JP2002139436A - 多光子レーザ顕微鏡法 - Google Patents

多光子レーザ顕微鏡法

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JP2002139436A JP2001229511A JP2001229511A JP2002139436A JP 2002139436 A JP2002139436 A JP 2002139436A JP 2001229511 A JP2001229511 A JP 2001229511A JP 2001229511 A JP2001229511 A JP 2001229511A JP 2002139436 A JP2002139436 A JP 2002139436A
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Shu Chris
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Abstract

(57)【要約】 レーザ走査顕微鏡は、３つ又はそれ以上の光子の同時吸
収により、目的物における分子励起を生じさせて、内在
的な３次元分解能をもたらす。短い（紫外線の又は可視
の）波長領域における単一光子の吸収を有する蛍光体
は、比較的長い（赤色の又は赤外線の）波長領域のレー
ザ光による、強く結像されたサブピコ秒のパルスのビー
ムにより励起させられる。蛍光体は、生きた細胞及び他
の極微的な対象物の蛍光画像を作成するために、レーザ
波長の約３分の１，４分の１又はそれより小さい分数で
さえも吸収する。蛍光体からの蛍光放射は、励起強度と
ともに、３次的に，４次的に又はそれより大きな冪乗の
法則で増大し、その結果、レーザ光を結像させることに
より、光漂白のみならず、蛍光が焦点面の近傍に限定さ
れる。この特徴は、共焦点レーザ走査顕微鏡によりもた
らされるものに匹敵する視野分解能の深度を与え、更
に、光漂白及び光の有毒性を減少させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、３つ又はそれ以上の光子の同時
吸収により、目的物における分子の励起をもたらすレー
ザ顕微鏡検査技術に関する。本発明は、デンク（Ｄｅｎ
ｋ）等により米国特許第５，０３４，６１３号（以
下、’６１３号特許という）に開示された２光子レーザ
顕微鏡における改良であり、また、この特許は、引用す
ることにより、ここに組み込まれる。
【０００２】発明の背景 上記’６１３号特許は、内在的な３次元分解能をもたら
すべく、２光子の同時吸収により目的物における分子の
励起を生じさせるレーザ走査顕微鏡を開示している。短
い（紫外線の又は可視の）波長帯域における単一光子吸
収を有する蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、強
く結像されたサブピコ秒の比較的長い（赤色の又は赤外
線の）波長帯域のレーザ光の流れにより励起させられ
る。上記蛍光体は、生きた細胞及び他の極微的な対象物
の蛍光像をつくるために、約２分の１のレーザ波長を吸
収する。上記蛍光体からの蛍光放射は、レーザ光を結像
させることにより、蛍光及び光漂白が焦点面近傍に限定
されるように、励起強度とともに２次的に増える。この
特徴は、共焦点のレーザ走査顕微鏡により生じさせられ
たものに匹敵する視野分解能の深度を与え、その上、光
漂白を減少させるものである。レーザ走査顕微鏡による
レーザビームの走査は、レーザビームを結像させること
により、また、そのビームをパルス時間で圧縮すること
により得られる非常に高い励起強度についての必要条件
を満たしながら、走査された対象物における各ポイント
からの２光子の励起による蛍光を集めることにより、像
の形成を可能とする。結像されたパルスは、また、かご
閉じ込めエフェクタ分子（ｃａｇｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏ
ｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の光分解の放出（ｐｈｏｔｏ
ｌｙｔｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ）において特に有用であ
る、３次元空間的に解像される光化学をもたらす。
【０００３】上記’６１３号特許に開示された２光子レ
ーザ顕微鏡検査技術についての欠点は、その適用が、有
用なレーザ技術に限定されることである。特に、２光子
技術は、その適用に従って、２光子のエネルギーレベル
