WO2002008732A1 - Verfahren und vorrichtung zur mehrfabben 2-photonen-fluoreszenz-koinzidenzanalyse - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur mehrfabben 2-photonen-fluoreszenz-koinzidenzanalyse Download PDF

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WO2002008732A1
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fluorescence
sample
markers
excitation
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Katrin Heinze
Petra Schwille
Andre Koltermann
Ulrich Kettling
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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Definitions

  • the invention relates to a method for fluorescence correlation analysis, in particular methods for coincidence or cross correlation analysis on analytes marked with at least two different fluorescent markers in a sample, and measuring devices for carrying out the methods mentioned.
  • Fluorescence correlation spectroscopy is generally known as a highly sensitive optical method for the detection of dynamic properties of individual molecules or molecular compounds or of the lowest concentrations of fluorescent substances.
  • a laser beam is coupled into the sample with a microscope and focused on a measuring volume of approx. 10 "15 1 (1 fl).
  • the measuring volume is so small that, on average, less than a fluorescent one
  • the fluorescence of the sample molecules of interest is detected by a correlation analysis of the detector signals.
  • the microscope is designed for three-dimensional positioning of the measurement volume, as is possible with a confocal microscope, for example.
  • a laser beam for fluorescence excitation is focused on a diffraction-limited point in the sample.
  • a point diaphragm in the image plane, in which the excitation point is shown, serves as a field diaphragm, with which fluorescence and scattered light, which emanates from locations outside the focus, are masked out dynamic molecular properties (diffusion coefficient) in the pro- be determined.
  • relatively high excitation intensities in the range of approx. 100 kW / cm 2
  • the detector signals are subjected to a cross-correlation or coincidence analysis.
  • concentration of the sample and the size of the measuring volume are selected so that at most one molecule is present in the measuring volume at one point in time.
  • temporal correlations or coincidences in the detector signals it can be determined whether there was an analyte with one or the other or both marker dyes in the measurement volume at the time of measurement.
  • molecular association or dissociation processes such as e.g. B. the formation or breaking of chemical bonds are measured in real time.
  • the two-color technique according to WO 99/34195 also has disadvantages which limit the applicability and the accuracy of the method.
  • Various lasers 21 ', 22' are usually required to excite the fluorescence emissions of the marking dyes, the foci of which must be formed at a measuring point in a stable manner over time and with an accuracy of fractions of a femtoliter. A considerable amount of experimentation is required to adjust and stabilize the excitation laser. Furthermore, in order to achieve a sufficient spatial resolution in the radiation direction (z direction), the imaging system must have a pinhole on the imaging side, onto which the measurement volume is imaged. Another limitation concerns the available dye systems. The marking dyes must have high light stability at all excitation wavelengths. In addition, the marking dyes used must have high quantum yields.
  • the object of the invention is to provide an improved method for fluorescence measurement based on a cross-correlation and / or coincidence analysis, with which the disadvantages, in particular of the conventional two-color technique, are avoided become.
  • the method according to the invention is to be implemented with a simplified measurement setup, without having to accept restrictions in terms of accuracy and stability.
  • the object of the invention is also to provide improved correlation and / or coincidence measuring devices for fluorescence measurement with a simplified structure.
  • the basic idea of the invention is to illuminate the sample for correlation fluorescence measurement on analytes with at least two fluorescence markers on one or more substances to be analyzed with such a high excitation intensity (photon flux density) that the fluorescence excitation of the fluorescence markers by 2-photon absorption he follows.
  • the sample is preferably illuminated with a single laser line.
  • the laser beam is focused into the sample at the desired location in the measurement volume.
  • the fluorescence markers are excited simultaneously at a common excitation wavelength, but have spectrally separated fluorescence emissions that are detected with different detectors.
  • the signals from the detectors are subjected to a correlation analysis (coincidence or cross-correlation analysis).
  • the 2-photon excitation of fluorescence markers has the advantage that fluorescence markers can be used which have similar maxima in the excitation spectra of the 2-photon excitation, but which are characterized by different Stokes shifts in the emission.
  • the fluorescence measurement is aimed at a single-molecule-based analysis, in which the measurement or observation volume is so small that fluorescence fluctuations from individual molecules can be detected and evaluated.
  • fluorescent markers in particular fluorescent dyes
  • the fluorescence markers for the correlation fluorescence measurement are preferably excited at an excitation wavelength at which both fluorescence markers have essentially the same fluorescence photon yield after 2-photon absorption. Since the fluorescence photon yield, defined as the count rate, which is detected per unit of time and per molecule, depends in particular on the ambient conditions (for example absorption state of the fluorescent markers, solvents and the like), a preliminary test is preferably carried out before the fluorescence measurement to determine the optimal excitation wavelength. The preliminary test is carried out once for a specific measuring system or several times before each fluorescence measurement.
  • the measurement setup is considerably simplified.
  • the simplification is that only one laser has to be used for excitation.
  • the experimental set-up is further simplified since the excitation volume of the 2-photon excitation in the direction of propagation of the laser beam (z-direction) is reduced compared to the excitation volume for 1-photon excitation.
  • the probability of 2-photon absorption depends on the square of the excitation intensity.
  • the absorption cross section is therefore reduced proportionally to z ⁇ 4 .
  • There is an inherent concentration of excitation at the focal level It is not absolutely necessary to map the measurement volume to a pinhole, since there is no flow outside the focal plane anyway. orescent light is emitted in the spectral regions of interest.
  • Another important advantage of the 2-photon excitation according to the invention is the high tolerance of biological materials (cells, cell components or cell assemblies) to infrared radiation.
  • biological materials cells, cell components or cell assemblies
  • Due to the long-wave excitation there is a further advantage for the signal-to-noise ratio, since excitation and emission light are spectrally far apart, so that disturbing stray light can be largely suppressed by optical filters without losing part of the emission light to be detected.
  • Another advantage is the reduction of false light, which mainly concerns the fluorescence of contaminants ("dirt").
  • This fluorescence is essentially critical in the short-wave visible range, ie in the case of 1-photon excitation.
  • impurities are excited with significantly less efficiency, so that the signal-to-noise ratio - compared to 1-photon excitation - is significantly higher.
  • the invention also relates to a measuring device for fluorescence measurement on analytes with at least two different fluorescence markers, in which the illumination device is formed by a single laser line which is designed to excite 2-photon absorptions of the fluorescence markers.
  • Another important feature of the device according to the invention consists in the provision of two detector devices which are set up to detect the fluorescence emission in different spectral ranges and on which the whole of the sample (in particular the excitation lumen and also fluorescent light emanating from the area surrounding the excitation volume). The detection takes place without an aperture, a pinhole aperture is not provided. A non-confocal mapping of the excitation volume onto the detectors is provided.
  • the 2-photon excitation with a single laser not only reduces the expenditure on equipment. There are also advantages for the optical adjustment. The problem of size and overlap of excitation volumes is excluded. Additional detection shutters are not required. If fluorescent dyes are used as markers, there is a further advantage in the fact that, after the 2-photon excitation, practically no triplet states are assumed, so that no signal losses occur via the triplet formation.
