JP2004518488A - インビボ多光子診断的な神経変性疾患の検出および撮像 - Google Patents

Abstract

本発明は、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光特性の放射に有効な条件下で放射線を照射することによって哺乳類の脳組織を活性化させることにより、哺乳類の神経変性疾患を検出する方法を目的とする。その後、蛍光特性を、活性化段階を実行するために用いたのと同じ条件下で哺乳類の励起状態の健常脳組織から放射される標準的蛍光と比較する。蛍光特性が標準的蛍光と異なる部位の脳組織を、神経変性疾患を潜在的に有する部位として同定する。本発明の別の局面は、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光の生成に有効な条件下で照射される放射線によって哺乳類の脳組織を活性化させることにより、哺乳類由来の脳組織の画像を作製する方法を目的とする。その後、蛍光を収集して脳組織の画像を作製する。

Description

【０００１】
本出願は、２０００年１１月２日に出願された米国特許仮出願第６０／２４５，３０６号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の助成金第ＡＧ０８４８７号および第ＲＲ０４２２４号による政府財源により開発された。米国政府は一定の権利を有しうる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、インビボ多光子法による神経変性疾患の診断的検出および撮像に関する。
【０００４】
発明の背景
アルツハイマー病は米国内の患者数が約４００万人に達する壊滅的な疾患であり、直接の医療費および収入損失として数十億ドルの損失を国家に与え、さらに、最も重要なことに、数百万人の米国人家族に多大な苦痛をもたらしている。
【０００５】
同疾患の症状は、比較的非特異的な徴候及び症状とともに潜行的に始まる。微妙な記憶喪失、時折の失語症状、被刺激性、および攻撃性はいずれも、すでに脳がかなり罹患した進行状態を臨床的な見地から示す徴候である場合もある。同疾患は、数年の経過を経て、患者が自分自身または家族を認識できないような深刻な健忘症にまで進行する。多くの場合この健忘症は欲求不満およびパラノイアを伴う。患者は最終的に、自分自身の着替えおよび入浴の世話、さらには腸および膀胱の制御をする能力をすべて失う。患者は最後の数年間を介護施設で過ごすことが多い。アルツハイマー病は年齢と強く関連する疾患であることから、平均年齢の上昇に伴って同疾患の患者数が爆発的に増加すると予測される。
【０００６】
これらの臨床症状が進行する一方、脳にも変化が認められる。ごく初期の臨床症状が出現する頃までには、アミロイドと呼ばれるタンパク質（「Ａ−ベータ」または「Ａβ」）の微小沈着が無数に生じるとともに、脳細胞自体も変化をきたす。疾患の進行とともに脳が萎縮し、かつ脳細胞の５０％程度が失われる。
【０００７】
遺伝的リスク因子分析および分子生物学的知見から、Ａβの沈着が本疾患の決定的局面であることが強く示唆されている。神経病理学医が顕微鏡下に脳を観察してＡβおよびニューロンの変化すなわち神経原線維錯綜を認めれば確定診断が得られる。しかし、これらの変化はあまりに微細であり、コンピューター断層撮像または磁気共鳴画像法など最も高度な臨床用撮像装置でも確認できない（１００倍小さい）。
【０００８】
アミロイドの沈着および神経原線維の変化をインビボで検出できれば、アルツハイマー病を確定診断できる検査を提供できると考えられ、かつこれは疾患進行初期の極めて非特異的な臨床症状と対照的である。さらに、これらの変化を可視化および定量化できれば、疾患の進行および考えられる治療法の有効性を追跡するための決定的な手段を提供できると考えられる。
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病およびその他の神経変性疾患を診断用に検出および撮像する手段を提供することにより、従来技術の欠点を克服しようとするものである。
【００１０】
発明の概要
本発明は哺乳類の神経変性疾患を検出する方法を提供することを目的とする。これは、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光特性の放射に有効な条件下で放射線を照射することによって哺乳類の脳組織を活性化させることにより行う。その後、蛍光特性を、活性化段階を実行するために用いたのと同じ条件下で哺乳類の励起状態の健常脳組織から放射される標準的蛍光と比較する。蛍光特性が標準的蛍光と異なる部位の脳組織を、神経変性疾患を潜在的に有する部位として同定する。
【００１１】
本発明の別の局面は、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光の生成に有効な条件下で放射線を照射することによる哺乳類の脳組織の活性化により、哺乳類由来の脳組織の画像を作製する方法を提供することを目的とする。その後、蛍光を収集して脳組織の画像を作製する。
【００１２】
本技術分野の現状では、顕著な記憶喪失およびその他の認知障害が臨床的に発現して初めてアルツハイマー病の診断がなされる。神経病理学的な研究からは、実際にはこれらの明白な症状が現れる数年以上前から同疾患の進行が始まっていることが示唆されている。臨床症状の出現前に病理学的過程を検出できるような撮像技術があれば、単に症状を治療するのではなく進行の予防に焦点を当てた治療が可能になると考えられる。理想的には、治療の有効性を追跡する方法として、かつ、異なる治療法の指針を示す方法として、症状発現前に患者を同定するためにこの種の生物学的マーカーを使用できてもよい。これらの各用途はいずれも従来技術に対して大きな利点を提供するものと考えられる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光特性の放射に有効な条件下で放射線を照射することによって哺乳類の脳組織を活性化させることにより、哺乳類の神経変性疾患を検出する方法を提供することを目的とする。その後、蛍光特性を、活性化段階を実行するために用いたのと同じ条件下で哺乳類の励起状態の健常脳組織から放射される標準的蛍光と比較する。蛍光特性が標準的蛍光と異なる部位の脳組織を、神経変性疾患を潜在的に有する部位として同定する。
【００１４】
本発明の別の局面は、哺乳類由来の脳組織の画像を作製する方法を提供することを目的とする。これは、脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光の生成に有効な条件下で放射線を照射することによって哺乳類の脳組織を活性化させることにより行う。その後、蛍光を収集して脳組織の画像を作製する。
【００１５】
図１Ａ〜図１Ｃに、本発明により患者の神経変性疾患を撮像するための種々の態様を示す。
【００１６】
図１Ａは、撮像装置２を患者Ｐの頭蓋に配置することによって頭蓋を撮像する様子を示した図である。
【００１７】
図１Ｂは分光システムを用いた撮像を示した図である。このシステムは、ダイクロイックミラー４、レンズ６、分光選択装置８、および光検出器１０を含む。使用時、レーザーから出た多光子放射線Ｌはダイクロイックミラー４に向けられ、ミラーにより向きを変えられてレンズ６を通過する。レンズ６は、多光子放射線Ｌが患者Ｐの皮膚、頭蓋、硬膜、くも膜、くも膜下、および軟膜を通過して皮質に到達するように、患者の頭蓋の薄い部分に配置される。放射線Ｌは皮質内で蛍光Ｆを生じさせ、この蛍光はレンズ６を通過し、ダイクロイックミラー４を通過して、光検出器１０を備える分光選別装置８に到達する。光検出器１０は分光選別装置８を通過した蛍光Ｆを受光し、画像を作製する。その後、アルツハイマー病またはその他の神経変性疾患を診断するためこの画像が分析される。
【００１８】
図１Ｃに、本発明の方法を実施するための第二の態様を示す。本発明のこの態様においては、本発明の撮像手順を実施するために単一モード光ファイバー１００、末端レンズ１０２、および検出器１０４を使用する。使用時、多光子放射線Ｌは患者の皮膚、頭蓋、硬膜、くも膜、くも膜下、および軟膜を通過して皮質に到達する。または、ファイバーを皮質表面の近くまで貫入させるため、これらの層の一部または全部を貫通する。放射線Ｌは皮質内で蛍光Ｆを生じさせ、この蛍光は検出器１０４に到達しここで画像が作製される。その後、アルツハイマー病またはその他の神経変性疾患を診断するためこの画像が分析される。