の合計が所望の蛍光放射を生じるのに必要とされる特定
のエネルギーレベルをもたらすように、特定の波長にお
けるレーザの利用を要する。あいにく、幾らかのレーザ
顕微鏡の適用は、現時点では技術的に実現不可能である
波長を有するレーザの利用を要するであろう。例えば、
アミノ酸及び核酸のような、非常に短い波長の吸収を有
する発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）の励起は、上
記２光子技術を用いて、５４０ｎｍの波長を有するレー
ザを要することとなるが、現時点では、かかるレーザは
存在しない。
【０００４】発明の概要 本発明は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に、また、マイク
ロ薬理学（ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）につ
いてのかご閉じ込め試薬の活性化、及び、光学的な３次
元情報保存についてのポリマー架橋のような空間的に解
像される光化学的な処理に、３つ又はそれ以上の光子の
励起を適用することにより、前述した問題に対する解決
法をもたらすことができる。
【０００５】３光子に誘導される蛍光が、励起強度に対
する三次的な依存性に従う一方、４光子による励起が、
四次的な依存性に従うため、両方はレーザ走査顕微鏡に
おいて内在的な３次元分解能をもたらす。たとえ、かか
る３次元分解能が、上記’６１３号特許に開示された２
光子レーザ顕微鏡に基づく非線形の顕微鏡検査技術によ
り既に実現されるものでも、３つの光子の励起が、通常
では紫外帯域（２３０〜３５０ｎｍ）において励起可能
である分子を近赤外光（７００〜１１００ｎｍ）で励起
させることは稀である。アミノ酸トリプトファン（ｔｒ
ｙｐｔｏｐｈａｎ）及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ
ｅ）、神経伝達物質であるセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎ
ｉｎ）及び核酸のような興味あるバイオ分子は、約２６
０〜２８０ｎｍにおける１光子吸収ピークを有してお
り、これらのバイオ分子では、３つ及び４つの光子の励
起により、蛍光が励起され得る。赤外光に近い長波長を
用いる利点は、生きた細胞への光によるダメージがおそ
らく少ないことや深い紫外線吸収体について好都合に適
用し得る固体状態のフェムト秒のレーザ源である。実際
には、３光子レーザ走査顕微鏡の構成は、既存する２光
子システムと同様である。しかしながら、３光子及び２
光子の吸収スペクトルは、全体として、まったく異なる
ので、２光子及び３光子が励起される蛍光顕微鏡検査法
の組み合わせは、２光子顕微鏡において一般に採用され
ているレーザシステムの有効範囲を拡張する。
【０００６】３つ若しくはそれ以上の光子の励起の特に
有効な適用は、２００ｎｍ程度の波長の吸収を要するあ
る適用について、エキシマレーザを取り替えることであ
る。よりずっと長い波長（つまり５５０〜９００ｎｍ）
を発するレーザによる３つ及び４つの光子の励起は、同
様のエネルギー吸収をもたらし、その上、３次元空間分
解能をもたらすものである。エキシマレーザは、極めて
高価であり、ユーザに身近なものでないため、幾つかの
光子の励起が、非常に望ましいかも知れない。
【０００７】提案される３光子顕微鏡検査の実用性は、
種々の蛍光体及びバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅ）の３光子の蛍光励起断面積に極めて重大に依存す
る。しかしながら、３光子の吸収断面積が報告されたこ
とはほとんどない。摂動論に基づく簡単な計算は、３光
子の励起が、匹敵する励起のレベルを実現するために、
典型的には、２光子励起技術で一般に用いられるピーク
強度の＜１０倍を要することをあらわしている。この必
要とされる強度レベルが、モードロック式のＴｉ：サフ
ァイアレーザのようなフェムト秒のレーザ源により容易
に手に入れることができる。モデロック式のＴｉ：サフ
ァイアレーザを用いて、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏ
ｐｈａｎ）及びセロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）の３
光子に導かれる蛍光は、約８００と９００ｎｍとの間に
ある励起波長において観察される。測定される蛍光は、
期待された励起強度に対する３次的な法則の依存性に従
