DE10035190A1

DE10035190A1 - Verfahren und Vorrichtung zur 2-Photonen-Fluoreszenz-Koinzidenzanalyse

Info

Publication number: DE10035190A1
Application number: DE10035190A
Authority: DE
Inventors: Katrin Heinze; Petra Schwille; Andre Koltermann; Ulrich Kettling
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2002-02-07
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: WO2002008732A1; DE10035190B4; AU2001289690A1; DE10035190C5; US7507582B2; EP1303750A1; US20040022684A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung an mit unterschiedlichen, spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen aufweisenden Fluoreszenzmarkern markierten Analyten in einer Probe mit den folgenden Schritten beschrieben: Beleuchtung der Probe (11) in einem Messvolumen mit einem Laser (20) zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindestens zwei Fluoreszenzmarker, wobei die Beleuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensität erfolgt, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2-Photonen-Absorptionen angeregt werden, Detektion der Fluoreszenzemission mit mindestens zwei Detektoreinrichtungen (31, 32), die zur Lichtdetektion in verschiedenen Spektralbereichen entsprechend den spektralen Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzmarker ausgelegt sind, und Durchführung einer Kreuzkorrelations- und/oder eine Koinzidenzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen (31, 32). Es wird auch eine Messvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenz- Korrelationsanalyse, insbesondere Verfahren zur Koinzidenz- oder Kreuzkorrelationsanalyse an mit mindestens zwei unter schiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Analyten in einer Probe, und Messeinrichtungen zur Durchführung der genannten Verfahren.

Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) ist als höchstempfindliches optisches Verfahren zum Nachweis von dyna mischen Eigenschaften einzelner Moleküle oder Molekülverbin dungen oder von geringsten Konzentrationen fluoreszierender Substanzen allgemein bekannt. Bei einem herkömmlichen Fluores zenz-Korrelationsspektrometer wird mit einem Mikroskop ein La serstrahl in die Probe eingekoppelt und auf ein Messvolumen von ca. 10^-15 l (1 fl) fokussiert. Das Messvolumen ist so klein, dass sich im zeitlichen Mittel weniger als ein fluores zierendes Molekül darin befindet. Die Fluoreszenz der interes sierenden Probenmoleküle wird durch eine Korrelationsanalyse der Detektorsignale erfasst. Das Mikroskop ist zur dreidimen sionalen Positionierung des Messvolumens ausgelegt, wie dies z. B. mit einem Konfokalmikroskop möglich ist.

Bei der Konfokalspektroskopie wird ein Laserstrahl zur Fluo reszenzanregung auf einen beugungsbegrenzten Punkt in der Pro be fokussiert. Eine Punktblende (sog. "Pinhole") in der Bild ebene, in der der Anregungspunkt abgebildet ist, dient als Feldblende, mit der Fluoreszenz und Streulicht, das von Orten außerhalb des Fokus ausgeht, ausgeblendet wird. Die Beobach tung einzelner Moleküle im Messvolumen wird durch die dynami schen Moleküleigenschaften (Diffusionkoeffizient) in der Probe bestimmt. Um in der zur Verfügung stehenden kurzen Messzeit für ein annehmbares Signal-Rausch-Verhältnis genügend Photonen zu detektieren, müssen bei der herkömmlichen Konofkalspektros kopie relativ hohe Anregungsintensitäten (im Bereich von ca. 100 kW/cm²) verwendet werden. Dies ist jedoch problematisch, da die Stabilität der üblicherweise verwendeten Markierungsfarb stoffe (z. B. Fluorescein-, Rhodamin- und Cyanin-Derivate) be schränkt ist.

Eine Weiterentwicklung des FCS-Verfahrens für heterogene Sys teme, in denen molekulare Wechselwirkungen zwischen verschie denen Analyten beobachtet werden sollen, wird in WO 99/34195 mit der Zweifarben-Kreuzkorrelationsanalyse beschrieben. Bei diesem Verfahren werden mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffe an einen oder mehrere Analyten als Marker gebunden. Die Fluo reszenzfarbstoffe sind so gewählt, dass sie spektral verschie dene Fluoreszenzmaxima besitzen. In einem Messaufbau, der schematisch in Fig. 9 illustriert ist, werden die Farbstoffe mit zwei Lasern 21', 22', die auf die jeweiligen Farbstoffab sorptionen abgestimmt sind, angeregt. Mit zwei spektral auf die verschiedenen Fluoreszenzmaxima abgestimmten Detektoren 31', 32' wird die Fluoreszenzemission aus der Probenkammer 10' erfasst. Die Detektorsignale werden einer Kreuzkorrelations- oder Koinzidenzanalyse unterzogen. Die Konzentration der Probe und die Größe des Messvolumens sind so gewählt, dass zu einem Messzeitpunkt im Messvolumen höchstens ein Molekül vorhanden ist. Durch Auswertung von zeitlichen Korrelationen oder Koin zidenzen in den Detektorsignalen kann erfasst werden, ob sich zum Messzeitpunkt ein Analyt mit dem einen oder anderen oder beiden Markierungsfarbstoffen im Messvolumen befunden hat. Mit der Zweifarben-Korrelationsanalyse können molekulare Assozia tions- oder Dissoziationsvorgänge, wie z. B. die Bildung oder das Aufbrechen von chemischen Bindungen, in Echtzeit gemessen werden.

