JP2002136292A - 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規なレセプター型タンパク質のチロシンホス
ファターゼタンパク質または糖タンパク質を提供する。 【解決手段】白血球共通抗原(CD45)および白血球共通抗
原-関連タンパク質(LAR)以外のヒトレセプター型タンパ
ク質のチロシンホスファターゼ(R-PTPase)タンパク質ま
たは糖タンパク質分子、その機能的誘導体、もしくは他
の哺乳動物におけるその同等物であって、該分子が自然
界に存在するものである場合、該分子は自然界でそれと
結合している他のタンパク質または糖タンパク質を実質
的に含まず、自然界に存在する該分子は一般に哺乳動物
の肝臓、腎臓および脳に存在していることを特徴とする
上記分子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】生化学、細胞および分子生物
学の分野における本発明は、Ｒ−ＰＴＰase −α、βお
よびγ（ガンマ）と呼ばれる新規なレセプター型タンパ
ク質、チロシンホスファターゼタンパク質または糖タン
パク質、そのＤＮＡコード、該タンパク質の製造法およ
び同定法、並びにＰＴＰase 酵素活性と結合することが
でき、またこれを阻害または促進することのできる物質
をスクリーニングする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】幾つかの成長因子レセプターおよびチロ
シン特異的プロテインキナーゼとしてのレトロウィルス
がん遺伝子の同定によって、チロシン残基上におけるタ
ンパク質のリン酸化が細胞の成長コントロールに重要な
役割を果たしていることが示唆された。この考え方は最
近になって、シグナルトランスダクション（例えばホス
ホリパーゼＣなど）に重要な役割を果たすと考えられる
チロシンリン酸化のレベルが成長因子刺激に際してその
活性増加と相関し、したがってチロシンリン酸化の機能
的役割を確立することとなった観察によって支持を得た
（Ullrich, A. etal., Cell 61:203-212, 1990）。

【０００３】細胞タンパク質のチロシン残基のリン酸化
の程度およびパターンは、プロテイン−チロシンキナー
ゼ（ＰＴＫase ；ＡＴＰ：プロテイン−チロシンＯ−ホ
スホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．１１２）お
よびプロテイン−チロシン−ホスファターゼ（ＰＴＰas
e ；プロテイン−チロシン−ホスフェートリン酸加水分
解酵素、ＥＣ３．１．３．４８）の相反する活性によっ
て調節されている。ＰＴＫase の構造の特徴と進化、並
びに細胞成長の調節における役割が総説としてまとめら
れている（Hunter, T., et al., Annu. Rev. Biochem.
54:897-930, 1985; Ullrich, A. et al., 前出）。

【０００４】チロシンキナーゼはセリン／トレオニン特
異的プロテインキナーゼと共通の起源をもつが、これと
は大きく異なる別の酵素のファミリーからなる(Hanks,
S. K.ら、Science 241:42-52, 1998)。チロシンキナー
ゼの活性における変化へと導くメカニズムについは、ト
ランスメンブラントポロジーを有するレセプター型チロ
シンキナーゼで最もよく理解されている（Ullrich, A.e
t al., 前出）。このようなキナーゼでは、これらの酵
素の細胞外ドメインへの特異的リガンドの結合がそのオ
リゴマー化を誘導してチロシンキナーゼ活性の増加とシ
グナルトランスダクション経路の活性化へと導くと考え
られる（Ullrich, A. et al., 前出）。突然変異または
過剰発現によるキナーゼ活性の調節異常が癌性形質転換
のメカニズムであるという知見によってこの活性の重要
性が支持されている（Hunter, T.et al., 前出; Ullric
h, A.et al., 1990, 前出）。

【０００５】プロテインホスファターゼは少なくとも２
つの異なる区別されるファミリーからなり（Hunter, T.
Cell 58:1013-1016, 1989）、これはプロテインセリン
／トレオニンホスファターゼおよびプロテインチロシン
ホスファターゼである。これはセリン／トレオニン特異
的酵素とチロシン特異的酵素との間に明らかな配列類似
性を示すプロテインキナーゼとは対照的である。

【０００６】ＰＴＰase 分子には２種類あるように思わ
れる。第１のグループは、保存性ホスファターゼ触媒ド
メインを１つ含む小さな可溶性酵素からなり、（１）胎
盤ＰＴＰase １Ｂ（Charbonneau, H. et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. 86:5252-5256(1989);Chernoff, J. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2735-2789, 199
0）、（２）Ｔ細胞ＰＴＰase （Cool, D.E. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci.USA 86:5257-5261, 1989）、およ
び（３）ラット脳ＰＴＰase （Guan, K. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:1501-1503, 1990）を含む。

【０００７】第２のグループは、高分子量で、５６−５
７アミノ酸によって隔てられた２つの一列に並ぶ反復保
存ドメインを含む、Ｒ−ＰＴＰase と呼ばれる、より複
雑でレセプターに結合したＰＴＰaseからなる。Ｒ−Ｐ
ＴＰase の一例としては、白血球共通抗原（ＬＣＡ）
（Ralph, S.J., EMBO J., 6:1251-1257, 1987; Charbon
neau, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:718
2-7186, 1988）が挙げられる。ＣＤ４５、Ｔ２００およ
びＬｙ−５（Thomas, M.L., Ann. Rev. Immunol., 7:33
9-369, 1989にまとめられている）としても知られるＬ
ＣＡは、タンパク質のアミノ酸末端を必要とする別のス
プライシングによって共通の遺伝子から得られる造血細
胞（後期赤芽球を除く）中においてのみ発現する一群の
膜糖タンパク質からなる。ＣＤ４５の正確な機能はまだ
分かっていないが、細胞毒性Ｔリンパ球およびナチュラ
ルキラー細胞の活性、ＩＬ−２レセプター発現、Ｂ細胞
の分化、およびＴリンパ球の増殖を含む多数の過程にお
ける上記抗原の関与を多くの研究が示唆している(Pinge
l, J. T.ら、Cell 58:1055-1065, 1989)。

【０００８】Ｒ−ＰＴＰase のその他の例としては、Ｌ
ＣＡ関連タンパク質、ＬＡＲ(Streuli, M.ら、J. Exp.
Med., 168:1523-1530, 1988)およびＬＡＲ関連ショウジ
ョウバエタンパク質ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰ（Streuli,
M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8698-870
2, 1989）がある。Ｊｉｒｉｋらは、ヒト肝芽腫細胞系
ＨｅｐＧ２由来のｃＤＮＡライブラリーを、ＬＣＡの２
つのＰＴＰase ドメインをコードするプローブでスクリ
ーニングして（FASEB J. 4:A2082, 1990, 要旨2253）、
Ｈｅ−ＰＴＰと名付けた新規なＲ−ＰＴＰase をコード
するｃＤＮＡクローンを発見した。Ｈｅ−ＰＴＰ遺伝子
は多くのヒトおよびマウス細胞系および組織で発現する
と思われた。

【０００９】我々はＰＴＰase の構造と多様性について
より多くの理解をし始めたのであるが、その細胞での機
能についてはまだ分からないことが多い。小さい可溶性
ＰＴＰase は「ハウスキーピング」機能をもつことが示
唆された（Tonke, N.K. et al., Biochemistry 27:8695
-8701, 1989）。一方、Ｒ−ＰＴＰase は細胞膜に位置
しており、細胞外リガンドによって制御される可能性が
あるので、その活性はより制限されると予測される。Ｔ
細胞におけるＬＣＡ（ＣＤ４５）の役割に関しては、Ｌ
ＣＡの発現が不十分なＴ細胞クローンは、特異的抗原ま
たはＣＤ３の架橋によって刺激しても増殖できないこと
が見いだされた（Pingel, J.T. et al.,前出）。ＰＴＰ
ase 架橋は、ヒトＴ細胞におけるＴ細胞レセプターＣＤ
３媒介性の活性化を阻害する（Kiener, P.A. et al.,
J. Immunol. 143:23-28, 1989）。ＬＣＡのＰＴＰase
活性はリンパ球特異的ＰＴＰase であるｐｐ５６^lckの
活性化で役割を演じる（Mustelin, T. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 86:6302-6306,1989; Ostergaard,
H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8959-8
963, 1989）。これらの著者は、ＬＣＡのホスファター
ゼ活性がＣ末端チロシン残基の脱リン酸化によってｐｐ
５６^lckを活性化し、これが次いでＴ細胞活性化に関係
するかも知れないとの仮説を出した。

【００１０】ＬＣＡ中の４つの保存システイン（ホスフ
ァターゼドメイン１つ当たりに２個）のうちのどれが人
工基質の酵素活性に必要であるかを決定するために、部
位特異的突然変異誘発を用いて、Ｓｔｒｅｕｌｉら（１
９８９、前出）はＬＣＡのうちの１つのシステイン残基
（ＬＣＡホスファターゼドメイン−１の残基１７７）だ
けが活性のために必須であることを発見し、第１のホス
ファターゼドメインだけが酵素活性を有するらしい、と
示唆した。しかしながら、第２のドメインが異なる基質
を脱リン酸化するという可能性を排除できない。もっと
最近になって、Ｓｔｒｅｕｌｉら（EMBO J. 9:2399-240
7, 1990）は、ＬＣＡ（およびＬＡＲ）の第２の保存ド
メインは検出しうるホスファターゼ活性を欠くが、ドメ
イン中の配列が基質特異性に影響を及ぼすことができる
と結論した。

【００１１】ホスホチロシンの代謝をよりよく理解し、
コントロールするためには、キナーゼ活性の役割だけで
なく、ホスファターゼ酵素の作用も理解しなければなら
ない。細胞性ホスホチロシンの上昇はチロシンキナーゼ
自体の活性化を必要としないメカニズムによって起きる
のかも知れない。例えば、チロシンキナーゼ自体によら
ないｖ−ｃｒｋがん遺伝子の発現が、今までによく知ら
れていないメカニズムによってチロシン残基のリン酸化
を誘導する（Mayer, B.J. et al., Nature 332:272-27
5, 1988）。特に細胞性チロシン−リン酸の通常は高い
代謝回転速度という観点からすると、おそらく、このよ
うな結果は基質の突然変異によるか、あるいは細胞性ホ
スファターゼ活性の一般的減少によるかのいずれかによ
るものである（Sefton, B.M. et al., Cell 20:807-81
6, 1980）。チロシンホスファターゼ阻害剤が細胞を
「逆形質転換（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍ）」することができることを示すことによって、後
者の可能性が示唆された（Klarlund, J.K. Cell 41:707
-717, 1985）。したがって、ＰＴＰase は劣性がん遺伝
子となりうるとみなすことができる。

【００１２】チロシンの脱リン酸化自体が重要な調節メ
カニズムとして機能しうることが徐々に明らかになって
いる。Ｃ末端チロシン残基の脱リン酸化がチロシンキナ
ーゼのｓｒｃファミリーにおけるチロシンキナーゼ活性
を刺激する（Hunter, T., Cell 49:1-1, 1987）。チロ
シン脱リン酸化はＭＰＦ（成熟促進因子：ｍａｔｕｒａ
ｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）キナー
ゼの有糸分裂活性化に必須の段階であることが指摘され
てきた（Morla, A.O. et al., Cell 58:193-203, 198
9）。最後に、原始的な真核生物の突然変異分析によっ
て、細胞生理学におけるセリンホスファターゼの決定的
役割が確立された（Cyert, M.S. et al.,Cell 57:891-8
93, 1989）。これらの観察は、チロシンホスファターゼ
活性を制御するメカニズムについてより理解を深める必
要性を指摘している。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】細胞成長、分化および
発癌のメカニズムについての重要な理解を得るために
は、これら膜レセプターの構造と機能との関係をさらに
分析することが当該分野で必要であることは明らかであ
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、可能性の
ある抗腫瘍遺伝子としての、さらにはトランスメンブラ
ンシグナリングの新たに発見された機構でのエフェクタ
ーとしての、細胞制御機構におけるＲ−ＰＴＰａｓｅの
役割について考えた。かくして、彼らは、このようなプ
ロセスに関与すると思われるＲ−ＰＴＰａｓｅの検索に
着手し、本明細書ではトランスメンブラントポロジーを
有するＲ−ＰＴＰａｓｅファミリーの広範に発現された
新規メンバーの同定について開示する。重要なことに
は、その細胞外ドメインは以前に記載された他のどのＲ
−ＰＴＰａｓｅにも無関係である。新規Ｒ−ＰＴＰａｓ
ｅは、レセプターチロシンキナーゼに類似した方法で、
種々の異なる細胞外リガンドによる直接調節を受けやす
い。

【００１５】従って、本発明は、白血球共通抗原（ＬＣ
ＡまたはＣＤ４５）および白血球共通抗原- 関連タンパ
ク質（ＬＡＲ）以外のヒトレセプター型タンパク質のチ
ロシンホスファターゼ（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ）タンパク質
または糖タンパク質分子、ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅの機能
的誘導体または他の哺乳動物種におけるヒトＲ−ＰＴＰ
ａｓｅの同等物を提供する。当該分子が天然由来のもの
である場合、この分子は自然界でそれと結合している他
のタンパク質や糖タンパク質を実質的に含まない。この
自然界に存在する分子は一般に哺乳動物の肝臓、腎臓お
よび脳に存在している。これとは別に、Ｒ−ＰＴＰａｓ
ｅ分子は天然由来のものでなくてもよく、例えば化学的
または組換え手法により製造されたものであり得る。

【００１６】本発明の実質的に純粋なＲ−ＰＴＰａｓｅ
タンパク質または糖タンパク質は天然由来の糖タンパク
質の生化学的精製により調製することができ、またＲ−
ＰＴＰａｓｅは原核または真核細胞宿主での組換え手法
により生産することもできる。

【００１７】とりわけ、本発明は、図４のアミノ酸配列
を有する分子Ｒ−ＰＴＰａｓｅ、またはその機能的誘導
体に関するものである。他の態様では、本発明はヒトＲ
−ＰＴＰａｓｅ−βに向けられる。さらに他の態様で
は、本発明はヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−ガンマに向けられ
る。

【００１８】本発明はさらに、マウスまたはヒト由来の
Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α、またはヒト由来のＲ−ＰＴＰａ
ｓｅ−βもしくはＲ−ＰＴＰａｓｅ−ガンマ、あるいは
その機能的誘導体をコードするヌクレオチド配列から本
質的に成る、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの形のＤＮＡ
分子に関するものである。本発明はまた、発現ベヒクル
（運搬体）の形のＤＮＡ配列、およびこのＤＮＡにより
形質転換された原核または真核細胞宿主に向けられる。

【００１９】本発明には、さらに、本発明のＲ−ＰＴＰ
ａｓｅタンパク質または糖タンパク質、もしくはその機
能的誘導体を生産する方法が含まれ、この方法は： (a) 培養条件下で該タンパク質を発現し得る宿主を培養
し； (b) 該タンパク質を発現させ；そして(c) 培養物から該
タンパク質を回収する；ことから成っている。

【００２０】本発明は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク
質または糖タンパク質に対して特異的な、ポリクローナ
ル、モノクローナル、またはキメラの抗体にも向けられ
る。

【００２１】また、本発明は、被検者における正常また
は変異Ｒ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸の存在を検出
する方法に関し、この方法は： (a) 被検者由来の細胞またはその抽出物を、正常または
変異Ｒ−ＰＴＰａｓｅの少なくとも一部をコードするオ
リゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーション
条件下で接触させ；そして(b) 該細胞の核酸へのプロー
ブのハイブリダイゼーションを測定し、これにより該核
酸の存在を検出する；ことから成っている。このＤＮＡ
は、アッセイに先立って、ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクションを使って選択的に増幅させることができる。

【００２２】本発明はさらに、細胞または被検者におけ
るＲ−ＰＴＰａｓｅの存在を検出し、その量を測定する
方法に関し、この方法は： (a) 該細胞またはその抽出物を、Ｒ−ＰＴＰａｓｅのエ
ピトープに対して特異的な抗体と接触させ；そして(b)
該細胞またはその抽出物への該抗体の結合を検出する
か、または結合した抗体の量を測定し、これによりＲ−
ＰＴＰａｓｅの存在を検出し、その量を測定する；こと
から成っている。

【００２３】本発明はまた、化学的または生物学的調製
物からＲ−ＰＴＰａｓｅに結合し得る化合物を同定・単
離する方法に関し、この方法は： (a) Ｒ−ＰＴＰａｓｅまたはそのリガンド結合部分を固
相マトリックスに付着させ； (b) 化学的または生物学的調製物を該固相マトリックス
と接触させて該化合物を結合させ、そして未結合物質を
洗い流し； (c) 該固相に結合した化合物の存在を検出し；そして、
単離するために、 (d) 結合した化合物を溶離し、これにより該化合物を単
離する；ことから成っている。

