WO2020182256A1 - Vorrichtung zur spektroskopischen bestimmung der bindungskinetik eines analyten - Google Patents

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WO2020182256A1
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microstructure
optical
light source
analyte
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PCT/DE2020/100177
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Götz Dähne
Lars DÄHNE
Michael Himmelhaus
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Surflay Nanotec Gmbh
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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the invention relates to a device for the quantitative determination of the binding kinetics of an analyte.
  • the rate at which the respective analyte attaches to a complement can be determined in particular for different analytes contained in a fluid.
  • This rate ie the adsorption rate, is determined by means of the device in a spectroscopic manner and without a label, i.e. without the need for special marking of the analyte itself.
  • the device as a desorption rate and also label-free, can also be used - to a certain extent the other way round - to determine the rate at which an analyte adhering to a complementary is detached from this complementary, ie desorbed, by a moving fluid.
  • Desorption rates are determined, for example, in the context of release studies or when assessing the stability of layers to be applied to a surface.
  • binding kinetics Insofar as the determination of the binding kinetics is spoken of in the following descriptions and in the claims, this means in the broadest sense the determination of data which describe these binding kinetics, i.e. in particular the time course of the attachment of an analyte to one or its detachment from a complementary , ie the determination of an adsorption rate or a desorption rate and / or physical quantities or chemical properties which can be derived therefrom and which relate to the analyte. With regard to the preferred intended use of the device, the following representations generally relate to the determination of adsorption rates, without the invention being limited thereto.
  • binding kinetics and the phrase “determination of the binding kinetics” always include both possibilities of using the device, that is to say its optional use for considering adsorption processes or for considering desorption processes.
  • adsorption rate i.e. explanations given for determining it, always also adequately to the desorption rate, that is to say to its determination.
  • the invention itself relates in particular to essential components of the device that are arranged together in one device, their configuration and their interaction.
  • the binding kinetics specifically the adsorption rate at which an analyte under consideration in this context attaches to a complement or the rate (desorption rate) at which such an analyte detaches from a surface becomes.
  • the analyte can, for example, be a chemical substance, such as a medicinal substance, a DNA segment or an antibody, or else a heavy metal or a nanoparticle.
  • pharmacology for example, when developing drugs, it is important to know how an active ingredient contained in a drug accumulates in the body, namely in particular on certain body cells.
  • the determination of the adsorption rate taking place in the laboratory is carried out on the basis of a liquid that carries the analyte in question or, more generally, of a fluid that carries the analyte with it.
  • label-free methods that do not require marking of the analyte have been used for some time.
  • surface sensors are used which are provided with a substance which is complementary to the analyte in question, that is to say which is suitable for the analyte to adhere to the surface. The surface functionalized in this way is then flowed against by a fluid containing the analyte and examined in which way and in which time course the physical properties of the surface change due to the analyte adhering to it.
  • the microstructure is one or, preferably, several microchannels with a fleas and a width of a few micrometers each, introduced into a suitable substrate, for example made of glass.
  • a fold structure in the form of one or more recesses provided on the bottom of the microchannels is formed in the microchannels.
  • Microparticles are introduced into the preferably several, for example dome-shaped depressions, by flooding them into the microchannels with the aid of a fluid, for example by means of a liquid, and sediment at the bottom of the microchannels in the area of the depressions formed therein.
  • the transparent spherical microparticles are functionalized on their surface for the specific attachment of the analyte to be examined in terms of its adsorption rate and have a light inside fluorescent dye that can be excited to glow. As a result, they form micro-sensors.
  • a respective microparticle is exposed to the focused light from a light source, preferably a laser.
  • the fluorescent dye contained in the microparticle is stimulated to emit light, the wavelength spectrum of which is determined by the composition of the dye and the size of each microparticle.
  • the microparticle represents a resonance space comparable to the resonator of a laser, so that these light modes form a standing wave inside the microparticle through total reflection on the inside of its surface and are thereby intensified before part of this light finally leaves the microparticle.
  • the peak wavelengths for the light modes emitted by the microparticle are determined with the aid of a spectrometer. Thereafter, the previously described microstructure is flushed through by a fluid containing the analyte to be examined. The analyte is deposited on the functionalized surface of the microparticle, i.e. a microparticle previously examined spectrographically without the presence of the analyte. If the microparticle is now repeatedly exposed to the light used to excite the dye it contains during this attachment process, the position of the previously determined peak wavelengths due to the exposure changes as a result of the change in the refractive index on the outer surface of the microparticle the light modes emitted from the microparticle. This
  • the object of the invention is to provide a device which, for the label-free quantitative determination of the binding kinetics, namely in particular to determine the adsorption rate of an analyte contained in a fluid or the desorption rate of an analyte released into a fluid, the analysis principle and a microstructure of the type described above is used and has a construction that is as compact as possible and comparatively robust.
  • the device according to the invention for label-free spectroscopic determination of the adsorption rate of an analyte contained in a fluid or for determining the desorption rate of an analyte released into a fluid and its essential components will be presented.
  • An essential part of the device is initially a light source for emitting the light used for the spectroscopic analysis. It is this light source is preferably a pulse width modulated laser with a power between 0.1 mW and 10 mW.
  • an analyte that can be examined with regard to its adsorption behavior or desorption behavior by means of the device according to the invention, it can, as already mentioned at the beginning, be, for example, a chemical substance, such as a medicinal substance, a DNA segment or an antibody or the like, or else heavy metal ions or be nanoparticles.
  • a fluidics module which consists of a movable carrier and a microstructure arranged on this carrier and through which a fluid can flow. At least one microparticle, which functions as an optically active microsensor, is held by the aforementioned microstructure designed accordingly.
  • microsensor and microparticle are therefore also used synonymously below.
  • a fluid is understood to mean a liquid or a gas (possibly also air).
  • the at least one microsensor is designed to accumulate an analyte supplied to the microstructure in a fluid or - in the case of a desorption rate determination - to release an analyte already adhering to its surface to the fluid supplied to the microstructure. It is also designed to emit light modes as a result of exposure to the light from the light source mentioned at the outset and is therefore also referred to as an optically active microsensor in the context of these illustrations to explain the invention.
  • This is a spherical, that is to say a spherical microparticle of the type described at the beginning in the explanation of the prior art with a diameter between 5 ⁇ m and 30 ⁇ m, preferably between 7 ⁇ m and 12 ⁇ m.
  • its microstructure is designed to hold one or preferably several such microsensors.
  • microparticles that are individually exposed to the light of the light source absorb the incident light and emit the specific modes (WGM).
  • WGM specific modes
  • the wavelengths of these specific modes are determined by the fluorescent dye of the respective microparticle and by resonances that occur depending on the particle size, as well as by the difference between the refractive index of the microparticle and that of its immediate surroundings as a result of adsorption or desorption of the analyte.
  • the fluidics module is preferably a fluidics chip with a microstructure, of the type already described in connection with the statements relating to the prior art.
  • the microstructure here has one or more microchannels through which a fluid can flow, each at the bottom of these microchannels, one or more depressions with a depth between 5 ⁇ m and 30 ⁇ m are provided to form a holding structure for one spherical microparticle.
  • the microparticles held in this microstructure in connection with the intended use of the device are - as already stated - to
  • Spherical microparticles the surface of which is complementary functionalized for the purpose of the specific attachment of an analyte examined for its adsorption behavior and which also have a fluorescent dye inside which, when exposed to light of a certain wavelength, is used for the spectroscopic analysis Light modes emitted.
  • the fluidics module is provided with corresponding connections, via which the respective fluid is fed to the microchannel or microchannels.
  • the fluidics module can also be implemented, for example, in the form of an array of living cells, a chip controlled by means of electrical fields (dielectrophoresis chip) or an optically controlled chip (laser tweezers) or have at least one sensor trapped in microfluidic droplets.
  • the module itself should not be the subject of more detailed considerations in the context of the invention presented here, since this, for example, in the embodiment described in more detail above, is basically already known from the prior art and is therefore not itself the subject of the invention.
  • a fluid is supplied to the fluidics module and / or that the fluidics module is designed to supply a fluid and / or that the device comprises means for moving and supplying a fluid to the fluidics module, this means that a fluidics module designed in the manner described in more detail above can also be supplied with a different fluid than the fluid containing the analyte or the fluid that detaches the analyte from a microparticle.
  • the fluidics module is a replaceable component.
  • This component can be brought into an operative connection with the other components of the device with a microstructure already holding one or more microsensors, or as a module in its microstructure only after the connection of the module with the components of the device, for example immediately before the Examination of an analyte for its adsorption behavior or desorption behavior, one or more micro-particles are introduced.
  • the fluidics module is supplied with a fluid in which the optically re-active elements to be attached to the folded structure are supplied to the microstructure before the actual investigation process with the aid of the means already mentioned and mentioned in claim 1 for moving and supplying fluid to the microstructure or for the delivery of the analyte to be examined, namely the functionalized microparticles are suspended.
  • the actual analysis process is preceded by a rinsing process to introduce the microparticles into the microstructure.
  • a fluid fed to the fluidics module via said means can also be used to rinse the microstructure in order to release “used” microparticles after the end of an analysis process.
  • elements for beam guidance from this light source and for beam guidance from one in the microstructure are part of the device according to the invention ture held microsensor emitted light modes.
  • These optical elements include, in particular, an objective on which the light modes emitted by a microsensor of the microstructure of the fluidics module impinge, that is, via which these light modes are used for their transmission, further processing and ultimately the feed to an optical receiver that is also part of the device invade the device.
  • the device also includes actuators for positioning the carrier of the fluidics module, means for moving and supplying a fluid to the fluidics module, and an evaluation unit for determination the adsorption rate of the analyte under consideration in each case by evaluating the light modes received by the optical receiver and at least one control unit for controlling the light source, controlling the actuators, positioning the carrier and controlling the means for moving and guiding fluid.
  • the last-mentioned units namely the evaluation unit and the at least one control unit, can optionally form a common unit.
  • a common unit can, for example, be a microcontroller system.
  • At least its light source, the optical elements for beam guidance, the optical receiver and the actuators are gates for the positioning of the respective microparticle to be illuminated, held in the microstructure, in the three spatial directions x, y, z by moving the carrier of the fluidics module is arranged in a device and are consequently taken up by a common device housing.
  • the actuators xyz stage
  • the carrier more precisely a respective microsensor held by the microstructure arranged on the carrier, can be positioned very precisely, namely preferably with an accuracy of better than 0.2 ⁇ m.
  • the optics of the actual spectrometer is in accordance with a particularly preferred embodiment of the invention within this device housing again surrounded by an additional housing in order not to impair the result of the highly sensitive measurement by external light influences.
  • each of these components is either completely enclosed by the device housing this device or is at least partially visible to the outside, at least through one Housing wall of the device housing is framed, where it partially or largely completely protrudes through the relevant housing wall.
  • the latter can, for example, as will also be shown in connection with the exemplary embodiment to be explained later, relate to the lens already mentioned, into which the light modes emitted by a microsensor of the microstructure are incident.
  • the particular challenge of bringing the aforementioned components into the device housing of a device that accommodates them together is to design the device in question in such a way that it has a compact structure on the one hand, but on the other hand it is at least almost completely within the device housing on the other guided light path for the emitted by a microsensor held in the microstructure, the optical one
  • the light modes to be supplied to the receiver are long enough to receive them at the receiver with a sufficiently high resolution, that is to say with a resolution which enables a reliable determination of an adsorption rate (or desorption rate).
  • this is ensured by the fact that the light inside the device housing - and this refers to any light guided within the device housing, i.e. both the light emanating from the light source and the light from the light modes emitted by the respective microsensor of the microstructure - is conducted in three different levels.
  • the beam guidance of the light within the common, essential components of the device is such that the light emitted by the light source
  • the light is first guided along a first coordinate axis of the room, then by means of a first beam splitter (first optical deflecting element) waves are deflected length-selectively and guided onto the microstructure along a second coordinate axis of the room orthogonal to the first coordinate axis.