  • the excitation volume in the measurement method according to the invention is smaller than in the conventional 1-photon excitation. This enables measurements to be carried out at higher sample concentrations of approximately 100 nM, which has advantages for the further evaluation of the results. Concentrations in the nM range can also be determined. Short analysis times in the range of one or a few seconds are made possible. Measurements in living cells are made possible, which enables the exact determination of kinetics and concentrations of double-labeled molecules or complexes.
  • the 2-photon excitation offers the following advantages in particular: There is a physically perfect overlap of the excitation volume elements for both fluorophores.
  • the excitation volume element can counter can be reduced using conventional methods, ie measurements of higher concentrations (100 nM and higher) are possible. Detection takes place without a pinhole (excitation volume element is small enough due to 2-photon excitation). Multi-color detection of three or more fluorophores on a single-molecule basis is possible, ie monochromatic excitation via 2-photons with z.
  • FIG. 1 shows a schematic overview of a measuring device according to the invention
  • FIG. 2 shows an illustration of molecular processes which can advantageously be detected with the correlation measurement according to the invention
  • FIGS. 4, 5 measurement results to illustrate the quantum yield of marking dyes as a function of the excitation wavelength and the excitation power
  • FIGS. 6, 7 representations of curves to illustrate the accuracy and selectivity of the correlation measurement according to the invention
  • 8 shows graphs of an enzymatic degradation of a substance observed according to the invention
  • FIG. 9 shows a schematic overview of a conventional measuring device for two-color correlation measurement (prior art).
  • the invention is described below with reference to 2-photon excitations in test systems with two fluorescent markers. Corresponding implementations of the invention result in multi-color applications. Three or more suitable fluorophores can be excited for emission with a monochrome 2-photon excitation. This allows the measurement of complex molecular and cellular processes in which more than two analytes are involved.
  • the optical structure of a 2-photon fluorescence correlation spectrometer according to the invention is illustrated schematically in FIG. 1.
  • the spectrometer 100 comprises a sample chamber 10, an illumination device 20, a detector device 30, a correlator 40 and an imaging system 50.
  • the imaging system 50 is preferably formed by an inverted microscope construction (eg with an Olympus IX70 microscope).
  • the sample chamber 10 is an application-selected container, in which the sample 11 is arranged at rest or flowing.
  • the sample 11 is a solution or suspension of the substances or particles to be examined. It can be provided that the sample chamber 10 is arranged to be movable in one or more spatial directions. The agility of the
  • the sample chamber can rely on a scan movement relative to the imaging system 50 for taking three-dimensional images, e.g. B. three-dimensional concentration distributions in the sample. It is also possible to use the sample chamber 10 to impress a periodic modulation movement as described in WO 99/34195.
  • the wall of the sample chamber 10 facing the imaging system 50 has such a small thickness that the focus 12 of the excitation light can be formed by the objective 51 at a short distance of approximately 400 to 500 ⁇ m.
  • the corresponding wall preferably has the thickness of a cover slip, as is used in microscopy. The thickness is, for example, approx. 150 to 190 ⁇ m.
  • the illuminating device 20 is a single laser which is designed for the 2-photon excitation of the fluorescence markers used in each case.
  • a tunable pulse laser is preferably used, such as.
  • the parallel laser light is directed via the dichroic mirror 52 (eg of the type 710 DCSPXR, AHF Analysentechnik, Tübingen, Germany) into the lens 51 (eg 60 x 1.2 lens UplanApo Olympus) and in the sample chamber 10 focused.
  • the dimensions of the excitation volume r 0 and z 0 in the focal plane are known from calibration measurements.
  • the diameter of the focus in the focal plane is z. B.
  • r 0 0.48 ⁇ m.
  • a fluorescence emission is excited in this excitation volume, which is emitted via the objective 51, the dichroic mirror 52, an emission filter 53 (e.g. of the type 600 DF 200, AHF analysis technology) to suppress the excitation light and an optics 54 a second dichroic mirror 55 (e.g. type 595 DCLP, AHF analysis technology) is directed.
  • the short-wave part of the fluorescent light is reflected at the second dichroic mirror 55 and is passed through a bandpass filter 56 onto the long-wave Leader detector 31 directed to the detector device.
  • the fluorescent light transmitted through the dichroic mirror is also filtered (edge filter 57) and directed onto the shorter-wave detector 32.
  • the coupling into the detectors takes place with optical fibers 58 or 59.
  • the detectors are, for example, avalanche photodiodes (type: SPCM-200, EG & G Optoelectronics, Canada).
  • the optical coupling fibers have a diameter of 100 ⁇ m and are individually adjustable in all three spatial directions.
  • the detectors 31, 32 are connected to a correlator 40.
  • a correlator card type: ALV-5000, manufacturer LAV Langen, Germany
  • the coupling fibers can also be dispensed with and the fluorescent light can be imaged directly on the detectors.
  • the optical structure can be equipped with a fiber-coupled spectrometer (manufacturer Ocean Optics, USA).
  • the sample 11 in the sample chamber 10 contains at least two analytes marked with different fluorescent markers and / or at least one analyte marked with at least two fluorescent markers.
  • the subject of the fluorescence measurement according to the invention is, for example, a coincidence analysis of the fluorescence emissions of the different fluorescence markers detected with the detectors 31, 32. This is illustrated schematically in FIG. 2.
  • the sample contains, for example, the analytes AI and A2, which are each marked with fluorescent markers M1 and M2.
  • the analytes are, for example, pairs of antibodies and antigens, the binding behavior of which is to be examined. As long as the analytes AI and A2 are not bound to each other, they pass through the excitation volume separately at different times.
  • the detectors 31, 32 deliver fluorescence signals separated in time, which are symbolized schematically in FIG. 2 (left, center) by arrows P1, P2.
  • the fluorescence signals are measured uncorrelated at any time. relations or coincidence signal G cannot be derived.
  • a correlation or coincidence signal can be derived accordingly (FIG. 2, bottom right).
  • the decomposition of the analyte A3 into subcomponents can also be detected, as is of interest, for example, when observing the enzymatic degradation of a substrate labeled twice with fluorescent markers.
  • the measuring method according to the invention preferably captures all chemical reactions or physical processes in which a chemical bond is established between separate analytes or an existing bond is cut open or a physical association or dissociation is carried out accordingly. All analytes (substances) that can be marked with fluorescent markers on the different sides of the compound to be produced or separated are accessible to the measuring method.
  • the signal detection with the detectors and the correlation analysis are carried out in a manner known per se from the FCS techniques.
  • a fluorescence measurement is carried out with the detectors in predetermined time windows.
  • the width of the time window is chosen depending on the application. It is preferably set to the mean residence time of the analytes in the measurement volume.
  • the length of stay is particularly dependent on the molecular or particle size and mobility and can be measured or theoretically estimated.
  • the photon numbers recorded in the time windows are
  • a concentration measurement is possible on the basis of the coincidence analysis.
  • a measure of the number of double-labeled molecules or particles in the sample is derived from the strength of the detected coincidences (amplitude of coincidence signals).
  • the cross-correlation or coincidence analysis of the detector signals carried out with the correlator 40 is preferably carried out in a known manner, as described in WO 99/34195.
  • the details of signal analysis disclosed in this patent application are fully incorporated by reference into the present description.