Die Zweifarben-Technik gemäß WO 99/34195 besitzt aber auch Nachteile, die die Anwendbarkeit und die Genauigkeit des Ver fahrens einschränken. Zur Anregung der Fluoreszenzemissionen der Markierungsfarbstoffe sind gewöhnlich verschiedene Laser 21', 22' erforderlich, deren Foci zeitlich stabil und mit ei ner Genauigkeit von Bruchteilen eines Femtoliters an einem Messpunkt gebildet werden müssen. Es ist ein erheblicher expe rimenteller Aufwand zur Justierung und Stabilisierung der An regungslaser erforderlich. Des Weiteren muss das Abbildungs system zur Erzielung einer genügenden Ortsauflösung in Be strahlungsrichtung (z-Richtung) abbildungsseitig ein Pinhole vorgesehen sein, auf das das Messvolumen abgebildet wird. Eine weitere Beschränkung betrifft die verfügbaren Farbstoffsyste me. Die Markierungsfarbstoffe müssen bei allen Anregungswel lenlängen eine hohe Lichtstabilität besitzen. Außerdem müssen die verwendeten Markierungsfarbstoffe hohe Quantenausbeuten aufweisen.

Von W. Denk et al. wird in "Science", 1990, Band 248, Seite 73 ff. ein Verfahren zur Scanning-Fluoreszenzmikroskopie mit 2-Photonen-Laseranregung beschrieben. Es wurde festgestellt, dass bei 2-Photonen-Anregung Lichtschäden an den Markierungs farbstoffen und auch lichtinduzierte Zerstörungen der Zellum gebung in biologischen Proben vermieden werden. Allerdings er fordert die 2-Photonen-Anregung extrem hohe Photonen- Flussdichten der Größenordnung von 10³¹ Photonen/cm², um die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen innerhalb des Wir kungsquerschnittes der Farbstoffmoleküle zu bewirken. Die 2- Photonen-Anregung war bisher auf die Scanning-Mikroskopie be schränkt.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Fluoreszenzmessung auf der Basis einer Kreuzkorrelations- und/oder Koinzidenzanalyse anzugeben, mit dem die Nachteile insbesondere der herkömmlichen Zweifarben-Technik vermieden werden. Das erfindungsgemäße Verfahren soll mit einem verein fachten Messaufbau realisiert werden, ohne dass Einschränkun gen in Bezug auf die Genauigkeit und Stabilität hingenommen werden müssen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbes serte Korrelations- und/oder Koinzidenzmessvorrichtungen zur Fluoreszenzmessung mit einem vereinfachten Aufbau anzugeben.

Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren und einer Vorrich tung zur Fluoreszenzmessung mit den Merkmalen gemäß dem Pa tentansprüchen 1 bzw. 8 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung ist es, zur Korrelations- Fluoreszenzmessung an Analyten mit mindestens zwei Fluores zenzmarkern auf einem oder mehreren zu analysierenden Stoffen die Probe mit einer derart hohen Anregungsintensität (Photo nenflussdichte) zu beleuchten, dass die Fluoreszenzanregung der Fluoreszenzmarker durch 2-Photonen-Absorptionen erfolgt. Die Probe wird vorzugsweise mit einer einzigen Laserlinie be leuchtet. Der Laserstrahl wird in die Probe an dem gewünschten Ort des Messvolumens fokussiert. Die Fluoreszenzmarker werden simultan bei einer gemeinsamen Anregungswellenlänge angeregt, besitzen aber spektral getrennte Fluoreszenzemissionen, die mit verschiedenen Detektoren erfasst werden. Die Signale der Detektoren werden einer Korrelationsanalyse (Koinzidenz- oder Kreuzkorrelationsanalyse) unterzogen. Die 2-Photonen-Anregung von Fluoreszenzmarkern besitzt den Vorteil, dass Fluoreszenz marker verwendet werden können, die ähnliche Maxima in den An regungsspektren der 2-Photonen-Anregung besitzen, sich jedoch durch verschieden starke Stokes-Verschiebungen der Emission auszeichnen.

