CN113238369A - 基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明本发明公开了基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统及方法，其中，系统包括：飞秒激发光源，用于输出飞秒激发光束；小孔模块，用于对飞秒激发光束进行整形，增加双光子激发点扩散函数的高频分量；电动可调焦透镜，用于获得焦平面位置不同的多角度投影图像；角度扫描模块，用于对样本进行多角度投影成像；空间扫描模块，用于获得二维投影成像；扩束模块，用于控制飞秒激发光束孔径大小；显微物镜，用于收集样本荧光分子被激发后发出的发射光；光电倍增管，用于收集样本荧光分子发射出的荧光。该系统能够改变不同角度激发下的焦面位置，在现有生物成像信噪比条件下改善双光子层析显微镜重建体的各层横向分辨率，并且简单易实现。

Description

基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统及方法

技术领域

本发明涉及涉及计算显微成像技术领域，尤其涉及一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统及方法。

背景技术

作为非线性光学成像的一种，双光子显微（2-photon microscopy，2PM）具有成像深、抗散射、轴向高分辨率等一系列优势，在脑科学等活体生命科学研究中应用广泛。受限于其成像原理，双光子显微镜必须采用逐层逐点扫描的方式获得样本的三维体信息，这在一定程度上限制了体观测速度的提高和光毒性的降低。双光子层析计算显微术使用低NA（Numerical aperture，数值孔径）激发的工作模态，拉大景深，利用多角度投影通过计算方法恢复三维体，提高了体观测速度、降低了光毒性，是对双光子显微术的良好补充。

然而，低NA激发的工作模态同时意味着横向分辨率的下降。实际成像中可以通过在焦面于成像端的共轭面位置增加一小孔的方式，增加低NA激发的高频分量、使激发光产生“二次聚焦”现象以提高横向分辨率，但激发光的轴向最窄界面仍然会略宽于传统双光子激发模态。三维解卷积（3D deconvolution）技术从理论上说能对横向分辨率进行完美恢复，但噪声的存在使得解卷积的结果容易出现大量伪影。除此之外，在大厚度三维体成像的过程中，在焦层与离焦层相差甚远的横向分辨率事实上不利于生物现象的观测。因此，相关技术中的显微成像方法还是未能处理好双光子层析显微中的分辨率问题，有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的第一个目的在于提出一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统，通过控制、改变多角度投影成像过程中的焦面位置，抑制三维体重建过程中产生伪影的产生，获得轴向更加均匀的横向分辨率，并且在景深上具有更大的灵活性，提高用户的使用体验。

本发明的第二个目的在于提出一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法。

为达上述目的，本发明第一方面实施例提出了一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统，包括：

飞秒激发光源，用于为双光子激发输出飞秒激发光束；

小孔模块，用于对所述飞秒激发光束进行整形，增加双光子激发点扩散函数的高频分量；

电动可调焦透镜，用于从负屈光度到正屈光度的连续电压控制，获得焦平面位置不同的多角度投影图像；

角度扫描模块，用于对样本进行多角度投影成像；

空间扫描模块，用于获得二维投影成像；

扩束模块，用于控制所述飞秒激发光束孔径大小；

显微物镜，用于收集所述样本荧光分子被激发后发出的发射光；

光电倍增管，用于收集所述样本荧光分子发射出的荧光。

本发明实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统，通过双光子低NA激发模态、空间扫描、角度扫描获得样本的多角度投影图像，通过电动可调焦透镜改变不同角度下的最佳横向分辨率层位置，并三维解卷积技术重建三维体，不仅可以获得更优的横向分辨率、减少伪影的产生，而且在景深上具有更大的灵活性，从而提高了用户的使用体验。

另外，根据本发明上述实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，当所述空间扫描模块一次成像结束后，所述角度扫描模块和所述电动可调焦透镜的焦距发生变化，用于对下一个角度进行投影成像。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述角度扫描模块包括：