う。カルシウム指示薬（ｉｎｄｃａｔｏｒ）の蛍光パワ
ーの測定法は、期待された３光子励起の最適条件よりも
かなり下の励起波長（約９１１ｎｍ）でのフラ−２（Ｆ
ｕｒａ−ＩＩ）を着色し、満足な蛍光画像が、最適な励
起波長（約７３０ｎｍ）でのフラ−２の２光子励起に必
要とされるレーザパワーのわずか〜５倍で取得し得るべ
きであることが示されている。これらの予備結果から概
算される３光子蛍光励起断面積は、３光子レーザ走査顕
微鏡検査法が、適度なレベルの励起パワーを用いて行わ
れることを示している。このアプローチがどれほど広く
適用可能であるかは、決定されなければならない。４光
子励起は、約１０００ｎｍより上の水（ｗａｔｅｒ）に
よる強い１光子吸収のオンセット（ｏｎｓｅｔ）によっ
て制限され得る。
【０００８】３つ又はそれ以上の光子のプロセスによる
蛍光の分子励起の研究は、その励起断面積が相当小さい
ものであると予期されるので、稀である。その結果、励
起の有効なレートは、通常、非常に高い瞬間照明強度を
要する。多光子断面積の簡単な補外（ｅｘｔｒａｐｏｌ
ａｔｉｏｎ）としては、放射電磁界による分子励起に関
した双極子遷移確率の量子力学の摂動論の解における、
マトリックス素子のパターンの積が考えられる。基本的
には、多光子プロセスは、分子と相互作用するために、
（分子の断面領域、Ａ〜１０−１６ｃｍ２の範囲内で、
また同時に、中間状態の寿命により決定される時間間
隔、δτ〜１０−１６ｓの範囲内で）３つ又はそれ以上
の光子を要する。この短い一致時間は、摂動論のエネル
ギー分母から導出される大きなエネルギーの不確定性に
より制限される。
【０００９】幾つかの光子による蛍光励起は、（与えら
れた蛍光体についての）長い方の励起波長が、１光子ポ
イント拡張関数を複数の光子のプロセスに関するパワー
ｎに引き上げることにより増大させられるのと同じ程度
で、分解能を減少させるので、レーザ顕微鏡検査法の分
解能を著しく増大させることはない。それは、波長の因
子に関するものでなく、３光子励起の分解能における増
大は、本質的には、２光子顕微鏡に対して理想的な共焦
点空間フィルタを付加することにより招来されるものと
同様のものであろう。
【００１０】意外にも大きな３光子の断面積についての
近年のリポートは、（過度に明るい閃光から人間の視界
を保護するための調節可能な遮光物を付与することを目
的とした）光学的に制限のある吸収を向上させるための
研究のうちに見い出される。最近では、約１０−７５ｃ
ｍ６ｓ２の光子吸収断面積が、テトラヒドロフラン（ｔ
ｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）における２，５−ベン
ゾチアゾ（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏ）３，４−ジデシロ
キシ（ｄｉｄｅｃｙｌｏｘｙ）の吸収及び蛍光に関して
報告されている。近年のまた別の実験は、共役有機ポリ
マーからの蛍光の３光子励起を示している。しかしなが
ら、このプロセスは、ほとんどの蛍光励起とは異なった
２つの励起状態を含むようにみえる。これらの実験の条
件は、レーザ走査蛍光顕微鏡検査に若しくは大抵のマイ
クロ光化学にまったく適さないが、大きな断面積は約束
される。しかしながら、かかる大きな断面積は、３つ又
はそれ以上の光子の顕微鏡検査に不可欠ではないことに
注意すべきである。
【００１１】蛍光顕微鏡検査及びフォトマイクロ薬理学
における生きた細胞への光によるダメージのレートの励
起波長の依存性は、広くには知られておらず、異なる適
用については大きく変化し得る。経験では、２光子励起
が、匹敵する蛍光画像の認識についての１光子励起より
もはるかに少ないダメージを導くことが分かっている。
励起に関して３つ又は４つの光子に増加することによっ
て、改良が更に為され得るかどうかは明らかでない。こ
のような知識及び非線形吸収スペクトルの知識の助けに
よって、将来、最良の励起モードが、個々のシステムに
ついて決定され、利用されることが可能である。特に魅
力のある可能性は、３光子励起及びそれに伴う蛍光信号
の２光子励起による光化学を導き出すために、１つのレ
ーザ波長を用いることである。３光子励起は、それを元
に戻しそうにないことを除いて、まったく好ましいこと
に、既存の２光子励起技術を有効に向上させるように思
われる。
【００１２】代わりとして、極微的な光化学の活性，光
切除及び光学的な手術（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｕｒｇｅｒ
ｙ）に関し、光の励起は、アミノ酸及び核酸のような非
常に短い波長吸収体を有する内在的な発色団、若しくは
同等の付加された発色団の多光子励起により、好適に実
現され得る。多光子励起は、長波長でのサブピコ秒のパ
ルスをもたらすより有用なレーザの選択、及び、光の励
起が望まれる極微的な焦点体積への長波長光の伝達を可
能とする。
【００１３】発明を実施するための最適なモード さて、本発明の好適な実施の形態の詳細な説明について
は、図１は、３通りの検出方式を有する従来の走査顕微
鏡を模式的に示している。サブピコ秒のパルス化された
レーザ源１２は、可動式ステージ又は他の適切な支持部
材１５上に置かれた試料又は目的物の必然的な励起をも
たらすものである。上記レーザ１２は、例えば、約８０
ＭＨｚの繰り返し率で、１００ｆｓｅｃより短い持続期
間を有するパルスとともに、約６３０ｎｍの、スペクト
ルの赤領域における波長を有する光のパルスを生じ得
る、コライディング・パルス（ｃｏｌｌｉｄｉｎｇ ｐ
ｕｌｓｅ）の、モード・ロック式の色素レーザ若しくは
固体レーザであってよい。他の明るいパルスレーザもま
た、例えば、その合計が試料における蛍光に必要とされ
る適切な吸収エネルギー帯域に匹敵するであろう必然的
な励起の光子エネルギーを生じるように、赤外線の、若
しくは赤色の領域における比較的長い異なる波長の光を
もたらすために使用されてもよい。単一光子励起技術に
おいて、これらは３つ又は４つの光子励起について、そ
れぞれ、入射光の波長の約３分の１、若しくは４分の１
の波長を有するスペクトル領域における単一光子の吸収
により励起されることになる。その結果、例えば、９４
５ｎｍでの可視の赤色領域における３つの光子が、通常
３１５ｎｍでの紫外線領域における光を吸収する蛍光を
励起させるように協力する一方、１０７０ｎｍでの３つ
の光子が、可視光領域において、３５７ｎｍで吸収する
分子を励起させることになる。
【００１４】本発明の改良された態様では、単一波長レ
ーザ１２が、入射光ビームが、高い瞬間パワーの、ま
た、異なる波長の、２つ又はそれ以上の重ね合わせパル
ス光ビームからなるように、２つ又はそれ以上の異なる
長波長のレーザ源に交換され得る。入射ビームの波長
は、 １／λａｂｓ＝１／λ１＋１／λ２＋１／λ３ と表記され得る短い波長で吸収性のある蛍光を励起させ
るように選択される。ここで、λａｂｓは吸収体の短い
波長であり、λ１，λ２及びλ３は、３つの波長のケー
スに場合についての、レーザの入射ビームの波長であ
る。
【００１５】上記レーザ１２は、１組みの発振ミラーを
有するＸ−Ｙスキャナ１８により走査され、その後、接
眼レンズ２０及び２２並びに対物レンズ２４により、焦
点つまり焦点体積１９で試料１４上に結像される、パル
ス化された出力ビーム１６を生じる。対物レンズの背面
口径（ｂａｃｋ ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、走査されるビ
ームについてのピボットポイントであり、その結果、収
差を無視し、ラスターパターンにおける全ての点は、同
等の画像形成条件を経験する。上記スキャナ１８は、試
料１４を通じて、焦点つまり焦点体積１９の走査を行
い、それによって、焦点つまり焦点体積１９での若しく
はその近傍における試料１４の蛍光励起をもたらす。
【００１６】上記出力ビーム１６は、上記Ｘ−Ｙスキャ
ナ１８に指向させられる前に、分散補正及びパルス診断
器の両方にかけられる。フェムト秒のパルス化された照
明の問題の１つは分散である。短いパルスは、光学材料
を通過する場合に、パルス化された帯域幅の互いに異な
る周波数成分が、材料内で異なる速さで進むため、広が
る傾向にある。光学材料についての分散補正は、約１２
０ｆｓｅｃよりも大きいパルスにとって不可欠でない。
なぜなら、これらのパルスが小さな周波数帯域幅（約４
ｎｍ）を有し、その結果、広がりがほとんどないからで
ある。しかしながら、７００ｎｍで、７０ｆｓｅｃのパ
ルスは、良好な対物レンズにより約１．５倍に、ビーム
変調及びシャッタに用いられ得る標準的な音響光学変調
器によりそれ以上に広げられることが分かっている。パ
ルスの広がりは、観察される蛍光の均整を減少させる。
顕微鏡１０では、光学材料についての分散補正が、より
高い（全体としてより遅い）周波数がより少ないガラス
を通過して、その結果、固有の位相遅れに戻されるよう
に、光を指向させる一対のガラスプリズム２６及び２８
を二重に通過することにより達せられる。上記プリズム
２６及び２８を通過してリターンさせるためには、全反
射ミラー３０が用いられる。