【００２４】最後に、本発明は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵
素活性を刺激または阻害し得る化合物を同定する方法を
含み、この方法は： (a) 純粋な形の、メンブラン調製物中の、または生存も
しくは固定した全細胞中のＲ−ＰＴＰａｓｅと該化合物
とを接触させ； (b) 工程(a) からの混合物を十分な時間インキュベート
し； (c) Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵素活性を測定し； (d) その酵素活性を、該化合物の不在下でインキュベー
トしたＲ−ＰＴＰａｓｅのそれと比較し、これにより該
化合物が酵素活性を刺激するのかまたは阻害するのかを
判定する；ことから成っている。図面の説明 図１は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの推定一次構造を
提示する。パネル(a)は、ファージラムダ−１０９ ｃ
ＤＮＡ挿入物の配列および推定Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αタ
ンパク質配列（標準一文字アミノ酸表記を使用）を示
す。開始コドンＡＴＣはイタリック体で示してあり、停
止コドンは星印で示してある。推定トランスメンブラン
ドメイン（アミノ酸１４３−１６６）には下線が引いて
あり、細胞外ドメイン中の可能性のあるＮ−結合グリコ
シル化部位にも下線が引いてある。タンデムに反復され
たＰＴＰａｓｅドメイン（ＩおよびII）間の相同の境界
は四角のかっこで示してある。全ての既知Ｒ−ＰＴＰａ
ｓｅの触媒ドメインに保存されたシステイン残基にも下
線が引いてある。パネル(b) は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α
コード配列を含むラムダ−１０９ ｃＤＮＡクローンの
概略的構造を示す。Ｒ−ＰＴＰａｓｅドメインＩおよび
IIは黒のボックスとして示してあり、トランスメンブラ
ンドメインには陰影が付けてある。図３に示したＮ−末
端切断型のＰＴＰ−ＤｅｌｔａＣタンパク質の開始を矢
印（アミノ酸２１４）で示す。配列決定のためにnested
deletion を生成に使用された制限部位の位置も示して
ある。略号：ＴＭ，トランスメンブランドメイン；Ｂ，
BamHI部位；Ｂｓ，BstEII部位；Ｎ，NcoI部位；Ｎｄ，N
deI部位；Ｐ，PstI部位；Ｒ，EcoRI部位；Ｓ，SacII部
位；Ｓｔ，StuI部位。

【００２５】図２は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−α ｍ
ＲＮＡの発現を示すノーザンブロットの図である。マウ
ス組織・細胞系由来の５μｇのポリＡ⁺ＲＮＡをホルム
アルデヒド含有アガロースゲルで分画化し、プローブと
して全Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αｃＤＮＡを使ってノーザン
分析にかけた。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの
位置を示す。

【００２６】レーン：１，腎臓；２，肺；３，心臓；
４，胃；５，脳；６，脾臓；７，肝臓；８，ＮＩＨ−３
Ｔ３線維芽細胞系 (Honegger, A.M. et al. (1987) Cel
l 51,199-209)；９，ＢＡＦプレプロ−Ｂリンパ様細胞
系 (Palacios, R. et al. (1985) Cell 41, 727-734)。

【００２７】図３は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタン
パク質の免疫沈降のＰＡＧＥの結果を示す図である。Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン法を使って、ＣＯＳ細胞を、陰性
対照プラスミド（挿入物を含まない発現ベクターｐＬＳ
Ｖ）、ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−α（Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−α
ｃＤＮＡを含む同一の発現ベクター）、またはトランス
メンブランおよび細胞外ドメインが除かれた（部位特異
的突然変異誘発によりこの位置にイニシエーターメチオ
ニン残基を導入した）末端切断型のＲ−ＰＴＰａｓｅ−
αタンパク質（ＰＴＰ−ＤｅｌｔａＣ、アミノ酸２１４
−７９４）を発現するようにデザインされた発現ベクタ
ーｐＬＳＶＤｅｌｔａＣで一時的にトランスフェクトし
た。 [³⁵Ｓ]-メチオニンで代謝物を標識した後、免疫前
血清（レーン１および２）またはＲ−ＰＴＰａｓｅ−α
タンパク質のＣ末端に対応する合成ペプチドに対して誘
導された、 100μg の免疫用ペプチドの不在または存在
下での抗血清（２Ａ）（レーン３−８）を用いて免疫沈
降を行った。分子量マーカーの大きさはｋＤａで示して
ある。矢印は130 kDのＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質
の位置を示す（レーン５）。

【００２８】レーンは次の通りである：１：ｐＬＳＶ，
免疫前血清；２：ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−α，免疫前血清；
３：ｐＬＳＶ，抗血清２Ａ；４：ｐＬＳＶ，合成ペプチ
ドの存在下での抗血清２Ａ；５：ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−
α，抗血清２Ａ；６：ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−α，合成ペプ
チドの存在下での抗血清２Ａ；７：ｐＬＳＶＤｅｌｔａ
Ｃ，抗血清２Ａ；８：ｐＬＳＶＤｅｌｔａＣ，合成ペプ
チドの存在下での抗血清２Ａ。

【００２９】図４は、ｃＤＮＡクローンの配列から推定
されたヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの構造を示す。

【００３０】(A) ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの全コード
領域を含む、重複するクローン３１−４および２７−１
の混成制限地図〔3615塩基対 (bp) 〕。

【００３１】(B) クローン３１−４および２７−１の相
対位置。一連のオリゴヌクレオチドプライマーを使っ
て、各クローンの両鎖とも全体の配列を決定した。クロ
ーン３１−４の斜線領域はノーザンブロット用（下記の
図６）および染色体指定用のプローブとして使用したフ
ラグメントに相当する。

【００３２】(C) ヒト（レーン１）およびマウス（レー
ン２）Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αのアミノ酸配列の比較。一
文字アミノ酸表記を使用する。差異だけを示してある。
ダッシュ（−）で示した線はマウス配列に存在しないア
ミノ酸の広がりを示す。ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αのコ
ード部分、およびクローン３１−４および２７−１(B)
に対するその位置を上に示す。次の領域が示してある：
シグナルペプチド(I)、下線を施したヒトタンパク質の
可能なＮ−グリコシル化部位を含む細胞外ドメイン(I
I)、トランスメンブラン(III)、ジャクスタメンブラン
(juxtamembrane)(IV) 、第１ホスファターゼドメイン
(V)、インタードメイン(VI)、第２ホスファターゼドメ
イン(VII) 、Ｃ末端(VIII)。

【００３３】図５は、ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ ＬＣＡ、
α、βおよびガンマの第１（Ａ）および第２（Ｂ）保存
ホスファターゼのアミノ酸配列の比較を示す。ＣＯＮは
コンセンサス配列であり、大文字は完全な一致を示す
が、小文字は４つの配列のうち２つまたは３つの一致を
示す。ダッシュはコンセンサスの欠如を示す。

【００３４】図６は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αプローブ
（上）とβ−アクチンプローブ（下）を用いたノーザン
ブロットハイブリダイゼーションにより測定した、種々
の組織および細胞系でのヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの相
対的発現を示すゲルパターンの図である。表示したヒト
細胞系または組織からの全ＲＮＡ（左側の５つのレー
ン）またはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（右側の５つのレーン）
試料を分析した。Ａ４３１はヒト類表皮腫細胞系であ
り、ＨＥＬは赤白血病細胞系であり、他の全てのレーン
はフラッシュ凍結組織試料（ＨＵＶＥＣ−ヒト臍静脈内
皮細胞）を表す。

【００３５】図７は、17の齧歯目−ヒト体細胞ハイブリ
ッドのパネルの分析に基づいたヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−
αの染色体局在化を示すマトリックス図である。完全点
刻ボックスは、そのハイブリッドが上の列に示した染色
体を含むことを示し、右下の点刻は染色体の長腕（また
は長腕の一部、より小さい点刻域で示される）の存在を
示し、左上の点刻は染色体の短腕（または短腕の一部）
の存在を示し、オープンボックスは染色体の不在を示
す。染色体20の縦列は、この染色体（または染色体領
域）の存在とＲ−ＰＴＰａｓｅ−α遺伝子の存在との相
関性を強調するようにはっきりと描かれ、点刻されてい
る。ハイブリッドにおけるヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−α配
列の保持パターンを右側（ＲＰＴＰα）に示してある。
該遺伝子の存在は点刻ボックス中に「＋」で示され、該
遺伝子の不在はオープンボックス中に「−」で示され
る。

【００３６】

【発明の実施の形態】組換えＤＮＡ技術を用いることに
より、本発明者らは新規哺乳動物レセプター型 (トラン
スメンブラン) タンパク質チロシン・ホスファターゼ
(ＰＴＰase ;ＥＣ3.1.3.48) を同定している。マウスＲ
−ＰＴＰase−αは794アミノ酸を有しているが、ヒトＲ
−ＰＴＰase−αは802アミノ酸を有している。そのレセ
プター様構造と、あるファミリーの一員である可能性を
考慮して、本発明者らはこのタンパク質をＲ−ＰＴＰas
e −α (レセプター・タンパク質・チロシン・ホスファ
ターゼ・アルファ) と命名した。このファミリーをここ
では「Ｒ−ＰＴＰase」と命名する。

【００３７】Ｒ−ＰＴＰase −αは他のチロシン・ホス
ファターゼの触媒ドメインに相同な細胞内ドメインを有
している。さらに本発明者らは 142アミノ酸細胞外ドメ
イン(シグナル・ペプチドを含む) をセリンとトレオニ
ン含有量が高く (32％) 、そして８ヶ所のＮ−グリコシ
ル化部位を有するものとして、特徴決定した。本発明者
らは、新規タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを
生成し、そのタンパク質を真核生物宿主で発現させた。
種々の細胞や組織中でのタンパク質の自然な発現を同定
するために、ノーザン分析を用いた。さらに本発明者ら
はＲ−ＰＴＰase −αの合成ペプチドで免疫化すること
によりそのタンパク質に対するポリクローナル抗体を生
成し、この抗体はＲ−ＰＴＰase −αの一部をコードす
るｃＤＮＡクローンでトランスフェクトした細胞中の13
0kDaタンパク質を同定する。

【００３８】注目すべきことに、酵素活性を有する細胞
内ドメインにより構成されているのに加えて、Ｒ−ＰＴ
Ｐase が属するレセプター・ファミリーはＮ末端細胞外
ドメインを有するトランスメンブラン・タンパク質を含
んでいる；これはチロシン・キナーゼ酵素ファミリーに
類似している (Tonks, N.K.ら, (1988) Biochemistry2
7,8695-8701; Charbonneau, H. ら, (1988) Proc. Nat
l. Acad. Sci.USA. 85,7182-7186; Streuli, M.ら, (19
88) J.Exp, Med.168,1523-2530; Streuli, M.ら,(1989)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 86, 8698-8702)。従っ
て、本発明者らは細胞外環境におけるリガンドがＰＴＰ
ase のこの膜結合サブクラスの活性を制御すると結論し
た。

【００３９】本発明のＲ−ＰＴＰase −αと他のＲ−Ｐ
ＴＰase は、Ｒ−ＰＴＰase 活性を活性化するかまたは
阻害することができ、それにより細胞の代謝の主要経路
に影響を与える、薬剤や他の作用物質をスクリーニング
する方法に有用である。固相マトリックスに完全なまま
のＲ−ＰＴＰase またはそのリガンド結合部分を付着さ
せることにより、結合活性に基づいてレセプターと相互
作用する能力に関して、生物学的産物または化学薬品を
スクリーニングするために用いられるアフィニティー・
プローブを作製する。続いて、結合物質を精製された形
でアフィニティー・プローブから溶出する。

【００４０】固相にタンパク質やペプチドをカップリン
グする方法、これらの方法に有用な固相物質、溶出媒体
は当業者によく知られている。

【００４１】酵素活性を有するＲ−ＰＴＰase タンパク
質またはその誘導体は、ホスファターゼ活性を高めるか
または阻害することができる化合物の検査に使用するこ
とができる。ホスファターゼ活性を変化させる被検化合
物の能力は、被検化合物を精製Ｒ−ＰＴＰaseタンパク
質またはその酵素的に活性な誘導体に加え、当業者によ
く知られている標準酵素的方法を用いて酵素活性に及ぼ
す影響を測定する、invitro系で検査される。

【００４２】または、化合物のＲ−ＰＴＰase 活性に及
ぼす作用を生きた細胞または固定化細胞を用いて完全細
胞調製物中で、または生きた細胞または固定化細胞から
得られた膜画分中で測定する。この方法はタンパク質の
細胞外レセプター部分を介して作用する化合物およびタ
ンパク質の酵素部分に直接作用する化合物をスクリーニ
ングするのに有用である。トランスフェクトしたＣＯＳ
細胞またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞のように本発明のＲ−Ｐ
ＴＰase を多量に発現する、細胞またはそれらから得ら
れた膜調製物と被検化合物をインキュベートする。続い
て、当分野でよく知られている方法を用いて、細胞のホ
スホチロシンの量を測定する (Honegger, A. M.ら, Cel
l51:199-209 (1987); Margolis, B.ら, Cell 57:1101-1
107 (1989))。結果を、被検化合物の非存在下で得られ
た結果、またはＲ−ＰＴＰase の既知の活性化物質の非
存在下または存在下で得られた結果と比較する。このよ
うな研究において、チロシン・キナーゼの活性化物質の
存在下での被検化合物の作用もまた測定する。

【００４３】Ｒ−ＰＴＰase 活性を刺激する化合物はホ
スホチロシン量の実質的低下をもたらし、一方Ｒ−ＰＴ
Ｐase 活性を阻害する化合物はホスホチロシン量の実質
的増加をもたらす。

【００４４】例えば上皮細胞成長因子 (ＥＧＦ) や血小
板由来増殖因子 (ＰＤＧＦ) のレセプターのように、チ
ロシン・キナーゼである成長因子レセプターの場合、チ
ロシンリン酸化は細胞増殖および癌形成性形質転換と関
連している。脱リン酸化へ導くＰＴＰase の活性化は、
増殖を妨げるまたは阻害する逆の調節メカニズムとして
働き、癌に対する内在性調整メカニズムとして働くかも
しれない。従って、このレセプター／酵素系の変異また
は調節異常により、癌にかかりやすくなるかもしれな
い。

【００４５】インシュリン・レセプターもまたチロシン
・キナーゼであり、インシュリン・レセプターを担持す
る細胞でのチロシンのリン酸化は正常な生理学的機能と
関連するであろう。細胞増殖および癌の場合と対照的
に、Ｒ−ＰＴＰase の活性化はインシュリン作用を中和
するであろう。正常以下のＲ−ＰＴＰase レベルまたは
酵素活性は、正常な逆の調節メカニズムを除去するよう
に作用するであろう。しかしながら、さらに重要なこと
は恐らく、Ｒ−ＰＴＰase の活性過剰または不適切な活
性が細胞に対するインシュリンの作用を阻害または完全
に妨げることが予想され、 (インシュリン耐性型の) 糖
尿病を生じるであろう。従って糖尿病への罹病性はＲ−
ＰＴＰase の調節異常と関連している。

【００４６】従って、正常または変異Ｒ−ＰＴＰase 遺
伝子を同定する、または細胞または組織と関連したＲ−
ＰＴＰase の量または活性を測定する、本発明の方法
は、細胞のホスホチロシン代謝の変化と関連した癌、糖
尿病または他の疾患に対する罹病性を同定する方法とし
ての役割を果す。

【００４７】本発明は被験者の正常または変異Ｒ−ＰＴ
Ｐase の存在およびレベルを評価する方法を提供する。
個人のＲ−ＰＴＰase の非存在または、さらに一般的に
は低い発現性または、変異Ｒ−ＰＴＰase の存在は癌形
成性形質転換や癌の発生に対する罹病性の重要な予告と
しての役割を果す。または、恐らく負の調節に反応しな
い変異レセプター／酵素系によるか、または体内の刺激
性リガンド過多によるＲ−ＰＴＰase の過剰発現は糖尿
病に対する罹病性の重要な予告としての役割を果す。

【００４８】Ｒ−ＰＴＰase の種々の部分をコードする
オリゴヌクレオチド・プローブ (下記参照) を用いて、
Ｒ−ＰＴＰase をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列の
存在について被験者の細胞を検査する。好ましいプロー
ブは、本発明のＲ−ＰＴＰase −αまたは他のＲ−ＰＴ
Ｐase タンパク質の少なくとも４アミノ酸残基、好まし
くは少なくとも５アミノ酸残基をコードする核酸配列に
関するものであろう。そのようなプローブを用いて、定
性的または定量的アッセイを行う。例えば、ノーザン分
析 (下記実施例IIIとVI参照)を用いて、細胞または組織
調製物中のＲ−ＰＴＰase ｍＲＮＡの発現を測定する。

