CN111462813B - 一种基于α螺旋融合两种蛋白质且保持各自亚基活性的蛋白质融合设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发明融合设计方法利用α螺旋结构通过相同氨基酸替换的方法将变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白α亚基与蛋白A的D结构域融合,通过α螺旋形成条件、二级结构分析、能量计算和动力学模拟筛选出可行性较高的融合蛋白,通过实验证明了筛选出的融合蛋白确实具备微管组装特性和蛋白A的D结构域亲和VHⅢ单链抗体的活性。本发明的融合设计方法以天然存在的自组装体系——微管位基础,通过再微管蛋白亚基上融合其他具备活性的蛋白质亚基,在保留微管亚基自组装活性的条件下增加了微管自组装体系结合单链抗体的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物信息技术、计算方法与计算机虚拟现实技术,具体涉及一种利用α螺旋融合两种蛋白质且融合蛋白保持两种蛋白质活性的蛋白质融合设计方法。
背景技术
生命体由生物大分子组成,这些生物大分子对于生命活动起着至关重要的作用。大分子核酸控制着细胞的活动,而蛋白质则是细胞分子活动的体现,各种各样的蛋白质均具有与环境相适应的生物功能。蛋白质是构成生物体最基本的结构物质和功能物质,是生命活动的物质基础。它参与了几乎所有的生命活动过程,如生物体内发生的催化作用、免疫作用、物质运转、代谢工程等,都有蛋白质的直接参与并起着重要作用。目前,许多与蛋白相关的研究已经成为科学前沿。蛋白质结构与功能以及相关领域的研究,不仅对于解释生命现象的本质具有重要意义,而且对于工业、农业、医学等领域的发展也有深远影响。
蛋白质大部分由20种基础氨基酸组成,化学性质具有多样性,蛋白质的序列组合及组装概率也具有多样性,这样创造的结构具有多样化和高级功能等优点。因此,蛋白质是一类结构独特、功能丰富的生物大分子,具有来源丰富、可生物降解、具有生物可溶性、可再生等优势。利用蛋白质的自组装特性构建具有生物功能的可控自组装体系是纳米科学、材料科学以及生物医学等学科重要的课题之一。
蛋白质是结构复杂的生物大分子,其表面无规则分布着多个疏水相互作用、静电相互作用位点,很难对其自组装过程进行有效控制以获得结构精确的组装体,这限制了蛋白质组装材料的应用。目前,常用的方法是通过氨基酸序列突变来进行蛋白质表面相互作用的调控,从而实现蛋白质的自组装。但是,此方法存在突变位点设计困难、重组表达繁琐、蛋白质扩量困难等缺点。
蛋白质天然存在多种自组装方式,如微管的组装、病毒衣壳蛋白的组装等,因此寻找一种利用天然存在的蛋白质自组装体系的方法,不仅可以推动对蛋白质设计的理解,同时可以多层次利用天然蛋白质。
本发明以变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管α亚基与蛋白A的D结构域融合为例,利用两种蛋白结构末端的α-螺旋结构及相同氨基酸替换构建融合蛋白,利用二级结构预测、能量计算和动力学模拟筛选出合理结构,通过大肠杆菌表达系统成功表达出同时具备微管亚基自组装活性和蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族单链抗体活性的融合蛋白,对利用天然蛋白质自组装体系的研究有示范性作用。
发明内容
本发明的目的,就是为了解决上述问题而提供了一种基于α螺旋将来自变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管α亚基与蛋白A的D结构域融合且保持两种亚基活性的蛋白质融合设计方法。
本发明的目的是这样实现的:
本发明提供了一种基于α螺旋融合两种蛋白质且保持各自亚基活性的蛋白质融合设计方法,包括以下步骤:
1)梳理并比较不同物种的微管蛋白序列同源性和结构相似性,分析蛋白A的D结构于在不影响微管自组装前提下的刚性融合部位,选择变形杆菌来源的微管蛋白进行融合设计;
2)使用步骤1)中选择的微管蛋白α亚基与蛋白A的D结构域进行α螺旋融合,利用Chimera软件进行微管蛋白C-端和蛋白A的D结构域N-端相似氨基酸位点拼接;
3)通过Chimera软件结合键角、二面角数值分析,初步筛选得到一系列微管蛋白α亚基和蛋白A的D结构域可能的拼接方式,筛选条件为:融合位点外肽键的C-N键长0.132-0.133nm,Ω=180°,Φ=-57°,Ψ=-47°,误差不超过±2°,其中,围绕酰胺键中C-N键旋转产生的角度称为Ω,绕Cα-N键轴旋转的二面角(C-N-Cα-C)称为Φ,绕Cα-C键轴旋转的二面角(N-Cα-C-N)称为Ψ;
