

(2)flag-TIP150缺失突变体的构建

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N1，将酶切后的TIP150-N1插入同样酶切后的p3XFLAG-myc-CMV-24进行连接，得到缺失突变体flag-TIP150-N1。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-N2，将酶切后的TIP150-N2插入同样酶切后的p3XFLAG-myc-CMV-24进行连接，得到得到缺失突变体flag-TIP150-N2。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-C，将酶切后的TIP150-C插入同样酶切后的p3XFLAG-myc-CMV-24进行连接，得到得到缺失突变体flag-TIP150-C。

(3)GST-TIP150缺失突变体的构建

用EcoRI和SalI酶切TIP150-C，将酶切后的TIP150-C插入同样酶切后的pGEX-6P-1进行连接，得到缺失突变体GST-TIP150-C。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-P，将酶切后的TIP150-P插入同样酶切后的pGEX-6P-1进行连接，得到缺失突变体GST-TIP150-P。

用EcoRI和SalI酶切TIP150-CC，将酶切后的TIP150-CC插入同样酶切后的pGEX-6P-1进行连接，得到缺失突变体GST-TIP150-CC。

实施例3、TIP150与EB1相互作用区域的鉴定

一、体外pull-down检测TIP150和EB1之间的相互作用

MBP-TIP150在Rossetta(DE)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用Amylose resin(New England Biolabs)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的MBP-TIP150融合蛋白。GST-EB1在Rossetta(DE)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用glutathione-Sepharose 4B(Amersham Biosciences)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的GST-EB1融合蛋白。pMAL-c2x在Rossetta(DE)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用Amylose resin(New England Biolabs)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的MBP蛋白。pGEX-6P-1在Rossetta(DE)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用glutathione-Sepharose 4B(Amersham Biosciences)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的GST蛋白。

处理1：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的MBP蛋白。

处理2：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的MBP-TIP150融合蛋白。

处理3：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST-EB1融合蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的MBP蛋白。

处理4：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST-EB1融合蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的MBP-TIP150融合蛋白。

4℃混匀仪2h，然后4℃、12000rpm离心0.5min，将上清去除。用1mL冰预冷的裂解液(50mM NaH₂PO4，pH8.0；300mM NaCl)悬浮树脂，4℃、12000rpm离心0.5min，重复三次，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行电泳并用考马斯亮蓝染色。

电泳图谱如图3所示。图3中，1：纯化的MBP蛋白；2：纯化的MBP-TIP150融合蛋白；3：处理1；4：处理3；5：处理2；6：处理4。结果表明：TIP150可以和EB1在体外直接相互作用。

二、半体外pull-down鉴定TIP150和EB1相互作用的区域

将GFP-TIP150和9种缺失突变体(GFP-TIP150-N、GFP-TIP150-C、GFP-TIP150-CC、GFP-TIP150-P、GFP-TIP150-P1、GFP-TIP150-N1、GFP-TIP150-N2、GFP-TIP150-N3、GFP-TIP150-N4)分别用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每10⁶细胞转染10μg质粒)，在37℃下培养于添加10％FBS的DMEM培养基中。培养24小时后，收集培养细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。

分别将各个处理的上清与结合了GST-EB1融合蛋白的GST树脂在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，将上清去除。用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳。用GFP抗体(Sigma，Cat.No.G1544)进行检测，图谱如图4所示。图4中，泳道1-11分别代表GFP蛋白和GFP-TIP150及其缺失突变体转染293T细胞以后的细胞裂解液用GFP的抗体进行检测的结果；泳道12-18和26-29分别代表GFP蛋白和GFP-TIP150及其缺失突变体转染293T细胞以后的细胞裂解液用GST蛋白树脂进行pull-down用GFP抗体进行检测的结果；泳道19-25和30-33分别代表GFP蛋白和带有GFP-TIP150及其缺失突变体转染293T细胞以后的细胞裂解液用GST-EB1融合蛋白树脂进行pull-down用GFP抗体进行检测的结果。结果表明：TIP150-P和TIP150-N2都与GST-EB1有明显相互作用，表明TIP150有两个区域即第481-800位氨基酸残基和第801-980位氨基酸残基共同负责与EB1的相互作用。