【００４９】このような方法は、選択的増幅法の採用に
より、個人から得られたＤＮＡが極めて少ない場合にも
使用できる。精製核酸フラグメントを増幅できる、組換
えＤＮＡ方法は長い間認められている。通常、その方法
は核酸フラグメントのＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの
導入、ベクターのクローン増幅、そして増幅核酸フラグ
メントの回収を必要とする。そのような方法の例は、Co
henら, (米国特許第4,237,224号) 、Sambrookら, Molec
ularCloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
(1989)により提供され、これらの文献は参照によりここ
に引用されるものとする。

【００５０】最近、そのような所望の核酸分子の濃度を
増加することができるin vitro酵素法が記載されてい
る。この方法は「ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン」すなわち「ＰＣＲ」と呼ばれる (Mu llis, Kら,Col
d Spring Harbor Symp. Quant.Biol. 51:263-273(198
6); Erlich, Hら, EP 50,424; EP 84,796, EP 258,017,
EP 237,362; Mullis, K., EP 201,184; Mullis, K.ら,
US 4,683,202; Erlich,H., US 4,582,788; and Saiki,
Rら, US 4,683,194) 。

【００５１】ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
は、特定の核酸配列が前もって精製されておらず、特定
の試料中に、ほんの１コピしか存在しない場合でさえ、
その配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。こ
の方法を用いて一本鎖ＤＮＡでもまたは二本鎖ＤＮＡで
も増幅できる。この方法の基本は、所望の核酸分子の鋳
型依存性、ポリメラーゼ媒介複製のプライマーとして働
く２本のオリゴヌクレオチド・プローブの使用を必要と
する。

【００５２】ＰＣＲ法の２本のオリゴヌクレオチド・プ
ローブの正確性はこの方法の成功を左右する。よく知ら
れているように、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は方向性を有
し、この方向性はその分子のホスフェート基の５'−３'
結合により与えられる。ＤＮＡまたはＲＮＡの配列は第
１配列の末端５' ホスフェート基と第２配列の末端３'
ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合の形成に
より連結されている。５' ヌクレオチド・トリホスフェ
ートを核酸分子の３' ヒドロキシル末端に付加すること
により、核酸分子のポリメラーゼ依存性増幅が進行す
る。従って、ポリメラーゼの作用により核酸分子の３'
末端が伸長する。ＰＣＲのオリゴヌクレオチド・プロー
ブの選択では、これらの固有の性質を利用する。ＰＣＲ
法のプローブのオリゴヌクレオチド・プローブは、増幅
を必要とする特定の核酸配列のフランキング配列と同じ
か、または相補となる配列を含むように選択される。

【００５３】さらに詳細には、「第一」プローブのオリ
ゴヌクレオチド配列は、それが所望の配列の３' 側に位
置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド形成でき
るように選択し、一方、「第二」プローブのオリゴヌク
レオチド配列は、それが所望の領域の５' 側に存在する
配列と同じオリゴヌクレオチド配列を含むように選択す
る。両プローブは３' ヒドロキシ基を保有し、従って核
酸合成のプライマーとして働く。

【００５４】ＰＣＲにおいて、反応条件はハイブリッド
形成と核酸重合に導く反応条件と二本鎖分子の変性を生
じる反応条件の繰り返しである。反応の第一段階におい
て、存在し得る、あらゆる二本鎖分子を変性させるため
に試料の核酸を一時的に熱し、続いて冷ます。続いて、
「第一」および「第二」のプローブを所望の核酸分子の
濃度よりはるかに高い濃度で試料に加える。試料をハイ
ブリッド形成と重合へ導く条件下でインキュベートする
場合、「第一」のプローブは増幅される配列の３' 側の
位置で試料の核酸分子にハイブリッド形成する。試料の
核酸分子が最初二本鎖だとしたら、「第二」のプローブ
は増幅が必要な配列の相補鎖である配列の３'側の位置
で核酸分子の相補鎖とハイブリッド形成する。ポリメラ
ーゼの添加後、「第一」および (核酸分子が二本鎖の場
合) 「第二」のプローブの３'末端が伸長される。「第
一」のプローブの伸長は、所望の核酸の正確な配列を有
するオリゴヌクレオチドの合成を生じる。「第二」のプ
ローブの伸長は、所望の核酸の相補鎖の正確な配列を有
するヌクレオチドの合成を生じる。

【００５５】ＰＣＲ反応は特定の核酸配列の指数的増幅
を可能にする。なぜなら「第一」のプローブの伸長産物
は「第二」のプローブの配列に相補となる配列を当然含
み、従って「第二」のプローブの伸長産物の生成のため
の鋳型としての役割を果す。同様に、「第二」のプロー
ブの伸長産物は「第一」のプローブの配列に相補となる
配列を当然含み、従って「第一」のプローブの伸長産物
の生成のための鋳型としての役割を果す。従って、重合
と変性を繰り返すことにより所望の核酸分子の濃度の幾
何級数的増加が達成される。ＰＣＲの概説はMullis, K.
B. (Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 51:263-27
3 (1986)); Saiki, R.K.,ら,(Bio/Technology 3:1008-1
012 (1985)); and Mullis, K.B.,ら (Moth. Enzymol. 1
55:335-350 (1987))に載っている。

【００５６】一実施態様において、本発明は自然界に存
在する哺乳動物のＲ−ＰＴＰase −αに関する。別の実
施態様において、本発明は組換え哺乳動物Ｒ−ＰＴＰas
e −αに関する。本発明の好ましいＲ−ＰＴＰase はヒ
ト起源である。本発明は、その分子が自然界で結合して
いる他のタンパク質を実質的に含まない自然界に存在す
る分子を提供する。「他のタンパク質または糖タンパク
質を実質的に含まない」とは、そのタンパク質が自然界
で結合している他のタンパク質や糖タンパク質の少なく
とも90％ (重量ベースで) 、所望により少なくとも99％
までもが除かれて精製されており、従って、それらを実
質的に含まないことを示す。それは、例えばＲ−ＰＴＰ
ase を含む細胞、組織または体液を、このタンパク質に
対して反応するモノクローナル抗体を担持する免疫吸着
カラムのような標準的タンパク質精製法にかけることに
より達成できる。アフィニティー精製の他の形態は、Ｐ
ＴＰase ドメインに結合する固相支持体またはレセプタ
ー・ドメインに結合するリガンドを利用する。または標
準的方法の組合わせ、例えば硫安沈澱、分子ふるいクロ
マトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーに
より精製を達成する。

【００５７】本発明の哺乳動物Ｒ−ＰＴＰase は様々な
細胞源または組織源から生化学的に精製されると解釈さ
れよう。自然界に存在するＲ−ＰＴＰase の調製のため
には哺乳動物の (特にヒト由来の) 胎盤または脳のよう
な組織が好ましい。

【００５８】または、Ｒ−ＰＴＰase の遺伝子は単離ま
たは合成され得るので、必要に応じてポリペプチドは原
核生物中で、または哺乳動物以外の真核生物中で哺乳動
物由来の他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に
含むことなしに合成することができる。本発明により意
図されているように、例えば、トランスフェクトされた
ＣＯＳ, ＮＩＨ−３Ｔ３またはＣＨＯ細胞のような哺乳
動物細胞中で生成された組換えＲ−ＰＴＰase −α分子
は自然界に存在するタンパク質配列または、その機能的
誘導体である。自然界に存在するタンパク質または糖タ
ンパク質が組換え法により生成される場合、そのタンパ
ク質が天然で結合している他のタンパク質および糖タン
パク質を実質的に含まない状態で提供される。

【００５９】また、固相上での所望の配列のポリペプチ
ドの合成およびその後の支持体からの分離についての方
法がよく知られている。

【００６０】別の実施態様において、本発明はＲ−ＰＴ
Ｐase の「機能的誘導体」を提供する。「機能的誘導
体」とはＲ−ＰＴＰase の「フラグメント」、「変異
型」、「類似体」、または「化学的誘導体」を意味し、
これらの用語は下記で定義される。機能的誘導体は、本
発明通りにその有用性を可能にする、例えば特異的抗体
への結合、ホスファターゼ酵素活性または細胞外ドメイ
ンのリガンドへの結合といった、Ｒ−ＰＴＰase の機能
の少なくとも一部を保持する。

【００６１】Ｒ−ＰＴＰase の「フラグメント」とは分
子の任意のサブセット、すなわち短かいペプチドを言
う。

【００６２】Ｒ−ＰＴＰase の「変異型」とは、ペプチ
ド全体またはそのフラグメントに実質的に類似している
分子を言う。当分野でよく知られている方法を用いて、
変異型ペプチドはその直接的化学合成により都合よく調
製される。

【００６３】または、ペプチドのアミノ酸配列変異型は
合成されたペプチドをコードするＤＮＡの変異により調
製される。そのような変異型は、例えば、アミノ酸配列
内の残基の欠失または挿入または置換を含む。最終的構
築物が所望の活性を保有するならば、最終構築物に到る
どんな欠失、挿入および置換の組合わせも行うことがで
きる。明らかに、変異型ペプチドをコードするＤＮＡ中
になされる変異はリーディング・フレームを変化させて
はならないし、好ましくは、第二のｍＲＮＡ構造をつく
り得る相補領域をつくってはならない (ヨーロッパ特許
公報EP第75,444号参照) 。

【００６４】遺伝子レベルで、これらの変異型はペプチ
ド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異
的突然変異誘発 (例えばAdelmanら, DNA 2:183 (1983))
により通常作製され、それにより変異型をコードするＤ
ＮＡを生成し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発
現させる (下記参照) 。変異型は非変異型ペプチドと同
じ定性的生物学的活性を通常は示す。

【００６５】Ｒ−ＰＴＰase の「類似体」とは、分子全
体またはそのフラグメントと実質的に類似した天然のも
のでない分子を言う。

【００６６】Ｒ−ＰＴＰase の「化学的誘導体」とは、
通常ペプチドの一部でない追加の化学的部分を含む。ペ
プチドの共有結合修飾は本発明の範囲に含まれる。ペプ
チドの標的アミノ酸残基と、選択された側鎖または末端
残基と反応できる有機誘導体化剤と、を反応させること
により、そのような修飾を分子に導入する。

【００６７】最も一般的には、システイニル残基をクロ
ロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなアルファ−ハ
ロアセテート (および相当するアミン類) と反応させ
て、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘
導体を生成する。システイニル残基はまたブロモトリフ
ルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ− (５−イ
ミドゾイル) プロピオン酸、クロロアセチル ホスフェ
ート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリ
ジル ジスルフィド、メチル２−ピリジル ジスルフィ
ド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメル
クリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロ
ベンゾ−２−オキサ−1,３−ジアゾールとの反応により
誘導体化される。

【００６８】ヒスチジル残基は、pH５.５−７.０でジエ
チルプロカーボネートとの反応により誘導体化される。
なぜならこの薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的だか
らである。パラブロモフェナシル ブロミドもまた有用
である；この反応は好ましくはpH６．０の０.１Ｍカコ
ジル酸ナトリウム中で行われる。

【００６９】リシニルおよびアミノ末端残基を無水コハ
ク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これら
の薬剤での誘導体化はリシニル残基の電荷を反対に変え
る作用を用する。アルファ−アミノ含有残基の誘導体化
のための他の好適な試薬はメチルピコリンイミデートの
ようなイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；
ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロ
ベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；2,４ペンタ
ンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナ
ーゼ触媒反応を含む。

【００７０】アルギニル残基は１または数個の従来の試
薬、そのなかでもフェニルグリオキサール、2,３−ブタ
ンジオン、1,２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒド
リンとの反応により修飾される。アルギニン酸基の誘導
体化は、グアニジン官能基の高いpKa のためにアルカリ
条件下で反応を行うことが必要である。さらに、これら
の試薬はリシンのアミノ基およびアルギニンのイプシロ
ン・アミノ基と反応するだろう。

【００７１】チロシル残基自体の特異的修飾は、芳香族
ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応
によりスペクトル標識をチロシル残基に導入することに
特別の関心を払って、鋭意研究された。最も一般的に
は、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタ
ンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３
−ニトロ誘導体を生成する。

【００７２】カルボキシル側基 (アスパルチルまたはグ
ルタミル) は、例えば１−シクロヘキシル−３− (２−
モルフォリニル− (４−エチル) カルボジイミドまたは
１−エチル−３− (４−アゾニア−4,４−ジメチルペン
チル) カルボジイミドのようなカルボジイミド (Ｒ'−
Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ') との反応により選択的に修飾する。
さらにアスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウ
ムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミ
ニル残基に変換される。

【００７３】グルタミニルおよびアスパラギニル残基は
しばしば脱アミド化されて対応するグルタミルおよびア
スパルチル残基になる。または、これらの残基は弱酸性
条件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形
態も本発明の範囲に入る。

【００７４】二官能性薬剤での誘導体化は水不溶性支持
体マトリックスまたは他の高分子担体へのペプチドの架
橋に有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば１,1
−ビス (ジアゾアセチル) −２−フェニルエタン、グル
タルアルデヒド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３,3'
−ジチオビス (スクシンイミジル−プロピオネート) の
ようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性
イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−1,８−
オクタンのような二官能性マレイミドを含む。メチル−
３−〔 (ｐ−アジドフェニル) ジチオ〕プロピオイミデ
ートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成で
きる光活性化可能な中間体を生成する。または、臭化シ
アン活性化炭水化物および米国特許第3,969,287号；3,6
91,016号；4,195,128号；4,247,642号；4,229,537号お
よび4,330,441号に記載されている反応性担体のような
反応性の水不溶性マトリックスをタンパク質固定化に使
用する。

【００７５】他の修飾はプロリンおよびリシンのヒドロ
キシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル
基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン
側鎖のα−アミノ基のメチル化 (T.E. Creighton, Prot
eins: Structure and Molecule Properties, W.H. Free
man & Co., San Francisco, pp.79-85 (1983))、Ｎ末端
アミンのアセチル化およびいくつかの場合においては、
Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を含む。

【００７６】そのような誘導体化部分は溶解度、吸収、
生物学的半減期その他を改善する。または、その部分は
タンパク質の望ましくない任意の副作用その他を除去ま
たは軽減する。そのような作用を媒介できる部分は、例
えば Remington'g Pharmaceutical Sciences, 16 th e
d., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) に記載
されている。

【００７７】本発明はまたＲ−ＰＴＰase のエピトー
プ、好ましくはＲ−ＰＴＰase −αのエピトープ、最も
好ましくはヒトＲ−ＰＴＰase−αのエピトープに特異
的な抗体、および細胞中、細胞または組織抽出物中また
は生物の体液中のＲ−ＰＴＰase の存在を検出するため
の、または量、濃度を測定するためのそのような抗体の
使用に関する。

【００７８】「抗体」の用語はポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体 (mAbs) 、キメラ抗体、および抗イデ
ィオタイプ (抗Ｉｄ) 抗体を含むと解される。

【００７９】ポリクローナル抗体は抗原で免疫化された
動物の血清から得られた抗体分子の不均質集団である。

【００８０】モノクローナル抗体は特定の抗原に対する
抗体の実質的均質集団である。ｍＡｂは当業者に知られ
ている方法により得られる。例えば、Kohler and Milst
ain,Nature 256:495-497 (1975) および米国特許第4,37
6,110号を参照。そのような抗体はＩｇＧ,ＩｇＭ, Ｉｇ
Ｅ, ＩｇＡ, ＧＩＬＤおよびその任意のサブクラスを含
む任意の免疫グロブリンクラスのものであってよい。本
発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマはin vitroまた
はin vivo で培養される。in vivo 生成されるｍＡｂが
高い抗体価を示すので現在における好ましい生成方法と
なっている。簡略に述べると、個々のハイブリドーマか
らの細胞をプリスタン感作ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内
に注入し、高い濃度の所望のｍＡｂを含む腹水液を生成
する。当業者によく知られているカラムクロマトグラフ
ィーを用いて、アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡ
ｂをそのような腹水液または培養物上清から精製する。