4)将步骤3)中可能的拼接方式进行二级结构预测,采用PSIPRED、SCARTCH3、SCARTCH8、YASPIN、PSSpred、SPIDER2、SPIDER3、s2D、Netsurfp、Frag1D、SOPMA和CFSSP十二个在线网站进行结构预测,挑选出满足融合位点上下各延伸3个残基,即共计8个残基,至少11个在线网站预测的二级结构均为螺旋结构,作为进一步测试的可能的拼接方式;
5)将步骤4)中挑选出的可能的拼接方式从微管蛋白α亚基截取融合位点及以上的18个残基,从蛋白A的D结构域融合位点及以下截取12个残基,整个融合区域30个残基的三个角度,采用Gaussian 09软件的HF算法进行能量计算并比较其稳定性,融合区域能量与微管蛋白α亚基、蛋白A的D结构域能量处于同一数量级且误差不大于0.035kcal/mol,即视作融合区域能量稳定,筛选出融合区域能量稳定的可能的拼接方式;
6)将步骤5)中筛选出的可能的拼接方式采用进行Amber软件进行动力学模拟分析,比较融合蛋白的结构稳定性,分析结果为主链碳原子的RMSD趋于平稳、不大于且上下波动不大于则视作融合蛋白的结构比较稳定,筛选后保留的拼接方式即为潜在工程化自组装蛋白亚基。
本发明以变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管α亚基与蛋白A的D结构域融合为例,利用两种蛋白结构末端的α-螺旋结构及相同氨基酸替换构建融合蛋白,利用二级结构预测、能量计算和动力学模拟筛选出合理结构,通过大肠杆菌表达系统成功表达出同时具备微管亚基自组装活性和蛋白A的D结构域结合VHⅢ家族单链抗体活性的融合蛋白,对利用天然蛋白质自组装体系的研究有示范性作用。
附图说明
图1是不同物种的微管蛋白α亚基序列同源性比较图;
图2是不同物种的微管蛋白α亚基结构相似性比较图:其中,橙色:Saccharomycescerevisiae,灰色:Sus scrofa、洋红:Homo sapiens,蓝绿:Prosthecobacter dejongeii;
图3是变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)来源的微管蛋白α亚基与蛋白A的D结构域(αA)通过α-螺旋进行相同氨基酸替换融合的示意图;
图4是αA采用PSIPRED、SCARTCH3、SCARTCH8、YASPIN、PSSpred、SPIDER2、SPIDER3、s2D、Netsurfp、Frag1D、SOPMA、CFSSP在线网站进行二级结构预测;
图5是αA从微管亚基、蛋白A的D结构域和融合蛋白三个角度Gaussian09计算结果;
图6是αA通过Amber软件进行200ns动力学模拟的RMSD结果;
图7-图13分别是αA1-7的表达纯化图;其中:1.上清液,2.穿出液,3.沉淀,4.50mM咪唑洗脱液,5.100mM咪唑洗脱液,6.150mM咪唑洗脱液,7.300mM咪唑洗脱液,8.500mM咪唑洗脱液;红色框框出的是目的蛋白;
图14是αA6通过负染TEM检验微管蛋白自组装活性结果图;
图15是αA6通过ELISA检验蛋白A的D结构域对于VH III家族单链抗体的亲和结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。下述实施例中所述试剂原料除非注明来源外,均为市售的常见原料,试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。
实施例1不同物种来源微管蛋白的结构与序列比较
1.通过PDB数据库,检索出四种不同来源的微管:酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、欧亚野猪(Sus scrofa)、智人(Homo sapiens)和变形杆菌(Prosthecobacterdejongeii),收集其结构和序列信息;
2.通过DNAMAN软件比较微管亚基的氨基酸序列同源度:如图1所示,α亚基同源度为70.65%;
3.通过Discovery Studio2.5软件比较微管亚基的结构相似性:如图2所示,不同物种的α亚基极为相似;
4.出于实验操作方便性、表达纯化便捷性与蛋白表达量考虑,选择变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管α亚基作为基础蛋白;蛋白A的D结构域能结合VHⅢ家族的抗体,后续可以通过抗体结合其他蛋白,拓展了微管作为超分子自组装体系的应用范围,因此,选择蛋白A的D结构域作为融合片段,采用pET-22b(+)载体、E.coli C43(DE3)宿主细胞的大肠杆菌表达系统。