一个二维扫描振镜，放置于物面共轭面上，具体用于激发光入射角度的控制。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述空间扫描模块包括：

两块一维扫描振镜，放置于傅里叶面上，具体用于激发光横向位置的控制。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述电动可调焦透镜与所述扩束模块和所述显微物镜相结合，用于所述样本的焦面轴向移动。

为达上述目的，本发明第二方面实施例提出了一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法，包括：

根据成像的轴向范围，设计不同角度的焦距；

通过改变从负屈光度到正屈光度的连续控制电压，获得焦平面位置不同的多角度投影图像；

在进行所述多角度投影图像成像的过程中，通过改变所述焦距，改变横向分辨率层的位置，仿真得到所述多角度投影图像的点扩散函数；

利用所述点扩散函数及所述点扩散函数对应的投影图像，进行三维解卷积以获取样本的三维体信息。

本发明实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法，通过根据成像的轴向范围，设计不同角度的焦距，获得焦平面位置不同的多角度投影图像，在进行多角度投影图像成像的过程中，通过改变焦距改变横向分辨率层的位置，仿真得到多角度投影图像的点扩散函数，利用点扩散函数及点扩散函数对应的投影图像，进行三维解卷积以获取样本的三维体信息，本发明通过双光子低NA激发模态、空间扫描、角度扫描获得样本的多角度投影图像，通过电动可调焦透镜改变不同角度下的最佳横向分辨率层位置，并三维解卷积技术重建三维体，不仅可以获得更优的横向分辨率、减少伪影的产生，而且在景深上具有更大的灵活性，从而提高了用户的使用体验。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例所提供的一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统的结构示意图；

图2为本发明实施例所提供的一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统的结构图；

图3为根据本发明一个实施例的评估原型系统的点扩散函数和能量分布对比示意图；

图4为根据本发明一个实施例的轴向各层分辨率板三维重建结果对比示意图；

图5为根据本发明实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参考附图描述本发明实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统及方法。

图1为本发明实施例所提供的一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统的结构示意图。

如图1所示，该显微系统10包括：

飞秒激发光源100，用于为双光子激发输出飞秒激发光束。

具体的，飞秒激发光源100输出双光子激发所必需的飞秒激光。

小孔模块200，用于对飞秒激发光束进行整形，增加双光子激发点扩散函数的高频分量。

具体而言，小孔模块用于对激发光束进行整形，拓展后续低NA激发的频域范围。

电动可调焦透镜300，用于从负屈光度到正屈光度的连续电压控制，获得焦平面位置不同的多角度投影图像。

具体而言，电动可调焦透镜能在实验常用的近红外波段下，可以实现从负屈光度到正屈光度的连续电压控制，实现从负到正的连续屈光度调节，并且与后续的扩束模块和显微物镜相结合，能够实现样本焦面处正负百微米范围的焦面轴向移动。在进行不同角度投影成像的过程中，通过设计并改变电动可调焦透镜的焦距，改变最佳横向分辨率层的位置。通过实际测量以及光学计算的手段，获得电动可调焦透镜在不同焦距设置下，物镜下方焦面的实际位置，并结合其他参数通过仿真得到不同角度成像过程中点扩散函数的具体形状。

图2为本发明实施例所提供的一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统的结构图。

具体地，参照图2所示，电动可调焦透镜与其前方的会聚透镜相结合，可等效为一个新的、焦距发生变化的会聚透镜；当电动可调焦透镜的屈光度设置为0dpt时，新会聚透镜与单独的原会聚透镜完全等价。当电动可条焦透镜的屈光度不为0时，新会聚透镜的等效焦距和原会聚透镜的焦距不同，会聚点也会发生前后移动；这个前后移动的距离经后续光学系统缩小后，等价于物镜下方焦面位置的轴向移动。