【００８１】キメラ抗体は、例えばマウスｍＡｂから得
られた可変領域とヒト免疫グロブリン不変領域を有する
もののような、異なる動物種に由来する異なる部分を有
する分子である。キメラ抗体およびその生成方法は当分
野で知られている（Cabillyら、Proc, Natl, Acad, sc
i. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison ら、Proc, Nat
l, Acad, Sci,USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne
ら、Nature 312 :643-646(1984); Cabillyら、ヨーロッ
パ特許出願第125023号（1984年11月14日公告); Neuberg
erら、Nature 314:268-270 (1985);Taniguchi ら、ヨー
ロッパ特許出願第171496号（1985年２月19日公告); Mor
rison ら、ヨーロッパ特許出願第173494号（1986年３月
５日公告); Neubergerら、ＰＣＴ出願 WO 86/01533 (19
86年３月13日公告); Kudo、ヨーロッパ特許出願第18418
7号（1986年７月11日公告); Morrison ら、ヨーロッパ
特許出願173494（1986年３月５日公告); Sahaganら、J.
Immunol, 137:1066-1074 (1986); Robinsonら、国際特
許公告PCT/US86/02269（1987年５月７日公告); Liu
ら、Proc, Natl, Acad, Soi, USA 84:3439-3443 (198
7);Sunら、Proc, Natl, Acad, Sci, USA 84:214-218 (1
987); Betterら、Science240:1041-1043 (1988))。これ
らの文献は参照によりここに引用されるものとする。

【００８２】抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は抗体の
抗原結合部位と一般に関連している特有の抗原決定基を
認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄを調製しよ
うとするｍＡｂで、ｍＡｂの起源と同じ種および遺伝子
型（例えばマウス株）の動物を免疫化することにより調
製される。免疫化された動物は免疫抗体のイディオタイ
プ決定基を認識し、これに応答して、これらのイディオ
タイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を生成する。

【００８３】抗Ｉｄ抗体もまたさらに別の動物中で免疫
応答を誘発する「免疫原」として用いられ、いわゆる抗
−抗Ｉｄ抗体を生成する。抗−抗Ｉｄは抗Ｉｄを誘発し
た最初のｍＡｂとエプトープが同じである。従ってｍＡ
ｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることに
より、同じ特異性を有する抗体を発現する他のクローン
を同定することが可能である。

【００８４】従って、本発明のＲ−ＰＴＰase に対して
生成されたｍＡｂはＢＡＬＢ／ｃマウスのような好適な
動物中で抗Ｉｄ抗体を誘発するために用いられる。その
ような免疫マウスからの脾臓細胞を用いて抗Ｉｄ ｍＡ
ｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを生成する。さら
に、抗Ｉｄ ｍＡｂをキーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（ＫＬＨ）のような担体に結合させ、別のＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスを免疫化するのに用いる。これらのマウス
からの血清は、Ｒ−ＰＴＰase エピトープに特異的な最
初のｍＡｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含むだ
ろう。

【００８５】従って、抗Ｉｄ ｍＡｂは、Ｒ−ＰＴＰase
−αのような、評価しようとするエピトープに構造的に
類似している、独自のイディオタイプエピトープすなわ
ち「イディオトープ」を有している。

【００８６】「抗体」の用語もまた完全な分子およびそ
のフラグメント、例えば抗原に結合可能なＦabおよびＦ
(ab')₂、を両方とも含むことを意味する。ＦabおよびＦ
(ab')₂フラグメントは完全な抗体のＦcフラグメントを
欠いており、循環系からより速く消失し、完全な抗体よ
りも非特異的組織結合が少ない（Wahlら、J. Nucl, Me
d, 21: 316-325 (1983))。

【００８７】本発明において有用な抗体のＦabとＦ(a
b')₂および他のフラグメントが、完全な抗体分子に関し
てここに開示された方法により、Ｒ−ＰＴＰase の検出
および定量化に用いられることが認識されよう。そのよ
うなフラグメントは、パパイン（Ｆabフラグメントを生
成する）またはペプシン（Ｆ(ab')2フラグメントを生成
する）のような酵素を用いてタンパク質分解切断により
通常生成される。

【００８８】抗体が分子と特異的に反応して、それによ
り分子を抗体に結合させることができる場合、抗体は分
子に「結合できる」と言われる。「エピトープ」の用語
は、抗体により結合される任意の分子の部分をさすもの
と解され、またその抗体により認識されるものでもあ
る。エピトープまたは「抗原決定基」は通常アミノ酸や
糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置から成
り、特別の三次元構造特性および特別の電荷特性を有す
る。

【００８９】「抗原」は抗体により結合される分子また
は分子の部分であり、さらに動物にその抗原のエピトー
プに結合可能な抗体の生成を誘発できる。抗原は１また
は１以上のエピトープを有する。上述の特異的反応と
は、非常に選択的に抗原がその対応する抗体と反応し、
他の抗原により誘起される多数の他の抗体とは反応しな
いことを指すと解される。

【００９０】本発明に有用な抗体または抗体のフラグメ
ントは、Ｒ−ＰＴＰase タンパク質を発現する細胞の存
在を定量的または定性的に検出するために用いられる。
これは、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光
定量検出と共に蛍光標識抗体（下記参照）を使用する免
疫蛍光法により達成される。

【００９１】免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡における
ようにＲ−ＰＴＰaseのin situ検出のために、本発明に
有用な抗体（またはそのフラグメント）を、組織学的に
使用しうる。患者から組織学的標本を取り出し、本発明
の標識抗体をそのような標本に供給することにより、in
situ 検出は達成される。標識抗体（またはフラグメン
ト）を生物学的試料に加えることにより、または重層す
ることにより抗体（またはフラグメント）を供給するこ
とが好ましい。そのような方法の使用により、Ｒ−ＰＴ
Ｐase の存在だけでなく検査組織上のその分布もまた決
定することが可能である。本発明を用いることにより、
当業者は、そのような in situ検出を達成するように広
く様々な組織学的方法（例えば染色法）のどれも改変可
能であることを容易に考え及ぶであろう。Ｒ−ＰＴＰas
e のためのそのようなアッセイは、通常Ｒ−ＰＴＰase
を同定できる検出用に標識された抗体の存在下で生物学
的試料、例えば生物学的体液、組織抽出物、リンパ球ま
たは白血球のような新しく収穫した細胞、または組織培
養でインキュベートされている細胞をインキュベート
し、当分野でよく知られている数多くの方法のうちの任
意のものを用いて抗体を検出することから成る。

【００９２】生物学的試料は、ニトロセルロースのよう
な固相支持体または細胞、細胞粒子または可溶性タンパ
ク質を固定化できる他の固相支持体で処理する。続い
て、支持体を好適な緩衝液で洗浄し、続いて検出用に標
識したＲ−ＰＴＰase 特異的抗体で処理する。続いて、
固相支持体を２回目に緩衝液で洗浄し未結合抗体を取り
除く。続いて、該固相支持体上の結合標識物の量を従来
の方法により検出する。

【００９３】「固相支持体」とは抗原または抗体に結合
可能な任意の支持体を意図する。よく知られている支持
体または担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラー
ゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルア
ミド、斑れい岩および磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発
明の目的のためにある程度可溶性であっても、不溶性で
あってもよい。支持体材料は、結合分子が抗原または抗
体に結合できる限り、事実上あらゆる可能な構造的形状
をとり得る。従って、支持体形状はビーズのように球
体、試験管の内面のようにまたは棒の外面のように円筒
状である。または、その表面はシート、テスト帯片その
他のように平らである。好ましい支持体はポリスチレン
ビーズを含む。当業者は抗体または抗原を結合するため
に他の多くの好適な担体を知っていようし、またはそれ
らを通常の実験で用いることにより確認できるであろ
う。

【００９４】所定のロットの抗Ｒ−ＰＴＰase の結合活
性はよく知られた方法により測定できる。当業者は通常
の実験を使用することにより各測定の最適アッセイ条件
を決定することができるだろう。

【００９５】特定の状況に通常用いられるまたは必要と
される洗浄、攪拌、振とう、ろ過等の他の工程をアッセ
イに加えてもよい。

【００９６】Ｒ−ＰＴＰase 特異的抗体を検出用に標識
する方法の一つはその抗体を酵素イムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）に用いる酵素に結合することである。その後適切な
基質にさらされた場合、この酵素は、例えば分光光度
計、フルオロメトリーまたは可視手段により検出可能な
化学部分を生成するように、基質と反応することにな
る。抗体を検出用に標識するために用いられる酵素は、
マレート・デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカス・ヌ
クレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵
母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロ
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオース・ホスフ
ェート・イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリ・ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコ
ース・オキシダーゼ、ベータ・ガラクトシダーゼ、リボ
ヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ
およびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに
限定されない。酵素に対して発色性基質を用いる比色法
により検出は達成される。検出はまた、同じ様に調製さ
れた標準と基質の酵素反応の程度を視覚的に比較するこ
とにより達成される。

【００９７】検出は、様々な他のイムノアッセイのどれ
を用いても達成される。例えば、抗体または抗体フラグ
メントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰaseを検出すること
が可能である（たとえば、ここに参照により引用され
る、Work, T.S.ら、Laboratory Technigues and Bioche
mistry in Molecular Biology, North Holland Publish
ing Company, New York,1978 を参照）。放射性アイソ
トープはガンマ・カウンターまたはシンチレーション・
カウンターまたまオートラジオグラフィーのような方法
により検出できる。

【００９８】抗体を蛍光化合物で標識することも可能で
ある。蛍光標識された抗体を適正な波長の光にさらした
場合、その存在が蛍光によりすぐに検出される。なかで
も最も一般に用いられる蛍光標識化合物は、フルオレセ
イン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリト
リン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタ
ルアルデヒドおよびフルオレサミンである。

【００９９】抗体はまた蛍光発光金属、例えば¹⁵²Euま
たは他のランタニド系のものを用いて検出用に標識する
ことができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン
五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）のようなキレート化剤を用いて抗体に付着させ
る。

【０１００】抗体はまたそれを化学発光化合物と結合さ
せることにより検出用に標識できる。続いて化学発光標
識抗体の存在を化学反応中に起る発光の存在を検出する
ことにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の
例はルミノール、イソルミノール、theromaticアクリジ
ニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およ
びシュウ酸エステルである。

【０１０１】同様に、生物発光化合物を本発明の抗体を
標識するために用いてもよい。生物発光は、触媒タンパ
ク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系にみ
られる化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在
は、発光の存在を検出することにより測定される。標識
の目的で重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフ
ェラーゼおよびエクオリンである。

【０１０２】本発明の抗体分子は「２サイト」または
「サンドイッチ」アッセイとしても知られる、イムノメ
トリックアッセイに有用なように適合させ得る。通常の
イムノメトリックアッセイでは、ある量の非標識抗体
(または抗体のフラグメント) を固相支持体に結合さ
せ、ある量の検出可能に標識した、可溶性抗体を加え
て、固相抗体、抗原および標識抗体との間で形成された
三成分複合体の検出および／または定量化を可能にす
る。

【０１０３】通常の、かつ好ましいイムノメトリックア
ッセイは、固相に結合された抗体を最初に検査される試
料と接触させて、二成分から成る固相抗体−抗原複合体
の形成により試料から抗原を抽出する、「フォーワード
(forward) 」アッセイを含む。適切なインキュベーショ
ン期間の後、固相を洗浄し、未反応の抗原 (もしあれ
ば)を含む液体試料の残渣を取り除き、続いて未知の量
の標識抗体(「リポーター分子」として機能する) を含
む溶液と接触させる。標識抗体が非標識抗体により固相
と結合した抗原と複合体形成する２回目のインキュベー
ション期間の後、固相は２回目の洗浄をして未反応標識
抗体を取り除く。

【０１０４】本発明の抗原にも有用である別の型の「サ
ンドイッチ」アッセイでは、いわゆる「同時」および
「逆」アッセイを用いる。同時アッセイは固相支持体に
結合された抗体と標識抗体との両方が検査される試料に
同時に加えられる、１回のインキュベーション・ステッ
プを必要とする。インキュベーション終了後、固相を洗
浄し、液体試料および未複合化標識抗体の残渣を取り除
く。続いて、固相支持体と結合した標識抗体の存在を、
従来の「フォーワード」サンドイッチアッセイでなされ
るように測定する。

【０１０５】「逆」アッセイでは、最初に標識抗体の溶
液を液体試料へ添加し、適当なインキュベーション期間
の後に固相に結合した非標識抗体を添加する段階的添加
を用いる。２度目のインキュベーション後、固相を従来
の方法で洗浄し、検査される試料の残渣および未反応標
識抗体の溶液を固相から取り除く。続いて固相に結合し
た標識抗体の測定は「同時」および「フォーワード」ア
ッセイのように測定される。

【０１０６】被験者の正常に機能するＲ−ＰＴＰase の
存在は、直接酵素アッセイを用いて、チロシンホスファ
ターゼ活性について検査することもできる。酵素活性の
正確な測定を可能にする精製された酵素を用いて、また
は正味のホスフォチロシンレベルが測定される膜調製物
または完全細胞を用いて、そのような生化学測定をinvi
tro で行う。

【０１０７】本発明の別の実施態様において、Ｒ−ＰＴ
Ｐase 分子をコードするＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ配
列を発現する方法が提供される。当業者は、過度な実験
をすることなく、本発明の遺伝子配列およびオリゴヌク
レオチドを用いて、ここで記載されているＲ−ＰＴＰas
e 分子に相同の配列を有する、ヒトまたは他の哺乳動物
種の別のＰＴＰase 分子を同定しクローン化する方法が
わかるであろう。さらに、本発明の遺伝子構築物の操作
により、Ｒ−ＰＴＰase のトランスメンブランおよび触
媒部分に特定のリガンド結合レセプター・ドメインをグ
ラフトしてキメラ分子を生成することができる。そのよ
うなキメラ分子の例としては、レセプターが上皮細胞成
長因子レセプター、線維芽細胞成長因子レセプター等で
あるＲ−ＰＴＰase を含む。遺伝子工学的に操作された
キメラ・レセプターは当分野で知られている (例えばRi
edel, H.ら, Nature 324:628-670 (1986) を参照) 。

【０１０８】Ｒ−ＰＴＰase −α、その機能的誘導体、
および記載されているキメラ分子をコードする遺伝子構
築物は遺伝子療法に用いられる。疾患を起こす、異常ま
たは機能不全Ｒ−ＰＴＰase は正常のＲ−ＰＴＰase で
トランスフェクトされた所望の系統の細胞 (例えば造血
細胞) の注入により置換される。また、あるいは、さら
に、所定のリガンド (例えばＥＧＦ) に対するレセプタ
ーを有するキメラＲ−ＰＴＰase を担持する細胞はその
ような遺伝子療法に用いられる。

【０１０９】本発明の組換えＤＮＡ分子は、例えばＤＮ
ＡまたはＲＮＡ合成、より好ましくは組換えＤＮＡ法の
適用のような種々の方法のうちのどれによっても生成さ
れる。そのような分子を合成する方法は、例えば Wu,
R.,ら (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-
141 (1978))により開示されている。上記方法により組
換え分子を構築する方法はSambrookら (上記) により開
示されている。

【０１１０】本発明の組換え分子の３' 末端は、それが
重合に不向きになるように処理することが好ましい。そ
のような処理は、化学的方法により末端をブロックする
か、または末端塩基がポリメラーゼ作用を立体的に妨げ
るようにそれらを変更することにより達成される。好ま
しい実施態様において、そのような処理は、例えば３'
末端を固相支持体 (例えば、ガラス、プラスチック、ラ
テックス等) に結合させて、それを固定化することによ
り達成される。支持体はどのような形態でもよい (すな
わちシート、棒、球体、卵形等) 。そのような固定化の
方法は当業者によく知られている。最も好ましい実施態
様において、組換え分子の３' 末端部は固相支持体に共
有結合で結合される。スペーサー領域は、（１）それが
組換え分子のどのような機能または特性も立体的に妨害
せず、そして（２）スペーサー領域の配列がアッセイの
ハイブリッド形成または重合反応に関与しない限り、固
相支持体から外方向にプローブを伸長させるために用い
られる。通常、数個の、好ましくは数多くのそのような
組換え分子を支持体に固定化することが望ましい。

【０１１１】Ｒ−ＰＴＰase の一部に相当するオリゴヌ
クレオチドは、そのようなタンパク質をコードする遺伝
子の存在をスクリーニングするために、そしてＲ−ＰＴ
Ｐase 遺伝子のクローニングに有用である。そのような
オリゴヌクレオチドを合成する方法は、例えばWu, R.,
ら (Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141
(1978))に開示されている。