  • first beam splitter first optical deflecting element
  • the light modes emitted by a microsensor in the microstructure as a result of the light exposure are initially also guided along the aforementioned second coordinate axis, but in the opposite direction to the light guided onto the microstructure for partial light exposure, and then by means of a second beam splitter (second optical deflection element ) wavelength-selectively deflected and along a third coordinate axis of the space, which is orthogonal to both the first and the second coordinate axis, leads to an optical grating via an optical gap.
  • the light reflected by the grating and fanned out according to wavelengths is fed to the optical receiver.
  • the fluidics module is arranged outside the device housing on a housing wall of the essential components of this device mentioned in the basic illustration of the invention, such as in particular the device housing receiving the optical elements.
  • the fluidics module namely the carrier carrying the microstructure, has suitable mechanical coupling means, so to speak a mechanical interface, via which the fluidics module is connected to corresponding complementary mechanical components (adapters) accessible on the outside of the device housing and via these an operative connection with the actuators for positioning the microstructure arranged on the carrier is brought.
  • This embodiment has the advantage that the fluidics module can be easily changed, that is to say converted, depending on the analyte to be analyzed, without the need to intervene in the device.
  • This in turn has the advantage that on the one hand no corresponding access options (flaps, windows or the like) are provided on the device housing must be and a person operating the device when changing the fluidics module or removing it after the end of an analysis may not come into unintentional contact with the high-precision optical components or with the elements which are preferably set and calibrated at the factory.
  • the aforementioned lens for the incidence of light from the light modes emitted by a microsensor is framed by an opening provided for this purpose in a housing wall and is arranged directly adjacent to the fluidics module to be mounted on this housing wall via the aforementioned adapter.
  • the objective is preferably not an immersion objective, but a dry objective with a 5 to 100 times, preferably a long-distance dry objective with a 10 to 40 times, particularly preferably with a 20 times magnification and with a numerical aperture between 0 .6 to 1.2, but preferably at least 0.75 (NA> 0.75).
  • the device of the device according to the invention can be designed in such a way that the lens can be exchanged.
  • the device can therefore be operated with different lenses during the analysis.
  • the latter can also be ensured by equipping the device from the outset with several different objects, one of which, namely the one required for the specific analysis process - for example by means of a correspondingly controlled turret construction - is moved into a working position , in which the light modes emitted by a particle of the microstructure can be guided into the device housing via this lens selected.
  • Such an embodiment should also be expressly encompassed by the invention.
  • a pulse-width modulated laser with a power between Between 0.1 mW and 10 mW are used, a pulse-width modulated laser with a power between 0.5 mW and 1.5 mW being particularly preferred.
  • the aim here is to measure the laser power in such a way that, on the one hand, the microsensor, which is used to determine the adsorption kinetics and illuminated by the laser spot, reliably stimulates the emission of evaluable light modes, but, on the other hand, premature bleaching of the microsensor, i.e. the fluorescent dye Microparticles is avoided by excessive heating as a result of irradiation with the laser light.
  • the laser power, the measurement duration and the measurement frequency are freely adjustable, depending on the application and taking into account the nature of the microparticles used, i.e. taking into account parameters such as the adsorption speed, the bleaching speed of the microparticle and the signal intensity determined on the receiver side.
  • the device comprises a camera which is also integrated into the device.
  • the embodiment in question is designed so that those light waves that are not fed to the grating and subsequently to the optical receiver for the purpose of evaluation and without being deflected by pass through the second beam splitter, which are fed to the aforementioned camera.
  • the camera is connected to an imaging system, such as a monitor, via corresponding connections on the device housing, via which an optical control of the automatic positioning of the microsensor to be illuminated is carried out by corresponding movement of the support of the microstructure during a respective analysis process and the analysis process can be followed with regard to the scanning of the microparticles held in the microstructure.
  • the automatic scanning of each of the preferably, that is, according to a practice-relevant design of the fluidics module, several microparticles held in the microstructure is ensured by their software recognition in the context of image processing.
  • an additional lighting device - preferably a diffuse light source - can be arranged on the device housing, by means of which the fluidics module is emitted by a microsensor without influencing the light used for analysis and the light used for the analysis Light modes can be illuminated.
  • a further advantageous embodiment of the device according to the invention consists in the fact that the evaluation unit mentioned at the beginning for evaluating the light modes arriving at the receiver and by the at least one control unit, for example a microcontroller unit realizing the last-mentioned components, in the common, including the optical components receiving device housing is / are arranged.
  • Fig. 1 an isometric view of the device with an outbreak in the
  • Fig. 2 the device with attached fluidics module in a plan view with an opening on the top of the housing
  • Fig. 3 an example of that occurring during an adsorption process
  • Fig. 4 an example of the time-dependent shift of the mode position during an adsorption process.
  • the device 1 shows an isometric view of an exemplary embodiment for the essential component of the device according to the invention, namely for the device 1 which essentially forms and shapes this device and is designed in a manner essential to the invention, through which essential components, in particular the optical elements 5, 6 , 7, 8, 9, 13, 13 'of the bean claimed device in a common device housing 11 are received.
  • the device 1 is shown from an angle of view obliquely in front of ne with a cutout made in the device housing 11.
  • the essential components of the device according to the invention which are combined in the common device housing 11, are clearly visible therein.
  • Essential components of the device which are received by the device housing 11, are accordingly a light source 2 for emitting the for the spectroscopic analysis, more precisely for the excitation of the microparticles (not shown in Fig. 1 because of their small size) resp the light contained in the microsensors of the microstructure 3, and optical elements 5, 6, 7, 8, 9, 13, 13 ' for beam guidance and for optical influencing of the light emitted by this light source 2 and by the microsensor currently illuminated by the light source 2 in the microstructure 3 emitted light modes.
  • first optical deflecting element 6 hereinafter first beam splitter 6
  • second optical deflecting element 7 hereinafter second beam splitter 7
  • objective 5 an optical slit 8
  • optical grating 9 two of the beam focusing serving lenses 13, 13 '
  • the optical receiver 10 which is also an essential optical element, that is to say an essential optical component, is not visible in this drawing because it is covered by a partition. However, the optical receiver 10 can be clearly seen in FIG. 2, which will be explained later.
  • the fluidics module 3, 4 consisting of a carrier 4 movable in the three spatial dimensions x, y and z and the microstructure 3 arranged thereon is connected to the device 1 by means of suitable connecting means, not shown in detail in the drawing, with complementary connecting means also not shown Connected via at least one opening (not shown) in the upper housing wall 12 and via these complementary connec tion elements in an operative connection with the actuators 14, 15 used to move the carrier 4.
  • the actuators 14, 15 are linear motors and their movements are transmitted to the connecting elements coupling the fluidics module 3, 4 mechanical elements.
  • the actuators 14, 15 xyz stage
  • the carrier 4 of the fluidics module 3, 4 and with it the microstructure 3 arranged thereon can be positioned very precisely with respect to the three spatial dimensions with an accuracy in the submicrometer range, controlled by a control unit (not shown).
  • a control unit not shown.
  • the fluidics module 3, 4 has corresponding , connections not shown here provided.
  • the respective fluid is supplied to the fluidics module 3, 4 by means of a pump via connections formed thereon (not recognizable here) and connecting lines to be attached to them.
  • the aforementioned connection lines, for their connection to the connections of the fluidics module 3, 4 neces sary sealing elements and the said pump are not shown in the drawing.
  • the light source 2 used for the spectroscopic examination is, according to the example shown here, a pulse-width-modulated laser which emits laser radiation in the violet spectral range, namely with a wavelength of 405 nm.
  • This laser radiation which is initially guided along the coordinate axis x, is deflected into a second plane by the first wavelength-selective beam splitter 6 that is tuned to a wavelength of 405 nm and in this plane along the coordinate axis y onto the microstructure 3 of the fluidics module 3 , 4, more precisely on a microparticle held therein and positioned accordingly.
  • the light beam of the laser hits a prototype of the device 1 implemented in accordance with the exemplary embodiment shown, forming a light point with a diameter of approximately 10 ⁇ m with a power of approximately 1 mW.
  • the dye contained in the microparticle concerned is excited to glow.
  • resonant light modes of different wavelengths are formed in the range of the fluorescence band of the dye used, for example with wavelengths in the range between 470 and 520 nm, whereby two mutually associated modes, namely a TE mode and a TM mode, are formed for each resonance wavelength, which are polarized orthogonally to one another with respect to their electric field component and their magnetic field component. Part of this light finally leaves the microparticle and is thus emitted by it.
  • Part of the light with the light modes emitted by a microparticle currently exposed to the light from the light source 2 is captured by the lens 5 via a recess in the housing wall 12 and via this, against the direction of the light hitting the microparticle from the light source 2, also if guided into the device 1 along the coordinate axis y.
  • these modes pass through the first beam splitter 6, which does not reflect the wavelengths of these modes, and finally fall on the second beam splitter 7, which is selectively designed with respect to these wavelengths.
  • the second Beam splitter 7 light with wavelengths below 550 nm is again deflected into another plane and is guided here along the coordinate axis z first over the optical gap 8 used for beam shaping and then onto the optical grating 9.
  • light with wavelengths above 550 nm also passes through the second beam splitter 7 and is fed below the beam splitter 7 through a deflection mirror 18 to a camera 16 used for imaging.
  • the arrows entered in the figure are intended to clarify the light paths shown above, with a corresponding double arrow making it recognizable that the section between the first beam splitter 6 and the microstructure 3 is passed in alternating directions by light, namely on the one hand by the through the first beam splitter 6 along the coordinate axis y in the direction of the microstructure Rich deflected light from the light source 2 and on the other hand from the light modes which are emitted by the microparticles of the microstructure 3 exposed to this light and after entering the device housing 11 via the Objective 5 - symbolized by the arrow extension between tween the first beam splitter 6 and the second beam splitter 7 - the first beam splitter 6 pass.
  • the light modes used for the spectroscopic examination and guided onto the optical grating 9 are reflected by the grating and the reflected light is also fanned out with regard to its wavelength spectrum and finally fed to the optical receiver 10 (see FIG. 2), which cannot be seen here.
  • the optical receiver 10 Between the optical gap 8 and the optical grating 9 on the one hand and between the optical grating 9 and the optical Em receiver 10 on the other hand, one of the beam focusing Sam mell lens 13, 13 'is arranged.
  • the pair of lenses 13, 13 ' are two lenses which are identical in terms of their optical properties.
  • the light received by the optical receiver 10 is evaluated by means of a processing unit, again not shown here.
  • modes belonging to one another at least the modes of maximum light intensity are used for the evaluation.
  • the adsorption of a 2 nm to 3 nm thick polymer layer on the sensor surface produces a shift in the mode wavelength of around 200 pm to 300 pm depending on the refractive index of the polymer.
  • displacements of at least 20 pm or better must therefore be detected. This requires an extremely high-resolution spectroscopic arrangement, which is implemented with the device according to the invention. In Ver could look with a device according to the one explained here
  • Embodiment resolutions of less than 10 pm can be achieved.
  • the last-mentioned evaluation unit and the control unit or the control units for controlling the light source 2, for controlling the actuators 14, 15 for the positioning of the fluidics module 3, 4 and for controlling the means for movement and Guide the fluid with the microparticles and / or the fluid with the analyte can be implemented jointly by a microcontroller system.
  • the processes of exposing a microsensor (microparticle) held in microstructure 3 to the light of light source 2 and guiding the light modes emitted by this microsensor to optical receiver 10 as a result of this exposure are repeated several times during an analysis process.
  • a corresponding microparticle functionalized for the analyte to be investigated is initially irradiated with the light of the pulsewidth modulated laser (light source 2) without the presence of the analyte, and the light modes emitted by the microparticle as a result are evaluated.