【００１７】量的な測定のために、励起ビームの波長及
びパルス持続時間を知る必要があり、そのため、パルス
化された出力ビーム１６を分析すべく、種々の態様のパ
ルス診断器３２が提供される。波長及び持続時間の両方
の大まかなモニタのためには、波長の測定値をもたら
す、標準的な形態にある単一のモノクロメータが十分で
ある。もし、出力のスリットが取り除かれ、その結果得
られるスペクトルが、スクリーン又は１次元検出器へ送
られれば、パルス波長帯域がモニタされ得る。より正確
なパルス分析のために、上記パルス診断器３２は、直接
的で詳細なパルス幅の測定及びその位相干渉の輪郭の指
示を可能とする自己相関器（ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔ
ｏｒ）を有してもよい。
【００１８】レーザ顕微鏡１０は、また、３つの検出方
式の各々について、蛍光通路を分離するために用いられ
る、第１，第２及び第３のダイクロックミラー３４，３
６及び３８を有している。これらの方式の第１のもの
は、分離スキャンされた（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ）共焦点
検出方式として知られている。共焦点検出では、蛍光ビ
ームが、共焦点光電子増倍管（ＰＭＴ）４２の前に配置
されたピンホール絞り４０で静止画像面を形成するよう
に、分離スキャンされる。走査におけるすべての位置
で、標本において照射されるポイントは、検出器の面に
おける開口部に対して結像する、若しくは共焦である。
上記ピンホール絞り４０と第１のダイクロックミラー３
４との間には、検出された信号から望ましくない周波数
を除去するために、帯域放射フィルタ４４が配置されて
いる。
【００１９】第２の検出技術は、対物レンズの背面口径
が、分離スキャンなしに、レンズ４６及び帯域放射フィ
ルタ４８を介して、フーリエＰＭＴ５０上に結像される
フーリエ面検出方式として知られている。上記背面口径
が走査においてピボットポイントであるため、蛍光のパ
ターンは、光電陰極において定常である。
【００２０】最後に、第３の検出技術は、試料１４にお
ける完全な焦点面が、上記帯域放射フィルタ５２及び結
像レンズ５４を通じて、その認識速度がフレームの走査
時間に同調させられるＣＣＤカメラのような画像形成検
出器５６上に結像される、走査された画像形成検出方式
として知られている。
【００２１】検出方法の最初の選択は、既存の顕微鏡の
構成により、若しくは設計された特定の実験に必要な顕
微鏡検査方法により決められる。各検出方式の概要は、
それ自身特有の長所及び短所を呈している。これら全て
の検出方式の概要では、集光された蛍光が、適切に被覆
されたダイクロックミラーにより抽出される。典型的に
は、励起波長と放射波長との間の差がストークスシフト
（Ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ）よりもずっと大きいた
め、２色性の被覆が、反射透過帯域間の通常のシャープ
なカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）を有する必要はない。放
射フィルタ４４，４８及び５２は、多光子励起波長での
特有の阻止のために点検される必要があるが、通常、標
準的である。蛍光パワーに対する平均励起パワーの比
は、線形顕微鏡検査における場合よりも多光子レーザ顕
微鏡検査における場合の方が高いため、より高い阻止の
比が得られる。それ故、赤色に鈍感な光電子エミッタに
ついての光電子増倍管の選択は、有益である。
【００２２】２光子より多い多光子の励起について、例
えば、Ｎ個の光子では、１蛍光体につき１パルス当たり
に吸収される光子の数は、一般に、 と表記される。ここで、前に肩付けされた文字Ｎは、前
述したＮ＝２である２光子励起の場合の類推（ａｎａｌ
ｏｇｙ）において同時に吸収される光子の数をあらわし
ている。多光子吸収プロセスに関した連続的な比である
比Ｎｎａ／（Ｎ− １）ｎａは、 の形の有用な比較パラメータを提供する。
【００２３】予期される吸収断面積の好適な値を下の表
に記す。 （領域）ｎ （一致時間）ｎ−１ 光子の数ｎ Ａｎ（ｃｍ２ｎ） （δτ）ｎ−１ 励起断面積 単位 １ １０−１６ｃｍ２ １ σ＝１０−１６ ｃｍ２ ２ １０−３２ｃｍ４ １０−１７ｓ δ＝１０−４９ ｃｍ４ （ｓ／光子） ３ １０−４８ｃｍ６ １０−３４ｓ２ γ＝１０−８２ ｃｍ６ （ｓ／光子）２ ４ １０−６４ｃｍ８ １０−５１ｓ３ ε＝１０−１１５ ｃｍ８ （ｓ／光子）３
【００２４】これら上記２光子励起について記述された