图3为根据本发明一个实施例的评估原型系统的点扩散函数和能量分布对比示意图。

进一步，在本发明的一个具体实施例中，参照图3所示，电动可调焦透镜前方的会聚透镜焦距为﹢500mm，电动可调焦透镜（optotune，EL-16-40-TC-VIS-5D）可实现-2dpt（即焦距-500mm）至﹢3dpt（即焦距﹢333mm）的屈光度变化。根据几何光学等效焦距公式：

可算出两块透镜的等效焦距大小，其中d为电动可调焦透镜与其前方会聚透镜的距离。再结合后续光学系统的轴向放大倍数可以算出，要实现样本位置处±100^μm的焦面轴向变化，只需对电动可调焦透镜的屈光度在-0.79dpt至﹢3dpt的范围内进行调节即可。

角度扫描模块400，用于对样本进行多角度投影成像。

空间扫描模块500，用于获得二维投影成像。

可以理解的是，角度扫描模块包括一个二维扫描振镜，放置于物面共轭面上，实现对激发光入射角度的控制。空间扫描模块包括两块一维扫描振镜，放置于傅里叶面上，实现激发光横向位置的控制。

进一步的，在本发明的一个实例中，通过角度扫描模块和空间扫描模块的协同控制，获取样本在不同角度下的投影成像图像。空间扫描模块经过一次扫描后得到一张二维投影图像，在其进行下一次扫描之前，改变角度扫描模块和电动可调焦透镜的控制电压，使得下一张投影图像是另一个方向、另一个焦面位置的投影图像。

进一步，在本发明的一个实施例中，角度扫描模块的角度数量被控制为13个，它们在物镜的光瞳面上大致均匀分布。空间扫描模块进行面成像的速度大约为30Hz。

扩束模块600，用于控制飞秒激发光束孔径大小。

具体的，在本发明的一个实例中，激发光在进入物镜前，通过扩束镜改变其光束直径，实现低数值孔径激发。低数值孔径激发具有较大的景深，因而利用低数值孔径点扩散函数进行扫描成像等价于对样本进行投影成像。

在本发明的一个实施例中，通过调节扩束镜的扩束倍数，控制低NA激发过程中的NA大小为0.1，而显微物镜的NA大小为1.05。以此得到的PSF景深大小在50左右。

显微物镜700，用于收集样本荧光分子被激发后发出的发射光。

光电倍增管800，用于收集样本荧光分子发射出的荧光。

具体的，样本的荧光分子被激发后发出发射光，经显微物镜收集后被光电倍增管接收，并进一步得到投影图像。当空间扫描模块一次成像结束后，角度扫描模块和电动可调焦透镜的焦距均发生变化，再对下一个角度进行投影成像。

进一步的，图4为根据本发明一个实施例的轴向各层分辨率板三维重建结果对比示意图。

具体的，参照图4所示，传统双光子显微镜虽然在z=5的位置具有更高的分辨率，但在z=25位置处分辨率已经下降到较差水准。相比之下，本发明一个实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统虽然在z=5位置处没有传统方法那么清晰，但在z=5至z=25的整个范围内分辨率没有发生太大下降。分辨率的相对均匀能有效抑制噪声伪影的产生，也有利于生物现象的观测。

综上，根据本发明实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统，通过飞秒激发光源，用于输出飞秒激发光束；小孔模块，用于对飞秒激发光束进行整形，增加双光子激发点扩散函数的高频分量；电动可调焦透镜，用于获得焦平面位置不同的多角度投影图像；角度扫描模块，用于对样本进行多角度投影成像；空间扫描模块，用于获得二维投影成像；扩束模块，用于控制飞秒激发光束孔径大小；显微物镜，用于收集样本荧光分子被激发后发出的发射光；光电倍增管，用于收集样本荧光分子发射出的荧光。本发明实施例的系统，通过控制、改变多角度投影成像过程中的焦面位置，抑制三维体重建过程中产生伪影的产生，获得轴向更加均匀的横向分辨率，并且在景深上具有更大的灵活性，提高用户的使用体验。