  • the fluidics module 3, 4, that is to say its microstructure 3 is then flushed through by the fluid containing the analyte to be examined. Meanwhile, the measurement is repeated on a respective observed microparticle of the microstructure 3, namely optionally according to the expected speed of the binding kinematic processes to be detected with a sampling rate of up to 25 Hz. That is, the microparticle in question is repeatedly exposed to the light of the laser and it is the light modes arriving at the optical receiver 10 are evaluated.
  • the peak wavelength of the light modes emitted by the microparticle shifts due to the continued accumulation of the analyte on the microparticle up to saturation. From this shift, as exemplified by the spectrum shown in FIG. 3, the time course of the accumulation of the analyte on the microparticle, ie the rate of adsorption of the analyte, is automatically calculated. An exemplary result of this calculation is illustrated by FIG. 4.
  • the objective 5 is a special objective with 20 times magnification and a numerical aperture of at least 0.75.
  • the special beam guidance of the light within the device housing 11 made light a very compact design for the device 1 while ensuring a very precise determination of adsorption rates by means of the inventive, the device 1 as the main component comprising the device.
  • the device 1 as the main component comprising the device.
  • edge lengths of the device housing 11 of approx. 223 mm in width, approx. 193 mm in height and approx. 568 mm in depth (length) for the microparticles emitted by an irradiated, to determine the adsorption rate of the optical receiver 10 supplied light modes realized a beam path length of about 400 mm.
  • light source 2 pulse width modulated laser with a wavelength of 405 nm, exposure of a microparticle of the microstructure with a light output of 1 mW with a light spot with a diameter of approx. 10 ⁇ m, Emission of light modes by the respectively illuminate
  • the already mentioned camera 16, located at the bottom right in the illustration within the device housing 11, is used in combination with a display to be connected to it (not shown here) for the optical control of the position of the fluidics module 3, 4 and the course of the adsorption process by a service technician or by an operator.
  • a diffuse light source for example LED-based
  • the device 1 is also characterized by a high level of robustness and low maintenance requirements. Due to the arrangement of the fluidics module 3, 4 outside the device housing 11, a multiple exchange is possible without interfering with the device 1, which is also a high Brings ease of use.
  • control and connection elements 19, namely an on / off switch and a USB socket for data exchange are provided on the top of the device 1 shown in the example .
  • control and connection elements 19 namely an on / off switch and a USB socket for data exchange
  • a service technician has the option of calibrating the actuators 14, 15 for positioning the carrier 4 with the microstructure 3 of the fluidics module 3, 4 arranged thereon.
  • the service technician is supported by the visual reproduction of partial areas of the microstructure by means of the camera 16.
  • FIG. 2 shows the device 1 shown in FIG. 1 and explained above again in a top view, the housing wall 12 on the top of the device having been partially broken away for the illustration.
  • the optical grating 9 and the two identical Lin sen 13, 13 ' in particular the spectrometer with the optical receiver 10 can also be seen.
  • the spectrometer is housed again within the device housing 11 in a further housing.
  • the fluidics module 3, 4 can also be clearly seen again in FIG. 2.
  • FIG. 3 shows, by way of example, the shift in the peak wavelengths, as can be observed in the case of light modes emitted by a microparticle with a diameter of 7 ⁇ m during an adsorption process.
  • the solid line shows the spectrum of the emitted by the microparticle before the start of adsorption upon exposure to the light of the light source 2, light modes detected by the optical receiver 10.
  • PBS phosphate buffered saline - phosphate-buffered saline solution
  • FIG. 4 illustrates the time-dependent shift of the Modenpo position or the peak wavelengths of the modes emitted by a 10 ⁇ m microparticle during the adsorption of a solution of streptavidin in PBS buffer onto the biotinylated particle surface and detected by means of the optical receiver 10.
  • first optical deflection element first beam splitter

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur labelfreien quantitativen spektroskopischen Bestimmung der Bindungskinetik eines Analyten. Wesentliche Komponenten der Vorrichtung, nämlich eine Lichtquelle (2), optische Elemente (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13') zur Strahlführung und zur optischen Beeinflussung des Lichtes der Lichtquelle (2) sowie von einem in einer Mikrostruktur (3) gehaltenen Mikrosensor (funktionalisiertes sphärisches Mikropartikel) infolge der Exposition mit dem Licht der Lichtquelle (2) emittierter Lichtmoden, ein aus einem optischen Empfänger (10) für die emittierten Lichtmoden und einer Auswerteeinheit bestehendes Spektrometer, Aktuatoren (14; 15) zur Positionierung eines Trägers (4) mit der darauf angeordneten Mikrostruktur (3) und mindestes eine Steuereinheit, sind gemeinsam in einem Gerät (1) mit einem Gerätegehäuse (11) angeordnet. Das Licht, nämlich das Licht der Lichtquelle (2) einerseits und die von einem jeweiligen Mikropartikel infolge der Exposition mit diesem Licht emittierten Lichtmoden andererseits, wird innerhalb des Gerätegehäuses (11) mittels der optischen Elemente (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13'), insbesondere mittels eines ersten optischen Umlenkelements (6) und mittels eines zweiten optischen Umlenkelements (7), in drei verschiedenen Ebenen geführt.

Description

Vorrichtung zur spektroskopischen Bestimmung der Bindungskinetik eines Analy ten
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Bin dungskinetik eines Analyten. Mittels der Vorrichtung ist insbesondere für unter schiedliche, jeweils in einem Fluid enthaltene Analyten die Rate bestimmbar, mit der sich der jeweilige Analyt an einem Komplementär anlagert. Die Bestimmung dieser Rate, also der Adsorptionsrate, erfolgt mittels der Vorrichtung auf spek troskopischem Wege und labelfrei, das heißt ohne, dass es einer speziellen Mar kierung des Analyten selbst bedarf. Darüber hinaus ist - gewissermaßen umge kehrt - mittels der Vorrichtung, als Desorptionsrate und dabei ebenfalls labelfrei, auch die Rate bestimmbar, mit welcher ein an einem Komplementär haftender Analyt durch ein bewegtes Fluid von diesem Komplementär abgelöst, also desor- biert wird. Die Bestimmung von Desorptionsraten erfolgt beispielsweise im Rah men von Release-Studien oder bei der Beurteilung der Stabilität auf eine Ober fläche aufzubringender Schichten.
Soweit in den nachfolgenden Darstellungen und in den Patentansprüchen von der Bestimmung der Bindungskinetik gesprochen wird, meint dies im weitesten Sinne die Bestimmung von Daten, welche diese Bindungskinetik, das heißt ins besondere zeitliche Verläufe der Anlagerung eines Analyten an einen oder seines Ablösens von einem Komplementär beschreiben, also die Bestimmung einer Ad sorptionsrate oder einer Desorptionsrate und/oder davon ableitbarer, sich auf den Analyten beziehender physikalischer Größen oder chemischer Eigenschaften. Im Hinblick auf den bevorzugten Einsatzzweck der Vorrichtung beziehen sich die nachfolgenden Darstellungen im Allgemeinen auf die Bestimmung von Adsorpti onsraten, ohne dass jedoch die Erfindung hierauf beschränkt wäre. Insoweit schließen der Begriff„Bindungskinetik“ und die Formulierung„Bestimmung der Bindungskinetik“ stets beide Möglichkeiten des Einsatzes der Vorrichtung, also deren wahlweise Verwendung zur Betrachtung von Adsorptionsvorgängen oder zur Betrachtung von Desorptionsvorgängen ein. Ebenso beziehen sich, abgese- hen von dem insoweit ohnehin nicht beschränkend wirkenden Ausführungsbei spiel, zur Adsorptionsrate, also zu deren Bestimmung gegebene Ausführungen in adäquater Weise immer auch auf die Desorptionsrate, das heißt auf deren Be stimmung. Die Erfindung selbst betrifft insbesondere wesentliche, gemeinsam in einem Gerät angeordnete Komponenten der Vorrichtung, deren Ausgestaltung und ihr Zusammenwirken.
Für unterschiedliche Zwecke ist es erforderlich, die Bindungskinetik, nämlich ins besondere die Adsorptionsrate zu bestimmen, mit welcher sich ein in diesem Zu sammenhang jeweils betrachteter Analyt an einem Komplementär anlagert oder die Rate (Desorptionsrate), mit der ein solcher Analyt von einer Oberfläche abge löst wird. Bei dem Analyten kann es beispielsweise um eine chemische Sub stanz, wie einen medizinischen Wirkstoff, einen DNS-Abschnitt oder einen Anti körper, oder aber auch um ein Schwermetall oder um ein Nanopartikel handeln. So ist es zum Beispiel in der Pharmakologie bei der Entwicklung von Arzneimit teln wichtig zu wissen, wie sich ein in einem Medikament enthaltener Wirkstoff im Körper, nämlich insbesondere an bestimmten Körperzellen, anlagert. Die im La bor erfolgende Bestimmung der Adsorptionsrate erfolgt dabei ausgehend von einer den betreffenden Analyten mit sich führenden Flüssigkeit oder, allgemeiner, von einem den Analyten mit sich führenden Fluid.
Während gemäß dazu etablierten Verfahren die Bestimmung entsprechender Adsorptionsraten häufig durch eine geeignete Markierung (beispielsweise radio aktive Markierung) des insoweit betrachteten Analyten erfolgt, werden seit einiger Zeit vermehrt auch labelfreie, eine Markierung des Analyten nicht erfordernde Verfahren eingesetzt. Hierfür werden zum Beispiel Oberflächensensoren einge setzt, welche mit einer für den betreffenden Analyten komplementären, das heißt zur Anhaftung des Analyten an der Oberfläche geeigneten Substanz versehen werden. Die in dieser Weise funktionalisierte Oberfläche wird dann von einem den Analyten enthaltenden Fluid angeströmt und untersucht, in welcher Weise und in welchem zeitlichen Verlauf sich physikalische Eigenschaften der Oberflä che durch den sich daran anlagernden Analyten verändern. Durch die Auswer- tung der Veränderung dieser physikalischen Eigenschaften der Oberfläche, wie beispielsweise der Veränderung einer Oberflächenladung oder des dielektrischen Verhaltens, über die Zeit betrachtet, kann dann im Wege des Vergleichs auf die Adsorptionsrate geschlussfolgert werden. Beispiele für vergleichende Verfahren oder sich solcher bedienender Vorrichtungen sind SPR (SPR = Surface Plasmon Resonance), Quartz Crystal Microbalance (Quarzkristall-Mikrowaagen) oder die Reflexionsinterferometrie.
Unterschiedliche Formen derartiger Oberflächensensoren werden beispielsweise in der DE 10 2014 104 595 A1 erläutert. Dabei wird in der Druckschrift auch auf die Schwachstellen der beschriebenen Oberflächensensoren und auf die mit ihrem Einsatz verbundenen Nachteile eingegangen. Zur Vermeidung der in diesem Zusammenhang aufgezeigten Nachteile wird bei der in der Schrift bean spruchten Vorrichtung ein spektroskopisches Verfahren unter Einsatz einer spe ziellen, auch als Fluidik-Chip bezeichneten Mikrostruktur verwendet.
Ähnliche Mikrostrukturen für vergleichbare Zwecke werden außerdem in der US 2003/0186 426 A1 , der US 2017/007 4870 A1 , der WO 2010/141 365 A2 und in der WO 93/22053 A1 beschrieben.
Bei der Mikrostruktur handelt es sich um einen oder vorzugsweise mehrere in ein geeignetes Substrat, beispielsweise aus Glas, eingebrachte Mikrokanäle mit einer Flöhe und einer Breite von jeweils wenigen Mikrometern. In den Mikrokanä len ist eine Flaltestruktur in Form einer oder mehrerer am Boden der Mikrokanäle vorgesehener Vertiefungen ausgebildet. In die vorzugsweise mehreren, bei spielsweise kalottenförmigen Vertiefungen werden Mikropartikel eingebracht, in dem diese beispielsweise in die Mikrokanäle mit Hilfe eines Fluids, also zum Bei spiel mittels einer Flüssigkeit, eingeschwemmt werden und am Boden der Mikrokanäle im Bereich der darin ausgebildeten Vertiefungen sedimentieren. Die transparenten sphärischen Mikropartikel sind an ihrer Oberfläche zur spezifi schen Anlagerung des jeweils hinsichtlich seiner Adsorptionsrate zu untersu chenden Analyten funktionalisiert und weisen in ihrem Inneren einen durch Licht zum Leuchten anregbaren Fluoreszenzfarbstoff auf. Sie bilden hierdurch Mikro sensoren aus.