【０１１２】タンパク質分子は臭化シアンまたはパパイ
ン、キモトリプシン、トリプシン等のようなプロテアー
ゼでフラグメント化される(Oike, Y.,ら, J. Biol. Che
m. 257:9751-9758 (1982); Liu, C.,ら,Int. J. Pept.
Protein Res. 21:209-215 (1983))。遺伝暗号は縮重す
るので、１以上の暗号が特定のアミノ酸をコードするの
に用いられる (Watson, J.D., In: Molecular Biology
of the Gene, 4th Ed., Benjamin/Cummings Publishin
g Co., Inc.,Menlo Park, CA (1987))。遺伝暗号を用い
て、１またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドが同
定され、その各々はアミノ酸をコードし得るであろう。
事実、特定のオリゴヌクレオチドが実際のＸＸＸコード
配列を構成するという可能性は、異常な塩基対合関係お
よび特定のコドンが実際に真核細胞で (特定のアミノ酸
をコードするために) 用いられる頻度を考慮することに
より推定される。そのような「コドン使用規則」は Lat
he, R., ら, J. Molec. B iol. 163:1-12 (1985)によ
り開示されている。Latheの「コドン使用規則」を用い
て、Ｒ−ＰＴＰase をコードできる、理論上の「最も可
能性のある」ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌク
レオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを同定する。

【０１１３】時々、アミノ酸配列は単一のオリゴヌクレ
オチドでのみコードされるが、しばしばアミノ酸配列は
１組の類似のオリゴヌクレオチドのどれかによりコード
される。重要なことは、この組の全てのメンバーはペプ
チドフラグメントをコードできるオリゴヌクレオチドを
含み、従って、ペプチドフラグメントをコードする遺伝
子と同じオリゴヌクレオチド配列を含み得るが、その組
のひとつのメンバーだけが遺伝子のヌクレオチド配列と
同じヌクレオチド配列を含むことである。このメンバー
はその組の中に存在し、その組の他のメンバーの存在下
でさえＤＮＡとハイブリッド形成できるので、単一のオ
リゴヌクレオチドを用いてペプチドをコードする遺伝子
をクローンするのと同じ方法で、分画化してない組のオ
リゴヌクレオチドを用いることが可能である。

【０１１４】Ｒ−ＰＴＰase フラグメントをコードでき
る、理論上の「最も可能性の高い」配列を含むオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組を用いて、
「最も可能性の高い」配列または配列の組にハイブリッ
ド形成できる、相補オリゴヌクレオチドの配列またはオ
リゴヌクレオチドの組を同定する。そのような相補配列
を含むオリゴヌクレオチドは、Ｒ−ＰＴＰase 遺伝子を
同定、単離するプローブとして用いられる (Sambrook
et al., 上記) 。

【０１１５】Ｒ−ＰＴＰase 遺伝子のフラグメントをコ
ードしうる好適なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドの組 (または、そのようなオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチドの組に相補的なもの) は同定
され (上記方法を用いて) 、合成され、そして当分野で
知られている方法によりＤＮＡまたは最も好ましくはＲ
−ＰＴＰase 遺伝子を発現できる細胞から得られたｃＤ
ＮＡ調製物とハイブリッド形成される。「最も可能性の
高い」Ｒ−ＰＴＰase ペプチドをコードする配列に相補
的な一本鎖オリゴヌクレオチド分子は当業者によく知ら
れている方法を用いて合成される (Belagaje, R., ら,
J. Biol. Chem. 254:5765-5780 (1979);Maniatis, T.,
ら, In: Molecular Mechanigms in the Controlof Gene
Expresgion, Nierlich, D.P., ら, Eds., Acad. Pers
s,NY (1976); Wu, R.,ら, Prog. Nucl. Acid Res, Mole
c. Biol. 21:101-141 (1978); Khorana, R.G., Scienc
e 203:614-625 (1979)) 。さらに、ＤＮＡ合成は自動合
成機の使用により達成される。核酸ハイブリッド形成の
方法はSambrookら (上記) 、およびHaymes, B.D., ら(I
n: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approac
h, IRL Press, Washington, DC (1985)) 、により開示
され、これらの文献は、ここに参照により引用されるも
のとする。例えば上記のような技法、またはそれに類似
の技法はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ (Hsu, L.C.,
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771 -3775 (198
5)) 、フィブロネクチン(Suzuki, S.,ら，EMBO J. 4:25
19-2524 (1985))の遺伝子、ヒトエストロゲンレセプタ
ー遺伝子 (Walter, P., ら, Proc.Natl. Acad. Sci. US
A 82:7889-7893 (1985))、組織型プラスミノーゲンア
クチベーター (Pennlca, D.,ら, Nature 301:214-221
(1983))およびヒト出産期胎盤アルカリホスファターゼ
相補ＤＮＡ (Kam, W.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:8715-8719 (1985)) のクローニングを可能にするこ
とに成功した。

【０１１６】Ｒ−ＰＴＰase 遺伝子をクローニングする
別の方法において、発現ベクターのライブラリーがＤＮ
Ａまたはさらに好ましくはｃＤＮＡ (Ｒ−ＰＴＰase を
発現できる細胞からの) を発現ベクターにクローニング
することにより調製される。続いて、ライブラリーを、
抗Ｒ−ＰＴＰase 抗体に結合し、Ｒ−ＰＴＰase または
そのフラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードできるヌクレオチド配列を有するタンパク
質を発現することができるメンバーを選ぶためにスクリ
ーニングする。この実施態様において、ＤＮＡまたはさ
らに好ましくはｃＤＮＡをＲ−ＰＴＰase タンパク質を
発現できる細胞から抽出、精製する。精製したｃＤＮＡ
をフラグメント化し (剪断、エンドヌクレアーゼ消化等
により)ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを
生成する。続いてメンバーの各々が唯一のクローン化Ｄ
ＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターの
ゲノムライブラリーを生成するために、このプールから
のＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを発現するベクタ
ーにクローン化する。

【０１１７】「発現ベクター」とはベクターにクローン
化されたＤＮＡ (またはｃＤＮＡ)分子を発現でき、そ
れによりポリペプチドまたはタンパク質を生成できるベ
クター (適切な転写および／または翻訳制御配列の存在
により) である。クローン化配列の発現は発現ベクター
が適切な宿主細胞に導入された時に起る。原核生物発現
ベクターを用いる場合、適切な宿主細胞はクローン化配
列を発現できる任意の原核生物細胞であろう。同様に、
真核生物発現ベクターを用いる場合、適切な宿主細胞は
クローン化配列を発現できる任意の真核生物細胞であろ
う。重要なことは、真核生物ＤＮＡは介在配列を含み、
そのような配列が原核生物細胞で正しくプロセシングで
きないので、原核生物ゲノム発現ベクター・ライブラリ
ーを生成するためにはＲ−ＰＴＰase を発現できる細胞
からのｃＤＮＡを使用することが好ましい。ｃＤＮＡを
調製する方法、ゲノムライブラリーを生成する方法はSa
mbrookらの上記により開示されている。

【０１１８】本発明のＲ−ＰＴＰase をコードするＤＮ
Ａ配列またはその機能的誘導体は、ライゲーションのた
めの平滑末端化または粘着末端化末端、適切な末端を生
成するための制限酵素消化、適切になるように粘着末端
部の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホ
スファターゼ処理、および適切なリガーゼでのライゲー
ションを含む従来の方法に従ってベクターＤＮＡと再結
合される。そのような操作の技術はSambrookらの上記に
より開示され、当業者によく知られている。

【０１１９】ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写お
よび翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、そし
てそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列と「操作可能な連結」をしているならば、ポリ
ペプチドを「発現できる」と言われる。操作可能な連結
とは、調節ＤＮＡ配列と発現を求められるＤＮＡ配列が
遺伝子発現を可能にするように接続されている連結であ
る。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種々に
生物により異なり、原核生物では( ＲＮＡ転写の開始を
指示する) プロモーターおよび、ＲＮＡに転写された場
合にタンパク質合成の開始を知らせるＤＮＡ配列の両方
を含むプロモーター領域を一般に含む。そのような領域
は、例えばTATAボックス、キャップ配列、CAAT配列等の
転写や翻訳の開始に必要なこれらの５' 非コード配列を
通常含む。

【０１２０】必要に応じて、タンパク質をコードする遺
伝子配列の３' 非コード領域を上記方法により得る。こ
の領域はターミネーションおよびポリアデニレーション
のようなその転写終了調節配列を保持する。従って、タ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列に天然では隣接する
３' 領域を保持することにより、転写終了シグナルが提
供される。転写終了シグナルが発現宿主細胞中で十分に
機能しない場合は、宿主細胞で機能する３' 領域が置換
される。

【０１２１】２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）
フレームシフト変異の導入を生じない、（２）Ｒ−ＰＴ
Ｐase 遺伝子配列の転写を指示するプロモーター領域配
列の能力を妨げない、または（３）プロモーター領域配
列により転写されるＲ−ＰＴＰase 遺伝子配列の能力を
妨げない、ならば２つのＤＮＡ配列 (例えばプロモータ
ー領域配列およびＲ−ＰＴＰase をコードする配列) は
操作可能な連結であると言える。プロモーター領域は、
プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写に作用できるなら
ばＤＮＡ配列と操作可能な連結であろう。従って、タン
パク質を発現するためには、適切な宿主により認識され
る転写および翻訳シグナルが必要である。

【０１２２】プロモーターはＲＮＡポリメラーゼに結合
でき、「操作可能な連結」核酸配列の転写を促進できる
二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ここで用いられ
ているように、「プロモーター配列」はＲＮＡポリメラ
ーゼにより転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖上にみら
れるプロモーターの配列である。「プロモーター配列相
補」とはその配列が「プロモーター配列」の相補である
核酸分子である。従って、一本鎖「プロモーター配列相
補」に隣接するプライマーＤＮＡまたはＲＮＡの伸長ま
たは「プロモーター配列」の伸長後に、その伸長が「プ
ロモーター配列」または「プロモーター配列相補」の方
向へ進行するならば機能的プロモーターを含む二本鎖分
子が生成される。この機能的プロモーターは、（「プロ
モーター配列相補」を含む分子の鎖ではなく）「プロモ
ーター配列」を含む二本鎖分子の鎖に操作可能な連結を
している核酸分子の転写を指示する。

【０１２３】いくつかのＲＮＡポリメラーゼはそのよう
なプロモーターに高い特異性を示す。バクテリオファー
ジＴ７, Ｔ３およびＳＰ−６のＲＮＡポリメラーゼは特
によく特徴づけられ、高いプロモーター特異性を示す。
これらＲＮＡポリメラーゼの各々に特異的なプロモータ
ー配列もまたポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡ鋳型の二本鎖
の一本鎖だけを利用する (すなわち転写) ように指示す
る。どの鎖が転写されるかの選択は、プロモーター配列
の方向性により決定される。ＲＮＡは、３' ヒドロキシ
ル末端にヌクレオチド５'ホスフェートを加えることに
より酵素的に重合されるだけなので、この選択が転写の
方向を決定する。

【０１２４】核酸分子の２つの配列は、両配列が同じＲ
ＮＡ転写物に転写されるかまたはＲＮＡ転写物が１配列
に始まり２番目の配列に伸長するような仕方でそれらが
互いに連結している場合、「操作可能な連結」であると
言える。従って、プロモーター配列およびＤＮＡまたは
ＲＮＡの他の「第２」配列のような２つの配列は、プロ
モーター配列で始まる転写が操作可能な連結をした第２
配列のＲＮＡ転写物を生成する場合、操作可能な連結で
ある。「操作可能な連結」であるためには、２配列が互
いに直接隣接している必要はない。

【０１２５】従って、上に示しているように、プロモー
ターとして機能するためには、プロモーター配列は二本
鎖分子として存在しなければならない。本発明の目的の
ために、機能的プロモーター配列の二本鎖を「転写」鎖
および「相補」鎖と呼ぶ。「転写」鎖はＲＮＡポリメラ
ーゼにより転写される二本鎖のうちのその鎖である (す
なわち転写の鋳型として働く) 。「相補」鎖とは、「転
写」鎖に相補な配列を有し、転写が行なわれるためには
存在してかつ「転写」鎖とハイブリッド形成しなければ
ならない鎖である。従って、プロモーター配列の「転
写」鎖が２番目の配列と操作可能な連結をしている場
合、「転写」鎖の「相補」鎖とのハイブリッド形成はポ
リメラーゼ存在で「転写」鎖の転写を生じて、鋳型とし
て「転写」鎖の配列を用いてＲＮＡ転写物を生成する。

【０１２６】本発明のプロモーター配列は原核生物、真
核生物またはウイルスである。好適なプロモーターは抑
制可能であるかまたはさらに好ましくは構成的である。
好適な原核生物プロモーターの例は、Ｔ４ (Malik, S.
ら, J. Biol. Chem. 263:1174-1181 (1984);Rosenberg,
A.H.ら, Gene 59:191-200 (1987); Shinedling, S.ら,
J. Molec. Biol. 195;471-480 (1987); Hu, M. ら, Ge
ne 42:21-30 (1986))、Ｔ３, Ｓｐ６，およびＴ７ (Cha
mberlin, M.ら, Nature 228:227-231 (1970);Bailey,
J.N,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:2814-28
18 (1983); Davanloo, P.ら,Proc. Natl. Acad. Sci.
(U.S.A.) 81:2035-2039 (1984))ポリメラーゼを認識で
きるプロモーター；バクテリオファージラムダのＰR と
ＰL プロモーター (The Bacteriophage Lambda, Hershe
y, A.D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Sprin
g Harbor, NY (1973);ラムダIIHendrix, R.W., Ed.,Col
d Spring Harbor, Press, Cold Spring Harbor, NY (19
80); E.coliのtrp,recA, ヒートショックおよびlaczプ
ロモーター；α−アミラーゼ (Ulmanen, I.,ら, J. Bac
teriol. 162:176-182 (1985) およびB.サブチリスのσ-
28-特異的プロモーター(Cilman, M.Z.,ら, Gene 32 :11
-20 (1984)); バチルスのバクテリオファージのプロモ
ーター (Gryozan, T.J.,In: The Molecular Biology of
the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982));ス
トレプトミセスのプロモーター(Ward, J.M.,ら, Mol. G
en. Genet, 203: 468-478 (1986));バクテリオファージ
ラムダの intプロモーター；pBR322のβ−ラクタマーゼ
遺伝子の blaプロモーターおよびpPR325のクロラムフェ
ニコールアセチルトランスファラーゼ遺伝子の CATプロ
モーター等を含む。

【０１２７】原核生物プロモーターは、Glick, B.R.
(J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo,
Y. (Biochimie 68:505-516(1986)); Watson, J.D. ら,
(In:Molecular Biology of the Gene, Fourth Editio
n, Benjamin Cummins, Menlo Park, CA (1987)); およ
びGottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (198
4))により概説されている。好ましい原核生物プロモー
ターはマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター
(Hamer, D.,ら, J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (198
2)); ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター (McKnight,
S., Cell 31:355-365 (1982));ＳＶ初期プロモーター
(Benoist, C.,ら, Nature (London) 290:304-310 (198
1));および酵母 gal４遺伝子プロモーター(Johnston,
S.A., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)71:6971-6975
(1982);Silver, P.A., ら, Proc. Natl. Acad. Sci.(U
SA) 81:5951-5955 (1981))を含む。上記の参照文献はこ
こに参照文献として編入されている。

【０１２８】強力なプロモーターが好ましい。そのよう
な好ましいプロモーターの例は、Ｔ３、ＳＰ６およびＴ
７ポリメラーゼを認識するプロモーター、バクテリオフ
ァージラムダのＰL プロモーター、recAプロモーターお
よびマウスモタロチロネインＩ遺伝子のプロモーターで
ある。Ｒ−ＰＴＰase の真核生物発現のために最も好ま
しいプロモーターは、pLSVベクター（Livneh, E., ら,
(1986) J. Biol. Chem. 261, 12490-12497) 中で転写を
うながすSV40プロモーターであるる。そのようなポリメ
ラーゼ認識部位の配列はWatson, J.D.ら, (In: Molecul
ar Biology ofthe Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cu
mmings Publishing Co., Inc., MenloPark, CA, (198
7))により開示されている。

【０１２９】本発明を一般的に記載したが、本発明は下
記の実施例を参考にすることにより、より容易に理解さ
れるであろう。しかし実施例は説明のために提供してい
るのであり、特にことわらない限り、本発明を限定する
ことを意図するものではない。