实施例4、免疫荧光鉴定TIP150负责结合微管正端的区域

带GFP-TIP150及其5种缺失突变体(GFP-TIP150-N、GFP-TIP150-C、GFP-TIP150-C1、GFP-TIP150-P、GFP-TIP150-ΔP)分别用Lipofectamine 2000试剂转染24孔板内的HeLa细胞(每10⁵细胞转染1μg质粒)，在37℃下培养于添加10％FBS的DMEM培养基中。转染36小时后弃去培养基，用-20℃甲醇固定3分钟。然后按照(Yao，X.，A.Abrieu，Y.Zheng，K.F.Sullivan，and D.W.Cleveland.2000.CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules tokinetochores and the mitotic checkpoint. Nat Cell Biol.2：484-91.)所述方法进行。在荧光倒置显微镜下观察，并拍照(Axiovert 200荧光倒置显微镜为Zeiss公司产品；相机为AxioCam CCD相机，采集图象的软件为AxioVision 3.0)。结果如图5所示，说明TIP150-P(第801-980位氨基酸残基)即EB1结合区域负责结合微管正端。

实施例5、TIP150基因siRNA的合成及其对TIP150基因的抑制作用

一、抑制TIP150基因表达的siRNA及其编码基因的设计及合成

根据TIP150基因的mRNA序列，借助Ambion公司在网上提供的siRNA工具软件设计其siRNA序列，得到一条双链RNA序列，命名为TIP150siRNA，再设计一条作为阴性对照的双链RNA序列，命名为Control siRNA，序列如下：

TIP150siRNA：

正义链：5’-uuaggucagggaaagggagaggcca-3’(序列表中的序列5)

反义链：5’-uggccucucccuuucccugaccuaa-3’(序列表中的序列6)；

Control siRNA：

正义链：5’-aauccuuaggcaacagccaccug-3’

反义链：5’-cagguggcuguugccuaaggauu-3’。

二、TIP150抗体的制备

使用GFP-TIP150-N1缺失突变体(第1-480位氨基酸残基)作为抗原免疫Balb/C小鼠制备抗体，免疫方案为：每次10μg，分三次进行免疫，每次间隔21天。

三、检测TIP150基因的siRNA对TIP150基因在细胞内表达的抑制作用用美国Invitrogen公司的Lipofectamine^TM2000试剂盒并参照试剂盒操作指南将化学合成的TIP150siRNA和Control siRNA分别转染24孔板内的Hela细胞(每10⁵细胞转染0.1nmol siRNA)，转染36小时后收集转染细胞，使用裂解缓冲液裂解细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清，加入加样缓冲液(2×加样缓冲液：100mmol/L Tris·HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)后在100℃下煮10分钟，然后进行10％SDS-PAGE分离细胞中的蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜上，然后分别使用TIP150抗体血清、EB1抗体(BDBiosciences，Cat.No.610534)、MCAK抗体(Bethyl MCAK Antibody Laboratories，Inc.Cat.No.A300-807A)、tubulin抗体(Sigma公司，对照)与膜在25℃下孵育1小时，再分别与辣根过氧化酶标记的二抗羊抗鼠抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Cat.No.115-035-174)和羊抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Cat.No.112-035-175)在25℃下孵育1小时。使用胶片进行显影，检测TIP150、EB1、MCAK在分别转染TIP150siRNA和Control siRNA条件下蛋白的表达水平差异，检测结果见图6。结果表明：本发明的TIP150siRNA能特异地抑制TIP150基因在细胞内的表达，同时不影响EB1、MCAK基因在细胞内的表达。

实施例6、TIP150与MCAK相互作用的检测

一、免疫沉淀检测TIP150与MCAK的相互作用

处理一：将Myc-MCAK和flag-TIP150用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每10⁶细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。