实施例2α-螺旋结构中相同氨基酸替换
1.分析变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白α亚基的C-端(去除C-末端羧基结构)410-435位氨基酸序列的结构,是α-螺旋结构;分析蛋白A的D结构域结构,发现其位3个连续的α-螺旋结构;
2.采取借助α-螺旋结构进行拼接,将变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白α亚基的C-端与蛋白A的D结构域的N-端进行α-螺旋连接,采用相同氨基酸替换进行连接,相同氨基酸替换见图3示意。
实施例3融合方式的α-螺旋形成条件筛选
1.肽链主链的构象通常可以通过Ω,Φ和Ψ描述,围绕酰胺键中C-N键旋转产生的角度称为Ω,绕Cα-N键轴旋转的二面角(C-N-Cα-C)称为Φ,绕Cα-C键轴旋转的二面角(N-Cα-C-N)称为Ψ。
由于酰胺键中C-N键受到C=O键的影响,具有部分双键性质,又由于反式构象具有更低的能量,故Ω通常约为180°。α螺旋每圈有3.6个残基组成,螺距为0.54nm,Φ为约-57°,Ψ为约-47°;
2.利用Chimera软件进行微管蛋白α亚基C-端和蛋白A的D结构域N-端相同氨基酸位点拼接方式进行初步筛选,结合Ω,Φ和Ψ数值分析,筛选出较为合理的拼接方式,筛选条件为:融合位点外肽键的C-N键长0.132-0.133nm,Ω=180°,Φ=-57°,Ψ=-47°,误差不超过±2°。
实施例4二级结构预测
将实施例3中筛选出的拼接方式采用PSIPRED、SCARTCH3、SCARTCH8、YASPIN、PSSpred、SPIDER2、SPIDER3、s2D、Netsurfp、Frag1D、SOPMA、CFSSP十二个在线网站进行融合蛋白二级结构预测,挑选出满足融合位点上下各延伸3个残基,即共计8个残基,至少11个在线网站预测的二级结构均为螺旋(helix)结构,作为进一步测试的可能的拼接方式。
融合蛋白αA采用PSIPRED、SCARTCH3、SCARTCH8、YASPIN、PSSpred、SPIDER2、SPIDER3、s2D、Netsurfp、Frag1D、SOPMA、CFSSP在线网站进行二级结构预测,预测结果如图4所示。
实施例5能量计算
将实施例4中挑选出的可能的拼接方式从微管蛋白α亚基截取融合位点及以上的18个残基,从蛋白A的D结构域融合位点及以下截取12个残基,整个融合区域30个残基的三个角度,采用Gaussian 09软件的HF算法进行能量计算并比较其稳定性,计算结果如图5所示。
融合区域能量与微管蛋白α亚基、蛋白A的D结构域能量处于同一数量级且误差不大于0.035kcal/mol,即视作融合区域能量稳定,筛选出融合区域能量稳定的可能的拼接方式。
实施例6动力学模拟
将实施例5中筛选出的可能的拼接方式采用进行Amber软件进行200ns动力学模拟分析,比较融合蛋白的结构稳定性,分析结果如图6所示。
实施例7融合蛋白αA1-7的表达菌株构建及纯化
全基因合成融合蛋白αA1-7基因,分别克隆到表达载体pET-22b(+),得到表达重组质粒pET-22b(+)-αA1至pET-22b(+)-αA7,再分别转化E.coli C43(DE3)得到表达菌株。
表达菌株通过发酵、表达以及纯化,表达纯化图如图7-图13所示,最终得到融合蛋白αA6和αA7。
实施例8微管蛋白α亚基-蛋白A的D结构域融合蛋白的自组装活性测定
1.将实施例7中获得融合蛋白αA6和αA7以及微管蛋白α亚基、微管蛋白β亚基分别用3kD的透析袋,于4℃的条件置换成组装缓冲液;
2.将α、β、αA6和αA7配置浓度为2mg/mL的溶液,按照α+β、αA6+β、αA7+β的3种组合方式等体积混合,加入终浓度为1mM的GTP,室温下组装10min;
3.取3uL组装后样品滴在200目的镀碳膜铜网上,0.1%磷钨酸染色,通过120kVTEM观察形貌。如图14所示,α+β、αA6+β成功组装,αA7+β组装失败。
以上数据说明,融合蛋白αA6具有变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)来源的微管自组装活性。
实施例9微管蛋白α亚基-蛋白A的D结构域融合蛋白的VHⅢ单链抗体结合活性测定
1.将抗酪氨酸激酶受体2的单链抗体稀释至5ug/mL,以每孔加入100uL、4℃过夜的条件包被96孔板;每孔加入200uL PBST洗涤液,洗涤三次,每次5min;