Die Fluoreszenzmessung ist auf eine einzelmolekülbasierende Analyse gerichtet, bei der das Mess- oder Beobachtungsvolumen so klein ist, dass Fluoreszenzfluktuationen von einzelnen Mo lekülen detektiert und ausgewertet werden können.

Erfindungsgemäß ergibt sich eine erhebliche Vereinfachung des Messaufbaus. Die Vereinfachung besteht erstens darin, dass nur ein Laser zur Anregung benutzt werden muss. Eine weitere Ver einfachung des experimentellen Aufbaus ist gegeben, da das An regungsvolumen der 2-Photonen-Anregung in Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (z-Richtung) gegenüber dem Anregungsvolumen bei 1-Photon-Anregung verkleinert wird. Die Wahrscheinlichkeit der 2-Photonen-Absorption ist vom Quadrat der Anregungsinten sität abhängig. Der Absorptionsquerschnitt verringert sich deshalb für 2-Photonen-Absorptionsprozesse außerhalb der Fo kalebene in z-Richtung proportional zu z^-4. Es ergibt sich eine inhärente Konzentration der Anregung auf die Fokalebene. Es ist nicht zwingend erforderlich, das Messvolumen auf ein Pin hole abzubilden, da außerhalb der Fokalebene ohnehin kein Flu oreszenzlicht in den interessierenden Spektralbereichen emi tiert wird.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der 2-Photonen-Anregung gemäß der Erfindung besteht in der hohen Toleranz biologischer Mate rialen (Zellen, Zellbestandteile oder Zellverbunde) gegenüber Infrarotstrahlung. Zur Anregung einer Fluoreszenzemission im sichtbaren Spektralbereich durch 2-Photonen-Absorption ist es ausreichend, wenn mit Laserlicht im roten oder nahen infraro ten Spektralbereich angeregt wird. Aufgrund der langwelligen Anregung ergibt sich ein weiterer Vorteil für das Signal- Rausch-Verhältnis, da Anregungs- und Emissionslicht spektral weit voneinander getrennt sind, so dass störendes Streulicht weitestgehend durch optische Filter unterdrückt werden kann, ohne einen Teil des zu detektierenden Emissionslichts einzubü ßen. Ein weiterer Vorteil hierbei ist die Reduktion von Falschlicht, was hauptsächlich die Fluoreszenz von Verunreini gungen ("Schmutz") betrifft. Diese Fluoreszenz ist im wesentlichen im kurzwelligen sichtbaren Bereich, also im Fall von 1- Photonen-Anregung kritisch. Bei einer langwelligen 2-Photonen- Anregung werden solche Verunreinigungen mit deutlich geringe rer Effizienz angeregt, so dass hierdurch das Signal-zu- Rausch-Verhältniss - verglichen zur 1-Photonen-Anregung - deutlich höher liegt.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Messvorrichtung zur Fluoreszenzmessung an Analyten mit mindestens zwei unter schiedlichen Fluoreszenzmarkern, bei der die Beleuchtungsein richtung durch eine einzelne Laserlinie gebildet wird, die zur Anregung von 2-Photonen-Absorptionen der Fluoreszenzmarker ausgelegt ist. Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungs gemäßen Vorrichtung besteht in der Bereitstellung von zwei De tektoreinrichtungen, die zur Detektion der Fluoreszenzemission in verschiedenen Spektralbereichen eingerichtet sind und auf die das gesamte, von der Probe (insbesondere vom Anregungsvo lumen und auch aus der Umgebung des Anregungsvolumens) ausge hende Fluoreszenzlicht abgebildet wird. Die Detektion erfolgt blendenfrei, eine Pinhole-Blende ist nicht vorgesehen. Es ist eine nicht-konfokale Abbildung des Anregungsvolumens auf die Detektoren vorgesehen.

Durch die 2-Photonen-Anregung mit einem einzelnen Laser wird nicht nur der Geräteaufwand reduziert. Es ergeben sich auch Vorteile für die optische Justierung. Das Problem von Größe und Überlappung von Anregungsvolumen ist ausgeschlossen. Zu sätzliche Detektionsblenden sind nicht erforderlich. Werden Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet, so ergibt sich als weiterer Vorteil die Tatsache, dass nach der 2-Photonen- Anregung praktisch keine Triplett-Zustände eingenommen werden, so dass keine Signalverluste über die Triplett-Bildung erfol gen.