处理二：将Myc-MCAK和flag-TIP150N1用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每10⁶细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。

处理三：将Myc-MCAK和flag-TIP150-N2用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每10⁶细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。

处理四：将Myc-MCAK和flag-TIP150-C用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每10⁶细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。

上述四个处理的细胞培养24小时后，收集培养细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。将1ml微升上清与20微升结合FLAG标签抗体的树脂(anti-flag M2coupled to UltraLink Protein A/G)(Ezview Redanti-flag M2Affinity Gel)(Sigma：Cat.No.F2426)在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，电泳图谱见图7。图7中，泳道1-5分别代表Myc-MCAK单独转染293T细胞和Myc-MCAK与带有flag-TIP150及其缺失突变体共转染293T细胞以后的细胞裂解液用flag抗体(Sigma，Cat.No.F1804)和Myc抗体(Sigma，Cat.No.M4439)进行检测的结果，泳道6-10分别代表Myc-MCAK单独转染293T细胞和Myc-MCAK与带有flag-TIP15吸其缺失突变体共转染293T细胞以后的细胞裂解液用结合FLAG标签抗体的树脂纯化后用flag抗体和Myc抗体进行检测的结果。结果表明：flag-TIP150和flag-TIP150-C都能和Myc-MCAK相互作用，即TIP150第801-1368位氨基酸残基负责与MCAK相互作用。

二、半体外pull-down鉴定TIP150和MCAK相互作用的区域

将GFP-MCAK(每10⁶细胞转染10μg质粒)用Lipofectamine 2000试剂转染人胚肾成纤维293T细胞，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。培养24小时后，收集培养细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。将上清分别与结合了GST-TIP150、GST-TIP150C、GST-TIP150-P和GST-TIP150-CC融合蛋白的GST树脂在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，电泳图谱如图8所示。图8中，泳道1-4分别表示转染了GFP-MCAK蛋白的人胚肾成纤维293T细胞裂解液经过GST-TIP150、GST-TIP150-C、GST-TIP150-P和GST-TIP150-CC融合蛋白树脂pull-down后用考马斯亮蓝染色(图8A)及用GFP抗体(Sigma，Cat.No.G1546)检测(图8B)的结果。结果表明：TIP150-P(第801-980位氨基酸残基)负责与MCAK相互作用。

实施例7、免疫荧光鉴定TIP150对MCAK的解聚微管活性的抑制作用

处理一：将GFP-MCAK用Lipofectamine 2000试剂转染24孔板内的HeLa细胞(每10⁵细胞转染1μg质粒)，在37℃下培养于添加10％FBS的DMEM培养基中。

处理二：将GFP-MCAK和flag-TIP150用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞24孔板内的HeLa细胞(每10⁵细胞转染1μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FBS的DMEM培养基中。

转染36小时后弃去培养基，用-20℃甲醇固定3分钟。然后按照(Yao，X.，A.Abrieu，Y.Zheng，K.F.Sullivan，and D.W.Cleveland.2000.CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint.Nat Cell Biol.2：484-91.)中所述方法进行。在荧光倒置显微镜下观察，并拍照(Axiovert 200荧光倒置显微镜为Zeiss公司产品；相机为AxioCam CCD相机，采集图象的软件为AxioVision 3.0)。结果如图9和图10所示。

图9是处理一中的细胞样品的照片，其中图9A是细胞样品的微管照片，图9B是同一细胞样品同一区域的GFP-MCAK分布照片。由于在转染质粒的细胞样本中有很多细胞没有转染上质粒，将其作为阴性对照(图9中的圆圈内)。图9表明，没有阴性对照的细胞微管形态及数量都正常，转染了GFP-MCAK的细胞微管发生解聚，数量明显变少。