【００１９】
図１Ｂ〜図１Ｃに示すように、本発明の診断／撮像手順を、患者の頭部に放射線Ｌを当てることによって非侵襲的に実施することができる。または、頭蓋を穿孔もしくは摩削することにより患者の頭蓋を菲薄化させてもよい。または、外科的に頭蓋を開けることによって脳を曝露した後に放射線Ｌを脳に当ててもよい。
【００２０】
多光子励起した蛍光ならびに組織内で生じたレーザー励起の第二高調波および第三高調波の検出は、励起を提供する光ファイバーと、単一モード励起ファイバーの先端付近で励起された光を効率的に収集するための太い光チューブまたは励起用ファイバー周囲のファイバー束とを介して実現してもよい。多光子組織蛍光では、収集光学系を最も到達させやすい場所であるファイバー先端付近に発光が限局されるため、単光子励起と比較して蛍光収集効率の面で大きな利点を有する。本発明は、複数の収集ファイバーに囲まれた単一の励起ファイバーを含む複数の光ファイバーを用いて実施するのが望ましい。
【００２１】
本発明に基づいて（ａ）限局的かつ瞬間的な非常に高い光度および（ｂ）パルスレーザーの時間的集中を組み合わせることにより、効率的な多光子分子励起が可能となる。回折限界まで集光可能な高光度かつ長波長の単色光源としては、反復速度が約８０ ＭＨｚで各パルスの持続時間が約１００フェムト秒（１００×１０^−１５秒）である、チタンサファイア・モードロック固体レーザーなどがある。多光子励起および高調波生成に有効な他のレーザーを使用してもよい。持続時間が非常に短い高光度のパルスを回折限界まで集光させることにより強い瞬間的なパワーが得られるため、通常は短波長の高エネルギーの単一光子（典型的には紫外光）により励起されうる標的中の蛍光体（蛍光色素）が、レーザー光源から出る長波長の光子２個を同時に吸収する確率はかなり高い。この吸収により蛍光体分子内で２つの光子のエネルギーが結合され、これによって蛍光体は励起状態になる。蛍光体が通常の状態に戻るときに光が放出され、この光が適切な検出器に入る。
【００２２】
高光度短パルス光による蛍光体の多光子励起によって、バックグラウンド識別力がより良好でかつ蛍光体の光退色がより少ない撮像を行うための一般的な蛍光顕微鏡技術が提供される。これは、顕微鏡内で提供される集束照明光が、標本を通過する際に収束円錐（ｃｏｎｅ）を形成することによる。集束円錐の頂点で焦平面に到達するすべての光は、蛍光体で吸収されるごく一部を除いて、発散円錐を通って標本の反対側へと抜ける。照度は、集束円錐と発散円錐とで形成されるくびれ部分（ｗａｉｓｔ）にある対物面上の焦点部位でのみ、標本蛍光体の多光子吸収を生じさせるのに十分な強さとなり、この照度依存性により、焦点周囲の小さな局所領域内でのみ長波長の励起を生じさせることが可能となる。この吸収は、高速、高光度で、かつ、標本内の焦点領域以外の部位で長波長光の適度な平均照度を維持するような、比較的波長の長いフェムト秒パルスの流れという手段によって実現される。その結果、焦平面以外の部位の蛍光体の光退色は事実上生じない。長波長光の１光子吸収は無視できる程度である。さらに、実際には時間平均照度は標本の全深度にわたってほぼ均一であるものの、焦平面以外の部位では瞬間照度が低すぎるため、感知可能な２光子吸収および励起が生じない。この効果により、生きている細胞への傷害も大幅に低下する。
【００２３】
本発明では、三次元分解能を得るため、励起光の波長の２分の１と重複するまたはこれを上回る波長に１光子吸収のピークをもつ蛍光体の２光子励起を利用してもよい。３光子励起の場合は、１光子吸収の波長が励起光の波長の３分の１と重複するようにする。これを実現するには、例えば赤外線領域の可視赤色など比較的波長が長く、かつ高い瞬間パワーをもつ非常に短いパルスレーザー光を生成させる。このレーザー光を、２つの低エネルギー（赤色）の光子がそのエネルギーを結合させなければ１つの高エネルギー（紫外光）の光子の場合と同様の励起が生じないように、通常は短波長領域（例：紫外光）の１光子で励起される蛍光体を含んだ標本に向ける。標本中の励起率も、かつしたがって蛍光率も、入射光光度の２乗に比例する。集光した励起レーザー光において、長波長の入射光は標本内の焦点領域でのみ蛍光体を励起するのに十分な光度となる。この焦点は、焦点周囲の選択した長円形領域でのみ標本の蛍光および／または光分解が生じるよう、標本内で位置を調整してもよい。したがって、本発明においては、長波長の励起光のみが標本を通過する必要があり、かつ、この長波長の光は、非常に小さな領域内でのみ蛍光を励起するのに十分な光度を提供するよう集光される。この蛍光は、通常は紫外領域でしか吸収しない蛍光体でも発生する。焦点は標本内で選択的に位置決めすることができるため、走査蛍光顕微鏡観察および光分解のいずれにおいても三次元分解能が得られる。光分解には、光分解で放出されてもよい、光子により活性化される薬剤の光分解も含まれる。
【００２４】
本発明によると、必要な励起光度は、例えば、赤色領域（例えば約７００ ｎｍ〜１０００ ｎｍ）の波長を持つパルス光またはパルス幅１０^−９秒〜１０^−１５秒でありかつ便宜的には反復速度が約８０ ＭＨｚであるパルス光を生成するチタンサファイア・モードロックレーザーであってもよい放射線源から供給される。他の高輝度パルスレーザーを使用して、例えば赤外または可視赤色領域の比較的長い異なる波長の光を生成し、これにより、総エネルギーが適切な吸収エネルギーバンドとなるような必要な励起光子を生じさせてもよい。適切な吸収エネルギーバンドとは、通常は波長領域がこの入射光の約半分である単一光子の吸収により励起されるスペクトルの蛍光体が必要とするエネルギーである。より短い励起波長が必要な場合は、外部の高調波発生によりレーザー波長を２つ、３つ、または４つに分割してもよい。したがって、例えば、７５０ ｎｍの可視赤色領域の２つの光子が結合することにより、通常は３７５ ｎｍまたはそれ以上の紫外領域の光を吸収する蛍光体が励起され、例えば、１０７０ ｎｍの赤外領域の２つの光子により、５３５ ｎｍまたはそれ以上の可視光領域の光を吸収する蛍光体が励起される。
【００２５】
本発明のひとつの改変形式においては、入射光が強い瞬間パワーと異なる波長とを持つ２つの重ね合わせパルス光からなるように、単一波長の光源を２つの異なる波長のレーザー光源で置き換えてもよい。入射光の各波長は、短波長で吸収性を示す蛍光体を励起するよう選択され、これは以下の式で表される。
１／λ_ａｂｓ＝１／λ_１ ＋ １／λ_２
式中、λ_ａｂｓは吸収体の短い波長、λ_１およびλ_２は各レーザー入射光の波長である。
【００２６】
２光子励起において、２光子断面積δが、典型的な式
δ＝１０^−５８ ｍ^４ｓ ／ 光子
で与えられ、パルスパラメータが前述のとおり（反復速度８０ ＭＨｚの１００ ｆｓｅｃパルス）であり、かつ開口数Ａ − １．４のレンズで光が集光される場合、平均パワー（Ｐ_０）約 ５０ ｍＷの入射レーザー光により、１蛍光体１パルスにつき１吸収光子が限界である蛍光体の蛍光出力が飽和する。１パルス１蛍光体につき吸収される光子数ｎ_ａは次式の関係に従う。
【数１】

式中、
τはパルス持続時間、
ｆは反復速度、
Ｐ_０は入射レーザー光の平均パワー、
δは光子吸収断面積、
ｈはプランク定数（Ｐｌａｎｃｋ ｑｕａｎｔｕｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）、
ｃは光速、および
Ａは集光レンズの開口数
である。ただし、蛍光はパルス反復周波数を蛍光寿命の逆数まで増加することによって増強できる。これは典型的には次式で表される。
【数２】

比較として、１光子の蛍光飽和は約３ ｍＷの入射光パワーで生じる。
【００２７】