Das Anregungsvolumen ist beim erfindungsgemäßen Messverfahren kleiner als bei der herkömmlichen 1-Photon-Anregung. Dies er möglicht, Messungen bei höheren Probenkonzentrationen von un gefähr 100 nM durchzuführen, was Vorteile für die weitere Be wertung der Ergebnisse besitzt. Es können aber auch Konzentra tionen im nM-Bereich ermittelt werden. Es werden kurze Analy sezeiten im Bereich von einer oder wenigen Sekunden ermög licht. Es werden Messungen in lebenden Zellen ermöglicht, die die genaue Bestimmung von Kinetiken und Konzentrationen dop pelt markierter Moleküle oder Komplexe erlaubt.

Wichtige Merkmale der Erfindung bestehen darin, dass nur ein Anregungsvolumenelement gegeben ist, da zwei verschiedene Flu orophore monochromatisch mittels 2-Photonenanregung auf Ein zelmolekülbasis angeregt werden. Die 2-Photonenanregung bietet insbesondere die folgenden Vorteile: es ist ein physikalisch perfektes Überlappen der Anregungsvolumenelemente für beide Fluorophore gegeben. Das Anregungsvolumenelement kann gegen über herkömmlichen Verfahren verkleinert werden, d. h. es sind Messung von höheren Konzentrationen (100 nM und höher) ist möglich. Es erfolgt eine Detektion ohne Pinhole (Anregungsvo lumenelement ist durch 2-Photonenanregung klein genug). Es wird eine Multi-Color-Detektion von drei oder mehr Fluoropho ren auf Einzelmolekülbasis möglich, d. h. es kann eine mono chromatische Anregung über 2-Photonen bei z. B. < 800 nm und eine Detektion von verschiedenen Fluorophoren von 300 bis < 800 nm erfolgen, ohne das in diesem Bereich störende Anre gungswellenlängen liegen, wie es bei der CW-Anregung notwendig ist. Es werden Messungen von Molekülen, insbesondere von Mole külkomplexen mit drei oder mehr Komponenten, ermöglicht.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersicht lich. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer erfindungsgemäßen Messvorrichtung,

Fig. 2 eine Illustration von molekularen Vorgängen, die mit Vorteil mit der erfindungsgemäße Kor relationsmessung erfassbar sind,

Fig. 3 Kurvendarstellungen der spektralen Eigenschaf ten von Markierungsfarbstoffen,

Fig. 4, 5 Messergebnisse zur Illustration der Quanten ausbeute von Markierungsfarbstoffen in Abhän gigkeit von der Anregungswellenlänge und der Anregungsleistung,

Fig. 6, 7 Kurvendarstellungen zur Illustration der Ge nauigkeit und Selektivität der erfindungsgemä ßen Korrelationsmessung,

Fig. 8 Kurvendarstellungen eines erfindungsgemäß beo bachteten enzymatischen Abbaus einer Substanz, und

Fig. 9 eine schematische Übersichtsdarstellung einer herkömmlichen Messvorrichtung zur Zweifarben- Korrelationsmessung (Stand der Technik)

Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf 2-Photonen- Anregungen in Testsystemen mit zwei Fluoreszenzmarkern be schrieben. Entsprechende Umsetzungen der Erfindung ergeben sich bei Mehr-Farben-Anwendungen. Es können drei oder mehr ge eignete Fluorophore mit einer einfarbigen 2-Photonen-Anregung zur Emission angeregt werden. Dies erlaubt die Vermessung kom plexer molekularer und zellulärer Prozesse, an denen mehr als zwei Analyte beteiligt sind.

Der optische Aufbau eines 2-Photonen-Fluoreszenzkorrelations spektrometers gemäß der Erfindung ist schematisch in Fig. 1 illustriert. Das Spektrometer 100 umfasst eine Probenkammer 10, eine Beleuchtungseinrichtung 20, eine Detektoreinrichtung 30, einen Korrelator 40 und ein Abbildungssystem 50. Das Ab bildungssystem 50 wird vorzugsweise durch einen invertierten Mikroskopaufbau (z. B. mit einem Olympus IX70-Mikroskop) ge bildet. Die Probenkammer 10 ist ein anwendungsabhängig gewähl tes Behältnis, in dem die Probe 11 ruhend oder strömend ange ordnet ist. Die Probe 11 ist eine Lösung oder Suspension der zu untersuchenden Substanzen oder Partikel. Es kann vorgesehen sein, dass die Probenkammer 10 in einer oder mehreren Raum richtungen beweglich angeordnet ist. Die Beweglichkeit der Probenkammer kann sich erstens auf eine Scan-Bewegung relativ zum Abbildungssystem 50 zur Aufnahme dreidimensionaler Abbil dungen, z. B. dreidimensionaler Konzentrationsverteilungen in der Probe, beziehen. Ferner ist es möglich, der Probenkammer 10 eine periodische Modulationsbewegung aufzuprägen, wie es in WO 99/34195 beschrieben ist. Die zum Abbildungssystem 50 wei sende Wand der Probenkammer 10 besitzt eine derart geringe Di cke, dass der Fokus 12 des Anregungslichts mit einem geringen Abstand von ca. 400 bis 500 µm vom Objektiv 51 gebildet werden kann. Die entsprechende Wand besitzt vorzugsweise die Dicke eines Deckglases, wie es in der Mikroskopie verwendet wird. Die Dicke beträgt bspw. ca.. 150 bis 190 µm.