图10是处理二中的细胞样品的照片，图10A是细胞样品的微管照片，图10B是同一细胞样品同一区域GFP-MCAK分布照片，图10C是同一细胞样品同一区域flag-TIP150分布照片。由于在转染质粒的细胞样本中有很多细胞没有转染上质粒，将其作为阴性对照(图10中的圆圈内)。图10表明，共转染了GFP MCAK和flag-TIP150的细胞微管数量及形态又基本恢复正常，与阴性对照的细胞微管数量及形态相似。

结果表明：TIP150对MCAK的解聚微管活性有明显抑制作用。

序列表

<110>中国科学技术大学

<120>微管结合蛋白及其编码基因与应用

<130>CGGNARY92090

<160>6

<210>1

<211>1368

<212>PRT

<213>人属人(homo sapiens)

<400>1

Met Ser Val Pro Val Ala Pro Lys Lys Ser Cys Tyr Thr Gln Leu Arg

1 5 10 15

Asp Asn Arg Asn Ala Ala Arg Asn Asn Asn Glu Ser Ile Leu Ser Leu

20 25 30

Gly Asp Thr Asn Ala Asn Gln Ile Met Leu Glu Val Ser Ser Ser His

35 40 45

Asp Glu Ser Lys Thr Cys Asp Leu Gly Asp Glu Ile Gly Asn Thr Asn

50 55 60

Ser Ser Glu Pro Glu Asn Arg Thr His Phe His Lys Glu Phe His Gln

65 70 75 80

Leu Gln Gly Phe Gly Lys Gly Ser Gln Ala Gly Ser Ala Ser Leu Lys

85 90 95

Asp Phe Arg Leu Ser Ser Thr Ile Gln Arg Glu Leu Asn Glu Glu His

100 105 110

Thr Val Glu Arg Gly Thr Asp Ser Leu Gln Thr Thr Arg Ser Ile Gln

115 120 125

Gly Pro Ser Leu Ser Ser Trp Arg Asn Val Met Ser Glu Ala Ser Leu

130 135 140

Asp Val Leu Ala Lys Arg Asp Ala Glu Ile Pro Arg His Val Pro Lys

145 150 155 160

Asp Lys Leu Ala Lys Thr Leu Asp Asn Glu Glu Leu Arg Arg His Ser

165 170 175

Leu Glu Arg Ala Ser Ser Ser Val Ala Ala Val Gly Ser Leu Thr Pro

180 185 190

Gln His Pro Gln Pro Leu Ser Leu Asp Ser Arg Glu Ala Arg Gly Gln

195 200 205

Ile Pro Gly Gly Gly Glu Gly Pro Gln Lys Thr Leu Pro Asp His Ala

210 215 220

Val Pro Ala Ala Phe Pro Ala Thr Asp Ser Thr Ser Glu Gly Lys Ser

225 230 235 240

Val Arg His Pro Lys Pro Ser Thr Ser Glu Ser Lys Gln Ser Thr Pro

245 250 255

Ser Glu Thr Gln Thr Val Gly Ala His Val Leu Gln Val Cys Ser Glu

260 265 270

His Thr Ser His Ser Ala His Pro Glu Pro Ala Leu Asn Leu Thr Leu

275 280 285

Ala Ser Lys Glu Ile Pro Ser Lys Leu Glu Ala Gln Leu Gly Gln Gly

290 295 300

Lys Gly Glu Ala Lys Leu Asp Leu Lys Tyr Val Pro Pro Arg Arg Val

305 310 315 320

Glu Gln Glu Gly Lys Ala Ala Gln Glu Gly Tyr Leu Gly Cys His Lys

325 330 335

Glu Glu Asn Leu Ser Ala Leu Glu Gly Arg Asp Pro Cys Gly Glu Ala

340 345 350

His Pro Glu Ala Thr Asp Ala Leu Gly His Leu Leu Asn Ser Asp Leu

355 360 365

His His Leu Gly Val Gly Arg Gly Asn Cys Glu Glu Lys Arg Gly Val

370 375 380

Asn Pro Gly Glu Gln Asp Ser Leu His Thr Thr Pro Lys Gln Gly Ser

385 390 395 400

Ala Ser Leu Gly Gly Ala Asp Asn Gln Pro Thr Gly Lys Ile Ser Pro