多光子励起により固有の組織蛍光（自己蛍光としても知られる）を測定することに加えて、蛍光色素などの光活性薬剤を多光子顕微鏡観察とともに使用することにより細胞および組織の特性を撮像することも可能である。適切な光活性薬剤としては、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、またはＨ^＋などの金属イオンに結合したときに蛍光が変化する有機分子など、多光子励起により励起される色素が含まれる。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド）などの色素もこれに含まれる。これら色素の多くはインビボでの使用に適している。このような光活性薬剤は神経変性疾患またはその他の神経異常の病変部に結合すると蛍光を発する。本発明の第一の態様を実施する場合は、少なくとも１つの光活性薬剤を用いて脳組織を処理する前に、標準的蛍光を決定する。
【００２８】
本発明の多光子撮像技術を使用して、生きている哺乳類の脳内の斑およびニューロンを観察してもよい。さらに、錯綜も観察されうる。
【００２９】
錯綜および斑を観察するための可能な手法は複数ある。錯綜はタウタンパク質が高度に構造化された状態に凝集することによって生じ、電子顕微鏡下ではヘリックス周辺線維（ｐｅｒｉｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）として確認される。このタンパク質の確認は、多光子顕微鏡観察に利用される波長を用いた自己蛍光であることが発見された（励起波長約７００ ｎｍ、発光波長約４５０ ｎｍ）。この知見により、走査能を有するよう設計された装置を用いた撮像または原子分解能は失われるがタンパク質構造の特有の生化学的特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を検出できる分光分析のいずれかによって、脳内の神経原線維錯綜を検出することが可能になる。錯綜による自己蛍光は、錯綜タンパク質に関して発見された特有の波長特性によって、さらに、最終的に蛍光寿命撮像など他の技術を用いてバックグラウンド中の低レベルの自己蛍光と区別することによって、他の脳構造と識別できる。したがって、頭蓋を介して脳実質に長波長光を照射し、かつ放射される自己蛍光を測定するという方法を想定することが可能である。長波長の光は、脳内のヘモグロビン飽和度測定に現在使用されているシステムにおいて、軟部組織およびその上の骨を容易に通過する。このことは、本発明の手法の実行可能性が高いことを示唆している。
【００３０】
アミロイド沈着については別の手法を用いる。現在のところアミロイドは自己蛍光性を有していないと考えられており、したがってアミロイドを可視化するには造影剤を使用する必要がある。広く使用されている試薬であるチオフラビンＳは皮質表面または髄液中に直接使用できることが明らかになっている。この色素はアミロイド斑に結合したときのみ強い蛍光性を示す。したがって、本発明の別の態様においては、チオフラビンＳまたは同様のアミロイド結合特性を有する色素を、髄液中に導入するまたは血液脳関門を通過できる化合物を利用して全身投与的に注射することによって患者に投与し、続いて長波長光を用いて脳を撮像してもよい。この場合も、分光分析または直接撮像によってアミロイドの検出および定量が可能となる。神経原線維の変化またはアミロイド沈着を示す蛍光マーカーを赤外に近い長波長を用いて発生させるこのような技術を利用して、脳内に存在するこれらの変化を診断および定量してもよい。これによって、治療的介入に資する定性的な情報が提供できる。
【００３１】
本発明は、アルツハイマー病の診断／撮像に加えて、他の神経変性疾患の診断／撮像に利用されうる。このような疾患の例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、ルー・ゲーリッグ病などがある。
【００３２】
実施例
実施例 １ アミロイド沈着のインビボ撮像
雄性Ｔｇ２５７６マウス９匹（平均月齢１８．６ヵ月（Ｈｓｉａｏら、「トランスジェニックマウスにおける相関的記憶欠如、Ａβ増加、およびアミロイド斑（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ Ｍｅｍｏｒｙ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ， Ａβ Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９９−１０２ （１９９６）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）を使用して斑のインビボ撮像を行った。これらのマウスは、ハムスタープリオンタンパク質プロモーター下のスウェーデン型変異を有するヒトアミロイド前駆体を発現する。撮像の２日〜６日前に頭蓋の調製を行った。Ａｖｅｒｔｉｎ（トリブロモエタノール、２５０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）でマウスを麻酔した。解剖顕微鏡による拡大観察下で高速ドリル（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて頭蓋上の直径約１ ｍｍ〜１．２ ｍｍの円形領域を菲薄化した（図２Ａ）。ドリル中の熱および振動による人為結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）は、人工脳脊髄液（「ＡＣＳＦ」； １２５ ｍＭ ＮａＣｌ； ２６ ｍＭ ＮａＨＣＯ_３； １．２５ ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４； ２．５ ｍＭ ＫＣｌ； １ ｍＭ ＭｇＣｌ_２； １ ｍＭ ＣａＣｌ_２； ２５ｍＭ グルコース）を頻繁に使用することによって最小限に抑えた。外科用プローブ（Ｒｏｂｏｚ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により頭蓋厚を繰返し評価し、直径約０．６ ｍｍの中央部の骨が柔軟性を示したところでドリルを停止した。軟膜血管が明瞭に視認できることを、頭蓋厚の更なる指標として用いた。次に頭皮を縫合し、マウスを回復させた。撮像日に、マウスを再度麻酔し、頭皮を反転させ、調製以降に成長した少量の結合組織を削って除去した。チオフラビンＳを脳内に拡散させやすくするため、２２ゲージの針の先端を用いて頭蓋標本部位の側壁に小さい亀裂をつくった。その後、チオフラビンＳ（０．００５％ ＡＣＳＦ溶液、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を撮像部位に２０分間接触させた。溶融した骨ロウを小さい輪にして撮像部を囲むように頭蓋に置き、このウェルにＡＣＳＦを満たすことによって、作動距離の長い水中浸漬物のための水溶液リザーバを作製した（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、日本）。骨をこのように薄層として残すことにより、インビボ撮像に固有である心拍および呼吸による脳の動きが十分に安定化されるため、頭蓋標本を薄く作製することによって、撮像部位にカバーガラスを乗せる必要がなくなる（Ｓｖｏｂｏｄａら、「新皮質錐体ニューロンにおける樹状突起のインビボカルシウム動力学（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ Ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：１６１−１６５ （１９９７）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。脳定位固定装置に似た設計の、特注ステージに取り付けた耳固定用バーと鼻当てとによって、マウスを固定した。その後、撮像を行うため、頭蓋の菲薄化した部位をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５０顕微鏡の対物レンズの下方に直接配置した（図２Ｂ）。
【００３３】