Die Beleuchtungseinrichtung 20 ist ein einzelner Laser, der für die 2-Photonen-Anregung der jeweils verwendeten Fluores zenzmarker ausgelegt ist. Bei der Markierung mit Fluoreszenz farbstoffen wird vorzugsweise ein durchstimmbarer Pulslaser verwendet, wie z. B. ein modengekoppelter Tsunami Ti: Saphier- Laser (Hersteller: Spectra Physics, Mountain View, CA, Puls frequenz 80 mHz, Pulsbreite 100 fs, Durchstimmbarkeit zwischen 700 und 1000 nm). Das parallele Laserlicht wird über den dichroitischen Spiegel 52 (z. B. vom Typ 710 DCSPXR, ABF Analysen technik, Tübingen, Deutschland) in das Objektiv 51 gelenkt (z. B. 60 × 1.2-Objektiv UplanApo Olympus) und in der Probenkammer 10 fokussiert. Aus Kalibrierungsmessungen sind die Dimensionen des Anregungsvolumens r₀ und z₀ in der Fokalebene bekannt. Der Durchmesser des Fokus in der Fokalebene beträgt z. B. r₀ = 0.48 µm. Mit einem Verhältnis r₀/z₀ = 2.8 ergibt sich ein wirksames Anregungs-Volumenelement von ungefähr 0.4 fl.

In diesem Anregungsvolumen wird je nach Anwesenheit von Fluo reszenzmarkern eine Fluoreszenzemission angeregt, die über das Objektiv 51, den dichroitischen Spiegel 52, einen Emissions filter 53 (z. B. vom Typ 600 DF 200, AHF Analysentechnik) zur Unterdrückung des Anregungslichts und eine Optik 54 auf einen zweiten dichroitischen Spiegel 55 (z. B. vom Typ 595 DCLP, AHF Analysentechnik) gerichtet wird. Am zweiten dichroitischen Spiegel 55 wird der kurzwellige Teil des Fluoreszenzlichtes reflektiert und durch einen Bandpassfilter 56 auf den langwel ligen Detektor 31 der Detektoreinrichtung gerichtet. Das am dichroitischen Spiegel durchgelassene Fluoreszenzlicht wird ebenfalls gefiltert (Kantenfilter 57) und auf den kürzerwelli gen Detektor 32 gerichtet. Die Einkopplung in die Detektoren erfolgt mit Lichtleitfasern 58 bzw. 59. Die Detektoren sind bspw. Avalanche-Photodioden (Typ: SPCM-200, EG & G Optoe lectronics, Kanada). Die optischen Einkoppelfasern besitzen einen Durchmesser von 100 µm und sind einzelnen in allen drei Raumrichtungen justierbar. Die Detektoren 31, 32 sind mit ei nem Korrelator 40 verbunden. Als Korrelator wird bspw. eine Korrelatorkarte (Typ: ALV-5000, Hersteller LAV Langen, Deutschland) verwendet. Abweichend vom in Fig. 1 gezeigten Aufbau kann auch auf die Einkoppelfasern verzichtet und das Fluoreszenzlicht direkt auf die Detektoren abgebildet werden. Der optische Aufbau kann zusätzlich zur Aufnahme von konfoka len Spektren mit einem fasergekoppelten Spektrometer (Herstel ler Ocean Optics, USA) ausgestattet sein.