  • a relative movement is set between the sample and the illumination device during the fluorescence analysis by means of a beam scanner and / or a sample drive.
  • the fluctuation movements increase and the diffusion times become shorter.
  • the measuring volume element can be scanned through the sample. If this relative movement is set, the time window of the coincidence analysis may have to be adjusted.
  • Fluorescent dyes such as are known, for example, from fluorescence microscopy are preferably used as fluorescence markers M1, M2.
  • Dye pairs are selected which have similar absorption cross sections at a selected wavelength and which have spectrally separable fluorescence spectra with high photostability.
  • the marker pairs are, for example, the dyes rhodamine green / Texas red, fluorescein derivatives (eg Alexa 488 / Alexa 594) or molecular biological dyes such as green fluorescent proteins (GFP) / red fluorescent proteins (RFP) used.
  • GFP green fluorescent proteins
  • RFP red fluorescent proteins
  • autofluorescent proteins such as GFP, dsRED, autofluorescent biomolecules, e.g. As tryptophan, tyrosine, or flavins, or autofluorescent organic molecules can be used.
  • the method according to the invention can also be designed to detect Raman scattering or surface enhanced Raman scattering (SERS).
  • FIG. 3 shows the spectral properties of the marker system rhodamine green / Texas red. Both dyes show a similarly high fluorescence photon yield and sufficient light stability to tolerate the excitation intensities used according to the invention.
  • the spectra (1) and (2) show the fluorescence emissions of rhodamine green and Texas red ( ⁇ M solutions) at an excitation wavelength of 830 nm.
  • Curve (3) shows the transmission curve of the dichroic mirror 55. In the region of the shorter-wave Fluorescence (1) results in the reflection to the detector 31.
  • the curves (4) and (5) show the transmission characteristics of the filters 56 and 57, respectively, which are intended to further improve the signal-to-noise ratio, but not a mandatory feature of the invention are.
  • the excitation of the 2-photon absorptions takes place at a predetermined excitation wavelength, which is selected as follows. After determining the excitation spectra of the fluorescent markers used (see FIG. 3), the fluorescence photon yield is determined for each fluorescence marker as a function of the excitation wavelength. Since the excitation spectra of the fluorescence markers overlap, there are also overlapping curve profiles of the wavelength-dependent fluorescence photons. prey.
  • the optimal wavelength is selected according to the wavelength or the wavelength interval in which the fluorescence photon yields of the two fluorescent markers essentially match or the deviation between the fluorescence photon yields is less than a predetermined ratio, e.g. B. is less than factor 3. This is illustrated below using the example of fluorescent dyes.
  • FIGS. 4 and 5 illustrate spectral properties of the marker pair rhodamine green / Texas red.
  • an excitation spectrum in the range 740 nm to 900 nm is recorded for each dye.
  • the curve profiles in FIG. 4 show an excitation maximum at 780 nm for Texas red (crosses) and at 850 nm for rhodamine green (triangles).
  • an excitation wavelength is selected in which both dyes can be excited with almost the same efficiency and in which both dyes exhibit comparatively strong fluorescence emissions. In the example shown, the excitation wavelength is 830 nm.
  • Figure 5 shows that the excitation at 830 nm actually causes 2-photon absorption.
  • the fluorescence intensity as a function of the excitation power was measured separately for both dyes. For both dyes below the saturation limit there is the expected square dependence of the fluorescence intensity on the incident power for 2-photon processes.
  • the double logarithmic representation provides the corresponding linearized form with slope 2.
  • FIG. 6 shows the course of autocorrelation curves, which were recorded with a test solution from Rhodamin Grün in the two detection channels, and a corresponding cross-correlation curve between the two detection channels. All three curves are essentially the same. This shows that the detection volumes are identical or the detection beam paths are precisely adjusted to the excitation volume.
  • Cross-correlation measurements on double-labeled (upper curve) and single-labeled (lower curve) DNA samples are illustrated in FIG. 7.
  • One advantage of the measurement method is that cross-correlation signals G result for the non-correlated samples, which are less than 10% of the corresponding correlated signals.
  • the structure according to the invention is thus superior to the conventional 1-photon measurements.
  • FIG. 8 illustrates a preferred application of the measurement method according to the invention for determining concentrations in the sample.
  • the real-time measurement of enzyme kinetics is shown.
  • a double-labeled substrate (DNA sample) is broken down enzymatically into individually labeled products. Accordingly, the number of double-labeled molecules detected decreases over time. With increasing concentration of the added enzyme (endonuclease EcoRI), the decrease in substrate concentration is accelerated.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Fluoreszenzmessung an mit unterschiedlichen, spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen aufweisenden Fluoreszenzmarkern markierten Analyten in einer Probe mit den folgenden Schritten beschrieben: Beleuchtung der Probe (11) in einem Messvolumen mit einem Laser (20) zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindestens zwei Fluoreszenzmarker, wobei die Beleuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensität erfolgt, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2-Photonen-Absorptionen angeregt werden, Detektion der Fluoreszenzemission mit mindestens zwei Detektoreinrichtungen (31, 32), die zur Lichtdetektion in verschiedenen Spektralbereichen entsprechend den spektralen Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzmarker ausgelegt sind, und Durchführung einer Kreuzkorrelations- und/oder eine Koinzidenzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen (31, 32). Es wird auch eine Messvorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR
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KOINZIDΞNZANA YSE ((
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenz- Korrelationsanalyse, insbesondere Verfahren zur Koinzidenzoder Kreuzkorrelationsanalyse an mit mindestens zwei unter- schiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Analyten in einer Probe, und Messeinrichtungen zur Durchführung der genannten Verfahren.
Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) ist als höchstempfindliches optisches Verfahren zum Nachweis von dynamischen Eigenschaften einzelner Moleküle oder Molekülverbindungen oder von geringsten Konzentrationen fluoreszierender Substanzen allgemein bekannt. Bei einem herkömmlichen Fluores- zenz-Korrelationsspektrometer wird mit einem Mikroskop ein Laserstrahl in die Probe eingekoppelt und auf ein Messvόlumen von ca. 10"15 1 (1 fl) fokussiert. Das Messvolumen ist so klein, dass sich im zeitlichen Mittel weniger als ein fluoreszierendes Molekül darin befindet. Die Fluoreszenz der interessierenden Probenmoleküle wird durch eine Korrelationsanalyse der Detektorsignale erfasst. Das Mikroskop ist zur dreidimensionalen Positionierung des Messvolumens ausgelegt, wie dies z. B. mit einem Konfokalmikroskop möglich ist.
Bei der Konfokalspektroskopie wird ein Laserstrahl zur Fluoreszenzanregung auf einen beugungsbegrenzten Punkt in der Probe fokussiert. Eine Punktblende (sog. „Pinhole") in der Bildebene, in der der Anregungspunkt abgebildet ist, dient als Feldblende, mit der Fluoreszenz und Streulicht, das von Orten außerhalb des Fokus ausgeht, ausgeblendet wird. Die Beobachtung einzelner Moleküle im Messvolumen wird durch die dynamischen Moleküleigenschaften (Diffusionskoeffizient) in der Pro- be bestimmt. Um in der zur Verfügung stehenden kurzen Messzeit für ein annehmbares Signal-Rausch-Verhältnis genügend Photonen zu detektieren, müssen bei der herkömmlichen Konfokalspektroskopie relativ hohe Anregungsintensitäten (im Bereich von ca. 100 kW/cm2) verwendet werden. Dies ist jedoch problematisch, da die Stabilität der üblicherweise verwendeten Markierungsfarbstoffe (z. B. Fluorescein-, Rhodamin- und Cyanin-Derivate) beschränkt ist.