市販の多光子撮像システム（ＢｉｏＲａｄ １０２４ＥＳ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に取り付けたモードロックＴｉ：サファイアレーザー（Ｔｓｕｎａｍｉ、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；５．４５Ｗ Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｖポンピングレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）、対物レンズ後部開口部のパワー１０ｍＷ、パルス６０ ｆｓ〜１００ ｆｓ）による７５０ ｎｍの励起光を用いて、２光子蛍光を生成させた。光電子倍増管を３本有する外部検出器（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）により、波長３８０ ｎｍ〜４８０ ｎｍ、５００ ｎｍ〜５４０ ｎｍ、および５６０ ｎｍ〜６５０ ｎｍの放射線を収集した。チオフラビンＳ像はすべて３８０ ｎｍ〜４８０ ｎｍのチャネルから得られた。走査速度は走査ヘッドの通常の速度とし、停止時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）＝１．５μ秒／ピクセルにて撮像を行った。測定に使用できる斑の数を最大にするため、マウス１匹あたり頭蓋の最大４箇所を菲薄化して標本を作製した。撮像時ごとにチオフラビンＳ（０．００５％ ＡＣＳＦ溶液）を標本部位に塗布した。薄い頭蓋標本部位の表面をマッピングしかつ以後の撮像時の再位置決めを容易にするため、最初に、１０×対物レンズ（視野１２３０ 平方ｍｍ； ＮＡ＝０．５）で対象部位を撮像した。ＸＹステージエンコーダー（Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を、菲薄化した頭蓋部位の中心に原点を合わせて較正したうえで、強拡大像の相対座標を保持するために使用した。その後、標本部位の最も薄い部分をカバーする３×３アレイにおいて、６０×対物レンズ（２０５μｍ×２０５μｍ； ＮＡ＝ ０．８）を使用し、ステージをＸ方向およびＹ方向に正確に２０５μｍずつ動かすことによって、９枚のＺ軸画像を収集した。ｚ軸の増分は２μｍとし、頭蓋表面から脳の約１５０μｍの深さまで一連の画像を取得した。後のモンタージュ生成時のｚ軸アライメントに使用するため、頭蓋の位置に対するｚ軸モーターの開始位置を記録した。画像収集完了後、マウスをステージから降ろし、骨ロウの輪を除去し、無菌食塩水で頭蓋を洗浄し、かつ、頭皮を縫合した。麻酔からの回復中、マウスを３７℃に加温した。麻酔時間は合計２時間を上限とした。
【００３４】
実施例 ２ 画像分析
Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を用いて、モンタージュを再構成し１つの画像スタックを生成した。各光学切片において、隣接するバックグラウンド領域の平均より２標準偏差大きい値を閾値として、個々の斑の断面積を測定した。撮像の基準を満たしていない斑は測定の集合から除外した。画像領域の端またはモンタージュ線上にある斑は、ステージ上でのマウスの移動に不正確さが存在する可能性があるため、評価から除外した。バックグラウンドに対して光度が十分大きくなく適切な閾値が設定できない斑も除外した。これにより、存在するように見えたが自動閾値法で測定するには弱すぎる多くの斑が、特に標本の深部において除外された。最後に、容易に検出できる人為運動結果が像に含まれている斑を除外した。その後、各斑について最も面積の大きい断面から斑の最大径を計算した。Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴベースのワークステーション（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ６１０、Ｄｅｌｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、Ｒｏｕｎｄ Ｒｏｃｋ、ＴＸ）上でＶｏｘＢｌａｓｔ（ＶａｙＴｅｋ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＩＡ）を用いてボリュームレンダリングを実行した。
【００３５】
実施例 ３ 血管造影
加温パッド上でマウスの尾を加温して血管を拡張させ、滅菌ＰＢＳに溶解した約０．０５ ｍｌのフルオレセイン（２５ ｍｇ／ｍｌ）を、撮像の少なくとも２０分前にマウスの尾静脈に注射した。この色素は血液脳関門を通過せず、これによって、脳の撮像領域全体にわたって血管の同時画像化が可能となった。
【００３６】
実施例 ４ 断面の組織学的検討
アミロイド沈着を組織学的に測定するため２群の動物（ｎ＝３／群、平均月齢１２．６ヵ月および２２．６ヵ月）を使用し、既報の方法に従ってアミロイドの負荷およびサイズの分布を測定した（Ｈｙｍａｎら、「アミロイドの沈着と分解との間の動的バランスを示唆する、アルツハイマー病における老人斑またはアミロイド負荷の欠如（Ｔｈｅ Ｌａｃｋ ｏｆ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｏｒ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、５２：５９４−６００ （１９９３）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。７５０ ｎｍの光による二光子励起を用いて、チオフラビンＳ染色切片の画像を収集した。各切片において、チオフラビンＳ陽性のアミロイド沈着を含む皮質の全視野を撮像し、マウス１匹につき約８０個の斑が撮像されるまでこれを行った。その後、画像をＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ）に転送し、このソフトウェア上で閾値設定を行い、ノイズを除去するためわずかにフィルターをかけ、かつ、ソフトウェアの粒子分析プロトコルにより斑の輪郭を自動的に画像化した。チオフラビンＳ陽性の血管およびエッジ効果人為結果を除去するため手動で画像を編集した。チオフラビンＳ陽性斑をほとんど含まない切片を徹底的にサンプリングし、この皮質領域中のすべての斑を計数した。重度のアミロイド負荷を含む切片については１切片につき約１０視野を無作為かつ系統的にサンプリングし、かつ、４００μｍ×４００μｍの計数フレームを使用して自動的に選択および測定を行うことによって、チオフラビンＳ陽性斑を計数した。このようにして、１匹あたり３切片において斑を計数した。誤差係数が１０％未満であったことから、このサンプリング戦略が適切であったことが示唆された。結果は、１平方ミリメートルあたりのチオフラビンＳ陽性斑の密度として表現した。２群間の斑数の差の統計有意性をｔ検定により評価した。
【００３７】
多光子顕微鏡観察はインビボ撮像で独特の利点を発揮しかつ１マイクロメートル程度の分解能を有するため、これを本実験用に適合させた（Ｄｅｎｋら、「２光子レーザー走査蛍光顕微鏡観察（Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：７３−７６ （１９９０）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。これまでは、いかなる系においても急性のインビボ撮像しか報告されていなかったため、長期的な反復撮像を行うための新しい手法を開発した。高速バードリルを用いて、麻酔したＴｇ２５７６マウスの頭蓋に直径約１ ｍｍ、厚さ約２０マイクロメートルの薄い透明な骨窓を作製した（図２Ａ）。脳に蛍光体を送達できるよう、観察部位の側壁に小さな亀裂をつくったが、菲薄化した領域以外の部分の骨を無傷の状態に維持した。改変したステージ挿入物（顕微鏡ステージ用温度制御器具）を備える、ステージ固定型直立顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５０を使用してインビボ撮像を行った（図２Ｂ）。
【００３８】