Die Probe 11 in der Probenkammer 10 enthält mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei Fluoreszenzmar kern markierten Analyten. Gegenstand der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmessung ist bspw. eine Koinzidenzanalyse der mit den Detektoren 31, 32 erfassten Fluoreszenzemissionen der ver schiedenen Fluoreszenzmarker. Dies ist schematisch in Fig. 2 illustriert. In der Probe sind bspw. die Analyten A1 und A2 enhalten, die jeweils mit Fluoreszenzmarkern M1 und M2 mar kiert sind. Die Analyten sind bspw. Paare von Antikörpern und Antigenen, deren Bindungsverhalten untersucht werden soll. So lange die Analyten A1 und A2 nicht aneinander gebunden sind, passieren sie getrennt zu verschiedenen Zeiten das Anregungs volumen. Die Detektoren 31, 32 liefern zeitlich getrennt Fluo reszenzsignale, die in Fig. 2 (links, Mitte) schematisch durch Pfeile P1, P2 symbolisiert werden. Die Fluoreszenzsigna le werden unkorreliert zu beliebigen Zeiten gemessen, ein Kor relations- oder Koinzidenzsignal G ist nicht ableitbar. Nach dem die Bindung zu einem Analyten A3 erfolgt ist, der die Flu oreszenzmarker M1 und M2 gemeinsam trägt, wird an beiden De tektoren 31, 32 gleichzeitig die Fluoreszenzemission erfasst. Entsprechend ist ein Korrelations- oder Koinzidenzsignal ableitbar (Fig. 2, rechts unten).

Umgekehrt kann auch die Zerlegung des Analyten A3 in Teilkom ponenten detektiert werden, wie dies bspw. bei der Beobachtung des enzymatischen Abbaus eines zweifach mit Fluoreszenzmarkern gelabelten Substrats von Interesse ist. Allgemein werden mit dem erfindungsgemäßen Messverfahren vorzugsweise alle chemi schen Reaktionen oder physikalischen Abläufe erfasst, bei de nen eine chemische Bindung zwischen getrennten Analyten herge stellt oder eine vorhandene Bindung aufgeschnitten oder ent sprechend eine physikalische Assoziation oder Dissoziation durchgeführt wird. Dem Messverfahren sind alle Analyten (Substanzen) zugänglich, die auf den verschiedenen Seiten der je weils herzustellenden oder zu trennenden Verbindung mit Fluo reszenzmarkern markierbar sind.

Die Signalerfassung mit den Detektoren und die Korrelations analyse erfolgen in an sich von den FCS-Techniken bekannter Weise. Mit den Detektoren erfolgt eine Fluoreszenzmessung in vorbestimmten Zeitfenstern. Die Breite der Zeitfenster wird anwendungsabhängig gewählt. Sie wird vorzugsweise auf die mittlere Aufenthaltsdauer der Analyten im Messvolumen einge stellt. Die Aufenthaltsdauer ist insbesondere von der Molekül- oder Teilchengröße und -beweglichkeit abhängig und kann gemes sen oder theoretisch abgeschätzt werden. Die in den Zeitfens tern erfassten Photonenzahlen werden in den beiden Detekti onskanälen verglichen. Zur Koinzidenzanalyse erfolgt der Ver gleich gleichzeitiger Zeitverläufe. Die Kreuzkorrelationsana lyse ist auf den Vergleich zeitlich versetzter Abläufe gerich tet. Die Korrelationanalysen werden mit an sich bekannten Al gorithmen zur Verarbeitung der Signale der verschiedenen De tektionskanäle durchgeführt.

Auf der Grundlage der Koinzidenzanalyse ist eine Konzentrati onsmessung möglich. Aus der Stärke der erfassten Koinzidenzen (Amplitude von Koinzidenzsignalen) wird ein Maß für die Zahl der doppelt markierten Moleküle oder Teilchen in der Probe abgeleitet.

Die mit dem Korrelator 40 durchgeführte Kreuzkorrelations- oder Koinzidenzanalyse der Detektorsignale erfolgt vorzugswei se in bekannter Weise, wie es in WO 99/34195 beschrieben ist. Die in dieser Patentanmeldung offenbarten Einzelheiten zur Signalanalyse werden vollständig durch Bezugnahme in die vor liegende Beschreibung einbezogen.

Es kann insbesondere analog zu dem in WO 99/34195 beschriebe nen Verfahren vorgesehen sein, dass während der Fluoreszenz analyse mittels eines Strahlscanners und/oder eines Probensan triebs zwischen der Probe und der Beleuchtungseinrichtung eine Relativbewegung eingestellt wird. Es erfolgt eine Erhöhung der Fluktuationsbewegungen, die Diffusionszeiten werden niedriger. Das Messvolumenelement kann durch die Probe gescannt werden. Bei Einstellung dieser Relativbewegung ist gegebenenfalls das Zeitfenster der Koinzidenanalyse anzupassen.