其次参照附图描述根据本发明实施例提出的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法。

图5是本发明一个实施例的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法示意图。

如图5所示，该基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法，包括：

S1，根据成像的轴向范围，设计不同角度的焦距；

S2，通过改变从负屈光度到正屈光度的连续控制电压，获得焦平面位置不同的多角度投影图像；

S3，在进行多角度投影图像成像的过程中，通过改变焦距，改变横向分辨率层的位置，仿真得到多角度投影图像的点扩散函数；

S4，利用点扩散函数及点扩散函数对应的投影图像，进行三维解卷积以获取样本的三维体信息。

具体的，S1包括，根据所需成像的轴向范围，设计不同角度下的焦距。设计过程主要根据已知光学元件的参数以及几何光学原理和公式。

具体的，S2包括，经过一次扫描后得到一张二维投影图像，在其进行下一次扫描之前，改变控制电压，使得下一张投影图像是另一个方向、另一个焦面位置的投影图像。

具体的，S3包括，点扩散函数参数的确定常常需要通过多种方法进行，单纯的理论推导往往容易出现较大偏差。这里可以通过在不同角度拍摄单个荧光小球的方式，找到控制电压大小与实际焦面位置的映射关系。主要参数确定以后，点扩散函数的仿真根据傅里叶光学理论开展即可。

根据本发明实施例提出的基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法，通过根据成像的轴向范围，设计不同角度的焦距，获得焦平面位置不同的多角度投影图像，在进行多角度投影图像成像的过程中，通过改变焦距改变横向分辨率层的位置，仿真得到多角度投影图像的点扩散函数，利用点扩散函数及点扩散函数对应的投影图像，进行三维解卷积以获取样本的三维体信息，本发明通过双光子低NA激发模态、空间扫描、角度扫描获得样本的多角度投影图像，通过电动可调焦透镜改变不同角度下的最佳横向分辨率层位置，并三维解卷积技术重建三维体，不仅可以获得更优的横向分辨率、减少伪影的产生，而且在景深上具有更大的灵活性，从而提高了用户的使用体验。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微系统，其特征在于，包括：

飞秒激发光源，用于为双光子激发输出飞秒激发光束；

小孔模块，用于对所述飞秒激发光束进行整形，增加双光子激发点扩散函数的高频分量；

电动可调焦透镜，用于从负屈光度到正屈光度的连续电压控制，获得焦平面位置不同的多角度投影图像；

角度扫描模块，用于对样本进行多角度投影成像；

空间扫描模块，用于获得二维投影成像；

扩束模块，用于控制所述飞秒激发光束孔径大小；

显微物镜，用于收集所述样本荧光分子被激发后发出的发射光；

光电倍增管，用于收集所述样本荧光分子发射出的荧光。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，当所述空间扫描模块一次成像结束后，所述角度扫描模块和所述电动可调焦透镜的焦距发生变化，用于对下一个角度进行投影成像。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述角度扫描模块包括：

一个二维扫描振镜，放置于物面共轭面上，具体用于激发光入射角度的控制。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述空间扫描模块包括：

两块一维扫描振镜，放置于傅里叶面上，具体用于激发光横向位置的控制。

5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述电动可调焦透镜与所述扩束模块和所述显微物镜相结合，用于所述样本的焦面轴向移动。

6.一种基于电动可调焦透镜的高分辨率双光子层析显微方法，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的系统，其中，方法包括：

根据成像的轴向范围，设计不同角度的焦距；

通过改变从负屈光度到正屈光度的连续控制电压，获得焦平面位置不同的多角度投影图像；

在进行所述多角度投影图像成像的过程中，通过改变所述焦距，改变横向分辨率层的位置，仿真得到所述多角度投影图像的点扩散函数；

利用所述点扩散函数及所述点扩散函数对应的投影图像，进行三维解卷积以获取样本的三维体信息。

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