405 410 415

Cys Ala Gly Glu Lys Leu Gly Glu Arg Thr Ser Ser Ser Phe Ser Pro

420 425 430

Gly Asp Ser His Val Ala Phe Ile Pro Asn Asn Leu Thr Asp Ser Lys

435 440 445

Pro Leu Asp Val Ile Glu Glu Glu Arg Arg Leu Gly Ser Gly Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Val Met Val Leu Val Phe Asn Pro Ser Val Gly Glu Asn Lys

465 470 475 480

Thr Glu Val Pro Glu Pro Leu Asp Pro Gln Ser Gly Arg Ser Glu Ala

485 490 495

Arg Glu Ser Lys Glu Val Thr Thr Ser Val Ala Glu Asn Arg Asn Leu

500 505 510

Leu Glu Asn Ala Asp Lys Ile Glu Ser Thr Ser Ala Arg Ala Asp Ser

515 520 525

Val Leu Asn Ile Pro Ala Pro Leu His Pro Glu Thr Thr Val Asn Met

530 535 540

Thr Tyr Gln Pro Thr Thr Pro Ser Ser Ser Phe Gln Asp Val Ser Val

545 550 555 560

Phe Gly Met Asp Ala Gly Ser Pro Leu Val Val Pro Pro Pro Thr Asp

565 570 575

Ser Ala Arg Leu Leu Asn Thr Ser Pro Lys Val Pro Asp Lys Asn Thr

580 585 590

Cys Pro Ser Gly Ile Pro Lys Pro Val Phe Thr His Ser Lys Asp Thr

595 600 605

Pro Ser Ser Gln Glu Gly Met Glu Asn Tyr Gln Val Glu Lys Thr Glu

610 615 620

Glu Arg Thr Glu Thr Lys Pro Ile Ile Met Pro Lys Pro Lys His Val

625 630 635 640

Arg Pro Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Arg Asn Pro Gln Ala Leu Gly

645 650 655

Gln Val Asp Ala Ser Leu Val Pro Val Gly Leu Pro Tyr Ala Pro Pro

660 665 670

Thr Cys Thr Met Pro Leu Pro His Glu Glu Lys Ala Ala Gly Gly Asp

675 680 685

Leu Lys Pro Ser Ala Asn Leu Tyr Glu Lys Phe Lys Pro Asp Leu Gln

690 695 700

Lys Pro Arg Val Phe Ser Ser Gly Leu Met Val Ser Gly Ile Lys Pro

705 710 715 720

Pro Gly His Pro Phe Ser Gln Met Ser Glu Lys Phe Leu Gln Glu Val

725 730 735

Thr Asp His Pro Gly Lys Glu Glu Phe Cys Ser Pro Pro Tyr Ala His

740 745 750

Tyr Glu Val Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Ser Ala Met Leu Leu Lys Pro

755 760 765

Gln Leu Gly Leu Gly Ala Met Ser Arg Leu Pro Ser Ala Lys Ser Arg

770 775 780

Ile Leu Ile Ala Ser Gln Arg Ser Ser Ala Ser Ala Ile His Pro Pro

785 790 795 800

Gly Pro Ile Thr Thr Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Ser Asp Pro Ser Asp

805 810 815

Leu Lys Lys Ala Ser Ser Ser Asn Ala Ala Lys Ser Asn Leu Pro Lys

820 825 830

Ser Gly Leu Arg Pro Pro Gly Tyr Ser Arg Leu Pro Ala Ala Lys Leu

835 840 845

Ala Ala Phe Gly Phe Val Arg Ser Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Ser