チオフラビンＳは、ＵＶ領域で発光しかつ最大発光波長を４５０ ｎｍ付近に有する、標準的なアミロイド結合性蛍光体である。チオフラビンＳは、ヒトのアルツハイマー病組織およびアミロイド沈着のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイド沈着を標識するために広く用いられている（Ｋｅｌｅｎｙｉ、「アミロイドの組織学的呈示における、チオフラビンＳ蛍光およびコンゴーレッドの異方性染色（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ Ｓｔａｉｎｉｎｇｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｌｏｉｄ）」、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （Ｂｅｒｌ）、７：３３６−３４８ （１９６７）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。チオフラビンＳは、死後組織におけるアルツハイマー病の神経病理学的診断用として、アルツハイマー病登録制定コンソーシアム（ＣＥＲＡＤ）が推奨している染料である（Ｍｉｒｒａら、「アルツハイマー病登録制定コンソーシアム（ＣＥＲＡＤ） Ｐａｒｔ ＩＩ アルツハイマー病の神経病理学的評価の標準化（Ｔｈｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｔｏ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＥＲＡＤ）． Ｐａｒｔ ＩＩ． Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ． ４１：４７９−４８６ （１９９１）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。多光子顕微鏡観察によりアミロイド沈着をインビボで可視化するため、生きている１８ヵ月齢のＴｇ２５７６トランスジェニックマウスの脳にチオフラビンＳの希釈溶液を塗布した。７５０ ｎｍの光で蛍光体を２光子励起させることにより、骨窓表面から約１５０マイクロメートルの深さまで、２．０マイクロメートルごとに薄い光学切片を取得した。これらの薄い光学切片を再構成したところ、表層付近の切片中に、古典的な分節状のアミロイド血管障害の様相を呈する、軟膜細動脈を囲むチオフラビンＳ陽性アミロイドが確認された（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌら、「脳出血併発性または非併発性の脳アミロイド血管障害：組織学的比較研究（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ Ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｄ Ｗｉｔｈ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ）」、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．、３０：６３７−６４９ （１９９１）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）（図２Ｃ）。より深部の光学切片（図２Ｄ）には脳実質のチオフラビンＳ陽性アミロイド斑が認められた。このようにして、皮質表面から１５０μｍの深さまで斑を可視化した。
【００３９】
撮像された斑は、トランスジェニック動物およびアルツハイマー病患者の組織でみられる古典的なチオフラビンＳ陽性老人斑と形態学的所見が一致しており、かつ、対照群である非トランスジェニックの同腹仔にはこのような構造は見られなかった。これらの構造が実際に老人斑であることは、死後固定したトランスジェニックマウスの脳を、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で直接蛍光標識した抗Ａβ抗体（１０Ｄ５、Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とともにインキュベートすることによってさらに確認された（Ｈｙｍａｎら、「アルツハイマー病におけるＫｕｎｉｔｚプロテアーゼインヒビター含有アミロイドβタンパク質前駆体の免疫反応性（Ｋｕｎｉｔｚ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５１：７６−８３ （１９９２）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。この二重染色により、チオフラビンＳと、その周囲のアミロイドβの免疫反応性との場所が一致することが判明した（図３Ａ〜図３Ｂ）。予測されたとおり、チオフラビンＳは、密な核を有する斑を染色する（これらの斑はすべてのＡβ免疫反応性構造物の亜集団である）（Ｓｃｈｍｉｄｔら、「共焦点顕微鏡により観察される、アルツハイマー病およびダウン症候群の脳の斑における線維状アミロイドの化学的および免疫学的不均質性（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ Ａｍｙｌｏｉｄ ｉｎ Ｐｌａｑｕｅｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｄｏｗｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｂｒａｉｎｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１４７：５０３−５１５ （１９９５）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。さらに、このような撮像から２日〜７日後に行った組織学的分析では、グリア線維酸性タンパク質染色で確認されるように、明白な損傷、ニューロン欠損、または反応性星状細胞の増加は認められなかった（図３Ｃ）。このことから、菲薄化した頭蓋の標本および撮像のプロトコルは生きた脳による耐容性が高いことが示唆される。
【００４０】
非破壊的インビボ撮像を行うための多光子顕微鏡撮像により、生きた動物において経時的に繰返し斑を可視化できる可能性がもたらされる。図４Ａに、生きたマウスにおける撮像手法の例を示す。頭蓋を準備し、チオフラビンＳを添加し、６０×水浸対物レンズを用いて６１５μｍ×６１５μｍの領域を３×３のマトリックスとして撮像した。マウスは麻酔から回復させた後にケージに戻した。撮像後に障害または不快の徴候を示すことはなかった。図４Ｂ〜図４Ｅに、２日間の間隔で撮像した１匹のマウスの代表的な像を示す。最初の撮像時には、斑（図４Ｂ）およびアミロイド血管障害（図４Ｄ）の例が認められた。２日後、マウスを再度麻酔し、かつ、頭蓋の菲薄化した領域にチオフラビンＳを再度添加した。最初の撮像時と同じ条件下で撮像を行った。斑（図４Ｃ）およびアミロイド血管障害（図４Ｅ）は２日後も鮮明に画像化され、かつ、最初の撮像時から変化していない様相を呈した。
【００４１】
チオフラビンＳ陽性アミロイド沈着の自然歴を調べるため、さらに５匹のマウス（平均月齢１８．６ヵ月）を漸加的により長期間にわたって撮像した。合計４１回の撮像セッションを行い、２回以上撮像に成功した斑を含む２９のデータセットを得た。このデータセットには、２日〜１５０日の間隔で整列化された斑のペア３４９組が含まれていた。各マウスにおいて、同じ領域に対して５回程度の撮像セッションを行った。質的には、斑の大多数の構造および大きさはこうした長期の観察期間にわたって非常に安定していた。数ヵ月後に取得したその後の像において、手指様付属物およびチオフラビンＳ陽性アミロイドの微小クラスターなど、各斑の形態学的な詳細が確認可能であった（図４Ｂ〜図４Ｃ）
【００４２】
斑の直径が最も大きい光学切片で直径を計測することにより定量的分析をしたところ、この質的な判断が確認された。図５に、測定結果の全集合における斑の直径の変化の分析結果を示す。母集団として考えると、測定の間隔が４日間であるか１５０日間であるかに関わらず、２回の測定における変動量は本質的に同じである（図５Ｂ）。各斑の大きさの初回測定結果は、測定間隔が数日間か数ヵ月間かに関わらず、同じ斑の以後の測定結果を予測するうえで優れた予測因子である。２日〜１５０日の間隔にわたるすべての測定結果について、初回撮像時の斑の大きさを後の大きさに対してプロットしたところ、このグラフの線形回帰の傾きはほぼ１であった（傾き＝０．９８；Ｒ^２＝０．８９）。このデータは、インビボの被検体において長期間にわたって斑が極めて安定であることと一致している。
【００４３】