Als Fluoreszenzmarker M1, M2 werden vorzugsweise Fluoreszenz farbstoffe verwendet, wie sie bspw. aus der Fluoreszenzmikro skopie bekannt sind. Es werden Farbstoffpaare ausgewählt, die bei einer ausgewählten Wellenlänge ähnliche Absorptionsquer schnitte aufweisen und spektral separierbare Fluoreszenzspekt ren bei hoher Photostabilität besitzen. Als Markerpaare werden bspw. die Farbstoffe Rhodamin Grün/Texas Rot, Fluoreszein- Derivate (z. B. Alexa 488/Alexa 594) oder molekular biologische Farbstoffe wie grün fluoreszierende Proteine (GFP)/rot fluoreszierende Proteine (RFP) verwendet. Anstelle von Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen können auch andere fluoreszierende Substanzen oder Partikel, z. B. sog. Quantum Dots, als Fluoreszenzmarker eingesetzt werden. Es kön nen auch autofluoreszierende Proteine, wie z. B. GFP, dsRED, autofluoreszierende Biomolekülen, z. B. Tryptophan, Tyrosin, oder Flavine, oder autofluoreszierende organische Molekülen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Erfassung von Ramanstreuung oder oberflächenverstärkter Ra manstreuung (surface enhanced raman scattering, SERS) ausge legt sein.

Fig. 3 zeigt die spektralen Eigenschaften des Markersystems Rhodamin Grün/Texas Rot. Beide Farbstoffe zeigen eine ähnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute und eine genügende Lichtstabi lität, um die erfindungsgemäß verwendeten Anregungsintensitäten zu tolerieren. Die Spektren (1) und (2) zeigen die Fluo reszenzemissionen von Rhodamin Grün bzw. Texas Rot (µM-Lösun gen) bei einer Anregungswellenlänge von 830 nm. Die Kurve (3) zeigt den Transmissionsverlauf des dichroitischen Spiegels 55. Im Bereich der kürzerwelligen Fluoreszenz (1) erfolgt die Re flektion zum Detektor 31. Die Kurven (4) und (5) zeigen die Transmissionscharakteristik der Filter 56 bzw. 57, die zur weiteren Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses vorgese hen, jedoch kein zwingendes Merkmal der Erfindung sind.

Die Fig. 4 und 5 illustrieren weitere spektrale Eigenschaf ten des Markerpaars Rhodamin Grün/Texas Rot. Zur Ermittlung der optimalen Anregungswellenlänge zur 2-Photonen-Anregung wird für jeden Farbstoff ein Anregungsspektrum im Bereich 740 nm bis 900 nm aufgenommen. Die Kurvenverläufe in Fig. 4 zei gen ein Anregungsmximum bei 780 nm für Texas Rot (Kreuze) und bei 850 nm für Rhodamin Grün (Dreiecke). Für die erfindungsge mäßen Fluoreszenzmessungen wird eine Anregungswellenlänge ge wählt, bei der beide Farbstoffe mit nahezu gleicher Effizienz anregbar sind und/oder bei der beide Farbstoffe vergleichbar starke Fluoreszenzemissionen zeigen. Die Anregungswellenlänge beträgt beim dargestellten Beispiel 830 nm. Fig. 5 zeigt, dass die Anregung bei 830 nm tatsächlich eine 2-Photonen- Absorption bewirkt. Für beide Farbstoffe wurde getrennt die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Anregungsleis tung gemessen. Für beide Farbstoffe ergibt sich unterhalb der Sättingungsgrenze die für 2-Photonen-Prozesse zu erwartende quadratische Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der eingestrahlten Leistung. Die doppelt logarithmische Darstel lung liefert die entsprechende linearisierte Form mit Steigung 2.

Fig. 6 zeigt den Verlauf von Autokorrelationskurven, die mit einer Testlösung von Rhodamin Grün in den beiden Detektionka nälen aufgenommen wurden und eine entsprechende Kreuzkorrelationskurve zwischen beiden Detektionskanälen. Alle drei Kurven verlaufen im Wesentlichen gleich. Dies zeigt, dass die Detek tionsvolumen identisch bzw. die Detektionsstrahlengänge genau auf das Anregungsvolumen justiert sind. Kreuzkorrelationsmes sungen an doppelt markierten (obere Kurve) und einfach mar kierten (untere Kurve) DNA-Proben sind in Fig. 7 illustriert. Als Vorteil des Messverfahrens zeigt sich, dass sich für die nicht-korrelierten Proben Kreuzkorrelationssignale G ergeben, die weniger als 10% der entsprechenden korrelierten Signale betragen. Damit ist der erfindungsgemäße Aufbau den herkömmli chen 1-Photon-Messungen überlegen.