Zum Zweck der Bestimmung einer Adsorptionsrate oder einer Desorptionsrate wird ein jeweiliger Mikropartikel dem fokussierten Licht einer Lichtquelle, vor zugsweise eines Lasers, ausgesetzt. Der in dem Mikropartikel enthaltene Fluo reszenzfarbstoff wird hierdurch zur Aussendung von Licht angeregt, dessen Wel lenlängenspektrum durch die Zusammensetzung des Farbstoffs und die Größe eines jeweiligen Mikropartikels bestimmt wird. Für Lichtmoden spezifischer Wel lenlängen dieses Spektrums (Whispering Gallery Modes = WGM) stellt der Mik ropartikel dabei einen mit dem Resonator eines Lasers vergleichbaren Reso nanzraum dar, so dass diese Lichtmoden im Inneren des Mikropartikels durch Totalreflektion an der Innenseite seiner Oberfläche eine stehende Welle ausbil den und dadurch verstärkt werden, bevor schließlich ein Teil dieses Lichtes den Mikropartikel verlässt.
Für die durch das Mikropartikel emittierten Lichtmoden werden mit Hilfe eines Spektrometers die Peakwellenlängen bestimmt. Danach wird die zuvor beschrie bene Mikrostruktur von einem den zu untersuchenden Analyten enthaltenden Fluid durchspült. An der funktionalisierten Oberfläche des Mikropartikels, also eines zuvor ohne Anwesenheit des Analyten spektrografisch untersuchten Mikro partikels, lagert sich der Analyt an. Setzt man nun während dieses Anlagerungs prozesses das Mikropartikel wiederholt dem zur Anregung des darin enthaltenen Farbstoffs dienenden Licht aus, verändert sich infolge des sich aufgrund der An lagerungen an der Außenfläche des Mikropartikels verändernden Brechungsin dexes die Lage der zuvor bestimmten Peakwellenlängen der aufgrund der Expo sition mit dem Licht von dem Mikropartikel emittierten Lichtmoden. Diese
Veränderung der Peakwellenlängen, welche spektrometrisch, also mittels eines optischen Empfängers erfasst wird, kann man rechentechnisch auswerten und daraus auf die Adsorptionsrate des jeweils betrachteten Analyten schließen. Die zuvor beschriebene optische Anregung der in der Mikrostruktur gehaltenen Mikropartikel und die spektrometrische Erfassung der von den Mikropartikeln aufgrund der optischen Anregung ausgehenden Lichtmoden erfordert einen ver gleichsweise komplexen und präzise kalibrierten optischen Aufbau. In entspre chenden Labors gelangen hierfür üblicherweise optische Bänke zum Einsatz, entlang derer die jeweils erforderlichen optischen Komponenten angeordnet sind, wobei die für die Weiterleitung, die optische Aufbereitung und den Empfang der von einem Mikropartikel ausgehenden Lichtmoden vorgesehenen optischen Komponenten üblicherweise entlang einer Achse angeordnet sind. Zum einen erfordert dies einen gewissen Platzbedarf, zum anderen müssen aber auch auf wendigere Maßnahmen ergriffen werden, um die präzise Anordnung und opti sche Kalibrierung der Komponenten und die mittels dieser bewirkte Strahlführung und Lichtaufbereitung und damit das Untersuchungsergebnis nicht zu beeinträch tigen.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, welche zur label freien quantitativen Bestimmung der Bindungskinetik, nämlich insbesondere zur Bestimmung der Adsorptionsrate eines in einem Fluid enthaltenen Analyten oder der Desorptionsrate eines an ein Fluid abgegebenen Analyten, das Analyseprin zip und eine Mikrostruktur der vorbeschriebenen Art verwendet und dabei einen möglichst kompakten und vergleichsweise robusten Aufbau aufweist.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentan spruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Aus- und Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
Nachfolgend sollen die erfindungsgemäße Vorrichtung zur labelfreien spektrosko pischen Bestimmung der Adsorptionsrate eines in einem Fluid enthaltenen oder zur Bestimmung der Desorptionsrate eines an ein Fluid abgegebenen Analyten und deren wesentliche Komponenten vorgestellt werden. Wesentlicher Bestand teil der Vorrichtung ist zunächst eine Lichtquelle zur Aussendung des für die spektroskopische Analyse verwendeten Lichtes. Bei dieser Lichtquelle handelt es sich vorzugsweise um einen pulsweitenmodulierten Laser mit einer Leistung zwi schen 0,1 mW und 10 mW.
Bei einem mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung hinsichtlich seines Adsorp tionsverhaltens oder Desorptionsverhaltens untersuchbaren Analyten kann es sich, wie eingangs schon erwähnt, beispielsweise um eine chemische Substanz, wie einen medizinischen Wirkstoff, einen DNS-Abschnitt oder einen Antikörper oder dergleichen, oder aber auch um Schwermetallionen oder um Nanopartikel handeln.
Ein weiterer Bestandteil der Vorrichtung ist ein hier als Fluidikmodul bezeichnetes Modul, welches aus einem bewegbaren Träger und aus einer auf diesem Träger angeordneten, von einem Fluid durchström baren Mikrostruktur besteht. Durch die vorgenannte, dafür entsprechend ausgebildete Mikrostruktur wird mindestens ein Mikropartikel gehalten, welches als optisch aktiver Mikrosensor fungiert. Die Be griffe Mikrosensor und Mikropartikel werden daher nachfolgend auch synonym gebraucht. Unter einem Fluid wird im Kontext der vorgestellten Erfindung eine Flüssigkeit oder ein Gas (gegebenenfals auch Luft) verstanden.
Der mindestens eine Mikrosensor ist zur Anlagerung eines der Mikrostruktur in einem Fluid zugeführten Analyten oder - im Falle der Bestimmung einer Desorp tionsrate - zur Abgabe eines bereits an seiner Oberfläche anhaften Analyten an das der Mikrostruktur zugeführte Fluid ausbildet. Er ist ferner zum Emittieren von Lichtmoden infolge einer Exposition mit dem Licht der eingangs genannten Licht quelle ausgebildet und wird daher im Kontext dieser Darstellungen zur Erläute rung der Erfindung auch als optisch aktiver Mikrosensor bezeichnet. Es handelt sich hierbei um ein kugelförmiges, das heißt um ein sphärisches Mikropartikel der eingangs, bei der Erläuterung des Standes der Technik beschriebenen Art mit einem Durchmesser zwischen 5 pm und 30 pm, vorzugsweise zwischen 7 pm und 12 pm. Je nach Ausführung des Fluidikmoduls ist dessen Mikrostruktur dazu ausgebildet, ein oder vorzugsweise mehrere solche Mikrosensoren zu halten.
Das oder die von der Mikrostruktur gehaltene(n) und durch jeweilige Positionie- rung des Trägers des Fluidikmoduls jeweils einzeln der Exposition mit dem Licht der Lichtquelle ausgesetzte(n) Mikropartikel nehmen das einfallende Licht auf und geben die spezifischen Moden (WGM) ab. Die Wellenlängen dieser spezifi schen Moden werdn durch den Fluoreszenzfarbstoff des jeweiligen Mikropartikels und durch in Abhängigkeit von der Partikelgröße auftretende Resonanzen sowie durch den sich infolge der Adsorption oder der Desorption des Analyten verän dernden Unterschied zwischen dem Brechungsindex des Mikropartikels und dem seiner unmittelbaren Umgebung bestimmt.
Bei dem Fluidikmodul handelt es sich vorzugsweise um einen Fluidik-Chip mit einer Mikrostruktur, der ebenfalls im Zusammenhang mit den Ausführungen zum Stand der Technik bereits beschriebenen Art. Die Mikrostruktur weist hierbei ei nen oder mehrere von einem Fluid durchströmbare Mikrokanäle auf, wobei am Boden jedes dieser Mikrokanäle eine oder mehrere Vertiefungen mit einer Tiefe zwischen 5 pm und 30 pm zur Ausbildung einer Haltestruktur für jeweils ein sphä risches Mikropartikel vorgesehen sind. Bei den im Zusammenhang mit dem be stimmungsgemäßen Einsatz der Vorrichtung jeweils in dieser Mikrostruktur ge haltenen Mikropartikeln handelt es sich - wie bereits ausgeführt - um
kugelförmige (sphärische) Mikropartikel, deren Oberfläche zum Zweck der spezi fischen Anlagerung eines jeweils auf sein Adsorptionsverhalten untersuchten Analyten komplementär funktionalisiert ist und welche darüber hinaus in ihrem Inneren einen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen, der bei einer Exposition mit Licht einer bestimmten Wellenlänge die zur spektroskopischen Analyse herangezoge nen Lichtmoden emittiert. Selbstverständlich ist das Fluidikmodul mit entspre chenden Anschlüssen versehen, über welche das jeweilige Fluid dem Mikrokanal oder den Mikrokanälen zugeführt wird.
Abgesehen von der vorstehend nochmals beschriebenen Ausbildungsform kann das Fluidikmodul aber beispielsweise auch in Form eines Arrays lebender Zellen, eines mittels elektrischer Felder gesteuerten Chips (Dielektrophoresechip) oder eines optisch gesteuerten Chips (Laserpinzette) realisiert sein oder mindestens einen in mikrofluidischen Tröpfchen gefangenen Sensor aufweisen. Das Fluidik- modul selbst soll jedoch im Rahmen der hier vorgestellten Erfindung nicht Ge genstand detaillierterer Betrachtungen sein, da dieses beispielsweise in der zuvor näher beschriebenen Ausbildungsform grundsätzlich aus dem Stand der Technik bereits bekannt und somit selbst nicht Gegenstand der Erfindung ist.
Dennoch sollen an dieser Stelle dazu noch einige Anmerkungen erfolgen. Soweit sich aus dem Patentanspruch 1 ergibt, dass dem Fluidikmodul ein Fluid zugeführt wird und/oder, dass das Fluidikmodul zur Zuführung eines Fluids ausgebildet ist und/oder, dass die Vorrichtung Mittel zur Bewegung und zur Zuführung eines Fluids zu dem Fluidikmodul umfasst, meint dies, dass einem in der zuvor näher beschriebenen Weise ausgebildeten Fluidikmodul im Einzelfall auch ein anderes Fluid als das den Analyten enthaltende oder den Analyten von einem Mikroparti kel ablösende Fluid zugeführt werden kann. Bei dem Fluidikmodul handelt es sich um eine austauschbare Komponente. Diese Komponente kann hierbei mit einer bereits ein oder mehrere Mikrosensoren haltenden Mikrostruktur mit den übrigen Komponenten der Vorrichtung in eine Wirkverbindung gebracht werden oder aber als ein Modul in dessen Mikrostruktur erst nach der Verbindung des Moduls mit den Komponenten der Vorrichtung, beispielsweise erst unmittelbar im Vorfeld der Untersuchung eines Analyten auf dessen Adsorptionsverhalten oder Desorpti onsverhalten, ein oder mehrere Mikrospartikel eingebracht werden.