Eine Weiterentwicklung des FCS-Verfahrens für heterogene Systeme, in denen molekulare Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Analyten beobachtet werden sollen, wird in WO 99/34195 it der Zweifarben-Kreuzkorrelationsanalyse beschrieben. Bei diesem Verfahren werden mindestens zwei Fluoreszenzfarbstoffe an einen oder mehrere Analyten als Marker gebunden. Die Fluoreszenzfarbstoffe sind so gewählt, dass sie spektral verschiedene Fluoreszenzmaxima besitzen. In einem Messaufbau, der schematisch in Figur 9 illustriert ist, werden die Farbstoffe mit zwei Lasern 21', 22', die auf die jeweiligen Farbstoffab- sorptionen abgestimmt sind, angeregt. Mit zwei spektral auf die verschiedenen Fluoreszenzmaxima abgestimmten Detektoren 31', 32' wird die Fluoreszenzemission aus der Probenkammer 10' erfasst. Die Detektorsignale werden einer Kreuzkorrelationsoder Koinzidenzanalyse unterzogen. Die Konzentration der Probe und die Größe des Messvolumens sind so gewählt, dass zu einem Messzeitpunkt im Messvolumen höchstens ein Molekül vorhanden ist. Durch Auswertung von zeitlichen Korrelationen oder Koinzidenzen in den Detektorsignalen kann erfasst werden, ob sich zum MessZeitpunkt ein Analyt mit dem einen oder anderen oder beiden Markierungsfarbstoffen im Messvolumen befunden hat. Mit der Zweifarben-Korrelationsanalyse können molekulare Assozia- tions- oder Dissoziationsvorgänge, wie z. B. die Bildung oder das Aufbrechen von chemischen Bindungen, in Echtzeit gemessen werde . Die Zweifarben-Technik gemäß WO 99/34195 besitzt aber auch Nachteile, die die Anwendbarkeit und die Genauigkeit des Verfahrens einschränken. Zur Anregung der Fluoreszenzemissionen der Markierungsfarbstoffe sind gewöhnlich verschiedene Laser 21', 22' erforderlich, deren Foci zeitlich stabil und mit einer Genauigkeit von Bruchteilen eines Femtoliters an einem Messpunkt gebildet werden müssen. Es ist ein erheblicher experimenteller Aufwand zur Justierung und Stabilisierung der Anregungslaser erforderlich. Des Weiteren muss das Abbildungssystem zur Erzielung einer genügenden Ortsauflösung in Bestrahlungsrichtung (z-Richtung) abbildungsseitig ein Pinhole vorgesehen sein, auf das das Messvolumen abgebildet wird. Eine weitere Beschränkung betrifft die verfügbaren FarbstoffSysteme. Die Markierungsfarbstoffe müssen bei allen Anregungswellenlängen eine hohe Lichtstabilität besitzen. Außerdem müssen die verwendeten Markierungsfarbstoffe hohe Quantenausbeuten aufweisen.
Von W. Denk et al. wird in „Science", 1990, Band 248, Seite 73 ff. ein Verfahren zur Scanning-Fluoreszenz ikroskopie mit 2-Photonen-Laseranregung beschrieben. Es wurde festgestellt, dass bei 2-Photonen-Anregung Lichtschäden an den Markierungsfarbstoffen und auch lichtinduzierte Zerstörungen der Zellumgebung in biologischen Proben vermieden werden. Allerdings erfordert die 2-Photonen-Anregung extrem hohe Photonen- Flussdichten der Größenordnung von 1031 Photonen/cm2, um die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen innerhalb des Wirkungsquerschnittes der Farbstoffmoleküle zu bewirken. Die 2- Photonen-Anregung war bisher auf die Scanning-Mikroskopie beschränkt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Fluoreszenzmessung auf der Basis einer Kreuzkorrelationsund/oder Koinzidenzanalyse anzugeben, mit dem die Nachteile insbesondere der herkömmlichen Zweifarben-Technik vermieden werden. Das erfindungsgemäße Verfahren soll mit einem vereinfachten Messaufbau realisiert werden, ohne dass Einschränkungen in bezug auf die Genauigkeit und Stabilität hingenommen werden müssen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbesserte Korrelations- und/oder Koinzidenzmessvorrichtungen zur Fluoreszenzmessung mit einem vereinfachten Aufbau anzugeben.
Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung mit den Merkmalen gemäß dem Patentansprüchen 1 bzw. 9 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung ist es, zur Korrelations- Fluoreszenzmessung an Analyten mit mindestens zwei Fluoreszenzmarkern auf einem oder mehreren zu analysierenden Stoffen die Probe mit einer derart hohen Anregungsintensität (Photo- nenflussdichte) zu beleuchten, dass die Fluoreszenzanregung der Fluoreszenzmarker durch 2-Photonen-Absorptionen erfolgt. Die Probe wird vorzugsweise mit einer einzigen Laserlinie beleuchtet. Der Laserstrahl wird in die Probe an dem gewünschten Ort des Messvolumens fokussiert. Die Fluoreszenzmarker werden simultan bei einer gemeinsamen Anregungswellenlänge angeregt, besitzen aber spektral getrennte Fluoreszenzemissionen, die mit verschiedenen Detektoren erfasst werden. Die Signale der Detektoren werden einer Korrelationsanalyse (Koinzidenz- oder Kreuzkorrelationsanalyse) unterzogen. Die 2-Photonen-Anregung von Fluoreszenzmarkern besitzt den Vorteil, dass Fluoreszenzmarker verwendet werden können, die ähnliche Maxima in den Anregungsspektren der 2-Photonen-Anregung besitzen, sich jedoch durch verschieden starke Stokes-Verschiebungen der Emission auszeichnen.
Die Fluoreszenzmessung ist auf eine einzelmolekülbasierende Analyse gerichtet, bei der das Mess- oder Beobachtungsvolumen so klein ist, dass Fluoreszenzfluktuationen von einzelnen Molekülen detektiert und ausgewertet werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messverfahrens werden Fluoreszenzmarker (insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe) verwendet, die sich überlappende Anregungsspektren der 2-Photonen-Absorption besitzen. Die Anregung der Fluoreszenzmarker für die Korrelations-Fluoreszenzmessung erfolgt vorzugsweise bei einer Anregungswellenlänge, bei der beide Fluoreszenzmarker eine im wesentlichen gleiche Fluores- zenphotonenausbeute nach 2-Photonen-Absorption aufweisen. Da die Fluoreszenzphotonenausbeute, definiert als die Zählrate, die pro Zeiteinheit und pro Molekül detektiert wird, insbesondere von den Umgebungsbedingungen (zum Beispiel Absorptionszustand der Fluoreszenzmarker, Lösungsmittel und dergleichen) abhängt, wird vorzugsweise vor der Fluoreszenzmessung ein Vorversuch zur Ermittlung der optimalen Anregungswellenlänge durchgeführt . Der Vorversuch erfolgt einmalig für ein bestimmtes Messsystem oder mehrfach vor jeder Fluoreszenzmessung.