しかし、このデータセットを詳しく検証したところ、撮像セッション間に実質的に増大または縮小したように見える斑が少数あることが判明した。この見かけ上の変化は技術的要因によるものである可能性が懸念されたことから、測定誤差を生じさせうる既知の要因を消去するため、操作基準を系統的に適用した。例えば、モンタージュ（ｍｏｎｔａｇｅ）を構成する２０５μｍ×２０５μｍの視野の一つの境界線上にある斑、または、所与のセッションにおいて撮像された最も深い斑については、その斑のデータを除外した。撮像セッション間の斑の整列を容易にするための内部ランドマークをより多くつくるため、複数のマウスにおいて、チオフラビンＳ撮像と同時にフルオレセイン血管造影を行った。３００組以上の斑を慎重に評価した結果、顕著な増大または分解（すなわち、４０％以上のサイズ変化）を示した例は１４例のみであった。図６は、１０４日間の間隔で取得した、皮質の同じ部位のボリュームレンダリング画像スタックの例であり、同じ４つの斑（赤色）およびフルオレセインフルオレセイン血管造影像（緑色）が示されている。定性分析および定量分析から、これら斑のうち２つは実質的に増大（約５０％）、１つは実質的に縮小（４０％以上）し、１つは大きさがまったく変化しなかったことが確認された。これらのデータから、同じ領域内かつ同じ撮像セッション間において、一部の斑は増大し一部の斑は縮小するようにみえることがわかる。チオフラビンＳの濃度または焦平面におけるパワーなどの技術的な要因では、１つの三次元視野という小さい領域内で一部が増大し一部が縮小するという事実を説明できない。したがって、これらのケースでは斑の大きさが変化しているというのが最も控えめな説明である。
【００４４】
加齢とともに皮質中のチオフラビンＳ陽性斑の数が増加することは周知である（Ｈｓｉａｏら、「トランスジェニックマウスにおける相関的記憶欠如、Ａβ増加、およびアミロイド斑（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ Ｍｅｍｏｒｙ Ｄｅｆｉｃｉｔｓ， Ａβ Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９９−１０２ （１９９６）； Ｉｒｉｚａｒｒｙら、「ＡＰＰＳｗトランスジェニックマウスにおける、年齢関連性Ａβ沈着および神経網異常の進行、ならびにＣＡ１におけるニューロン損失の不進行（ＡＰＰＳｗ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ａ Ｂｅｔａ Ｄｅｐｏｓｉｔｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｉｌ Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ， Ｂｕｔ Ｎｏ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｌｏｓｓ ｉｎ ＣＡ１）」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、５６：９６５−９７３ （１９９７）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。したがって、皮質の領域を再撮像する際には、撮像領域内に新しい斑が発見される場合もあると予測される。新しい斑の出現が、２回目の撮像セッションのＳ／Ｎ特性が１回目と比較してわずかに良好であること、撮像の深度が深いこと、または撮像領域がわずかに異なることを単に反映したものではないことを保証するため、厳重な基準を適用した。それでも、以前撮像した領域に新しい斑が出現するという否定し難い例があった。図７に、最初の撮像セッションには明確に規定される特徴的な斑が３つ存在し、６４日後の２回目の撮像セッションでは４つ存在したという劇的な視野の例を示す。
【００４５】
前述のインビボ長期的データから、斑の平均的な直径が年齢によって大きくばらつくことはないことが示唆される。この結論を、Ｔｇ２５７６マウスにおいて従来の組織学的分析を用いて検証するため、１２ヵ月齢（ｎ＝３）または２２ヵ月齢（ｎ＝３）のマウスのチオフラビンＳ染色切片をＢｉｏｑｕａｎｔ画像分析システムを用いて調べた（Ｈｙｍａｎら、「アミロイドの沈着と分解との間の動的バランスを示唆する、アルツハイマー病における老人斑またはアミロイド負荷の欠如（Ｔｈｅ Ｌａｃｋ ｏｆ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｏｒ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、５２：５９４−６００ （１９９３）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。この１０ヵ月の期間に、皮質中の斑の平均数は２．３±１．４個／ｍｍ^２から１３．７±４．３個／ｍｍ^２へと（平均±標準偏差、ｐ ＜ ０．０５）約６倍増加した。斑の直径の分布は、１２ヵ月齢で１８．１±１７．８マイクロメートル、２２ヵ月齢で２１．４±１６．２マイクロメートルと、大きな変化はなかった（ｐ ＞ ０．０５、有意差なし）。これらの断面のデータはインビボの測定結果と一致しており、斑の大きさが長期間にわたって安定であることが示唆された。インビボの測定結果と併せて考えると、これらのデータは、斑は形成されてから比較的早い速度で成長し、最大サイズに達すると成長が止まるというモデルと一致する。
【００４６】
この報告により、インビボ多光子レーザー操作顕微鏡観察を用いて生体のトランスジェニック動物における老人斑を問題なく撮像できることが示された。他の画像法で、これらアルツハイマー病様病変の観察に必要な分解能、特異度、または感度を有するものはない。したがって、生体の脳におけるこれら沈着物の自然歴についてはほとんど知られていない。多光子顕微鏡観察により、生きた組織を最低限の光傷害または毒性で高分解能撮像することが可能になる。無傷の頭蓋窓を介して撮像することにより、数日間〜数ヵ月間にわたって長期的に脳をインビボ撮像できる。老人斑を高感度かつ高特異度で蛍光呈示するチオフラビンＳを使用することにより、生きたトランスジェニックマウス内で同定した斑の母集団を経時的に追跡した。最高５ヵ月という長期間にわたってインビボ多光子顕微鏡観察により個々の斑を観察したところ、大きさおよび形態は非常に安定に維持された。これらの結果から、一旦形成された斑は速やかに安定化することが示唆される。可溶性Ａβの持続的な存在下で斑の大きさが経時的に一貫していることは、動的フィードバック仮説の予測を明らかに裏付けるものである（Ｈｙｍａｎら、「アルツハイマー病における老人斑の定量分析：アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型および２１−トリソミー（ダウン症候群）に関連する大きさの対数正規分布および差異の分子的疫学の検討（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｇ−Ｎｏｒｍａｌ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ （Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ））」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９２：３５８６−３５９０ （１９９５）；Ｃｒｕｚら、「アルツハイマー病における老人斑の進行および退行（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９４：７６１２−７６１６ （１９９７）；Ｕｒｂａｎｃら、「進行−退行モデルにおける動的フィードバック（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎ ａｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ）」、Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｅ．、６０：２１２０−２１２６（１９９９）；および、Ｕｒｂａｎｃら、「アルツハイマー病における斑形成の動力学（Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｑｕｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．、７６：１３３０−１３３４ （１９９６）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。さらなる研究として興味深い手段の１つは、最初の斑形成の機構および経時経過を理解することである。将来、この撮像技術により、この問題を解決するための手段を提供できる可能性がある。同様に、個々の斑の縮小がはじめて観察された。このことは、斑がその環境とある程度動的平衡にあるという仮説を裏付けるものである。したがって、斑はこれまで不溶性と考えられてきたが、適切にターゲティングされた治療法により解消できるかもしれないという可能性が示された。