【０１３０】

【実施例】実施例Ｉ マウスＲ−ＰＴＰase −α ｃＤＮＡクローンの単離と
分析 １．ライブラリー・スクリーニング ラムダｇｔ１１中のＢＡＬＢ／Ｃマウス脳ｃＤＮＡライ
ブラリー（Ｄｒ．Ｙ．Ｃｉｔｒｉから恵与された）を、
緩和な緊縮条件（６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ
ｓ、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．
５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１ｍｇ／ｍｌ サケ精子
ＤＮＡ、ハイブリダイゼーション温度５０℃）で、あら
かじめランダムプライミング法で³²Ｐ標識しておいたヒ
トＴ２００糖タンパク質（Ralph, S.J. et al., EMBO
J. 6:1251-1257, 1987）の細胞内およびトランスメンブ
ランドメインを表す２４００ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ａｃｃ
Ｉ断片をプローブとして用いてスクリーニングした。６
ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で洗浄を行っ
た。１０⁶個のクローンから５１個のポジティブなクロ
ーンを取り出し、選択し、制限酵素マッピングにより特
徴決定した。最長の挿入物を含むファージクローン（ラ
ムダ−１０９）から単離した０．９５、１．６および
０．３ＫｂのＥｃｏＲＩ断片をブルースクリプト（Ｂｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳプラアスおよびマイナスベクタ
ー中にサブクローニングした。クローン化ｃＤＮＡ断片
とプラスミドベクターのポリリンカー領域に共通な制限
部位を使用することにより、一連のｎｅｓｔｅｄ ｄｅ
ｌｅｔｉｏｎを作成した。使用した個々の制限部位を図
１ｂに示す。これら構築物から１本鎖ＤＮＡを調製し、
ジデオキシヌクレオチド鎖末端法（シーケナーゼ、Ｕｎ
ｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用
いる配列決定の鋳型として用いた。両方の鎖の全ての領
域を配列決定した。組換えファージ中のＥｃｏＲＩ断片
の相対的順序および方向性は制限酵素マッピングにより
決定した。異なるＥｃｏＲＩ断片が、ライブラリー構築
過程で一緒にライゲーションした無関係なｃＤＮＡ断片
に対応しないことを確認するために、別の独立した単離
物であるラムダ−１１３についても制限酵素マッピング
を実施した。 ２．結果 脳組織は、多くの型のチロシンキナーゼに富むことが既
に証明されており、最近の生化学的検証により複数の型
のＰＴＰase 活性の存在も示唆されている（Jones, S.
W. et al., J. Biol. Chem., 264:7747-7753, 1989）。
新しいレセプター型ＰＴＰase を検索するために、本発
明者らは、２つの一列に並ぶＰＴＰaseドメインを含む
ヒトＣＤ４５の細胞内ドメインをハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いて、マウス脳ｃＤＮＡライブラリ
ーを低緊縮条件でスクリーニングした（Tonks, N.K. et
al., 前出;Charbonneau, H. et al., 前出; Ralph, S.
J.et al., 前出）。クロスハイブリダイゼーションおよ
び制限酵素マッピングによりポジティブなクローンをい
くつかの範疇に分類して、最も多く現れたクラスに対応
する最長のファージ挿入物（ラムダ−１０９）を選択し
て次のサブクローニングおよび分析に用いた。

【０１３１】ヌクレオチド配列分析の結果を図１に示
す。ｃＤＮＡ配列の概念的翻訳から、７９４アミノ酸の
主要オープンリーディングフレームの存在が明らかとな
り、ヌクレオチド２５９で翻訳が開始される（フレーム
内停止コドンは６０ヌクレオチド上流に存在する）こと
が推定された。推定される開始メチオニンコドンは翻訳
開始にとって比較的標準的な環境中（Kozak, M., Nucl.
Ac. Res., 15:8125-8146, 1987）に位置しており、お
そらくシグナルペプチドとして機能する典型的疎水性ア
ミノ酸群がこれに続く。「−３，−１」ルール（von He
ijne, G., Nucl.Ac. Res., 14:4683-4690, 1986）に従
えば、残基２０および２５がいずれも成熟タンパク質の
Ｎ末端を構成する候補となりうる。第２の疎水性アミノ
酸群はアミノ酸１４３から１６６に見られ、一連の高荷
電残基がこれに続き、これは多くの膜橋かけ（ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインに関連して見ら
れる停止−移動シグナルと一致する。タンパク質の予測
される細胞内ドメインは、お互いに４４％の配列同一性
を有する２つのタンデムリピートからなる（残基２５９
−４８６および５５２−７７６）。これらのリピートの
それぞれは、以前記載されたトランスメンブランＰＴＰ
ase ＣＤ４５（Ralph, S.J. et al., 前出)およびＬＡ
Ｒ（Streuli, M. et al., 1988, 前出）の細胞内触媒ド
メインと有意な配列同一性を示す（それぞれ４５％およ
び５３％のアミノ酸配列が同一）。これとは対照的に、
ＥＭＢＬおよびＧＥＮＢＡＮＫデータベースには、コー
ドされるタンパク質の推定細胞外ドメインの既知の配列
と有意な相同性を示すものを含まない。細胞外ドメイン
の特徴は、セリンおよびトレオニン残基の極めて高い含
量（＞３２％）、システイン残基の非存在並びに８個の
Ｎ−結合グリコシル化しうる部位の存在を含む。

【０１３２】単離されたｃＤＮＡは、新規な型の細胞外
ドメインをもつ新しいトランスメンブランＰＴＰase フ
ァミリーをコードすることが結論された。そのレセプタ
ー様の構造と、本実験の結果からこのファミリーの別の
ものがさらに発見される可能性があることから、このタ
ンパク質をｍｕＲ−ＰＴＰase −α（ｍｕｒｉｎｅｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−α）と命名した。実施例II マウスＲ−ＰＴＰase −α遺伝子の染色体分布 ＳＴＳ／Ａ、０２０／Ａ、ＣＸＳおよびＯＸＡ組換え同
種交配（ＲＩ）マウス、並びにＣＸＢ ＲＩ株Ｎ、Ｏ、
Ｐ、ＱおよびＲは、Ｄｒ．Ｊｏ Ｈｉｌｇｅｒｓ（Ｔｈ
ｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ
ｉｔｕｔｅ）から恵与された。その他の全ての同種交配
マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａ
ｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍａｉｎｅ）から購入した。戻し
交雑（ＢＣ）動物はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙから購入した同種交配の原種との間でＮｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて交配した。全ての
交配において雌親を第１代とし、Ｆ１と名付けた。ＡＫ
ＸＤ、ＡＫＸＬ、ＢＸＤ、ＢＸＨおよびＧ、Ｈ、Ｉ Ｓ
ＷＸＬ ＲＩ株からの、並びにＣＸＢ、ＲＩ株Ｄ、Ｅ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫからの脾臓ゲノムＤＮＡはＪａ
ｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤＮＡ Ｒｅｓｏ
ｕｒｃｅから購入した。その他の全てのマウスについて
は、プロテase 消化、フェノールおよびクロロホルム抽
出、およびエタノール沈殿などの標準法によって肝臓の
粗核からゲノムＤＮＡを調製した。文献（Silver, J.,
J. Hered., 76:436-440, 1985）に詳述するように、標
準法を少し変更したサザンブロット分析にマウスゲノム
ＤＮＡを付す。Ｒ−ＰＴＰase−αの細胞内ホスファタ
ーゼドメインに対応する１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、
並びにその細胞外およびトランスメンブランドメインに
対応する０．７ｋｂのＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をブ
ルースクリプトＫＳベクターにクローニングして、それ
ぞれプラスミドｐ１０９およびｐ９２３を作成した。

【０１３３】Ｉｌ−１α（インターロイキン−１ アル
ファ）遺伝子座と関連するＤＮＡ制限断片長変異型を、
文献に記載されているようにサザンブロット法（D'Eust
achio, P. et al., Immunogenetics 26:339-343, 198
7）で検出した。マーカー対の１：１分離から得られる
偏差の有意性をＳｉｌｖｅｒおよびＢｕｃｋｌｅｒのＢ
ａｙｅｓｉａｎ法から計算した（Silver, J. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci.USA 83:1423-1427, 1986; Blan
k, R.D. et al., Genetics 120:1073-1083, 1988）。地
図上の距離を，Ｂ．Ａ．Ｔａｙｌｏｒの方法（Morse,
H.C. III,編集 Origins of Inbred Mice, Academic Pre
ss, New York, 1978, pp.423-438）に従い、ＲＩ株の組
換え分画測定から算出し、Ｓｉｌｖｅｒの方法(１９８
５，前出）によりその関連９５％二項信頼限界（ｂｉｎ
ｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ）
を計算した。Ｄ．Ｂｉｓｈｏｐの方法（Genet. Epidemi
ol.,2:349-361, 1985、 等式１）によりマーカー３つの
順序の可能性を計算した。コンピュター処理はＶＡＸ６
０００−４１０コンピューターで行った。

【０１３４】マウスの同種交配株からのゲノムＤＮＡの
サザンブロット分析によって、２つの有用な制限断片長
変異型が明らかとなり、１つはｍｕＲ−ＰＴＰase−α
（ｐ１０９）の細胞内ドメインに対応するプローブで見
ることができ、他の１つは細胞外およびトランスメンブ
ランドメインプローブ(ｐ９２３)で見ることができた。
結合すると、これらの変異型によって、検索したマウス
の１０の同種交配株中にｍｕＲ−ＰＴＰase −αの３つ
の対立遺伝子型が同定された（表１）。

【０１３５】

【表１】 TaｑI制限エンドヌクレアーゼで消化した肝臓ゲノムDNA
をサザンブロットで分析した。断片の大きさはキロベー
スで示す。

【０１３６】ＲＩマウスにおけるこれらの対立遺伝子の
遺伝を測定した。ＲＩマウスにおける既知の染色体位座
位のその他のマーカーで観察されたものと比較したｍｕ
Ｒ−ＰＴＰase −αでの株分布パターン（表２）は、染
色体２上でのｍｕＲ−ＰＴＰase −αとＩｌ−１ａ（イ
ンターロイキン−１ アルファ）との間の緊密な連鎖を
示唆した（検索した８９のうち３つのＲＩ株で）。この
一致度は、もしも遺伝子座が連鎖していない場合に起こ
る可能性の０．００００１よりも小さい。観察された組
換え株の分画から、遺伝子座の間の地図距離は０．９ｃ
Ｍであることが示された（９５％信頼限界 ０．２−
０．６ｃＭ）。

【０１３７】

【表２】

【０１３８】ＴａｑＩで消化したＤＮＡのサザンブロッ
トにより、ＲＩ株をｍｕＲ−ＰＴＰase −αおよびＩｌ
−１ａの対立遺伝子に分けた（表１および D'Eustachi
o, P.et al., Immunogenetics 26:339-343, 1987 参
照）。ＡＫＸＤ、ＣＸＢ株Ｄ−Ｋ，およびＢＸＨマウス
のＩｌ−１ａ対立遺伝子はＤ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら、
前出に記載されている。全てのＲＩマウスは各遺伝子座
における原種株対立遺伝子のうちの１つのホモ接合体で
ある。対立遺伝子は以下の親株に対応する大文字で示
す：Ａ，ＡＫＲ／Ｊ；Ｂ，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ，ＢＡ
ＬＢ／ｃ；Ｄ，ＤＢＡ／２Ｊ；Ｈ，Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；
Ｊ，ＳＪＬ／Ｊ；Ｌ，Ｃ５７Ｌ／Ｊ；Ｓ，ＳＷＲ／Ｊ；
Ｔ，ＳＴＳ／Ａ。

【０１３９】Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＳＷＲ／Ｊ株との間の
相互戻し交雑による子孫におけるｍｕＲ−ＰＴＰase −
α、Ｉｌ−１ａおよびａ（ノンアグーチ：ｎｏｎａｇｏ
ｕｔｉ）の遺伝の追跡調査によって、ｍｕＲ−ＰＴＰas
e −αとＩｌ−１ａとの連鎖が確認され、２つの遺伝子
の順序を示唆した（表３）。１５０の子孫のうち、１４
はｍｕＲ−ＰＴＰase −αとａとの間の組換えであり、
１つはｍｕＲ−ＰＴＰase −αとＩｌ−１ａとの間の組
換えであった。もしも遺伝子座がセントロメア・Ｉｌ−
１ａ・ｍｕＲ−ＰＴＰase−α・ａの順序であるなら
ば、二重交差が全く起こらないことになり；これ以外の
順序ならば１または１４のこのような事象を要すること
になり、Ｂｉｓｈｏｐの方法（前出）から計算して、少
なくとも９．５倍ありそうにない。Ｉｌ−１ａとｍｕＲ
−ＰＴＰase −αとの距離、０．６ｃＭ（９５％信頼限
界：０．１−２．４ｃＭ）は、ＲＩ株のデータから計算
される距離とサンプリング変動の範囲内で一致する。こ
の結果を最近Ｂｍｐ−２ａ（骨形態タンパク質２ａ：ｂ
ｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ２
ａ；Dickinson, M.E. et al., Genomics 6:505-520,199
0）で得られた結果と比較して、２つの遺伝子の間には
明瞭な構造的相同性がないが、これら２つの遺伝子は緊
密に連鎖していることが示唆された。

【０１４０】

【表３】

【０１４１】（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｘ ＳＷＲ／Ｊ）Ｆ
1（Ｆ１）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ）マウスの間の
ＢＣから得た１５０の子孫について、ノンアグーチ
（ａ）マーカーの遺伝を肉眼で型に分け、ｍｕＲ−ＰＴ
Ｐase −αおよびＩｌ−１ａの対立遺伝子をサザンブロ
ットで調べて分類した。実施例III マウスＲ−ＰＴＰase −α ＲＮＡの発現 １．ノーザン分析 文献記載の方法（Vennstrom, B. et al., Cell 28:135-
143, 1982）によるオリゴ（ｄＴ）選択により、成人マ
ウス組織および細胞系からポリＡ⁺ＲＮＡを調製し、ホ
ルムアルデヒド含有ゲル上で分画し（レーン当たり５μ
ｇ）、標準法を用いてニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移しとった。³²Ｐ−ｄＡＴ
Ｐの存在下に、アニールしたＴ７プライマーからの伸長
を行うためのＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメン
トを用いて、ブルースクリプト・ベクターのＥｃｏＲＩ
部位にアンチセンスの方向にクローン化した全ラムダ−
１０９ｃＤＮＡからなる１本鎖鋳型上で、プライマー伸
長法により³²Ｐ標識プローブを調製した。５０％ホルム
アルデヒド、５ｘＳＳＣ、２５ｍＭ ＫＰＯ₄、５ｘＤ
ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、
および１０％硫酸塩中、４２℃でハイブリダイゼーショ
ンを行った。洗浄は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中
で４８℃で行った。フィルターを高緊縮条件（５８℃）
で洗浄しても、ハイブリダイゼーション・パターンに検
知し得る影響を与えなかった。 ２．マウスＲ−ＰＴＰase −αタンパク質の発現 ファージ・ラムダ−１０９からの全ｃＤＮＡ挿入物を部
分的ＥｃｏＲＩ消化によってファージから１断片として
放出し、ブルースクリプトＫＳベクター中にクローン化
した。非翻訳リーダー配列の大半を欠くｃＤＮＡ断片
（位置２２６にあるＳａｃＩＩ部位から開始する；図１
ｂ参照）を、ＳＶ４０プロモーターを入れたｐＬＳＶ−
ベクターにサブクローニングし（Livneh, E. et al.,
J. Biol. Chem., 261:12490-12497, 1986）、得られた
プラスミドＤＮＡ（ｐＬＳＶ−ＰＴＰ−α）をＤＥＡＥ
−デキストラン法によってＣＯＳ細胞にトランスフェク
ションした（Lopata, M.A. et al., Nucl. Ac. Res., 1
2:5707-5717, 1984）。Ｎ末端を切ったｍｕＲ−ＰＴＰa
se −αタンパク質をコードする発現ベクターｐＬＳＶ
Ｃを免疫沈降試験の対照として用いた。 ３．結果 各種のマウス組織からのポリＡ⁺ＲＮＡを調製して、ｍ
ｕＲ−ＰＴＰase −α遺伝子の発現を研究した。ノーザ
ン分析（図２）によって広範な発現パターンが明らかに
なった。脾臓を除く試験した全ての組織に３．０ｋｂの
ｍＲＮＡが存在し、脳と腎臓が最も高い発現レベルを示
した。同様の大きさのｍＲＮＡがＮＩＨ−３Ｔ３マウス
繊維芽細胞系２．２、およびプレプロ−Ｂリンパ球系Ｂ
ＡＦにも観察された（図２）。ノーザンブロットを短時
間さらすと、別の非常によく似た大きさ（３．２ｋｂ）
の第２のｍＲＮＡ種が幾つかの組織（例えば脳）で少量
存在することを明らかに示した。ｃＤＮＡ配列の３’末
端にポリＡテイルおよびポリアデニル化シグナルは観察
されなかったが、単離したｃＤＮＡクローン(２８７２ヌ
クレオチド)はｍＲＮＡの全長にほぼ一致することもデ
ータは示唆している。実施例IV マウスＲ−ＰＴＰase −αタンパク質の過渡的発現 １．抗体の調製および免疫沈降 カップリング試薬としてＥＤＣＩ（１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いて
ＢＳＡとカップリングさせたｍｕＲ−ＰＴＰase−αタ
ンパク質の予測されるＣ末端（残基７７７−７９４）に
対応する合成ペプチドをウサギに注射した。抗原は１ｍ
ｇのペプチドと完全フロインド・アジュバントの懸濁液
を皮内および経皮で注射した。０．５ｍｇのペプチドと
不完全アジュバントで３回のブースター注射を２−３週
間の間隔で行った。この方法を用いて得られた抗血清を
「２Ａ」と命名した。代謝性³⁵Ｓ−メチオニン標識、細
胞抽出物の調製（トランスフェクション後６０時間）お
よびプロテイン−Ａ−セファロースを用いる間接免疫沈
降は標準法で実施した（Yarden, Y. et al., EMBO J.6:
3341-3351, 1987）。 ２．結果 成熟タンパク質の大きさを決定するために、ＳＶ４０プ
ロモーターの制御下に、非翻訳リーダーの大半を除い
て、ｍｕＲ−ＰＴＰ−ase −αをｐＬＳＶベクター中に
クローニングして（Linvneh, E. et al., J. Biol. Che
m. 261:12490-12497, 1986）、発現ベクターｐＬＳＶ−
ＰＴＰ−αを得た。このベクターをＣＯＳ細胞にトラン
スフェクションし、６０時間後に³⁵Ｓ−メチオニン標識
された全細胞抽出物を抗血清２Ａを用いて調製して、免
疫沈降に用いた。