850 855 860

Thr Gln Ser Gly Asp Ser Ala Gln Pro Glu Gln Gly Arg Pro Ala Thr

865 870 875 880

Arg Ser Thr Phe Gly Asn Glu Glu Gln Pro Val Leu Lys Ala Ser Leu

885 890 895

Pro Ser Lys Asp Thr Pro Lys Gly Ala Gly Arg Val Ala Pro Pro Ala

900 905 910

Ser Ser Ser Val Thr Ala Pro Arg Arg Ser Leu Leu Pro Ala Pro Lys

915 920 925

Ser Thr Ser Thr Pro Ala Gly Thr Lys Lys Asp Ala Gln Lys Asp Gln

930 935 940

Asp Thr Asn Lys Pro Ala Val Ser Ser Pro Lys Arg Val Ala Ala Ser

945 950 955 960

Thr Thr Lys Leu His Ser Pro Gly Tyr Pro Lys Gln Arg Thr Ala Ala

965 970 975

Ala Arg Asn Gly Phe Pro Pro Lys Pro Asp Pro Gln Ala Arg Glu Ala

980 985 990

Glu Arg Gln Leu Val Leu Arg Leu Lys Glu Arg Cys Glu Gln Gln Thr

995 1000 1005

Arg Gln Leu Gly Val Ala Gln Gly Glu Leu Lys Arg Ala Ile Cys

1010 1015 1020

Gly Phe Asp Ala Leu Ala Val Ala Thr Gln His Phe Phe Arg Lys

1025 1030 1035

Asn Glu Ser Ala Leu Val Lys Glu Lys Glu Leu Ser Ile Glu Leu

1040 1045 1050

Ala Asn Ile Arg Asp Glu Val Ala Phe His Thr Ala Lys Cys Glu

1055 1060 1065

Lys Leu Gln Lys Glu Lys Glu Glu Leu Glu Arg Arg Phe Glu Asp

1070 1075 1080

Glu Val Lys Arg Leu Gly Trp Gln Gln Gln Ala Glu Leu Gln Glu

1085 1090 1095

Leu Glu Glu Arg Leu Gln Leu Gln Phe Glu Ala Glu Met Ala Arg

1100 1105 1110

Leu Gln Glu Glu His Gly Asp Gln Leu Leu Ser Ile Arg Cys Gln

1115 1120 1125

His Gln Glu Gln Val Glu Asp Leu Thr Ala Ser His Asp Ala Ala

1130 1135 1140

Leu Leu Glu Met Glu Asn Asn His Thr Val Ala Ile Thr Ile Leu

1145 1150 1155

Gln Asp Asp His Asp His Lys Val Gln Glu Leu Met Ser Thr His

1160 1165 1170

Glu Leu Glu Lys Lys Glu Leu Glu Glu Asn Phe Glu Lys Leu Arg

1175 1180 1185

Leu Ser Leu Gln Asp Gln Val Asp Thr Leu Thr Phe Gln Ser Gln

1190 1195 1200

Ser Leu Arg Asp Arg Ala Arg Arg Phe Glu Glu Ala Leu Arg Lys

1205 1210 1215

Asn Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ile Ala Leu Ala Pro Tyr Gln His

1220 1225 1230

Leu Glu Glu Asp Met Lys Ser Leu Lys Gln Val Leu Glu Met Lys

1235 1240 1245

Asn Gln Gln Ile His Glu Gln Glu Lys Lys Ile Leu Glu Leu Glu

1250 1255 1260

Lys Leu Ala Glu Lys Asn Ile Ile Leu Glu Glu Lys Ile Gln Val

1265 1270 1275

Leu Gln Gln Gln Asn Glu Asp Leu Lys Ala Arg Ile Asp Gln Asn

1280 1285 1290

Thr Val Val Thr Arg Gln Leu Ser Glu Glu Asn Ala Asn Leu Gln

1295 1300 1305

Glu Tyr Val Glu Lys Glu Thr Gln Glu Lys Lys Arg Leu Ser Arg

1310 1315 1320

Thr Asn Glu Glu Leu Leu Trp Lys Leu Gln Thr Gly Asp Pro Thr

1325 1330 1335

Ser Pro Ile Lys Leu Ser Pro Thr Ser Pro Val Tyr Arg Gly Ser

1340 1345 1350

Ser Ser Gly Pro Ser Ser Pro Ala Arg Val Ser Thr Thr Pro Arg

1355 1360 1365

<210>2

<211>4107

<212>DNA

<213>人属人(homo sapiens)