Erfindungsgemäß ergibt sich eine erhebliche Vereinfachung des Messaufbaus. Die Vereinfachung besteht erstens darin, dass nur ein Laser zur Anregung benutzt werden muss. Eine weitere Vereinfachung des experimentellen Aufbaus ist gegeben, da das Anregungsvolumen der 2-Photonen-Anregung in Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (z-Richtung) gegenüber dem Anregungsvolumen bei 1-Photon-Anregung verkleinert wird. Die Wahrscheinlichkeit der 2-Photonen-Absorption ist vom Quadrat der Anregungsintensität abhängig. Der Absorptionsquerschnitt verringert sich deshalb für 2-Photonen-Absorptionsprozesse außerhalb der Fokalebene in z-Richtung proportional zu z~4. Es ergibt sich eine inhärente Konzentration der Anregung auf die Fokalebene. Es ist nicht zwingend erforderlich, das Messvolumen auf ein Pinhole abzubilden, da außerhalb der Fokalebene ohnehin kein Flu- oreszenzlicht in den interessierenden Spektralbereichen emittiert wird.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der 2-Photonen-Anregung gemäß der Erfindung besteht in der hohen Toleranz biologischer Mate- rialen (Zellen, Zellbestandteile oder Zeilverbunde) gegenüber Infrarotstrahlung. Zur Anregung einer Fluoreszenzemission im sichtbaren Spektralbereich durch 2-Photonen-Absorption ist es ausreichend, wenn mit Laserlicht im roten oder nahen infraroten Spektralbereich angeregt wird. Aufgrund der langwelligen Anregung ergibt sich ein weiterer Vorteil für das Signal- Rausch-Verhältnis, da Anregungs- und Emissionslicht spektral weit voneinander getrennt sind, so dass störendes Streulicht weitestgehend durch optische Filter unterdrückt werden kann, ohne einen Teil des zu detektierenden Emissionslichts einzubüßen. Ein weiterer Vorteil hierbei ist die Reduktion von Falschlicht, was hauptsächlich die Fluoreszenz von Verunreinigungen ("Schmutz") betrifft. Diese Fluoreszenz ist im wesentlichen im kurzwelligen sichtbaren Bereich, also im Fall von 1- Photonen-Anregung kritisch. Bei einer langwelligen 2-Photonen- Anregung werden solche Verunreinigungen mit deutlich geringerer Effizienz angeregt, so dass hierdurch das Signal-zuRausch-Verhältnis - verglichen zur 1-Photonen-Anregung - deutlich höher liegt.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Messvorrichtung zur Fluoreszenzmessung an Analyten mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern, bei der die Beleuchtungseinrichtung durch eine einzelne Laserlinie gebildet wird, die zur Anregung von 2-Photonen-Absorptionen der Fluoreszenzmarker ausgelegt ist. Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht in der Bereitstellung von zwei Detektoreinrichtungen, die zur Detektion der Fluoreszenzemission in verschiedenen Spektralbereichen eingerichtet sind und auf die das gesamte, von der Probe (insbesondere vom Anregungsvo- lumen und auch aus der Umgebung des Anregungsvolumens) ausgehende Fluoreszenzlicht abgebildet wird. Die Detektion erfolgt blendenfrei, eine Pinhole-Blende ist nicht vorgesehen. Es ist eine nicht-konfokale Abbildung des Anregungsvolumens auf die Detektoren vorgesehen.
Durch die 2-Photonen-Anregung mit einem einzelnen Laser wird nicht nur der Geräteaufwand reduziert. Es ergeben sich auch Vorteile für die optische Justierung. Das Problem von Größe und Überlappung von Anregungsvolumen ist ausgeschlossen. Zusätzliche Detektionsblenden sind nicht erforderlich. Werden Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet, so ergibt sich als weiterer Vorteil die Tatsache, dass nach der 2-Photonen- Anregung praktisch keine Triplett-Zustände eingenommen werden, so dass keine Signalverluste über die Triplett-Bildung erfolgen.
Das Anregungsvolumen ist beim erfindungsgemäßen Messverfahren kleiner als bei der herkömmlichen 1-Photon-Anregung. Dies ermöglicht, Messungen bei höheren Probenkonzentrationen von ungefähr 100 nM durchzuführen, was Vorteile für die weitere Bewertung der Ergebnisse besitzt. Es können aber auch Konzentrationen im nM-Bereich ermittelt werden. Es werden kurze Analysezeiten im Bereich von einer oder wenigen Sekunden ermöglicht. Es werden Messungen in lebenden Zellen ermöglicht, die die genaue Bestimmung von Kinetiken und Konzentrationen doppelt markierter Moleküle oder Komplexe erlaubt.
Wichtige Merkmale der Erfindung bestehen darin, dass nur ein Anregungsvolumenelement gegeben ist, da zwei verschiedene Flu- orophore monochromatisch mittels 2-Photonenanregung auf Einzelmolekülbasis angeregt werden. Die 2-Photonenanregung bietet insbesondere die folgenden Vorteile: es ist ein physikalisch perfektes Überlappen der Anregungsvolumenelemente für beide Fluorophore gegeben. Das Anregungsvolumenelement kann gegen- über herkömmlichen Verfahren verkleinert werden, d. h. es sind Messung von höheren Konzentrationen (100 nM und höher) ist möglich. Es erfolgt eine Detektion ohne Pinhole (Anregungsvolumenelement ist durch 2-Photonenanregung klein genug) . Es wird eine Multi-Color-Detektion von drei oder mehr Fluoropho- ren auf Einzelmolekülbasis möglich, d. h. es kann eine monochromatische Anregung über 2-Photonen bei z. B. > 800 nm und eine Detektion von verschiedenen Fluorophoren von 300 bis < 800 nm erfolgen, ohne das in diesem Bereich störende Anregungswellenlängen liegen, wie es bei der CW-Anregung notwendig ist. Es werden Messungen von Molekülen, insbesondere von Molekülkomplexen mit drei oder mehr Komponenten, ermöglicht.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer erfindungsgemäßen Mess orrichtung,
Figur 2 eine Illustration von molekularen Vorgängen, die mit Vorteil mit der erfindungsgemäße Korrelationsmessung erfassbar sind,
Figur 3 Kurvendarstellungen der spektralen Eigenschaften von Markierungsfarbstoffen,
Figuren 4, 5 Messergebnisse zur Illustration der Quantenausbeute von Markierungsfarbstoffen in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge und der Anregungsleistung,
Figuren 6, 7 Kurvendarstellungen zur Illustration der Genauigkeit und Selektivität der erfindungsgemäßen Korrelationsmessung, Figur 8 Kurvendarstellungen eines erfindungsgemäß beobachteten enzymatischen Abbaus einer Substanz, und
Figur 9 eine schematische Übersichtsdarstellung einer herkömmlichen Messvorrichtung zur Zweifarben- Korrelationsmessung (Stand der Technik)
Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf 2-Photonen- Anregungen in Testsystemen mit zwei Fluoreszenzmarkern beschrieben. 'Entsprechende Umsetzungen der Erfindung ergeben sich bei Mehr-Farben-Anwendungen. Es können drei oder mehr geeignete Fluorophore mit einer einfarbigen 2-Photonen-Anregung zur Emission angeregt werden. Dies erlaubt die Vermessung komplexer molekularer und zellulärer Prozesse, an denen mehr als zwei Analyte beteiligt sind.