Im letztgenannten Falle wird dem Fluidikmodul vor dem eigentlichen Untersu chungsvorgang mit Hilfe der schon erwähnten und im Patentanspruch 1 genann ten Mittel zur Bewegung und zur Zuführung von Fluid zu der Mikrostruktur ein Fluid zugeführt, in welchem die an der Flaltestruktur festzusetzenden optisch re aktiven Elemente zur Anlagerung oder zur Abgabe des zu untersuchenden Ana lyten, nämlich die funktionalisierten Mikropartikel suspendiert sind. Das heißt, dem eigentlichen Analysevorgang geht ein Spülvorgang zum Eintrag der Mikro partikel in die Mikrostruktur voraus. Beide Möglichkeiten, also sowohl eine Vor richtung, bei welcher an der Mikrostruktur in dem zur Vorrichtung gehörenden Fluidikmodul bereits Mikropartikel festgesetzt sind, als auch eine Vorrichtung, bei welcher die Einbringung von Mikropartikeln in die Mikrostruktur erst unmittelbar vor dem eigentlichen Analysevorgang erfolgt, sollen demnach von der Erfindung umfasst sein. Darüber hinaus kann ein dem Fluidikmodul über besagte Mittel zu geführtes Fluid auch dem Spülen der Mikrostruktur zum Auslösen„verbrauchter“ Mikropartikel nach dem Abschluss eines Analysevorgangs dienen.
Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind neben der Lichtquelle zur Aussendung des für die spektroskopische Analyse, nämlich für die Anregung des in den Mikropartikeln enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs verwendeten Lichtes und neben dem Fluidikmodul außerdem Elemente zur Strahlführung von dieser Licht quelle ausgesendeten Lichtes und zur Strahlführung von einem in der Mikrostruk tur gehaltenen Mikrosensor emittierter Lichtmoden. Zu diesen optischen Elemen ten gehört insbesondere ein Objektiv, auf welches die von einem Mikrosensor der Mikrostruktur des Fluidikmoduls emittierten Lichtmoden auftreffen, das heißt, über welches diese Lichtmoden in die ihrer Weiterleitung, Weiterverarbeitung und letztlich der Zuführung zu einem ebenfalls zur Vorrichtung gehörenden optischen Empfänger in das Gerät einfallen.
Neben dem letztgenannten optischen Empfänger, bei dem es sich vorzugsweise um eine CCD- oder CMOS- Zeilenkamera handelt, gehören zur Vorrichtung wei terhin noch Aktuatoren zur Positionierung des Trägers des Fluidikmoduls, Mittel zur Bewegung und Zuführung eines Fluids zum Fluidikmodul, eine Auswerteein heit zur Bestimmung der Adsorptionsrate des diesbezüglich jeweils betrachteten Analyten durch Auswertung der von dem optischen Empfänger empfangenen Lichtmoden sowie mindestens eine Steuereinheit zur Steuerung der Lichtquelle, zur Steuerung der Aktuatoren, zur Positionierung des Trägers und zur Steuerung der Mittel zur Bewegung und Führung von Fluid. Die letztgenannten Einheiten, nämlich die Auswerteeinheit und die mindestens eine Steuereinheit, können ge gebenenfalls eine gemeinsame Einheit ausbilden. Bei einer solchen gemeinsa men Einheit kann es sich beispielsweise um ein Mikrocontrollersystem handeln.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind zumindest deren Lichtquelle, die optischen Elemente zur Strahlführung, der optische Empfänger und die Aktua- toren für die in den drei Raumrichtungen x, y, z erfolgende Positionierung des jeweils zu beleuchtenden, in der Mikrostruktur gehaltenen Mikropartikels durch Bewegung des Trägers des Fluidikmoduls gemeinsamen in einem Gerät ange ordnet und werden folglich von einem gemeinsamen Gerätegehäuse aufgenom men. Mittels der Aktuatoren (xyz Stage) kann dabei der Träger, genauer gesagt ein jeweiliger, von der auf dem Träger angeordneten Mikrostruktur gehaltener Mikrosensor sehr genau, nämlich vorzugsweise mit einer Genauigkeit von besser als 0,2 pm, positioniert werden.
Die Optik des eigentlichen Spektrometers, also vorzugsweise die schon ange sprochene Zeilenkamera ist dabei gemäß einer besonders bevorzugten Ausbil dung der Erfindung innerhalb dieses Gerätegehäuse nochmals von einem zu sätzlichen Gehäuse umgeben, um das Ergebnis der hochempfindlichen Messung nicht durch Fremdlichteinflüsse zu beeinträchtigen.
Das Merkmal, wonach die vorgenannten Komponenten gemeinsam in einem Ge rät angeordnet sind, ist in diesem Zusammenhang so zu verstehen, dass eine jeweilige dieser Komponenten entweder komplett von dem Gerätegehäuse die ses Gerätes umschlossen ist oder aber nach außen hin zumindest teilweise sichtbar, mindestens durch eine Gehäusewand des Gerätegehäuses eingerahmt wird, wobei sie die betreffende Gehäusewand gegebenenfalls teilweise oder weitgehend vollständig durchragt. Letzteres kann sich beispielsweise, wie auch im Zusammenhang mit dem später noch zu erläuternden Ausführungsbeispiel zu zeigen sein wird, auf das schon erwähnte Objektiv beziehen, in welches die von einem Mikrosensor der Mikrostruktur emittierten Lichtmoden einfallen.
Die besondere Herausforderung, die vorgenannten Komponenten in das Gerä tegehäuse eines sie gemeinsam aufnehmenden Gerätes einzubringen, besteht dabei darin, das betreffende Gerät so zu gestalten, dass dieses einerseits einen kompakten Aufbau aufweist, andererseits aber der in jedem Falle zumindest na hezu vollständig innerhalb des Gerätegehäuses geführte Lichtweg für die von einem in der Mikrostruktur gehaltenen Mikrosensor emittierten, dem optischen Empfänger zuzuführenden Lichtmoden lang genug ist, um diese am Empfänger mit einer hinreichend hohen, das heißt mit einer eine zuverlässige Bestimmung einer Adsorptionsrate (oder Desorptionsrate) ermöglichenden Auflösung zu emp fangen. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird dies dadurch gewährleistet, dass das Licht innerhalb des Gerätegehäuses - und hierbei ist jegliches inner halb des Gerätegehäuses geführte Licht, also sowohl das von der Lichtquelle ausgehende Licht als auch das Licht der von dem jeweiligen Mikrosensor der Mikrostruktur emittierten Lichtmoden gemeint - in drei verschiedenen Ebenen geführt wird.
Dies geschieht, indem von der Lichtquelle ausgesendetes, zunächst in einer ers ten Ebene geführtes Licht zur Exposition genau eines in der Mikrostruktur des Fluidikmoduls gehaltenen Mikrosensors (Mikropartikels) mittels eines optischen Umlenkelements in eine zweite Ebene umgelenkt und die in entgegengesetzter Richtung zunächst ebenfalls in dieser zweiten Ebene geführten, von einem jewei ligen Mikrosensor in der Mikrostruktur infolge der Lichtexposition emittierten und zur Bestimmung der Adsorptionsrate herangezogenen Lichtmoden mittels eines zweiten optischen Umlenkelements in eine von der ersten und der zweiten Ebene verschiedene dritte Ebene umgelenkt werden. Die von dem mit dem Licht der Lichtquelle bestrahlten, in der Mikrostruktur gehaltenen Mikrosensor emittierten und auszuwertenden Lichtmoden werden schließlich über weitere optische Ele mente dem optischen Empfänger zugeführt. In dem bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Anwendung kommenden Fluidikmodul werden für die (wie gesagt vorzugsweise mehreren) von dessen Mikrostruktur gehaltenen Mikrosensoren sehr hochwertige Sensoren verwendet, bei denen die spektrale Halbwertsbreite der emittierten Moden (FWHM = Full Widths at Half Maximum) unter 200 pm be trägt.
Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausbildungsform der Vorrichtung ist die Strahlführung des Lichtes innerhalb des gemeinsamen, wesentliche Kompo nenten der Vorrichtung, wie insbesondere sämtliche optischen Komponenten aufnehmenden Gerätegehäuses derart, dass das von der Lichtquelle ausgesen- dete Licht zunächst entlang einer ersten Koordinatenachse des Raumes geführt, dann mittels eines ersten Strahlteilers (erstes optisches Umlenkelement) wellen längenselektiv umgelenkt und entlang einer zu der ersten Koordinatenachse or thogonalen zweiten Koordinatenachse des Raumes auf die Mikrostruktur geführt wird. Die von einem Mikrosensor in der Mikrostruktur infolge der Lichtexposition emittierten Lichtmoden werden bei dieser Ausbildungsform zunächst ebenfalls entlang der vorgenannten zweiten Koordinatenachse, aber in entgegengesetzter Richtung zu dem zur partiellen Lichtexposition auf die Mikrostruktur geführten Licht geführt und dann mittels eines zweiten Strahlteilers (zweites optische Um lenkelement) wellenlängenselektiv umgelenkt und entlang einer sowohl zu der ersten als auch zu der zweiten Koordinatenachse orthogonalen dritten Koordina tenachse des Raumes über einen optischen Spalt einem optischen Gitter zuge führt. Schließlich wird dann das vom Gitter reflektierte und nach Wellenlängen aufgefächerte Licht dem optischen Empfänger zugeführt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor richtung ist das Fluidikmodul außerhalb des Gerätegehäuses an einer Gehäuse wand des die wesentlichen, bei der grundsätzlichen Darstellung der Erfindung genannten Komponenten dieser Vorrichtung, wie insbesondere die optischen Elemente aufnehmenden Gerätegehäuses angeordnet. Das Fluidikmodul, näm lich dessen die Mikrostruktur tragender Träger, weist dazu geeignete mechani sche Kopplungsmittel, also gewissermaßen eine mechanische Schnittstelle auf, über welche das Fluidikmodul mit entsprechenden, außen an dem Gerätegehäu se zugänglichen komplementären mechanischen Komponenten (Adaptern) ver bunden und über diese in eine Wirkverbindung mit den Aktuatoren zur Positionie rung der auf dem Träger angeordneten Mikrostruktur gebracht wird.
Diese Ausbildungsform hat den Vorteil, dass das Fluidikmodul je nach dem jeweils zu analysierenden Analyten einfach gewechselt, das heißt umgerüstet werden kann, und zwar ohne das Erfordernis eines Eingriffs in das Gerät. Dies wiederum hat den Vorteil, dass einerseits an dem Gerätegehäuse keine entspre chenden Zugangsmöglichkeiten (Klappen, Fenster oder dergleichen) vorgesehen werden müssen und eine das Gerät bedienende Person bei einem Wechsel des Fluidikmoduls oder bei dessen Entfernen nach der Beendigung einer Analyse nicht eventuell ungewollt mit den hochpräzisen optischen Komponenten oder mit zu deren vorzugsweise werkseitig erfolgenden Einstellung und Kalibrierung vor gesehenen Elementen in Berührung kommt.
Bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform ist das bereits erwähnte Objektiv zum Einfall des Lichtes der von einem Mikrosensor emittierten Lichtmoden, ein gerahmt von einem dafür in einer Gehäusewand vorgesehenen Durchbruch un mittelbar benachbart zu dem an dieser Gehäusewand über die schon genannten Adapter zu montierenden Fluidikmodul angeordnet. Bei dem Objektiv handelt es sich vorzugsweise nicht um ein Immersionsobjektiv, sondern um ein Trockenob jektiv mit einer 5 bis 100fachen, vorzugsweise um ein Long-Distance- Trockenobjektiv mit einer 10 bis 40fachen, besonders bevorzugt mit einer 20fachen Vergrößerung und mit einer numerischen Apertur zwischen 0,6 bis 1 ,2, jedoch von vorzugsweise mindestens 0,75 (NA > 0,75).
Im Hinblick auf das zuvor besprochene, die Gehäusewand durchragende Objek tiv kann das Gerät der erfindungsgemäßen Vorrichtung derart ausgebildet sein, dass das Objektiv wechselbar ist. Je nach dem jeweiligen konkreten Einsatzfall kann das Gerät demnach bei der Analyse mit unterschiedlichen Objektiven be trieben werden. Letzteres kann aber darüber hinaus auch dadurch gewährleistet werden, dass die Vorrichtung von vornherein mit mehren unterschiedlichen Ob jektiven ausgestattet wird, von denen jeweils eines, nämlich das für den konkre ten Analysevorgang benötigte - beispielsweise mittels einer entsprechend ge steuerten Revolverkonstruktion - in eine Arbeitsposition bewegt wird, in welcher die von einem Partikel der Mikrostruktur emittierten Lichtmoden über dieses aus gewählte Objektiv in das Gerätegehäuse geführt werden können. Auch eine der artige Ausbildungsform soll ausdrücklich von der Erfindung umfasst sein.