【０１４２】図３から明らかなように、抗血清は幾つか
のバンドを認識し、そのうちの１つである拡散した１３
０ｋＤａのバンド（矢印）はトランスフェクションされ
た細胞からの免疫沈降（レーン５）にのみ存在し、モッ
ク・トランスフェクションされた細胞（レーン３）（ｍ
ｕＲ−ＰＴＰase −α ｃＤＮＡのないｐＬＳＶでトラ
ンスフェクションされた）からの免疫沈降には存在しな
かった。沈降は免疫感作に用いたペプチドで競合された
（レーン６）。

【０１４３】ｍｕＲ−ＰＴＰase −αの予測される分子
量（８８ｋＤａ）と実測分子量（１３０ｋＤａ）との差
は、著しいグリコシル化によるものである。

【０１４４】抗血清の特異性の別の制御として、ｍｕＲ
−ＰＴＰase −αｃＤＮＡのＮ末端切断形（アミノ酸２
１４から始まり、したがってトランスメンブランおよび
細胞外ドメインを欠く）を同じベクター中に入れたもの
でもＣＯＳ細胞をトランスフェクションした。このベク
ターでトランスフェクションした細胞からの免疫沈降
で、５５ｋＤａの見かけ上の分子量をもつ新規で大量の
タンパク質が観察され、これを再び抗原性ペプチドと競
合させた（レーン７および８）。成熟ｍｕＲ−ＰＴＰas
e −αと比較してのＮ末端切断形タンパク質の豊富さ
は、複数の独立したトランスフェクション実験での結果
と一致した。実施例Ｉ〜IVに関する一般的議論 上記の実施例は広範な発現パターンをもつ新規なレセプ
ター様ＰＴＰase 、Ｒ−ＰＴＰase −αの同定を記載し
たものである。したがって、Ｒ−ＰＴＰase は、従来Ｃ
Ｄ４５の研究をもとにして考えられていたようなリンパ
球細胞活性の調節以外の広範な機能を有することが期待
される。

【０１４５】ＣＤ４５タンパク質の細胞外ドメインに対
するモノクローナル抗体を用いる研究によって、Ｒ−Ｐ
ＴＰase の架橋が様々な細胞活性に重大な影響を及ぼし
得ることを示したが、ＰＴＰase 酵素活性に対する影響
はまだ研究の余地がある。しかしながら、リガンド誘導
のレセプターの凝集が、レセプター・チロシン・キナー
ゼによるトランスメンブラン・シグナリングの中心的な
出来事であるので（Ullrich, A. et al., 前出）、Ｒ−
ＰＴＰase のための推定的細胞外リガンドがｉｎ ｖｉ
ｖｏでのＲ−ＰＴＰase の活性を調節する能力をもつこ
とを本発明者らは提案する。

【０１４６】レセプター・チロシン・キナーゼ（ＰＴ
Ｋ）について提案されたのと類似の方法で、Ｒ−ＰＴＰ
ase は、先祖代々のＰＴＰaseドメインと、細胞外リガ
ンドと結合し得るドメインとの複数の遺伝子融合を経て
生じたものだと提案することができる（Ullrich, A. et
al.; Hanks, S.K. et al., 前出）。

【０１４７】ＰＴＰase ドメインと結合してレセプター
様タンパク質を形成し得る細胞外ドメインの多様性が、
同様のメカニズムで作用し得る可能なリガンドの範囲と
対応することが期待される。本明細書に開示したような
クローン化Ｒ−ＰＴＰase の入手可能性は、その基質特
異性を決定するうえで、またその機能を理解しその活性
を操作するうえで有用である。

【０１４８】Ｒ−ＰＴＰase は主要なチロシン・キナー
ゼ基質に対する広範な特異性を有しており、その異なる
細胞外ドメインが、細胞外環境における異なるシグナル
に応答する異なる調節メカニズムを可能にする主な原因
である。この観点に基づいて、レセプター・タンパク
質、チロシン・キナーゼを通して作用するこれらのポリ
ペプチド成長因子に対して細胞の応答性をＲ−ＰＴＰａ
ｓｅが変えることが予期される。ＰＴＫではリガンド結
合が酵素活性の活性化を導く。これから考えると、Ｒ−
ＰＴＰase −α並びにその類似分子はネガティブな成長
調節物質であり、劣勢がん遺伝子と考えることができ
る。

【０１４９】例えば、Ｒ−ＰＴＰase −αが位置するマ
ウス染色体２の部分を欠失すると、ＳＪＬ／Ｊマウスに
おける放射線誘導の骨髄白血病(Tracktenbrot, L. et a
l.,Leukemia 2:545-550, 1988)の初期症状を呈し、これ
は劣勢がん遺伝子の概念と一致する。さらに、ヒトＲ−
ＰＴＰase −α遺伝子が位置するヒト染色体２０に係る
再配置はヒトリンパ球白血病と結び付けられてきた(Mit
elman, F. (編集) Catalog of Chromosome Aberrations
in Human Cancer, A. Liss, New York)。

【０１５０】あるいは、Ｒ−ＰＴＰase −αは、ＣＤ４
５とｃ−ｌｃｋとの間の相互作用に対して提案されたの
と同様の方法で作用するのかも知れない（Oostergaard,
H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8959-8
963, 1989; Mustelin, T. etal., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 86:6302-6306, 1989）。この観点からすると、
Ｒ−ＰＴＰase −αは、レセプターではなく、かつｌｃ
ｋよりも広く発現している膜関連のＰＴＫにおけるネガ
ティブな調節部位（例えば、ｐｐ６０^c-srcにおけるｔ
ｙｒ⁵²⁷など）を脱リン酸化する。このように作用する
ことにより、Ｒ−ＰＴＰase −αはポジティブな成長コ
ントロールおよび分化に関与するであろう。

【０１５１】本発明者らは何ら特定の理論に拘泥するつ
もりはないが、各種レセプター・ＰＴＰase の触媒ドメ
インにおける高い種間保存は、細胞成長のコントロール
におけるこれらレセプターの重要な役割を示唆する。実施例Ｖ ヒトＲ−ＰＴＰase ｃＤＮＡの単離および特徴 （Kaplan, R.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
7000-7004, 1990） Ａ．材料 制限エンドヌクレアーゼおよび修飾酵素はＢｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ−ＭｎｎｈｅｉｍまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓから
購入した。全ての配列決定に用いるプライマー、並びに
ポリメラーゼ・チェーン・リアクションに用いるラムダ
ｇｔ１１前向きおよび逆向きプライマー（２４−ｍｅｒ
ｓ）は、メトキシまたはβ−シアノエチルホスホアミダ
イトを用いて、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，モデル３８０Ａ）で合成した（Ho
use, C. et al., J. Biol. Chem. 262:772-777, 198
7）。ラムダｇｔ１１ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーは
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託
番号３７４３２）から得た。ライブラリーのスクリーニ
ング用プローブとして用いるＬＣＡ（ＣＤ４５）クロー
ンはＥ．Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｌｅ）から恵
与された。全ての配列決定反応はシーケナーゼキット
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）を用いて行った。 Ｂ．方法 １日齢のヒト幼児脳幹のラムダｇｔ１１ ｃＤＮＡライ
ブラリーから得た約３００，０００プラークを、両方の
保存ホスファターゼドメインにまたがるニック・トラン
スレーションしたＬＣＡプローブを用いて、ゆるやかな
緊縮条件でふたつのニトロセルロースフィルター上でス
クリーニングした（Charbonneau, H. etal., 1989, 前
出）。０．２５％無脂肪ドライミルク、０．１％ＳＤ
Ｓ、および１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ標識ＬＣＡプロー
ブを含む５ｘ ＳＳＰＥ溶液（ＳＳＰＥは１０ｍＭ Ｎ
ａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４／０．１８Ｍ ＮａＣｌ／１ｍ
ＭＥＤＴＡ）中、５５℃で一夜ハイブリダイゼーション
を実施した。フィルターを２ｘ ＳＳＰＥ／０．２％
ＳＤＳ中、５５℃で２０分間、３回洗浄し、次いでオー
トラジオグラフィーに付した。このスクリーニングによ
り７９個の二重にポジティブなものが得られ、そのうち
のＬＣＡプローブと種々の程度のハイブリダイゼーショ
ンを示した１２個を、同じプローブを用いて繰り返しス
クリーニングすることによってプラーク精製した。次い
でｃＤＮＡ挿入物の大きさを決定するために、ポリメラ
ーゼ・チェーン・リアクションを用いた（Saiki, R.K.
et al., Science 230:1350-1354, 1985）。各精製プラ
ークからの溶出物の部分からなるＤＮＡ鋳型を７５℃、
１５分間加熱してＤＮＡを放出させた。鋳型にラムダｇ
ｔ１１前向きおよび逆向きプライマーを付けた。反応混
合物（０．１ｍｌ）を文献記載の方法により調製した
（Dionne, C.A. et al., Biotechniques 8:190-194, 19
90）。自動Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ Ｄ
ＮＡ熱サイクラー中で増幅を３０サイクル行い、各サイ
クルは９４℃で１．５分変性、６５℃で２分アニーリン
グ、および７２℃で４分伸長した。各サンプルの一部
（１５μｌ）を１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含
む１％アガロースゲルで電気泳動して分析した（Sambro
ok et al., 前出)。ラムダソルブ（ＬａｍｂｄａＳｏｒ
ｂ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４つの最大クローンか
らＤＮＡを調製し、次いでＥｃｏＲＩで消化した。配列
決定のために断片を別々にＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ
部位にサブクローニングした。ヌクレオチド配列は、修
飾Ｔ７ポリメラーゼ（Tabor, S. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:4767-4771, 1987）を用いてジデオ
キシヌクレオチド鎖末端法で決定した（Sanger, F. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 197
7）。

【０１５２】配列データに関する全てのコンピューター
分析はＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓの書いたプログ
ラムを用いてＭｉｃｒｏ ＶＡＸ ＩＩで行った。ＤＮ
Ａ配列を分析してＧＥＬプログラムを用いて組み立て
た。タンパク質の疎水性分析は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅのアルゴリズム（Kyte, J. et al., J. Mo
l. Biol., 157:105-132, 1982）に基づき、ＰＥＰプロ
グラムで行った。タンパク質配列順はＧＥＮＡＬＩＧＮ
プログラムを用いて行った（Sobel, E. et al.,Nucleic
Scids Res., 14:363-374,1985; Karlin, S. et al., M
ol. Biol. Evol., 1:357-370, 1984; Needleman, S.B.
et al., J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970)。最初の順
序付けはＪｉｍｅｎｅｚ−Ｍｏｎｔａｎｏプロテインア
ルファベットを用いて行った（Jimenez-Montano, M. et
al., Proc. 7th Int'l Biophysics Congress, 1981, M
exico City）。 Ｃ．結果 ＰＴＰase ファミリーの新たなメンバーを同定するため
に、ラムダｇｔ１１中のヒト幼児脳幹ｃＤＮＡライブラ
リーから得た３００，０００プラークを、両方の保存ホ
スファターゼドメインにまたがるニックトランスレーシ
ョンしたＬＣＡプローブを用いて、非緊縮条件でスクリ
ーニングした。二重ポジティブな最初の７９個のうちの
４個を完全に配列決定した。２つのクローン、３１−４
および２７−１はαと命名したヒトＲ−ＰＴＰase （ｈ
ｕＲ−ＰＴＰａｓｅ）の全長コーディング領域のオーバ
ーラップする部分を含んでいた（図４Ｂ）。クローン３
１−４と２７−１を組み合わせた長さは３６１５ｂｐ
（図４Ａ）であり、８０２アミノ酸のタンパク質をコー
ドしており（図４Ｃ）、さらに５’および３’非翻訳領
域にそれぞれ６９５ｂｐおよび５１０ｂｐを含む。４個
のクローンのうちの２個は、βおよびγ（ガンマ）と命
名したさらに２つのＲ−ＰＴＰase をコードする遺伝子
部分を含む(図５)。Ｒ−ＰＴＰase −αと同様、これら
２つのタンパク質は典型的な疎水性トランスメンブラン
領域と、別個の細胞外ドメインとを含み、これらが別の
Ｒ−ＰＴＰase であることを示唆する。

【０１５３】この遺伝子と相同なマウス由来のものをヒ
トＲ−ＰＴＰase −αと同時に配列決定した（前記実施
例Ｉ〜IV参照）。マウスとヒトタンパク質の比較を図４
Ｃに示す。いくらかの多様性の存在する細胞外ドメイン
を除けば、２つの多様性は５残基が異なるのみである。
ヒトＲ−ＰＴＰase −αの構造を検討したところ、該領
域中に１個のシステインのみをもつ疎水性シグナルペプ
チドを含む１５０残基からなる比較的短い細胞外ドメイ
ンが明らかとなった。Ｎ−グリコシル化を生じ得る部位
は８個あり、またＯ−グリコシル化を生じ得る部位は多
数存在する（このドメインにはセリンおよびトレオニン
に富むので）。Ｒ−ＰＴＰase −α、ＬＣＡ、およびＬ
ＡＲは構造的に無関係であるように思われる。両側を荷
電した残基で固着された疎水性トランスメンブラン領域
が存在する。これに続いてそれぞれ約２３５残基の一列
に並んで繰り返す２つの保存性ホスファターゼ・ドメイ
ンがあり、この２つのは５７アミノ酸によって隔てられ
ており、これはＬＣＡ、ＬＡＲのようなＲ−ＰＴＰase
類、並びに２つのショウジョウバエＰＴＰase であるＤ
ＬＡＲおよびＤＰＴＰに典型的な特徴である。