Der optische Aufbau eines 2-Photonen-Fluo eszenzkorrelations- spektrometers gemäß der Erfindung ist schematisch in Figur 1 illustriert. Das Spektrometer 100 umfasst eine Probenkammer 10, eine Beleuchtungseinrichtung 20, eine Detektoreinrichtung 30, einen Korrelator 40 und ein Abbildungssystem 50. Das Abbildungssystem 50 wird vorzugsweise durch einen invertierten Mikroskopaufbau (z. B. mit einem Olympus IX70-Mikroskop) gebildet. Die Probenkammer 10 ist ein anwendungsabhängig gewähltes Behältnis, in dem die Probe 11 ruhend oder strömend angeordnet ist. Die Probe 11 ist eine Lösung oder Suspension der zu untersuchenden Substanzen oder Partikel. Es kann vorgesehen sein, dass die Probenkammer 10 in einer oder mehreren Raumrichtungen beweglich angeordnet ist. Die Beweglichkeit der
1 I
Probenkammer kann sich erstens auf eine Scan-Bewegung relativ zum Abbildungssystem 50 zur Aufnahme dreidimensionaler Abbildungen, z. B. dreidimensionaler Konzentrationsverteilungen in der Probe, beziehen. Ferner ist es möglich, der Probenkammer 10 eine periodische Modulationsbewegung aufzuprägen, wie es in WO 99/34195 beschrieben ist. Die zum Abbildungssystem 50 weisende Wand der Probenkammer 10 besitzt eine derart geringe Dicke, dass der Fokus 12 des Anregungslichts mit einem geringen Abstand von ca. 400 bis 500 um vom Objektiv 51 gebildet werden kann. Die entsprechende Wand besitzt vorzugsweise die Dicke eines Deckglases, wie es in der Mikroskopie verwendet wird. Die Dicke beträgt bspw. ca. 150 bis 190 μm.
Die Beleuchtungseinrichtung 20 ist ein einzelner Laser, der für die 2-Photonen-Anregung der jeweils verwendeten Fluoreszenzmarker ausgelegt ist. Bei der Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen wird vorzugsweise ein durchstimmbarer Pulslaser verwendet, wie z. B. ein modengekoppelter Tsunami Ti:Saphier- Laser (Hersteller: Spectra Physics, Mountain View, CA, Pulsfrequenz 80 mHz, Pulsbreite 100 fs, Durchstimmbarkeit zwischen 700 und 1000 nm) . Das parallele Laserlicht wird über den dich- roitischen Spiegel 52 (z. B. vom Typ 710 DCSPXR, AHF Analysentechnik, Tübingen, Deutschland) in das Objektiv 51 gelenkt (z. B. 60 x 1.2-Objektiv UplanApo Olympus) und in der Probenkammer 10 fokussiert. Aus Kalibrierungsmessungen sind die Dimensionen des Anregungsvolumens r0 und z0 in der Fokalebene bekannt. Der Durchmesser des Fokus in der Fokalebene beträgt z. B. r0 =0.48μm. Mit einem Verhältnis r0/z0 =2.8 ergibt sich ein wirksames Anregungs-Volumenelement von ungefähr 0.4 f1.
In diesem Anregungsvolumen wird je nach Anwesenheit von Fluoreszenzmarkern eine Fluoreszenzemission angeregt, die über das Objektiv 51, den dichroitischen Spiegel 52, einen Emissionsfilter 53 (z. B. vom Typ 600 DF 200, AHF Analysentechnik) zur Unterdrückung des Anregungslichts und eine Optik 54 auf einen zweiten dichroitischen Spiegel 55 (z. B. vom Typ 595 DCLP, AHF Analysentechnik) gerichtet wird. Am zweiten dichroitischen Spiegel 55 wird der kurzwellige Teil des Fluoreszenzlichtes reflektiert und durch einen Bandpassfilter 56 auf den langwel- ligen Detektor 31 der Detektoreinrichtung gerichtet. Das am dichroitischen Spiegel durchgelassene Fluoreszenzlicht wird ebenfalls gefiltert (Kantenfilter 57) und auf den kürzerwelligen Detektor 32 gerichtet. Die Einkopplung in die Detektoren erfolgt mit Lichtleitfasern 58 bzw. 59. Die Detektoren sind bspw. Avalanche-Photodioden (Typ: SPCM-200, EG & G Optoe- lectronics, Kanada) . Die optischen Einkoppelfasern besitzen einen Durchmesser von 100 μm und sind einzelnen in allen drei Raumrichtungen justierbar. Die Detektoren 31, 32 sind mit einem Korrelator 40 verbunden. Als Korrelator wird bspw. eine Korrelatorkarte (Typ: ALV-5000, Hersteller LAV Langen, Deutschland) verwendet. Abweichend vom in Figur 1 gezeigten Aufbau kann auch auf die Einkoppelfasern verzichtet und das Fluoreszenzlicht direkt auf die Detektoren abgebildet werden. Der optische Aufbau kann zusätzlich zur Aufnahme von konfokalen Spektren mit einem fasergekoppelten Spektrometer (Hersteller Ocean Optics, USA) ausgestattet sein.
Die Probe 11 in der Probenkammer 10 enthält mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei Fluoreszenzmarkern markierten Analyten. Gegenstand der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmessung ist bspw. eine Koinzidenzanalyse der mit den Detektoren 31, 32 erfassten Fluoreszenzemissionen der verschiedenen Fluoreszenzmarker. Dies ist schematisch in Figur 2 illustriert. In der Probe sind bspw. die Analyten AI und A2 enthalten, die jeweils mit Fluoreszenzmarkern Ml und M2 markiert sind. Die Analyten sind bspw. Paare von Antikörpern und Antigenen, deren Bindungsverhalten untersucht werden soll. Solange die Analyten AI und A2 nicht aneinander gebunden sind, passieren sie getrennt zu verschiedenen Zeiten das Anregungsvolumen. Die Detektoren 31, 32 liefern zeitlich getrennt Fluoreszenzsignale, die in Figur 2 (links, Mitte) schematisch durch Pfeile Pl, P2 symbolisiert werden. Die Fluoreszenzsignale werden unkorreliert zu beliebigen Zeiten gemessen, ein Kor- relations- oder Koinzidenzsignal G ist nicht ableitbar. Nachdem die Bindung zu einem Analyten A3 erfolgt ist, der die Fluoreszenzmarker Ml und M2 gemeinsam trägt, wird an beiden Detektoren 31, 32 gleichzeitig die Fluoreszenzemission erfasst. Entsprechend ist ein Korrelations- oder Koinzidenzsignal ableitbar (Figur 2, rechts unten) .