多光子断面積及び計器パラメータの典型的な値を用いた
場合、約３Ｗレーザーパワーで、吸収の比は１（ｕｎｉ
ｔｙ）である。しかしながら、この等しい放射パワー
は、特に、波長に依存する断面積に従うものである。よ
り高い比Ｎδ／Ｎ−１δは、既知の好適な蛍光体につい
て存在し、それ以上のものは、この発明、また、他の多
光子吸収の適用がきっかけとなる研究において見い出さ
れるかもしれない。生物の細胞及び組織に対して適用す
る場合、より高いオーダの多光子励起プロセスの選択及
び励起波長の最適化は、閉じ込められた化合物の蛍光顕
微鏡検査及び極微的な活性化の間における、生物の光に
よるダメージを最小限に抑制するのに適した状態を選択
するための手段を提供する。多光子レーザーパワー顕微
鏡法又は光化学に関して、より高いオーダの多光子プロ
セスは、有効なレーザー波長の選択を調節する。
【００２５】Ｎ＞２である多光子励起を用いれば、分解
能を規定する顕微鏡のポイント拡張関数が、それ自身
で、パワーＮに増えるため、画像形成分解能は、２光子
の励起に相対して改良される。その結果、３光子励起に
関して、分解能は、波長が増大するにつれて分解能を小
さくする波長の因子を無視して、極微の共焦点アパーチ
ャの挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）とほぼ同じ因子により
更に改良される。
【００２６】図２及び３は、それぞれ、１．０μｍでの
Ｆｕｒａ−２及び１．０μｍでのＣａを備えたＩｎｄｏ
−１の３光子励起に関する入射光子の光束密度の関数と
しての蛍光強度を示している。両方の場合において、試
料における３光子の励起が明らかにあらわされ、蛍光強
度は、入射光子の光束密度の３乗に比例して増大する。
【００２７】３つ又はそれ以上の光子による多光子励起
の他の長所は、焦点励起外の依存性が、増大する光子オ
ーダＮの値とともに、強度のパワーＮが連続的に高くな
るにつれて小さくなるので、２光子励起の好適な特性
が、より高いオーダのプロセスにおいて、更に高められ
ることである。
【００２８】本発明による３つ又はそれ以上の光子の励
起は、可視又は赤外光による、単一紫外線光子の励起に
対応する励起エネルギーへのアクセスをもたらすので、
全く新しいクラスの蛍光体及び蛍光指示薬が、３次元的
に解像されるレーザ走査顕微鏡検査に受入れ可能とな
る。たとえ３つ又はそれ以上の光子の断面積は、多くの
化合物について未だ知られておらず、また、３つ又はそ
れ以上の光子の吸収には、異なる選択則が適用される
が、分子の非対称性は、しばしば、同じ励起状態への奇
数及び偶数の光子の遷移の両方を可能とする。励起状態
の対称性の効果が、奇数の光子及び偶数の光子の断面積
ピークの相対値をシフトするようにあらわれることが分
かっている。その結果、２光子吸収についての吸収ピー
クは、時折、１光子プロセスについての優勢な吸収ピー
クの２倍よりも著しく短い波長であらわれ、そして、３
光子吸収の波長依存性は、１光子の場合の３倍に近い波
長依存性にたよることができる。多光子励起は、非干渉
性の複数のステップの励起のケースにおいて特に強力で
あるかも知れない。この場合には、（例えば２光子の吸
収による）あるエネルギーの吸収が、それに伴う付加的
な光子が蛍光又は光化学的な活性が生じ得る状態に達す
るためのエネルギーをもたらす中間状態に到達する。
【００２９】さて、前述した蛍光体の全てが、２光子の
励起で、生きた細胞において蛍光性のラベル（ｌａｂｅ
ｌ）分布をイメージ化するために、決まって用いられ
る。匹敵する蛍光強度の３光子の励起は、Ｉｎｄｏ−
１，ＦＵＲＡ−２，ＤＡＰＩ及びダルニル（ｄａｒｎｙ
ｌ）とともに得られるものである。３光子の吸収断面積
は、約３δ〜２×１０−８２ｃｍ６（ｓ／光子）２であ
る。セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），ノレピネフェ
リン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ）及びトリプト
ファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）における蛍光性のアミ
ノ酸の３つ及び４つの光子の励起は、３００ｎｍ以下で
生じる１光子の吸収を用いた赤色光の励起で測定され
る。有用なレーザによる３つ及び４つの光子の使用は、
稀な神経伝達物質及びホルモンを極微的に検出しイメー
ジ化する上で都合が良い。
【００３０】本発明の他の適用は、組織又は組織の小器
官の微視的な局部除去を、それらの破壊若しくは外科的