【００４７】
この観察結果はまた、何故斑が成長を止めるのかという新たな疑問も呈示する。グリアが、神経網中の異常な蓄積を囲むことによってまたは食作用によって、こうした蓄積に迅速に反応しているとも推測できる。アルツハイマー病および試験対象のトランスジェニックマウスにおいては、グリアが、主として沈着をとり囲むことによって、斑の成長を止めるうえで積極的な役割を果たしている可能性がある（Ｆｒａｕｔｓｃｈｙら、「ＡＰＰｓｗトランスジェニックマウスにおける、アミロイド斑に対する小グリア細胞の反応（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ ＡＰＰｓｗ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ）」、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．、１５２：３０７−３１７（１９９８）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。別のアルツハイマー病トランスジェニックモデルであるＰＤＡＰＰマウスをアミロイドβで免疫して行われた最近の実験では、小グリア細胞が抗体で修飾されるとアミロイド沈着を貪食しうるということが示唆されている（Ｓｃｈｅｎｋら、アミロイドβ免疫による、ＰＤＡＰＰマウスのアルツハイマー様病変の緩和「（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｍｙｌｏｉｄ−Ｂｅｔａ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｌｉｋｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ Ｍｏｕｓｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ． ４００：１７３−１７７（１９９９）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。理論モデルで仮説設定されている「動的フィードバック」を担っている生物学的機構は、グリアとアミロイド沈着との相互作用であり、これによって斑の大きさが安定化されかつ継続的な成長が阻止されるという仮説が提唱されている（Ｈｙｍａｎら、「アルツハイマー病における老人斑の定量分析：アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型および２１−トリソミー（ダウン症候群）に関連する大きさの対数正規分布および差異の分子的疫学の検討（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｇ−Ｎｏｒｍａｌ Ｓｉｚｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ Ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ （Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ））」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９２：３５８６−３５９０ （１９９５）；Ｃｒｕｚら、「アルツハイマー病における老人斑の進行および退行（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｉｌｅ Ｐｌａｑｕｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９４：７６１２−７６１６ （１９９７）；Ｕｒｂａｎｃら、「進行−退行モデルにおける動的フィードバック（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎ ａｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−Ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ）」、Ｐｈｙｓ． Ｒｅｖ． Ｅ．、６０：２１２０−２１２６（１９９９）；および、Ｕｒｂａｎｃら、「アルツハイマー病における斑形成の動力学（Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｑｕｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．、７６：１３３０−１３３４ （１９９６）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。小グリア細胞の活性を特異的に阻害する実験をさらに行うことによって、この仮説を直接検証できると考えられる。
【００４８】
上述のデータは、これまでにない深度で共焦点顕微鏡と同等の分解能を有するインビボ多光子顕微鏡観察を用いて、組織にほとんど損傷を与えることなく、生きた脳のアミロイド斑を長期的に観察できるという能力を示すものである。この技術により、実験操作を加えた個々の動物の長期的研究が可能となる。さらにこの技術は、アミロイド除去を標的とした治療法の研究において特に強力な技術であると考えられる。同様に、チオフラビンＳ非染色性アミロイドβ沈着などの他の病理学的特徴を同定できる蛍光体を開発することによって、疾患のトランスジェニックモデルにおける脳の病態生理学の理解が大きく進歩する可能性が高い。原理的に同じ手法を利用して、ヒトのアルツハイマー病の脳におけるアミロイドβ沈着を診断および追跡することが可能であると考えられる。
【００４９】
実施例 ５ 方法
動物：
ホモ接合ＰＤＡＰＰマウス１０匹（１５ヵ月〜２１ヵ月齢、すべて雌）をＣＡＡのインビボ撮像に使用した。このマウスは、突然変異のヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰＶ７１７Ｆ）を過剰発現する。ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ系統、およびＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ系統の組合せを代表する雑種をバックグラウンドに、すでに確立された系統であるＰＤＡＰＰ−１０９を数世代にわたって交配したものである（Ｇａｍｅｓらの既報、１９９５）。
【００５０】
準備手術：
Ａｖｅｒｔｉｎ（トリブロモエタノール、２５０ｍｇ／ｋｇ ＩＰ）でマウスを麻酔した。高速ドリル（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解剖顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）観察下に小さな開頭部（直径約１ ｍｍ）を作製した。人工脳脊髄液（「ＡＣＳＦ」； １２５ ｍＭ ＮａＣｌ_２； ２６ ｍＭ ＮａＨＣＯ_３； １．２５ ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４； ２．５ ｍＭ ＫＣｌ； １ ｍＭ ＭｇＣｌ_２； １ ｍＭ ＣａＣｌ_２； ２５ｍＭ グルコース）で処置部位の湿度を保ち、硬膜を脳表面から静かに剥離した。
【００５１】
撮像剤：