Umgekehrt kann auch die Zerlegung des Analyten A3 in Teilkomponenten detektiert werden, wie dies bspw. bei der Beobachtung des enzymatischen Abbaus eines zweifach mit Fluoreszenzmarkern gelabelten Substrats von Interesse ist. Allgemein werden mit dem erfindungsgemäßen Messverfahren vorzugsweise alle chemischen Reaktionen oder physikalischen Abläufe erfasst, bei denen eine chemische Bindung zwischen getrennten Analyten hergestellt oder eine vorhandene Bindung aufgeschnitten oder entsprechend eine physikalische Assoziation oder Dissoziation durchgeführt wird. Dem Messverfahren sind alle Analyten (Substanzen) zugänglich, die auf den verschiedenen Seiten der jeweils herzustellenden oder zu trennenden Verbindung mit Fluoreszenzmarkern markierbar sind.
Die Signalerfassung mit den Detektoren und die Korrelationsanalyse erfolgen in an sich von den FCS-Techniken bekannter Weise. Mit den Detektoren erfolgt eine Fluoreszenzmessung in vorbestimmten Zeitfenstern. Die Breite der Zeitfenster wird anwendungsabhängig gewählt. Sie wird vorzugsweise auf die mittlere Aufenthaltsdauer der Analyten im Messvolumen eingestellt. Die Aufenthaltsdauer ist insbesondere von der Moleküloder Teilchengröße und -beweglichkeit abhängig und kann gemessen oder theoretisch abgeschätzt werden. Die in den Zeitfenstern erfassten Photonenzahlen werden in den beiden Detekti-
I I onskanälen verglichen. Zur Koinzidenzanalyse erfolgt der Vergleich gleichzeitiger Zeitverläufe. Die Kreuzkorrelationsanalyse ist auf den Vergleich zeitlich versetzter Abläufe gerichtet. Die Korrelationsanalysen werden mit an sich bekannten AI- gorithmen zur Verarbeitung der Signale der verschiedenen De- tektionskanäle durchgeführt.
Auf der Grundlage der Koinzidenzanalyse ist eine Konzentrationsmessung möglich. Aus der Stärke der erfassten Koinzidenzen (Amplitude von Koinzidenzsignalen) wird ein Maß für die Zahl der doppelt markierten Moleküle oder Teilchen in der Probe abgeleitet .
Die mit dem Korrelator 40 durchgeführte Kreuzkorrelationsoder Koinzidenzanalyse der Detektorsignale erfolgt vorzugsweise in bekannter Weise, wie es in WO 99/34195 beschrieben ist. Die in dieser Patentanmeldung offenbarten Einzelheiten zur Signalanalyse werden vollständig durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung einbezogen.
Es kann insbesondere analog zu dem in WO 99/34195 beschriebenen Verfahren vorgesehen sein, dass während der Fluoreszenzanalyse mittels eines Strahlscanners und/oder eines Probensantriebs zwischen der Probe und der Beleuchtungseinrichtung eine Relativbewegung eingestellt wird. Es erfolgt eine Erhöhung der Fluktuationsbewegungen, die Diffusionszeiten werden niedriger. Das Messvolumenelement kann durch die Probe gescannt werden. Bei Einstellung dieser Relativbewegung ist gegebenenfalls das Zeitfenster der Koinzidenzanalyse anzupassen.
Als Fluoreszenzmarker Ml, M2 werden vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, wie sie bspw. aus der Fluoreszenzmikroskopie bekannt sind. Es werden Farbstoffpaare ausgewählt, die bei einer ausgewählten Wellenlänge ähnliche Absorptionsquerschnitte aufweisen und spektral separierbare Fluoreszenzspekt- ren bei hoher Photostabilität besitzen. Als Markerpaare werden bspw. die Farbstoffe Rhodamin Grün/Texas Rot, Fluoreszein- Derivate (z. B. Alexa 488/Alexa 594) oder molekularbiologische Farbstoffe wie grün fluoreszierende Proteine (GFP) /rot fluoreszierende Proteine (RFP) verwendet. Anstelle von Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen können auch andere fluoreszierende Substanzen oder Partikel, z . B. sog. Quantum Dots, als Fluoreszenzmarker eingesetzt werden. Es können auch autofluoreszierende Proteine, wie z.B. GFP, dsRED, autofluoreszierende Biomolekülen, z. B. Tryptophan, Tyrosin, oder Flavine, oder autofluoreszierende organische Molekülen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Erfassung von Ramanstreuung oder oberflächenverstärkter Ra- manstreuung (surface enhanced raman scattering, SERS) ausgelegt sein.
Figur 3 zeigt die spektralen Eigenschaften des Markersystems Rhodamin Grün/Texas Rot. Beide Farbstoffe zeigen eine ähnlich hohe Fluoreszenzphotonenausbeute und eine genügende Lichtstabilität, um die erfindungsgemäß verwendeten Anregungsintensitäten zu tolerieren. Die Spektren (1) und (2) zeigen die Fluoreszenzemissionen von Rhodamin Grün bzw. Texas Rot (μM-Lösun- gen) bei einer Anregungswellenlänge von 830 nm. Die Kurve (3) zeigt den Transmissionsverlauf des dichroitischen Spiegels 55. Im Bereich der kürzerwelligen Fluoreszenz (1) erfolgt die Re- flektion zum Detektor 31. Die Kurven (4) und (5) zeigen die Transmissionscharakteristik der Filter 56 bzw. 57, die zur weiteren Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses vorgesehen, jedoch kein zwingendes Merkmal der Erfindung sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Anregung der 2-Photonen-Absorptionen bei einer vorbestimmten Anregungswellenlänge, die wie folgt ausgewählt wird. Nach Ermittlung der Anregungsspektren der verwendeten Fluoreszenzmarker (siehe Figur 3) wird für jeden Fluoreszenzmarker die Fluoreszenzphotonenausbeute in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge ermittelt. Da sich die Anregungsspektren der Fluoreszenzmarker überlappen, ergeben sich auch überlappende Kurvenverläufe der wellenlängenabhängigen Fluoreszenzphotonenaus- beute. Die optimale Wellenlänge wird entsprechend der Wellenlänge oder dem Wellenlängenintervall gewählt, in dem die Fluoreszenzphotonenausbeuten beider Fluoreszenzmarker im Wesentlichen übereinstimmen oder die Abweichung zwischen den Fluoreszenzphotonenausbeuten weniger als ein vorbestimmtes Verhältnis, z. B. weniger als Faktor 3, beträgt. Dies wird im Folgenden am Beispiel von Fluoreszenzfarbstoffen illustriert.
Die Figuren 4 und 5 illustrieren spektrale Eigenschaften des Markerpaars Rhodamin Grün/Texas Rot . Zur Ermittlung der optimalen Anregungswellenlänge zur 2-Photonen-Anregung wird für jeden Farbstoff ein Anregungsspektrum im Bereich 740 nm bis 900 nm aufgenommen. Die Kurvenverläufe in Figur 4 zeigen ein Anregungsmaximum bei 780 nm für Texas Rot (Kreuze) und bei 850 nm für Rhodamin Grün (Dreiecke) . Für die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmessungen wird eine Anregungswellenlänge gewählt, bei der beide Farbstoffe mit nahezu gleicher Effizienz anregbar sind und bei der beide Farbstoffe vergleichbar starke Fluoreszenzemissionen zeigen. Die Anregungswellenlänge beträgt beim dargestellten Beispiel 830 nm.