な切除のために行う方法としてのものである。これは、
内在的な発色団により、あるいは、外部から与えられた
発色団により、３つ又はそれ以上の光子の吸収の利用を
通じて達せられる。上記発色団は、組織を分類し、サブ
ピコ秒のレーザ光のパルス吸収のための第１の特性エネ
ルギーをもたらすもので、そのレーザ光のパルスが、例
えば３分の１，４分の１等のほぼ整数分数である、若し
くは第１の特性エネルギーよりも小さい第２の特性エネ
ルギーをもたらすことになる。代わりとして、必要な蛍
光をもたらす分子が、内在的な組織蛍光体であってもよ
い。
【００３１】本発明は、好適な実施の形態に関して開示
されているが、以下の請求の範囲に規定される発明の要
旨を逸脱することなく、様々な改良や変更が可能である
ことは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の好適な実施態様に従って、レーザ走
査顕微鏡の模式的な図解である。
【図２】 Ｆｕｒａ−２の３光子励起を用いて得られ適
用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強
度のグラフである。
【図３】 Ｉｎｄｏ−１の３光子励起を用いて得られ適
用されたピークレーザ光束密度に対する平均的な蛍光強
度のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリス・シュ アメリカ合衆国14850ニューヨーク州イサ カ、ハスブローク・アパートメント2203 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 EA01 EA10 GA04 GB01 HA01 HA09 JA03 KA02 KA03 LA03 2G045 AA40 DA35 FA12 FA16 FB12 GC15 2H052 AA07 AA09 AC04 AC15 AC27 AC34 AF14 AF25 5F072 AB20 AC02 HH07 SS08 YY20

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特性エネルギーの光子により励起可能な
    分子を含む目的物の３つ又はそれ以上の光子の励起技術
    による顕微鏡検査法であって、 ｎが上記目的物により吸収されるべき光子の数に等し
    く、３より大きい若しくはそれに等しい場合に、上記目
    的物に、上記特性エネルギーの約１／ｎのエネルギーの
    光子を有するレーザ光の強いサブピコ秒のパルスのビー
    ムを照射し、 少なくとも３つの入射光子の同時吸収により分子励起を
    生じさせるべく、十分に高い照射強度をもたらすよう
    に、上記目的物の範囲内に照射光を結像させるステップ
    を有する方法。
  2. 【請求項２】 上記目的物が、かご閉じ込めの生物学的
    に活性な分子を含み、上記照射強度が、ｎ個の入射光子
    の同時吸収により、かご閉じ込めされた生物学的に活性
    な化合物を解放するのに十分であり、各エネルギーが、
    上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項１の方
    法。
  3. 【請求項３】 上記目的物が、蛍光性の分子を含み、上
    記照射強度が、ｎ個の入射光子７の同時吸収により、上
    記目的物の蛍光を生じさせるのに十分であり、各エネル
    ギーが、上記特性エネルギーの約１／ｎに等しい請求項
    １の方法。
  4. 【請求項４】 上記照射光を結像させるステップが、上
    記ｎ個の入射光子の同時吸収により分子励起を生じさせ
    るべく、上記目的物の範囲内における小さな焦点体積へ
    照射光を結像させ、該焦点体積においてのみ十分に高い
    照射強度をもたらすことを有している請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 上記目的物を通じて、上記焦点体積を走
    査すべく、上記ビームを走査し、上記目的物により生じ
    させられた蛍光を検出するステップを更に含む請求項４
    の方法。
  6. 【請求項６】 上記目的物が組織であり、また、上記分
    子励起が、内在的な発色団，外部から与えられた発色
    団、若しくは上記組織内の内在的な蛍光体による少なく
    とも３つの照射光子の同時吸収により発生する請求項１
    の方法。
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