<400>2

atgagcgtcc cagtggctcc taagaaatca tgttacactc agttgcggga caacagaaat 60

gcagcaagaa ataataatga aagcatctta agtctgggag atacgaatgc caatcaaatc 120

atgttggagg tcagctcctc tcatgacgag tccaagacat gtgacctggg agatgaaatt 180

ggaaatacaa attcaagtga gccagaaaac cgtacccatt tccataagga atttcaccaa 240

cttcagggct ttgggaaagg ctctcaggct ggctctgcca gcctgaaaga ttttagactt 300

tcttcaacca ttcagaggga actcaatgaa gagcacacag tggagagagg cacagatagc 360

ctgcagacca cgcggagtat tcagggacca agtctgtcga gttggaggaa tgtgatgagt 420

gaggccagtc tagacgtttt ggctaaaagg gatgctgaaa ttccccggca tgttcccaag 480

gataaactgg caaagaccct tgacaatgag gaactgagga ggcattcttt ggaaagagca 540

agcagctctg tagctgcagt cgggagcctg actccgcagc atccacagcc tctatccctc 600

gactcccggg aagcacgggg tcagatacct gggggtgggg aggggccaca gaagacattg 660

ccagaccacg ctgtcccggc agctttccct gcaactgaca gtacctcaga gggaaagagt 720

gtgcgtcatc ctaaaccatc tacctcagaa agcaagcaga gcactccctc agagacccaa 780

acagtggggg cacatgtact gcaggtgtgc agtgagcaca catcacattc cgcccatcca 840

gagcctgctc tgaatttgac tttggcatcg aaggaaatcc caagtaaact ggaagcacaa 900

ttaggtcagg gaaagggaga ggccaagctg gatctgaaat atgttcctcc caggagagtt 960

gaacaggagg gaaaggcagc ccaggaaggg tatctgggat gccacaagga agagaatctg 1020

tcagccttgg agggaaggga tccatgtggg gaagcacacc cggaagccac cgatgcactt 1080

ggccatctgc tgaacagtga cctccaccac cttggggtgg gaagaggcaa ctgtgaagag 1140

aagagaggag tcaacccagg ggagcaggat tctctccaca ccacccccaa acagggctct 1200

gcttccttag gaggggctga taatcagccc actggcaaaa tttcaccatg tgcaggtgag 1260

aagttgggtg aaaggacatc cagcagcttt tcaccaggtg acagtcatgt ggcttttatt 1320

cctaataatc tgactgacag caagcccttg gatgtcattg aggaggaaag gcggttgggc 1380

agtgggaata aggacagtgt tatggttttg gtgttcaatc cttctgttgg agagaacaag 1440

acggaggtgc ctgagcccct ggaccctcaa agtggccgct cagaagcacg ggaaagcaaa 1500

gaggtcacca catctgttgc tgaaaacagg aaccttctag agaatgcaga taagattgaa 1560

agcacctcag caagagcaga ttcagttctc aatattccag cacccctcca cccagagaca 1620

actgtgaaca tgacctacca gcctacaaca cccagtagca gttttcagga tgttagcgtg 1680

ttcggtatgg atgcggggtc ccccttggta gttccacccc ctactgatag tgcacgcttg 1740

ttgaacacgt cccccaaagt gcctgacaag aacacttgcc ccagtgggat ccccaagcct 1800

gtcttcacac attccaagga cacaccttcc tcgcaggagg gaatggagaa ctatcaggtt 1860

gaaaaaacag aggagaggac agaaactaag cccatcatta tgcccaagcc caagcatgtg 1920

aggcccaaga tcatcaccta catcaggagg aatccccagg ccctgggcca ggtggacgcc 1980

tcgctggttc cagtggggct tccatatgcc ccgcccacat gtaccatgcc tcttccccac 2040

gaagagaagg cagcaggtgg tgacctgaag ccatctgcca acctctatga gaaattcaag 2100

ccagacctgc agaagccaag ggtcttcagt tccggattga tggtgtctgg aatcaagccc 2160

ccgggacatc ctttcagtca aatgagtgaa aagtttttgc aggaggttac agaccaccct 2220

ggaaaagaag agttttgttc tcctccctat gctcattatg aagtccctcc aactttctat 2280