Wie bereits ausgeführt wurde, wird bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Lichtquelle vorzugsweise ein pulsweitenmodulierter Laser mit einer Leistung zwi- schen 0,1 mW und 10 mW verwendet, wobei ein pulsweitenmodulierter Laser mit einer Leistung zwischen 0,5 mW und 1 ,5 mW besonders bevorzugt ist. Hierbei gilt es, die Laserleistung so zu bemessen, dass einerseits der jeweils für die Be stimmung der Adsorptionskinetik herangezogene, durch den Laserspot beleuch tete Mikrosensor zuverlässig zur Emission von auswertbaren Lichtmoden ange regt, aber andererseits ein vorzeitiges Ausbleichen des Mikrosensors, das heißt des Fluoreszenzfarbstoffs des Mikropartikels durch eine zu starke Erwärmung infolge der Bestrahlung mit dem Laserlicht vermieden wird. Letzteres ist auch der Grund dafür, dass ein jeweiliger Mikrosensor jeweils nur für die Dauer des Mess vorgangs durch die Lichtquelle beleuchtet und dass der Laser pulsweitenmodu liert und die gesamte empfängerseitige Auswertung der eingehenden Lichtmoden damit korrespondierend getriggert wird. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Laserleistung, die Messdauer und die Messhäufigkeit frei einstellbar, je nach Anwendungsfall und unter Berücksichtigung der Beschaffenheit der dabei jeweils verwendeten Mikropartikel, also unter Berücksichtigung von Größen wie der Adsorptionsgeschwindigkeit, der Bleichgeschwindigkeit des Mikropartikels und der empfängerseitig festgestellten Signalintensität.
In vorteilhafter weiterer Ausbildung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine ebenfalls in das Gerät integrierte Kamera. Im Falle der Verwendung der ange sprochenen wellenlängenselektiven Strahlteiler zur Bewerkstelligung der erfin dungsgemäß innerhalb des Gerätegehäuses vorgesehenen Lichtführung ist die betreffende Ausführungsform so gestaltet, dass diejenigen Lichtwellen, die nicht zum Zwecke der Auswertung dem Gitter und nachfolgend dem optische Empfän ger zugeführt werden und ohne Umlenkung durch den zweiten Strahlteiler hin durchtreten, der vorgenannten Kamera zugeführt werden. Die Kamera ist über entsprechende Anschlüsse an dem Gerätegehäuse mit einem bildgebenden Sys tem, wie einem Monitor, verbunden, über welchen eine optische Kontrolle der automatischen Positionierung des jeweils zu beleuchtenden Mikrosensors durch entsprechende Bewegung des Trägers der Mikrostruktur während eines jeweili gen Analysevorgangs erfolgen und der Analysevorgang im Hinblick auf die Ab tastung der in der Mikrostruktur gehaltenen Mikropartikel verfolgt werden kann. Dabei wird das automatische Scannen eines jeweils einzelnen der vorzugsweise, das heißt gemäß einer praxisrelevanten Ausbildung des Fluidikmoduls mehreren in der Mikrostruktur gehaltenen Mikropartikel durch deren softwaremäßige Er kennung im Rahmen einer Bildverarbeitung gewährleistet.
Zu dem letztgenannten Zweck kann in weiterer Ausbildung der Erfindung noch eine zusätzliche Beleuchtungseinrichtung - vorzugsweise eine diffuse Lichtquel le - an dem Gerätegehäuse angeordnet sein, mittels welcher das Fluidikmodul ohne Beeinflussung des zur Analyse verwendeten Lichtes und der für die Analy se herangezogenen, durch einen Mikrosensor emittierten Lichtmoden beleuchtet werden kann.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung be steht darin, dass auch die eingangs genannte Auswerteeinheit zur Auswertung der am Empfänger eingehenden Lichtmoden und durch die mindestens eine Steuereinheit, also beispielsweise eine die letztgenannten Komponenten realisie rende Mikrocontrollereinheit, in dem gemeinsamen, auch die optischen Kompo nenten aufnehmenden Gerätegehäuse angeordnet ist/sind.
Zu der erfindungsgemäßen Vorrichtung, genauer gesagt zu dem diese Vorrich tung im Wesentlichen repräsentierenden und wesentliche Komponenten, wie de ren optische Elemente, aufnehmenden Gerät, soll nachfolgend anhand von Zeichnungen ein Ausführungsbeispiel gegeben und erläutert werden. In den zu gehörigen Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 : eine isometrische Darstellung des Gerätes mit einem Ausbruch in dem
Gerätegehäuse,
Fig. 2: das Gerät mit daran befestigtem Fluidikmodul in einer Draufsicht mit einem Ausbruch auf der Gehäuseoberseite,
Fig. 3: ein Beispiel für die während eines Adsorptionsvorgangs auftretende
Beeinflussung eines mittels des optischen Empfängers erfassten Spekt rums, Fig. 4: ein Beispiel für die zeitabhängige Verschiebung der Modenpostion wäh rend eines Adsorptionsvorgangs.
Die Fig. 1 zeigt eine isometrische Darstellung eines Ausführungsbeispiels für den wesentlichen Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung, nämlich für das diese Vorrichtung im Wesentlichen ausbildende und prägende sowie in erfin dungswesentlicher Weise gestalte Gerät 1 , durch welches wesentliche Kompo nenten, insbesondere die optischen Elemente 5, 6, 7, 8, 9, 13, 13' der bean spruchten Vorrichtung in einem gemeinsamen Gerätegehäuse 11 aufgenommen werden. In der Darstellung ist das Gerät 1 aus einem Blickwinkel von schräg vor ne mit einem in das Gerätegehäuse 11 eingebrachten Ausbruch gezeigt. Auf grund des in der Darstellung gemachten Ausbruchs sind darin die wesentlichen, in dem gemeinsamen Gerätegehäuse 11 vereinten Komponenten der erfin dungsgemäßen Vorrichtung gut erkennbar.
Wesentliche Komponenten der Vorrichtung, welche durch das Gerätegehäuse 11 aufgenommen werden, sind demnach eine Lichtquelle 2 zur Aussendung des für die spektroskopische Analyse, genauer gesagt zur Anregung des in den (auch wegen ihrer geringen Größe in der Fig. 1 nicht gezeigten) Mikropartikeln respek tive in den Mikrosensoren der Mikrostruktur 3 enthaltenen Farbstoffs dienenden Lichtes, und optische Elemente 5, 6, 7, 8, 9, 13, 13' zur Strahlführung und zur optischen Beeinflussung von dieser Lichtquelle 2 ausgesendeten Lichtes sowie von dem augenblicklich von der Lichtquelle 2 beleuchteten Mikrosensor in der Mikrostruktur 3 emittierter Lichtmoden. Es handelt sich hierbei um ein erstes opti sches Umlenkelement 6 (im Weiteren erster Strahlteiler 6) und um ein zweites optisches Umlenkelement 7 (im Weiteren zweiter Strahlteiler 7), ein Objektiv 5, einen optischen Spalt 8, ein optisches Gitter 9 und zwei der Strahlfokussierung dienende Linsen 13, 13'. Der ebenfalls ein wesentliches optische Element, das heißt eine wesentliche optische Komponente darstellende optische Empfänger 10 ist in dieser Zeichnung nicht sichtbar, da er durch eine Zwischenwand verdeckt ist. Jedoch ist der optische Empfänger 10 gut in der später noch zu erläuternden Fig. 2 zu erkennen. Eine weiter wesentliche, in der Fig. 1 dargestellte Komponente der erfindungs gemäßen Vorrichtung, welche jedoch bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel nicht durch das Gerätegehäuse 11 aufgenommen wird, ist das Fluidikmodul 3, 4. Wie aus der Figur ersichtlich, ist dieses außerhalb des Gerätegehäuses 11 auf der Oberseite des Gerätes 1 in unmittelbarer Nähe der oberen Gehäusewand 12 angeordnet. Das aus einem in den drei Raumdimensionen x, y und z bewegba ren Träger 4 und der darauf angeordneten Mikrostruktur 3 bestehende Fluidik modul 3, 4 ist mittels geeigneter, in der Zeichnung nicht im Detail dargestellter Verbindungsmittel mit ebenfalls nicht gezeigten komplementären Verbindungs mitteln der Gerätes 1 über mindestens einen (nicht gezeigten) Durchbruch in der oberen Gehäusewand 12 verbunden und über diese komplementären Verbin dungselemente in eine Wirkverbindung mit zur Bewegung des Trägers 4 dienen den Aktuatoren 14, 15 gebracht.
Bei den Aktuatoren 14, 15 handelt es sich um Linearmotoren und um deren Be wegungen auf die das Fluidikmodul 3, 4 ankoppelnden Verbindungselemente übertragende mechanische Elemente. Mittels der Aktoren 14, 15 (xyz Stage) kann der Träger 4 des Fluidikmoduls 3, 4 und mit ihm die darauf angeordnete Mikrostruktur 3 gesteuert durch eine nicht gezeigte Steuereinheit bezüglich der drei Raumdimensionen mit einer Genauigkeit im Submikrometerbereich hoch präzise positioniert werden. Für die Zuführung von Fluid, mittels welchem darin suspendierte, funktionalisierte Mikropartikel und/oder der jeweils zu untersuchen de, an den zuvor in die Mikrostruktur eingebrachten Mikropartikeln anzulagernde Analyt in die Mikrokanäle der Mikrostruktur 3 eingebracht wird, sind an dem Flu idikmodul 3, 4 entsprechende, hier nicht gezeigte Anschlüsse vorgesehen. Das jeweilige Fluid wird dem Fluidikmodul 3, 4 über dazu an diesem ausgebildete (hier nicht erkennbare) Anschlüsse und an diesen zu befestigende Verbindungs leitungen mittels einer Pumpe zugeführt. Auch die vorgenannten Verbindungslei tungen, für deren Verbindung mit den Anschlüssen des Fluidikmoduls 3, 4 erfor derliche Dichtelemente sowie die genannte Pumpe sind in der Zeichnung nicht gezeigt. Bei der das für die spektroskopische Untersuchung verwendete Licht aussen denden Lichtquelle 2 handelt es sich, gemäß dem hier gezeigten Beispiel, um einen pulsweitenmodulierten Laser, welcher Laserstrahlung im violetten Spekt ralbereich, nämlich mit einer Wellenlänge von 405 nm, aussendet. Diese Laser strahlung, welche zunächst entlang der Koordinatenachse x geführt ist, wird durch den ersten wellenlängenselektiv ausgebildeten, nämlich diesbezüglich auf eine Wellenlänge von 405 nm abgestimmten Strahlteiler 6 in eine zweite Ebene umgelenkt und in dieser entlang der Koordinatenachse y auf die Mikrostruktur 3 des Fluidikmoduls 3, 4, genauer gesagt auf ein darin gehaltenes, entsprechend positioniertes Mikropartikel, geführt. Hier trifft der Lichtestrahl des Lasers bei ei nem entsprechend dem gezeigten Ausführungsbeispiel realisierten Prototyp des Gerätes 1 unter Bildung eines Lichtpunktes mit einem Durchmesser von etwa 10 pm mit einer Leistung von ca. 1 mW auf. Beim Auftreffen der Laserstrahlung wird der in dem betreffenden Mikropartikel enthaltene Farbstoff zum Leuchten angeregt. Dabei bilden sich mehrere resonante Lichtmoden unterschiedlicher Wellenlängen im Bereich der Fluoreszenzbande des verwendeten Farbstoffes aus, zum Beispiel mit Wellenlängen im Bereich zwischen 470 und 520 nm, wobei je Resonanzwellenlämge zwei zueinander gehörende Moden, nämlich eine TE- Mode und eine TM-Mode ausgebildet werden, die bezüglich ihrer elektrischen Feldkomponente und ihrer magnetischen Feldkompnente zueinander orthogonal polarisiert sind. Teile dieses Lichtes verlassen schließlich das Mikropartikel und werden insoweit von diesem emittiert.