【０１５４】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれＬＣＡ並び
にＲ−ＰＴＰase α、βおよびγ（ガンマ）の第１と第
２保存性ホスファターゼ・ドメイン間のアミノ酸配列を
示す。４つのＲ−ＰＴＰase のうち、βとγが最もよく
配列が似ていることが容易に見て取れる。ＰＴＰase １
Ｂ、ＬＣＡ、ＬＡＲ、ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰの保存性
ホスファターゼ・ドメインの配列のうち、２９残基が不
変であることが報告されている（Hunter, T. et al.,
前出）。これらの残基の多くはＲ−ＰＴＰase−α、β
およびγの両方のホスファターゼドメインにも存在する
が、βおよびγの第２の保存性ホスファターゼ・ドメイ
ンは、ＬＣＡのホスファターゼ・ドメイン２にある１０
４および２０１位の２つのシステインを含むこれらのア
ミノ酸の多くを欠いていることは興味深い。 Ｄ．議論 本明細書で同定された３つのヒトＲ−ＰＴＰase （α、
βおよびγ）の保存性ホスファターゼ・ドメインの配列
をお互いに比較し、またＬＣＡ、ＬＡＲ、並びに２つの
可溶性ＰＴＰase である胎盤ホスファターゼ１Ｂおよび
Ｔ細胞ＰＴＰase の配列と比較した（表４）。２つの可
溶性酵素は７０％の配列同一性を有していたが、それぞ
れをＲ−ＰＴＰase （ホスファターゼドメインＰＤ１ま
たはＰＤ２）と比較すると、この数字は２９−４２％に
落ちる。全ての場合において、可溶性ＰＴＰase はＲ−
ＰＴＰase のＰＤ２よりもＰＤ１とより多くの同一性を
示した。Ｒ−ＰＴＰase−αは、そのＰＤ１配列がＬＡ
Ｒと５６％同一であり、ＰＤ２配列は５２％同一である
ので、ＬＡＲと最も関連しているように思われる。Ｒ−
ＰＴＰase βおよびγの保存性ドメインはお互いに最も
関連しており、２つの可溶性ＰＴＰase βおよびγがＰ
Ｄ１およびＰＤ２の双方で７５％同一であるよりももっ
と関連している。一般に、いかなるＲ−ＰＴＰase でも
そのＰＤ１とＰＤ２の間の配列関連性はそのファミリー
の異なるもの同志の間に見られる関連性よりも高くない
のは興味深いことである。例えば、高いものでＬＡＲの
ＰＤ１とＰＤ２領域の間の同一性は４７％であり、低い
ものではＲ−ＰＴＰase γでは２９％である。

【０１５５】Ｒ−ＰＴＰase −α、βおよびγの細胞質
ドメインは高度に保存されているが、これらレセプター
の細胞外ドメインはお互いに関連がなく、またＬＡＲお
よびＬＣＡの細胞外ドメインとも関連がない。このこと
はこれらレセプターのそれぞれが別々のリガンドをもっ
ていることを示唆する。これらリガンドのＲ−ＰＴＰas
eへの結合が、ＰＴＫase 活性を示す成長因子レセプタ
ーとともに、シグナルトランスダクションに関与する標
的タンパク質のチロシンリン酸化の調節に決定的な役割
を果たしているようである。本明細書に記載するＲ−Ｐ
ＴＰase の多様性が多重遺伝子ファミリーの存在を明ら
かにするものである。これらの膜レセプター間の構造と
機能の関係をより理解することが、細胞成長、分化、お
よび発癌に関与するメカニズム解明への重要な洞察を提
供する。

【０１５６】

【表４】

【０１５７】保存性ホスファターゼ・ドメインの並び方
は前記の方法で決定した。比較した領域は図４Ｃおよび
図５に示す。ＰＤはホスファターゼドメインを表す。実施例VI ノーザンブロット分析によるヒトＲ−ＰＴＰase −αの
発現 全ＲＮＡ２０μｇまたはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ２μｇを含
むサンプルをホルムアルデヒド／アガロースゲル中に溶
解し、ニトロセルロースに移し取った。Ｒ−ＰＴＰase
−αおよびβ−アクチンプローブをランダムプライミン
グによって標識した（Sambrooket al., 前出）。前述
したように６５℃でハイブリダイゼーションと洗浄を行
った（Church, G. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA
81:1991-1995, 1984 ）。このＲ−ＰＴＰase −αとハ
イブリダイズしたブロットを、−８０℃、７２時間、増
感板とともにＸＡＲ−２−Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）
にさらした。同じ条件で１５時間後にアクチンプローブ
・ブロットからの結果を得た。

【０１５８】Ｒ−ＰＴＰase −αの発現を種々の細胞系
および組織で試験した（図６）。結果は、それぞれ約
４．３ｋｂおよび６．３ｋｂの２つの主要Ｒ−ＰＴＰas
e −転写物の存在を示唆する。この２つのうちの大きい
方は胎児組織により広く存在し、特にポリ（Ａ）+胎児
肝臓サンプルに顕著であり、ここには４．３ｋｂの転写
物も相対的に最も高い量が存在した。２つの転写物の発
現が個別に発生的に調節されており、また／あるいはＬ
ＣＡで見られるように（Ralph, S.J. 前出）、別のスプ
ライシングメカニズムによる結果かも知れない。成人の
脳はＲ−ＰＴＰase −αの発現が相対的に少ない。この
結果は、Ｒ−ＰＴＰase −αがある程度、多くの組織で
発現していることを示唆する。マウスＲ−ＰＴＰase −
αもまた、多くの組織および細胞系で発現し、脳および
腎臓で最も多く発現することが観察された（Sap, J. et
al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:6112-6116, 199
0；前述の実施例IIIおよびIVも参照されたい）。実施例VII ヒトＲ−ＰＴＰase −α遺伝子の染色体局在化 本研究で用いた親細胞と体細胞とのハイブリッドの単
離、増殖および性質については既に文献に記載されてい
る（Durst, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 8
4:1070-1074, 1987; Ku, D-H. et al., Somatic Cell M
ol. Genet. 15:297-307, 1989; Juan, C-C. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8910-8913,1988）。特定
のヒト染色体または染色体領域の存在は、特定の染色体
領域に帰せられる遺伝子のプローブを用いてＤＮＡハイ
ブリダイゼーションによって確認した。ハイブリッドＤ
ＮＡを過剰の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩま
たはＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルの電
気泳動で大きさを分け、ナイロンフィルターに移し取っ
て、上記のようにハイブリダイゼーションした（Durst
et al., 前出）。Ｒ−ＰＴＰase −αプローブはクロー
ン３１−４の３’側にある０．８ｋｂからなる（図４Ｂ
参照）。

【０１５９】サザンブロット分析によって、全ヒトゲノ
ムを表すヒト染色体領域のオーバーラッピング・サブセ
ットをもつ１７個のげっし類−ヒト体細胞ハイブリッド
からのＤＮＡにおける、ヒトＲ−ＰＴＰase −α遺伝子
座の存在を調べた。結果（図７）は、ハイブリッド細胞
中のヒトＲ−ＰＴＰase −α遺伝子座の存在が部分的ヒ
ト染色体２０の存在とのみ相関することを示す。ハイブ
リッドＰＢ５−１およびＡＢ３のそれぞれが染色体２０
の長腕を欠き、かつＲ−ＰＴＰase −α遺伝子座を保持
しているので、Ｒ−ＰＴＰase −α遺伝子座の領域局在
化もできうることをデータは示している。したがって、
ヒトＲ−ＰＴＰase −α遺伝子は２０ｐｔｅｒ−２０ｑ
１２に位置する。

【０１６０】ヒト染色体２０に位置する全てのヒト遺伝
子と相同なマウス遺伝子はマウス染色体２に位置するこ
とが観察されている（Lalley, P.A. et al., Cytogene
t. Cell Genet. 51:503-532, 1989）。これはＲ−ＰＴ
Ｐase −αについても同様であると思われる（上記実施
例II参照）。

【０１６１】骨髄障害および腫瘍における転座および欠
失にはヒト染色体２０の長腕が関与する（Trent, J.M.
et al., Cytogenet. Cell Genet., 51:533-562, 198
9）。ヒトＲ−ＰＴＰase −α遺伝子座は特に２０ｑの
欠失に関与するのかも知れない。この場合には、これが
がんサプレッサー遺伝子あるいは抗−がん遺伝子である
可能性が強くなる。ＳＪＬ／Ｊ株におけるマウスでも同
様に、染色体２の欠失が放射線誘導の骨髄白血病の進展
に関与するようである（Trakhtenbrot, I. et al.,Leuk
emia 2:545-550, 1988）。

【０１６２】本明細書で引用した全ての文献は、特別に
包含したとしないにかかわらず、参照として本明細書に
包含される。

【０１６３】今や本発明を十分に記載したので、本発明
の精神および範囲を逸脱することなく、かつ過度な実験
を行うことなく、均等なパラメーター、濃度、および条
件の広範な範囲内で当業者が同じことを実施できること
が理解されよう。

【０１６４】本発明はその特定の態様に基づいて記載し
たが、さらに修飾が可能なことが理解されるであろう。
本出願は、本発明の原理に従う本発明の全ての変更、使
用、または応用を含み、また既知あるいは慣用の方法に
よって本発明が適合する分野内に含まれるもの、および
後述する請求の範囲に示す本発明の本質的特徴に応用で
きるものは、たとえ本明細書の記載から逸脱するもので
あってもこれを含むことを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの推定一
次構造を提示する。

【図２】図２は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−α ｍＲＮ
Ａの発現を示すノーザンブロットの図である。レーン：
１，腎臓；２，肺；３，心臓；４，胃；５，脳；６，脾
臓；７，肝臓；８，ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞系；９，
ＢＡＦプレプロ−Ｂリンパ様細胞系。

【図３】図３は、マウスＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク
質の免疫沈降のＰＡＧＥの結果を示す図である。分子量
マーカーの大きさはｋＤａで示してある。矢印は130 kD
のＲ−ＰＴＰａｓｅ−αタンパク質の位置を示す（レー
ン５）。

【図４】図４は、ｃＤＮＡクローンの配列から推定され
たヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの構造を示す。

【図５】図５は、ヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ ＬＣＡ、α、
βおよびガンマの第１（Ａ）および第２（Ｂ）保存ホス
ファターゼのアミノ酸配列の比較を示す。

【図６】図６は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅ−αプローブ（上）
とβ−アクチンプローブ（下）を用いたノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションにより測定した、種々の組織
および細胞系でのヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの相対的発
現を示すゲルパターンの図である。

【図７】図７は、17の齧歯目−ヒト体細胞ハイブリッド
のパネルの分析に基づいたヒトＲ−ＰＴＰａｓｅ−αの
染色体局在化を示すマトリックス図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月２１日（２００１．９．２
１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｂ０６５ 9/16 Ｃ１２Ｑ 1/42 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/573 Ａ 33/566 33/577 Ｂ 33/573 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 HA14 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR13 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG20 AG27 CA19 CC24 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 CA25 CA31 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA50 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 白血球共通抗原（ＣＤ４５）および白血
   球共通抗原- 関連タンパク質（ＬＡＲ）以外のヒトレセ
   プター型タンパク質のチロシンホスファターゼ（Ｒ−Ｐ
   ＴＰａｓｅ）タンパク質または糖タンパク質分子、その
   機能的誘導体、もしくは他の哺乳動物におけるその同等
   物であって、該分子が自然界に存在するものである場
   合、該分子は自然界でそれと結合している他のタンパク
   質または糖タンパク質を実質的に含まず、自然界に存在
   する該分子は一般に哺乳動物の肝臓、腎臓および脳に存
   在していることを特徴とする上記分子。
2. 【請求項２】 自然界に存在していない、請求項１記載
   の分子。
3. 【請求項３】 自然界に存在しており、それが自然界で
   結合している他のタンパク質または糖タンパク質を実質
   的に含まない、請求項１記載の分子。
4. 【請求項４】 図４に示したアミノ酸配列を有するＲ−
   ＰＴＰａｓｅ−αまたはその機能的誘導体である、請求
   項１記載の分子。
5. 【請求項５】 図５に示したアミノ酸配列を有するＲ−
   ＰＴＰａｓｅ−βまたはその機能的誘導体である、請求
   項１記載の分子。
6. 【請求項６】 配列番号３のアミノ酸配列を有するＲ−
   ＰＴＰａｓｅ−ガンマまたはその機能的誘導体である、
   請求項１記載の分子。
7. 【請求項７】 請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパ
   ク質をコードするか、またはその機能的誘導体をコード
   するＤＮＡ分子であって、該タンパク質または該機能的
   誘導体が自然界に存在するものである場合、該ＤＮＡ分
   子は該タンパク質または該機能的誘導体と自然界で結合
   しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を実
   質的に含まないことを特徴とする上記ＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 ｃＤＮＡ配列である、請求項７記載のＤ
   ＮＡ分子。
9. 【請求項９】 ゲノムＤＮＡ配列である、請求項７記載
   のＤＮＡ分子。
10. 【請求項１０】 配列番号４、配列番号５、配列番号
    ６、または該配列の機能的誘導体より成る群から選ばれ
    るヌクレオチド配列を有する、請求項７記載のＤＮＡ分
    子。
11. 【請求項１１】 発現ベヒクルである、請求項７記載の
    ＤＮＡ分子。
12. 【請求項１２】 発現ベヒクルがプラスミドである、請
    求項１１記載のＤＮＡ分子。
13. 【請求項１３】 請求項１２のＤＮＡ分子で形質転換さ
    れた原核細胞宿主。
14. 【請求項１４】 細菌である、請求項１３記載の宿主。
15. 【請求項１５】 請求項１１のＤＮＡ分子でトランスフ
    ェクトされた真核細胞宿主。
16. 【請求項１６】 酵母細胞または哺乳動物細胞である、
    請求項１５記載の宿主。
17. 【請求項１７】 請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタン
    パク質または糖タンパク質、もしくはその機能的誘導体
    の生産方法であって、 (a) 培養条件下で該タンパク質を発現し得る宿主を培養
    し； (b) 該タンパク質を発現させ；そして(c) 培養物から該
    タンパク質を回収する；ことから成る方法。
18. 【請求項１８】 前記宿主が原核細胞である、請求項１
    ７記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記宿主が真核細胞である、請求項１
    ８記載の方法。
20. 【請求項２０】 請求項１記載のタンパク質または糖タ
    ンパク質に対して特異的な抗体。
21. 【請求項２１】 モノクローナルである、請求項２０記
    載の抗体。
22. 【請求項２２】 被検者における請求項７記載の核酸配
    列または変異型Ｒ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸配列
    の存在を検出する方法であって、 (a) 被検者由来の細胞またはその抽出物を、正常または
    変異型Ｒ−ＰＴＰａｓｅの少なくとも一部をコードする
    オリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーショ
    ン条件下で接触させ；そして(b) 該細胞の核酸への該プ
    ローブのハイブリダイゼーションを測定し、これにより
    該核酸配列の存在を検出する；ことから成る方法。
23. 【請求項２３】 工程(a) の前に、 (c) Ｒ−ＰＴＰａｓｅをコードする該細胞のＤＮＡの量
    を選択的に増幅する；ことをさらに含む、請求項２２記
    載の方法。
24. 【請求項２４】 細胞におけるＲ−ＰＴＰａｓｅの存在
    を検出し、またはその量を測定する方法であって、 (a) 該細胞またはその抽出物を請求項20記載の抗体と接
    触させ；そして(b) 該細胞またはその抽出物への該抗体
    の結合を検出するか、または結合した抗体の量を測定
    し、これによりＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または糖タ
    ンパク質の存在を判定し、またはその量を測定する；こ
    とから成る方法。
25. 【請求項２５】 化学的または生物学的調製物におい
    て請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタンパク質、糖タン
    パク質または誘導体に結合し得る化合物を同定する方法
    であって、 (a) Ｒ−ＰＴＰａｓｅタンパク質、糖タンパク質または
    誘導体、もしくはそのリガンド結合部分を固相マトリッ
    クスに付着させ； (b) 化学的または生物学的調製物を該固相マトリックス
    と接触させて該化合物を結合させ、未結合物質を洗い流
    し；そして(c) 該固相に結合した該化合物の存在を検出
    する；ことから成る方法。
26. 【請求項２６】 請求項１記載のＲ−ＰＴＰａｓｅタン
    パク質、糖タンパク質または機能的誘導体に結合し得る
    化合物を複合混合物から単離する方法であって、 (a) Ｒ−ＰＴＰａｓｅタンパク質または機能的誘導体、
    もしくはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに付
    着させ； (b) 複合混合物と該固相マトリックスとを接触させて該
    化合物を結合させ、未結合物質を洗い流し；そして(c)
    結合した該化合物を溶離し、これにより該化合物を単離
    する；ことから成る方法。
27. 【請求項２７】 Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵素活性を刺激ま
    たは阻害し得る化合物を同定する方法であって、 (a) 純粋な形の、メンブラン調製物中の、または全細胞
    中のＲ−ＰＴＰａｓｅと該化合物とを接触させ； (b) 工程(a) の混合物を十分な時間インキュベートし； (c) Ｒ−ＰＴＰａｓｅの酵素活性を測定し； (d) その酵素活性を、該化合物の不在下でインキュベー
    トしたＲ−ＰＴＰａｓｅのそれと比較し、これにより該
    化合物が酵素活性を刺激するのかまたは阻害するのかを
    判定する；ことから成る方法。