cggtcagcca tgctccttaa gccccagcta ggattgggtg caatgtcccg tttaccatct 2340

gcaaagagca ggattctgat tgcaagtcag aggtcttcag cgagcgccat ccacccacca 2400

ggacccataa caacagccac cagtctctac agttccgatc cttcagattt aaagaaagct 2460

tccagttcaa atgctgcaaa atccaatctc ccgaaatctg gtctccgtcc tcccggatac 2520

tcacgtctcc cggcagccaa actggcggca tttggctttg tccggagctc cagcgtctcc 2580

tcagtctcca gcacccagtc cggggacagt gcacagccag agcagggccg gccagccacc 2640

cgttcaacct ttgggaatga agaacagcca gttctgaagg catctctgcc ttctaaggac 2700

acacccaagg gggccggccg ggtggcccct ccagcatcct ccagtgtgac agcaccccgc 2760

aggagtttac ttccagcgcc aaaatccact tccacacccg ctggaacaaa gaaagatgct 2820

cagaaagatc aagatacgaa taaacctgct gtttcatctc ctaagagagt agcagcttca 2880

accaccaagc ttcattcacc aggataccca aagcagagga ctgcggcagc tcgaaatggg 2940

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aaggagcggt gtgagcagca gaccagacag ctgggcgttg cgcaagggga gctgaagagg 3060

gccatctgcg gctttgatgc cctcgccgtg gccacgcagc atttctttag aaagaatgaa 3120

agtgcccttg tgaaagaaaa agagctgtca atcgaacttg caaacatcag ggatgaagtt 3180

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gatgctgctc tcctagagat ggaaaataac cacacagttg ccatcacaat cctgcaggat 3480

gaccacgacc acaaagtcca agaattgatg tccactcatg agcttgaaaa gaaagaattg 3540

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ctgaagcagg tattagaaat gaagaatcag caaatacacg agcaagaaaa gaagattctt 3780

gagctggaaa agctggcaga aaagaacatt atcctagaag aaaagatcca ggttctccaa 3840

cagcagaacg aagacctcaa agcaaggatt gaccaaaaca cagttgtcac cagacagctg 3900

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ttgagccgaa ccaatgaaga gctgctttgg aagctccaaa ctggggaccc gaccagtccg 4020

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gccagagtca gcacaacacc cagatga 4107

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gcgaattcta tgagcgtccc agtgg 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gcgtcgactc atctgggtgt tgtgc 25

<210>5

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

uuaggucagg gaaagggaga ggcca 25

<210>6

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

uggccucucc cuuucccuga ccuaa 25

Claims

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制MCAK蛋白解聚微管的活性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述基因的引物。

6.抑制权利要求2或3所述基因的表达的方法，是将抑制所述基因的小干扰RNA导入宿主，从而抑制所述基因的表达。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小干扰RNA是正义链为序列表中的序列5、反义链为序列表中的序列6的双链RNA。

8.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因，在制备抑制肿瘤增殖的药物中的应用。

9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因，在制备抑制MCAK蛋白的解聚微管活性的药物中的应用。

10.抑制MCAK蛋白的解聚微管活性和/或抑制肿瘤增殖的药物，它的活性成分是权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因和权利要求4所述重组表达载体中的至少一种。