Fig. 8 illustriert eine bevorzugte Anwendung des erfindungs gemäßen Messverfahrens zur Ermittlung von Konzentrationen in der Probe. Es wird die Echtzeitmessung von Enzymkinetiken dar gestellt. Ein zweifach markiertes Substrat (DNA-Probe) wird enzymatisch in einzeln markierte Produkte zerlegt. Dementspre chend sinkt die Zahl der erfassten doppelt markierten Moleküle im Zeitverlauf. Mit zunehmender Konzentration des zugesetzten Enzyms (Endonuklease EcoRI) wird der Abfall der Substratkon zentration beschleunigt.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

1. Verfahren zur Fluoreszenzmessung an Analyten in einer Probe, wobei die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Analyte und/oder mindestens ei nen mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Analyten enthält, wobei die Fluoreszenzmarker spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen besitzen, mit den Schritten:

- Beleuchtung der Probe (11) in einem Messvolumen mit einem Laser (20) zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindes tens zwei Fluoreszenzmarker,
- Detektion der Fluoreszenzemission mit mindestens zwei De tektoreinrichtungen (31, 32), die zur Lichtdetektion in ver schiedenen Spektralbereichen entsprechend den spektralen Flu oreszenzeigenschaften der Fluoreszenzmarker ausgelegt sind, und
- Durchführung einer Kreuzkorrelations- und/oder eine Koinzi denzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen (31, 32),

dadurch gekennzeichnet, dass
die Beleuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensi tät erfolgt, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2- Photonen-Absorptionen angeregt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Detektion der Fluoreszenzemission eine blendenfreie Abbildung des Lichtes, das vom Messvolumen und von der Umgebung des Messvolumens ausgeht, auf die Detektoreinrichtungen erfolgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem als Fluores zenzmarker Fluoreszenzfarbstoffe, fluoreszierende Proteine, Biomoleküle, organische Moleküle, Quantum Dots oder Marker, die zur Erfassung von Ramanstreuung ausgelegt sind, verwendet werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem als Fluoreszenzmar ker Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, die sich überlap pende 2-Photonen-Anregungsspektren und unterschiedliche Fluo reszenzemissionsspektren besitzen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem eine Koinzidenzana lyse der Detektorsignale erfolgt und aus dem Ergebnis der Ko inzidenzanalyse die Konzentration von mehrfach markierten Analyten in der Probe abgeleitet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem mittels eines Strahlscanners und/oder eines Probensantriebs zwischen der Probe und der Beleuchtungseinrichtung eine Relativbewegung eingestellt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, bei dem die Koinzi denzanalyse durch Vergleich der in bestimmten Zeitfenstern erfassten Fluoreszenzsignale der verschiedenen Detektorein richtungen (31, 32) erfolgt, wobei die Breite des Zeitfens ters im Bereich der mittleren Aufenthaltsdauer der Analyten im Messvolumen eingestellt ist.

8. Vorrichtung (100) zur Fluoreszenzmessung an Analyten in einer Probe, wobei die Probe mindestens zwei mit unterschied lichen Fluoreszenzmarkern markierte Analyte und/oder mindes tens einen mit mindestens zwei Fluoreszenzmarkern markierten Analyten enthält, die umfasst:
eine Probenkammer (10), in der die Probe angeordnet ist,
eine Beleuchtungseinrichtung (20), die zur Anregung von Fluoreszenzemission der mindestens zwei Fluoreszenzmarker mit einer einzigen Laserlinie eingerichtet ist,
mindestens zwei Detektoreinrichtungen (31, 32), die zur De tektion der Fluoreszenzemission in verschiedenen Spektralbereichen ausgelegt sind, und
ein Korrelator (40) zur Kreuzkorrelations- und/oder Koinzi denzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Beleuchtungseinrichtung einen Laser umfasst, der zur Be leuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzel nen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensität ausgelegt ist, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2- Photonen-Absorptionen angeregt werden.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, bei dem der Laser bei ei ner Anregungslinie emittiert, die im roten oder nah infraroten Spektralbereich liegt.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, bei der ein Abbil dungssystem (50) mit Pinhole-freiem Aufbau vorgesehen ist.

11. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Messung von Konzentra tionen in Probenlösungen oder -supensionen zur

- Erfassung von molekularen Vorgänge in biologischen Zellen, physikalischen oder chemischen Vorgängen zur Verbindung oder Trennung von Substanzen oder Partikeln, oder molekularen Ei genschaften, wie physikalischen oder chemischen Assoziation oder Bindungen bzw. Spaltungen oder Dissoziationen durch Kon zentrationsbestimmung der Analyten,
- Diffusionsanalyse,
- Triplettanalyse mittels Kreuzkorrelation,
- molekularen Helligkeits- und Polarisationsanalyse der Fluo rophore, oder
- Analyse- oder Bewertung beim High-Throughput-Screening oder beim Selektionsschritt bei der evolutiven Optimierung von Biomolekülen.