Ein Teil des Lichtes mit den von einem aktuell dem Licht der Lichtquelle 2 ausge setzten Mikropartikel emittierten Lichtmoden, wird über eine Ausnehmung in der Gehäusewand 12 von dem Objektiv 5 eingefangen und über dieses, entgegen der Richtung des auf das Mikropartikel treffenden Lichtes der Lichtquelle 2, eben falls entlang der Koordinatenachse y in das Gerät 1 geführt. Hier durchdringen, also passieren diese Moden zunächst den die Wellenlängen dieser Moden nicht reflektierenden ersten Strahlteiler 6 und fallen schließlich auf den bezüglich die ser Wellenlängen selektiv ausgelegten zweiten Strahlteiler 7. Durch den zweiten Strahlteiler 7 wird Licht mit Wellenlängen unterhalb von 550 nm wiederum in eine andere Ebene umgelenkt und hier entlang der Koordinatenachse z zunächst über den der Strahlformung dienenden optischen Spalt 8 und dann auf das optische Gitter 9 geführt. Licht mit Wellenlängen oberhalb von 550 nm passiert hingegen auch den zweiten Strahlteiler 7 und wird unterhalb des Strahlteilers 7 durch einen Umlenkspiegel 18 einer zur Bildgebung genutzten Kamera 16 zugeleitet.
Die in der Figur eingetragenen Pfeile sollen die zuvor dargestellten Lichtwege verdeutlichen, wobei durch einen entsprechenden Doppelpfeil erkennbar ge macht ist, dass der Abschnitt zwischen dem ersten Strahlteiler 6 und der Mikro struktur 3 in wechselnder Richtung von Licht passiert wird, nämlich zum einen von dem durch den ersten Strahlteiler 6 entlang der Koordinatenachse y in Rich tung der Mikrostruktur umgelenkten Licht der Lichtquelle 2 und zum anderen von den Lichtmoden, welche durch das jeweils diesem Licht ausgesetzte Mikroparti kel der Mikrostruktur 3 emittiert werden und nach dem Eintritt in das Gerätege häuse 11 über das Objektiv 5 - symbolisiert durch die Pfeilverlängerung zwi schen dem ersten Strahlteiler 6 und dem zweiten Strahlteiler 7 - den ersten Strahlteiler 6 passieren.
Die zur spektroskopischen Untersuchung genutzten, auf das optische Gitter 9 geführten Lichtmoden werden durch das Gitter reflektiert und das reflektierte Licht dabei außerdem bezüglich seines Wellenlängenspektrums aufgefächert sowie schließlich dem hier nicht zu sehenden optischen Empfänger 10 (siehe Fig. 2) zugeführt. Zwischen dem optischen Spalt 8 und dem optischen Gitter 9 einerseits sowie zwischen dem optischen Gitter 9 und dem optischen Em pfänger 10 andererseits ist jeweils eine der Strahlfokussierung dienende Sam mellinse 13, 13'angeordnet. Bei dem Linsenpaar 13, 13' handelt es sich um zwei bezüglich ihrer optischen Eigenschaften identische Linsen. Das durch den opti schen Empfänger 10 empfangene Licht wird mittels einer hier wiederum nicht gezeigten Verarbeitungseinheit ausgewertet. Dabei werden im Hinblick auf zu einander gehörende Moden (zueinander orthogonal polarisierte TM-Moden und TE-Moden) jeweils mindestens die Moden maximaler Lichtintensität zur Auswer tung herangezogen.
Zudem werden hinsichtlich der bei diesen Moden im zeitlichen Verlauf aufgrund der Anlagerung eines Analyten an dem diese Moden emittierenden Mikrosensor (Bewertung der Bindungskinetik im Hinblick auf eine Adsorptionsrate) oder auf grund der Abgabe eines bereits zu Beginn des Analysevorgangs an dem Mikro sensor anhaftenden Analyten (Bewertung der Bindungskinetik im Hinblick auf eine Desorptionsrate) auftretenden Verschiebung der jenigen Peakwellenlänge mehrere Moden unterschiedlicher Resonanzwellenlängen ausgewertet. Dies er möglicht die Bestimmung der exakten Partikelgröße (des Partikeldurchmessers) des betrachteten Mikrosensors und deren Berücksichtigung bei der Bestimmung der Adsorptions- oder Desorptionsrate, woraus letztlich eine höhere Auflösung des Messergebnisses resultiert.
So erzeugt beispielsweise die Adsorption einer 2 nm bis 3 nm dicken Polymer schicht auf der Sensoroberfläche eine Verschiebung der Modenwellenlänge von etwa 200 pm bis 300 pm in Abhängigkeit vom Brechungsindex des Polymers. Um die Adsorption von wenigen Molekülen effektiv an der Oberfläche detektieren zu können, müssen daher Verschiebungen von mindestens 20 pm oder besser de- tektiert werden. Das erfordert eine extrem hochauflösende spektroskopische An ordnung, welche mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung realisiert wird. In Ver suchen konnten mit einer Vorrichtung entsprechend dem hier erläuterten
Ausführungsbeispiel Auflösungen von unter 10 pm erreicht werden.
Wie bereits bei der allgemeinen Darstellung der Erfindung ausgeführt, können die letztgenannte Auswerteeinheit und die Steuereinheit oder die Steuereinheiten zur Steuerung der Lichtquelle 2, zur Steuerung der Aktuatoren 14, 15 für die Positio nierung des Fluidikmoduls 3, 4 sowie zur Steuerung der Mittel zur Bewegung und Führung des Fluids mit den Mikropartikeln und/oder des Fluids mit dem Analyten gemeinsam durch ein Mikrocontrollersystem realisiert sein. Die aus den vorhergehenden Erläuterungen erkennbar werdenden Vorgänge der Exposition eines in der Mikrostruktur 3 gehaltenen Mikrosensors (Mikropartikels) mit dem Licht der Lichtquelle 2 und des Führens der infolge dieser Exposition von diesem Mikrosensor emittierten Lichtmoden auf den optischen Empfänger 10 werden während eines Analyseprozesses mehrfach wiederholt. Dabei wird ein entsprechendes, für den zu untersuchenden Analyten funktionalisiertes Mikropar tikel zunächst ohne die Anwesenheit des Analyten mit dem Licht des pulswei tenmodulierten Lasers (Lichtquelle 2) bestrahlt und eine Auswertung der infolge dessen von dem Mikropartikel emittierten Lichtmoden vorgenommen. Danach wird das Fluidikmodul 3, 4, also dessen Mikrostruktur 3, durch das Fluid mit dem zu untersuchenden Analyten durchspült. Währenddessen wird die Messung an einem jeweils betrachteten Mikropartikel der Mikrostruktur 3 wiederholt, nämlich wahlweise entsprechend der erwarteten Geschwindigkeit der zu erfassenden bindungskinematischen Vorgänge mit einer Abtastrate von bis zu 25 Hz. Das heißt das betreffende Mikropartikel wird wiederholt dem Licht des Lasers ausge setzt und es werden jeweils die an dem optischen Empfänger 10 eingehenden Lichtmoden ausgewertet. Während dieses Vorgangs verschiebt sich aufgrund der bis zu einer Sättigung fortdauernden Anlagerung des Analyten an das Mikroparti kel die Peakwellenlänge der von dem Mikropartikel emittierten Lichtmoden. Aus dieser Verschiebung, wie sie beispielhaft das in der Fig. 3 gezeigte Spektrum veranschaulicht, wird automatisiert der zeitliche Verlauf der Anlagerung des Ana lyten an das Mikropartikel, also die Adsorptionsrate des Analyten, berechnet. Ein beispielhaftes Ergebnis dieser Berechnung wird durch die Fig. 4 veranschaulicht.
Das jeweils von einem Mikropartikel der Mikrostruktur 3 emittierte Licht wird, wie bereits ausgeführt, mittels des Objektivs 5 eingefangen. Bei dem Objektiv 5 handelt es sich gemäß dem Ausführungsbeispiel um ein Spezialobjektiv mit 20facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von mindestens 0,75.
Die spezielle Strahlführung des Lichtes innerhalb des Gerätegehäuses 11 ermög licht eine sehr kompakte Bauweise für das Gerät 1 bei Gewährleistung einer sehr präzisen Bestimmbarkeit von Adsorptionsraten mittels der erfindungsgemäßen, das Gerät 1 als Hauptbestandteil umfassenden Vorrichtung. Bei dem schon er wähnten Prototyp des Gerätes 1 wird bei Kantenlägen des Gerätegehäuses 11 von ca. 223 mm in der Breite, ca. 193 mm in der Höhe und ca. 568 mm in der Tiefe (Länge) für die von einem bestrahlten Mikropartikel emittierten, zur Bestim mung der Adsorptionsrate dem optischen Empfänger 10 zugeführten Lichtmoden eine Strahlengangslänge von ca. 400 mm realisiert. Das Gerät respektive die Vorrichtung ermöglicht dabei unter den vorstehend schon genannten Randbedin gungen (insbesondere: Lichtquelle 2 = pulsweitenmodulierter Laser mit einer Wellenlänge von 405 nm, Exposition eines Mikropartikels der Mikrostruktur mit einer Lichtleistung von 1 mW bei einem Lichtspot mit ca. 10 pm Durchmesser, Emission von Lichtmoden durch das jeweils beleuchtete, von der Mikrostruktur 3 gehaltene Mikropartikel im Bereich von 470 nm bis 520 nm und bei Verwendung eines 20fach vergrößernden Objektivs mit NA > 0,75) für die Bestimmung der jeweiligen Peakwellenlängen der am optischen Empfänger eintreffenden Licht moden eine optische Auflösung von < 10 pm, welche im Wege der Interpolation, nämlich durch eine Modellierung der Kurven auf eine Lorentz-Verteilung hinunter bis auf etwa 5 pm gesteigert wird.
Die bereits erwähnte, unten rechts in der Darstellung innerhalb des Gerätege häuses 11 angeordnete Kamera 16 dient in Kombination mit einem daran anzu schließenden (hier nicht gezeigten) Display der optischen Kontrolle der Position des Fluidikmoduls 3, 4 und des Ablaufs des Adsorptionsvorgangs durch einen Servicetechniker oder durch eine Bedienperson. Zur Unterstützung der Bildge- bung ist bei der Ausbildungsform gemäß dem gezeigten Ausführungsbeispiel, ebenfalls außerhalb des Gerätegehäuses 11 , eine diffuse Lichtquelle (zum Bei spiel LED-basiert) als zusätzliches Beleuchtungsmittel 17 oberhalb des Fluidik moduls 3, 4 angeordnet.
Neben seiner kompakten Bauweise zeichnet sich das Gerät 1 außerdem durch eine hohe Robustheit und geringen Wartungsaufwand aus. Aufgrund der Anord nung des Fluidikmoduls 3, 4 außerhalb des Gerätegehäuses 11 ist dessen ein facher Austausch ohne Eingriff in das Gerät 1 möglich, was zugleich eine hohe Bedienfreundlichkeit mit sich bringt. Zur Bedienung des Gerätes 1 bei der Durch führung eines Analysevorgangs zur Bestimmung einer Adsorptionsrate sind bei dem im Beispiel gezeigten Gerät 1 an dessen Oberseite Bedien- und Anschluss elemente 19, nämlich ein Ein-/Ausschalter und eine USB-Buchse für einen Da tenaustausch, vorgesehen. Im Hinblick auf die Komplexität und auf die selbst vergleichsweise hohe Empfindlichkeit der im Inneren des Gerätes 1 angeordne ten Optik besteht in diesem Kontext ein weiterer Vorteil darin, dass nur sehr we nige Verstellmöglichkeiten zur Justage der Komponenten und Elemente dieser Optik vorgesehen sind, welche sich auf im Einzelfall unumgängliche Kalibrierein stellungen beschränken. So besteht beispielsweise im Hinblick auf letzteres vor zugsweise für einen Servicetechniker die Möglichkeit, die Aktuatoren 14, 15 zur Positionierung des Trägers 4 mit der darauf angeordneten Mikrostruktur 3 des Fluidikmoduls 3, 4 zu kalibrieren. Hierbei wird der Servicetechniker durch die bild liche Wiedergabe partieller Bereiche der Mikrostruktur mittels der Kamera 16 un terstützt.