Figur 5 zeigt, dass die Anregung bei 830 nm tatsächlich eine 2-Photonen-Absorption bewirkt. Für beide Farbstoffe wurde getrennt die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Anregungsleistung gemessen. Für beide Farbstoffe ergibt sich unterhalb der Sättigungsgrenze die für 2-Photonen-Prozesse zu erwartende quadratische Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der eingestrahlten Leistung. Die doppelt logarithmische Darstellung liefert die entsprechende linearisierte Form mit Steigung 2.
Figur 6 zeigt den Verlauf von Autokorrelationskurven, die mit einer Testlösung von Rhodamin Grün in den beiden Detektionka- nälen aufgenommen wurden und eine entsprechende Kreuzkorrelationskurve zwischen beiden Detektionskanälen. Alle drei Kurven verlaufen im wesentlichen gleich. Dies zeigt, dass die Detek- tionsvolumen identisch bzw. die Detektionsstrahlengänge genau auf das Anregungsvolumen justiert sind. Kreuzkorrelationsmessungen an doppelt markierten (obere Kurve) und einfach markierten (untere Kurve) DNA-Proben sind in Figur 7 illustriert. Als Vorteil des Messverfahrens zeigt sich, dass sich für die nicht-korrelierten Proben Kreuzkorrelationssignale G ergeben, die weniger als 10 % der entsprechenden korrelierten Signale betragen. Damit ist der erfindungsgemäße Aufbau den herkömmlichen 1-Photon-Messungen überlegen.
Figur 8 illustriert eine bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Messverfahrens zur Ermittlung von Konzentrationen in der Probe. Es wird die Echtzeitmessung von Enzymkinetiken dargestellt. Ein zweifach markiertes Substrat (DNA-Probe) wird enzymatisch in einzeln markierte Produkte zerlegt. Dementsprechend sinkt die Zahl der erfassten doppelt markierten Moleküle im Zeitverlauf. Mit zunehmender Konzentration des zugesetzten Enzyms (Endonuklease EcoRI) wird der Abfall der Substrat on- zentration beschleunigt.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Fluoreszenzmessung an Analyten in einer Probe, wobei die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern 'markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierten Analyten enthält, wobei die Fluoreszenzmarker spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen besitzen, mit den Schritten:
- Beleuchtung der Probe (11) in einem Messvolumen mit einem Laser (20) zur Anregung der Fluoreszenzemission der mindestens zwei Fluoreszenzmarker,
- Detektion der Fluoreszenzemission mit mindestens zwei Detektoreinrichtungen (31, 32) , die zur Lichtdetektion in verschiedenen Spektralbereichen entsprechend den spektralen Fluoreszenzeigenschaften der Fluoreszenzmarker ausgelegt sind, und
- Durchführung einer Kreuzkorrelations- und/oder eine Koinzidenzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen (31, 32), dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensität erfolgt, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2- Photonen-Absorptionen angeregt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Detektion der Fluoreszenzemission eine blendenfreie Abbildung des Lichtes, das vom Messvolumen und ^ron der Umgebung des Messvolumens ausgeht, auf die Detektoreinrichtungen erfolgt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem als Fluoreszenzmarker Fluoreszenzfarbstoffe, fluoreszierende Proteine, Biomoleküle, organische Moleküle, Quantum Dots oder Marker, die zur Erfassung von Ramanstreuung ausgelegt sind, verwendet werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem als Fluoreszenzmarker Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, die sich überlappende 2-Photonen-Anregungsspektren und unterschiedliche Fluoreszenzemissionsspektren besitzen.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Beleuchtung der Probe mit der Laserlinie mit einer Wellenlänge erfolgt, bei der beide Fluoreszenzmarker im wesentlichen gleiche oder in vorbestimmter Weise voneinander abweichende Fluoreszenzphotonenausbeuten besitzen.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem eine Koinzidenzanalyse der Detektorsignale erfolgt und aus dem Ergebnis der Koinzidenzanalyse die Konzentration von mehrfach markierten Analyten in der Probe abgeleitet wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem mittels eines Strahlscanners und/oder eines Probensantriebs zwischen der Probe und der Beleuchtungseinrichtung eine Relativbewegung eingestellt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, bei dem die Koinzidenzanalyse durch Vergleich der in bestimmten Zeitfenstern erfassten Fluoreszenzsignale der verschiedenen Detektoreinrichtungen (31, 32) erfolgt, wobei die Breite des Zeitfensters im Bereich der mittleren Aufenthaltsdauer der Analyten im Messvolumen eingestellt ist.
9. Vorrichtung (100) zur Fluoreszenzmessung an Analyten in einer Probe, wobei die Probe mindestens zwei mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Analyte und/oder mindestens einen mit mindestens zwei Fluoreszenzmarkern markierten Analyten enthält, die umfasst:
- eine Probenkammer' (10) , in der die Probe angeordnet ist,
- eine Beleuchtungseinrichtung (20) , die zur Anregung von Fluoreszenzemission der mindestens zwei Fluoreszenzmarker mit einer einzigen Laserlinie eingerichtet ist,
- mindestens zwei Detektoreinrichtungen (31, 32) , die zur Detektion der Fluoreszenzemission in verschiedenen Spektralbereichen ausgelegt sind, und
- ein Korrelator (40) zur Kreuzkorrelations- und/oder Koinzidenzanalyse von Detektorsignalen der Detektoreinrichtungen, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung einen Laser umfasst, der zur Beleuchtung der Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit einer derart hohen Anregungsintensität ausgelegt ist, dass die Fluoreszenzmarker gemeinsam durch 2- Photonen-Absorptionen angeregt werden.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, bei dem der Laser bei einer Anregungslinie emittiert, die im roten oder nahinfraroten Spektralbereich liegt.
11. Vorrichtung gemäß Anspruch 9 oder 10, bei der ein Abbildungssystem (50) mit Pinhole-freiem Aufbau vorgesehen ist.
12. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Messung von Konzentrationen in Probenlösungen oder -Suspensionen zur - Erfassung von molekularen Vorgänge in biologischen Zellen, physikalischen oder chemischen Vorgängen zur Verbindung oder Trennung von Substanzen oder Partikeln, oder molekularen Eigenschaften, wie physikalischen oder chemischen Assoziation oder Bindungen bzw. Spaltungen oder Dissoziationen durch Konzentrationsbestimmung der Analyten,
- Diffusionsanalyse',-
- Triplettanalyse mittels Kreuzkorrelation,
- molekularen Helligkeits- und Polarisationsanalyse der Fluo- rophore, oder
- Analyse- oder Bewertung beim High-Throughput-Screening oder beim Selektionsschritt bei der evolutiven Optimierung von Biomolekülen.
PCT/EP2001/008328 2000-07-20 2001-07-18 Verfahren und vorrichtung zur mehrfabben 2-photonen-fluoreszenz-koinzidenzanalyse WO2002008732A1 (de)

Priority Applications (3)

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