2.配置5%的BSA(w/v),每孔加入200uL、37℃、2h的条件封闭96孔板;每孔加入300uL PBST洗涤液,洗涤三次,每次5min;
3.融合蛋白αA6梯度稀释浓度0-0.00052-0.0052-0.052-0.52-5.2-52-520ug/mL,以每孔加入100uL、37℃、1h的条件孵育96孔板;每孔加入200uL PBST洗涤液,洗涤三次,每次5min;
4.按照1:125(v/v)稀释HRP-山羊抗兔IgG(H+L)抗体,以每孔加入100uL、37℃、1h的条件孵育96孔板;每孔加入200uL PBST洗涤液,洗涤三次,每次5min;
5.以每孔加入100uL、37℃避光的条件加入TMB底物显色30min,每孔加入50uL 2M硫酸终止反应,于450nm波长处测定吸光度。
如图15所示,融合蛋白αA6具有蛋白A的D结构域亲和VHⅢ单链抗体的活性。
从上述结果可以看出,本发明设计方法利用α螺旋结构通过相同氨基酸替换的方法将变形杆菌(Prosthecobacter dejongeii)的微管蛋白α亚基与蛋白A的D结构域融合,通过α螺旋形成条件、二级结构分析、能量计算和动力学模拟筛选出可行性较高的融合蛋白,通过实验证明了筛选出的融合蛋白确实具备微管组装特性和蛋白A的D结构域亲和VHⅢ单链抗体的活性。
蛋白质是生命活动的基础,是来源丰富且环保的生物材料,利用蛋白质的自组装特性构建具有生物功能的可控自组装体系是纳米科学、材料科学以及生物医学等学科重要的课题之一。然而蛋白质结构的复杂性使得很难对其自组装过程进行有效控制以获得结构精确的组装体,这限制了蛋白质组装材料的应用。目前常用的氨基酸序列突变法存在突变位点设计困难、重组表达繁琐、蛋白质扩量困难等缺点。
本发明的融合设计方法以天然存在的自组装体系——微管位基础,通过再微管蛋白亚基上融合其他具备活性的蛋白质亚基,在保留微管亚基自组装活性的条件下增加了微管自组装体系结合单链抗体的活性。本发明开发了一种新的蛋白质融合设计方法,具有巨大的科研、应用价值。
以上实施例仅供说明本发明之用,而非对本发明的限制,有关技术领域的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以作出各种变换或变型,因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴,应由各权利要求所限定。
Claims (1)
1.一种基于α螺旋融合两种蛋白质且保持各自亚基活性的蛋白质融合设计方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)梳理并比较不同物种的微管蛋白序列同源性和结构相似性,分析蛋白A的D结构于在不影响微管自组装前提下的刚性融合部位,选择变形杆菌来源的微管蛋白进行融合设计;
2)使用步骤1)中选择的微管蛋白α亚基与蛋白A的D结构域进行α螺旋融合,利用Chimera软件进行微管蛋白C-端和蛋白A的D结构域N-端相似氨基酸位点拼接;
3)通过Chimera软件结合键角、二面角数值分析,初步筛选得到一系列微管蛋白α亚基和蛋白A的D结构域可能的拼接方式,筛选条件为:融合位点外肽键的C-N键长0.132-0.133nm,Ω=180°,Φ=-57°,Ψ=-47°,误差不超过±2°,其中,围绕酰胺键中C-N键旋转产生的角度称为Ω,绕Cα-N键轴旋转的二面角(C-N-Cα-C)称为Φ,绕Cα-C键轴旋转的二面角(N-Cα-C-N)称为Ψ;
4)将步骤3)中可能的拼接方式进行二级结构预测,采用PSIPRED、SCARTCH3、SCARTCH8、YASPIN、PSSpred、SPIDER2、SPIDER3、s2D、Netsurfp、Frag1D、SOPMA和CFSSP十二个在线网站进行结构预测,挑选出满足融合位点上下各延伸3个残基,即共计8个残基,至少11个在线网站预测的二级结构均为螺旋结构,作为进一步测试的可能的拼接方式;
5)将步骤4)中挑选出的可能的拼接方式从微管蛋白α亚基截取融合位点及以上的18个残基,从蛋白A的D结构域融合位点及以下截取12个残基,整个融合区域30个残基的三个角度,采用Gaussian 09软件的HF算法进行能量计算并比较其稳定性,融合区域能量与微管蛋白α亚基、蛋白A的D结构域能量处于同一数量级且误差不大于0.035kcal/mol,即视作融合区域能量稳定,筛选出融合区域能量稳定的可能的拼接方式;
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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