Die Fig. 2 zeigt das in der Fig. 1 dargestellte und zuvor erläuterte Gerät 1 noch mals in einer Draufsicht, wobei die Gehäusewand 12 auf der Geräteoberseite für die Darstellung teilweise ausgebrochen wurde. In dieser Darstellung ist neben dem optischen Spalt 8, dem optischen Gitter 9 und den beiden identischen Lin sen 13, 13' insbesondere auch das Spektrometer mit dem optischen Empfän ger 10 erkennbar. Um Restlichteinflüsse durch Umgebungslicht zu vermeiden, welche die Genauigkeit der Messergebnisse beeinträchtigen könnten, wird das Spektrometer innerhalb des Gerätegehäuses 11 nochmals durch ein weiteres Gehäuse aufgenommen. Auch das Fluidikmodul 3, 4 ist in der Fig. 2 ebenfalls nochmals gut zu erkennen.
Die Fig. 3 zeigt beispielhaft die Verschiebung der Peakwellenlängen, wie sie bei von einem Mikropartikel mit einem Durchmesser von 7 pm während eines Ad sorptionsvorgangs emittierten Lichtmoden beobachtet werden kann. Die durch gezogene Linie zeigt das Spektrum der von dem Mikropartikel vor dem Beginn der Adsorption bei einer Exposition mit dem Licht der Lichtquelle 2 emittierten, durch den optischen Empfänger 10 erfassten Lichtmoden. Die gestrichelte Linie zeigt das entsprechende Spektrum zum Ende der Adsorption von Streptavidin in einem PBS Puffer (PBS = Phosphate buffered saline - Phosphat-gepufferte Salz lösung) an die biotinylierte Partikeloberfläche.
Durch die Fig. 4 wird beispielhaft die zeitabhängige Verschiebung der Modenpo sition, respektive der Peakwellenlängen der von einem 10 pm Mikropartikelartikel während der Adsorption einer Lösung von Streptavidin in PBS Puffer an die bioti nylierte Partikeloberfläche emittierten und mittels des optischen Empfängers 10 erfassten Moden veranschaulicht.
Liste der Bezugszeichen
1 Gerät
2 Lichtquelle
3, 4 Fluidikmodul mit Mikrostruktur 3 und Träger 4
5 Objektiv
6 erstes optisches Umlenkelement (erster Strahlteiler)
7 zweites optisches Umlenkelement (zweiter Strahlteiler)
8 optischer Spalt
9 optisches Gitter
10 optischer Empfänger
11 Gerätegehäuse
12 Gehäusewand
13, 13' Linse
14, 15 Aktuatoren für Bewegung in x, y, z Richtung
16 Kamera
17 (zusätzliches) Beleuchtungsmittel
18 Umlenkspiegel
19 Bedien- und Anschlusselemente

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur labelfreien quantitativen spektroskopischen Bestimmung der Bindungskinetik eines Analyten, umfassend
eine Lichtquelle (2) zur Aussendung für die spektroskopische Analyse verwendeten Lichtes,
ein Fluidikmodul (3; 4), bestehend aus einem bewegbaren Träger (4) und aus einer auf diesem Träger (4) angeordneten, von einem Fluid durchström- baren Mikrostruktur (3) mit mindestens einem in dieser Mikrostruktur (3) gehalte nen, als optisch aktiver Mikrosensor fungierenden sphärischen Mikropartikel, welches ausgebildet ist zur Anlagerung eines der Mikrostruktur (3) in einem Fluid zugeführten Analyten oder zur Abgabe eines an seiner Oberfläche haftenden Analyten in ein der Mikrostruktur (3) zugeführtes Fluid und zum Emittieren von Lichtmoden infolge der Exposition mit dem Licht der Lichtquelle (2),
optische Elemente (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13') zur Strahlführung und zur opti schen Beeinflussung von der Lichtquelle (2) ausgesendeten Lichtes sowie von einem in der Mikrostruktur (3) gehaltenen Mikrosensor emittierter, auf ein Objek tiv (5) der optischen Elemente (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13') treffender Lichtmoden,
einen optischen Empfänger (10) zum Empfang von einem in der Mikro struktur (3) gehaltenen Mikrosensor emittierter und über das Objektiv (5) geführ ter Lichtmoden,
Aktuatoren (14; 15) zur Positionierung des Trägers (3) des Fluidikmo- duls (3; 4),
Mittel zur Bewegung und Zuführung eines Fluids zum Fluidikmo dul (3; 4),
eine gemeinsam mit dem optischen Empfänger (10) ein Spektrometer ausbildende Auswerteeinheit zur Bestimmung der Bindungskinetik des diesbe züglich jeweils betrachteten Analyten durch Auswertung durch den optischen Empfänger (10) empfangener Lichtmoden,
mindestes eine Steuereinheit zur Steuerung der Lichtquelle (2), zur Steuerung von Aktuatoren (14; 15) zur Positionierung des Trägers (4) mit der Mikrostruktur (3) und zur Steuerung der Mittel zur Bewegung und Führung von Fluid,
wobei die Auswerteeinheit und die mindestens eine Steuereinheit eine gemein same Einheit ausbilden können, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest die Lichtquelle (2), die optischen Elemente (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13'), der optische Emp fänger (10) und die Aktuatoren (14; 15) zur Positionierung des Trägers (4) ge meinsam in einem Gerät (1 ) mit einem Gerätegehäuse (11 ) angeordnet sind und dass das Licht innerhalb des Gerätegehäuses (11 ) mittels der optischen Elemen te (5; 6; 7; 8; 9; 13; 13') in drei verschiedenen Ebenen geführt wird, indem von der Lichtquelle (2) ausgesendetes, zunächst in einer ersten Ebene geführtes Licht zur Exposition eines von der Mikrostruktur (3) gehaltenen Mikrosensors mittels eines ersten optischen Umlenkelements (6) in eine zweite Ebene umge lenkt und die in entgegengesetzter Richtung zunächst ebenfalls in dieser zweiten Ebene geführten von dem in der Mikrostruktur (3) gehaltenen Mikrosensor infolge der Lichtexposition emittierten und zur Bestimmung der Bindungskinetik des Ana- lyten herangezogenen Lichtmoden mittels eines zweiten optischen Umlenkele- ments (7) in eine von der ersten und der zweiten Ebene verschiedene dritte Ebe ne umgelenkt und über weitere optische Elemente (8; 9; 13; 13) dem optischen Empfänger (10) zugeführt werden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Flu- idikmodul (3; 4) außerhalb des Gerätegehäuses (11 ) an einer Gehäusewand (12) des Gerätes (1 ) angeordnet ist, wobei der Träger (4) über an diesem vorgesehe ne Verbindungsmittel durch mindestens einen Durchbruch in der Gehäuse wand (12) hindurch mit komplementären Verbindungsmitteln in eine Wirkverbin dung gebracht ist, welche mittels der zur Positionierung des Trägers (4) mit der darauf angeordneten Mikrostruktur (3) dienenden Aktuatoren (14; 15) bewegbar sind.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Lichtquelle (2) ausgesendete Licht zunächst innerhalb des Gerätegehäu ses (12) entlang einer ersten Koordinatenachse (x) des Raumes geführt, dann mittels eines das erste optische Umlenkelement (6) ausbildenden ersten Strahl teilers wellenlängenselektiv umgelenkt und entlang einer zu der ersten Koordina tenachse (x) orthogonalen zweiten Koordinatenachse (y) des Raumes auf die Mikrostruktur (3) geführt wird und dass die von einem in der Mikrostruktur (3) ge haltenen Mikrosensor infolge der Lichtexposition emittierten Lichtmoden zu nächst, entlang der vorgenannten zweiten Koordinatenachse (y), in entgegenge setzter Richtung zu dem zur Lichtexposition des Mikrosensors auf die
Mikrostruktur (3) geführten Licht geführt, dann mittels eines das zweite optische Umlenkelement (7) ausbildenden zweiten Strahlteilers wellenlängenselektiv um gelenkt und entlang einer sowohl zu der ersten als auch zu der zweiten Koordina tenachse (x; y) orthogonalen dritten Koordinatenachse (z) des Raumes über ei nen optischen Spalt (8) einem optischen Gitter (9) zugeführt und schließlich das vom Gitter (9) reflektierte und nach Wellenlängen aufgefächerte Licht dem opti schen Empfänger (10) zugeführt wird.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in dem gemeinsamen Gerät (1 ) auch eine, über an dem Gerätegehäuse (12) angeord nete Signalanschlüsse mit einem bildgebenden System verbindbare Kamera (16) angeordnet ist, welcher die den zweiten Strahlteiler ohne Umlenkung passieren den Lichtanteile zugeleitet werden.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass an dem Gerätegehäuse (12) Beleuchtungsmittel (17) für eine zusätzliche Beleuchtung des Fluidikmoduls (3; 4) zum Zweck seiner bildlichen Erfassung mittels der Ka mera (16) angeordnet sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den zusätzlichen Beleuchtungsmitteln (17) um mindestens eine diffuse Lichtquel le handelt.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich net, dass es sich bei dem die von einem in der Mikrostruktur (3) gehaltenen Mik- rosensor emittierten Lichtmoden einfangenden Objektiv (5) um ein Long- Distance-Trockenobjektiv handelt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Objektiv (5) um Objektiv mit einer 10fachen bis 40fachen, vorzugsweise mit einer 20fachen Vergrößerung und mit einer Numerischen Apertur NA zwischen 0,6 und 1 ,2, vorzugsweise von > 0,75, handelt.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeich net, dass es sich bei der Lichtquelle (2) zur Aussendung des für die spektrosko pische Analyse verwendeten Lichtes um einen pulsweitenmodulierten Laser mit einer Leistung zwischen 0,1 mW und 10 mW, vorzugsweise zwischen 0,5 mW und 1 ,5 mW, handelt.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der die Lichtquelle (2) ausbildende Laser Licht mit einer Wellenlänge im Bereich zwi schen 350 nm und 600 nm, vorzugsweise zwischen 400 nm und 500 nm, aus sendet.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtexposition eines von der Mikrostruktur (3) gehaltenen Mikrosensors mit dem Licht der Lichtquelle (2) nur für die Dauer eines den betreffenden Mikro sensor einbeziehenden Messvorgangs erfolgt.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeich net, dass des sich bei dem optischen Empfänger (10) zum Empfang der für die Bestimmung der Bindungskinetik des Analyten herangezogenen Lichtmoden um eine CCD- oder CMOS-Zeilenkamera handelt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Empfänger (10) von einem doppelwandigen Gehäuse umgeben ist, indem er innerhalb des Gerätegehäuses (11 ) gesondert durch ein weiteres Ge häuse aufgenommen ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeich- net, dass in dem Gerätegehäuse (11 ) auch die Auswerteeinheit zur Bestimmung der Bindungskinetik des Analyten und/oder die mindestens eine Steuereinheit zur Steuerung der Lichtquelle (2), zur Steuerung der Aktuatoren (14; 15) zur Positio nierung des Trägers (4) mit der Mikrostruktur (3) und zur Steuerung der Mittel zur Bewegung und Führung von Fluid angeordnet ist/sind.
PCT/DE2020/100177 2019-03-12 2020-03-11 Vorrichtung zur spektroskopischen bestimmung der bindungskinetik eines analyten WO2020182256A1 (de)

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