チオフラビンＳ陽性アミロイド沈着を標識するため、処置部位にチオフラビンＳ（０．００５％ＴｈｉｏＳ ＡＣＳＦ溶液、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を局所的に投与した。血管腔を可視化しかつ蛍光血管造影像を得るため、血液脳関門を通過しない７０，０００ ＭＷのテキサスレッド標識デキストラン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＣＯ）をマウスの尾静脈から注射した。いずれの薬剤も撮像２０分前に投与した。
【００５２】
インビボ撮像：
頭蓋表面から脳内の約２００μｍの深さまでの三次元画像スタックを生成するためｚ軸の増分を５μｍとした他は、上述と同じ方法で撮像を行った。
【００５３】
画像処理：
Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）およびＩｍａｇｅＴｏｏｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、Ｔｅｘａｓ）を用いて、単一のスタックとして画像を検証した。テキサスレッド血管造影像による血管構造、および血管に関連するＴｈｉｏＳアミロイド沈着を調べるため、画像を三次元に再構成し、次にＸＹ投影像として投射（ｃｏｌｌａｐｓｅ）した。血管造影像のうち技術的に不適切な部分（最深部の光学面など）は分析前に除外した。
【００５４】
画像の定量分析：
Ａβが血管径に及ぼす影響を調べるため、鮮明な血管造影像と検出可能な量のアミロイド血管障害とについてすべての血管の幅を分析した。無作為に選択した点を開始点とし、これら血管の走行方向に沿って３０μｍごとに血管内腔の直径を測定した（すなわち系統的無作為サンプリング（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、「新しい立体解析ツール：Ｄｉｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｔｏｒ、および点抽出切片、ならびに病理学的研究および診断におけるこれらの利用（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｏｏｌｓ： Ｄｉｓｅｃｔｏｒ， Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ， Ｎｕｃｌｅａｔｏｒ ａｎｄ Ｐｏｉｎｔ Ｓａｍｐｌｅｄ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、Ａｐｍｉｓ ９６：８５７−８１（１９８８）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる））。各測定点において、血管セグメントがＡβに罹患しているか否かを判別し、かつ、半定量的スケール（０＝なし、＋＝軽度、＋＋＝中度、＋＋＋＝重度）を使用してＡβ沈着の程度を評価した（図９）。
【００５５】
Ａβ沈着が血管の分岐点付近で生じやすいという仮説を検証するため、１００μｍ間隔で選択した点を系統的にサンプリングして画像に重ね合わせた。血管と重なった各点について、その血管部位がＡβに罹患しているか否かを判別した。この点から、最も近い血管分岐点までの距離も測定した。
【００５６】
実施例 ６ Ａβと微小血管造影との同時撮像
緑色の蛍光体であるＴｈｉｏＳと、赤色の蛍光体であるテキサスレッドは、市販のフィルターセットを用いて同時に検出することが可能である。いずれも、モードロックＴｉサファイアレーザーの７５０ ｎｍの励起光によって明るい蛍光を発する。約６１５μｍ×６１５μｍ×深さ２００μｍの光学像の三次元スタックを投射してさらなる分析に供した。図９に、血管腔、およびＴｈｉｏＳで染色されたＡβの円周性沈着を示す。これらは投射した画像であるため、この画像内ではところどころオーバーラップが生じている。個々の断面像においては、ＴｈｉｏＳ染色は常にテキサスレッドの部分を取り囲んでおり、オーバーラップはしていない。
【００５７】
Ａβが血管の生理に及ぼす影響を調べるため、血管径を測定した。いくつかの血管では、血管の一部にＡβが存在しているが他の部分には存在していないことが明白である。Ａβ沈着がこのように不連続であることはアミロイド血管障害の臨床的な特徴であり、トランスジェニックモデルでも再現されている。無作為な開始点を使用して、血管に沿って３０μｍごとに直径を測定した（図１０）。これは、立体解析学を基礎とした「系統的無作為サンプリング」手法の応用の代表例である。各点について半定量的スコアを決定した。各血管において、Ａβアミロイドを含む血管セグメントとを含まない血管セグメントとを比較した。このように、血管をそれ自体の「対照」として使用した。この分析により、ＴｈｉｏＳ陽性染色を含む血管セグメントの部分はＡβを含まない血管セグメントと比較して約１６％大きいことが明らかになった（ｐ ＜ ０．００１、対ｔ検定）。驚くべきことに、血管変化の重篤度がこの効果を増悪させるという明らかな徴候はなかった（図１１）。例えば、アミロイド血管障害が「軽度」にすぎない血管において、対照血管セグメントの平均内径が２７．７μｍであったのに対して、アミロイド含有血管セグメントの内径は３２．１μｍであった（ｐ ＜ ０．０１）。興味深いことに、重度に罹患した血管では、アミロイド非含有セグメントの内径が３０．８μｍ、アミロイド含有セグメントの内径が３５．５μｍと、内径がわずかに大きいだけであった（ｐ ＜ ０．００５）。
【００５８】
このインビボ撮像法により、血管周囲のアミロイド沈着と血管構造との関連を検証するための独特の三次元データセットも得られた。最初の撮像セッションにおいて、アミロイド沈着は、驚くべき度数で血管の分岐点またはその付近に生じていたように見えた（図１２）。この考えを検証するために、実際にアミロイド沈着が分岐点付近により生じやすいということの尤度を評価するため無作為サンプリング法を開発した。１００μｍごとに配置したプローブを用いて画像にサンプルグリッドを重ね合わせた。プローブが血管と重なっていた場合は、その血管セグメントにアミロイド沈着があるか（またはないか）を判定し、かつ、血管上のその点から、最も近い分岐点までの距離を測定した。アミロイドを含まない血管は細動脈であるか細静脈であるかを確実に確認することができなかったため、Ａβをいくぶんか含む血管のみをこの分析に含めた。変化が「軽度」である血管はアミロイド沈着の「早期」段階にあり、かつ、変化が中度〜重度である血管はより後期の段階にあるという可能性が最も高いと仮定した。この仮定が正しければ、アミロイド沈着が分岐点付近で発生し次第により多くの血管部分を「埋めていく」という傾向を示すのであれば、軽度の血管におけるアミロイド含有セグメントは中度または重度の場合と比較して分岐点に「より近い」場所に見出されると考えられる。データはこの仮説を裏付けるものであった。軽度の量のＡβに罹患した血管では、アミロイドを有する血管セグメントは有しない血管セグメントと比較して血管分岐点に有意に近かった（Ａβ含有血管セグメント６２μｍ±１０μｍ（平均±ＳＥ）に対してＡβ非含有セグメント１３３μｍ±１７μｍ、ｐ ＜ ０．００５、ｔ検定）（図１３）。中度のＡβ沈着に罹患した血管セグメントでもＡβを有する血管セグメントのほうが有しないセグメントよりも血管分岐点に近かったが、分岐点までの絶対的な距離は軽度に罹患した血管と比較して長くなっていた。距離の中央値は、Ａβ含有血管が８４μｍ±１０μｍ、Ａβ非含有血管が１４８μｍ±２１μｍであった（ｐ ＜ ０．００５）。興味深いことに、血管壁がほぼ全長にわたってアミロイド血管障害に罹患した重度の血管では、アミロイドの存在と血管分岐点までの相対的な近さとの関係はやや弱くなっていた（１１６μｍ±５μｍに対して１６０μｍ±２６μｍ、有意差なし）。
【００５９】
この試験では、生きているトランスジェニックマウスの血管上におけるアミロイド沈着の影響を調べるため、新規の光学撮像技術であるインビボ多光子顕微鏡観察を用いた。観察されたいくつかの事項を以下に挙げる。脳アミロイド血管障害は、たとえ軽度のものであっても、インビボの血管において統計有意な血管拡張を伴う解剖学的構造の変化を生じさせる。これは、アミロイドの量が多いほど血管の拡張も大きいという段階的な様式で起こっているものと思われる。本研究の結果は、コンゴーレッド染色性アミロイド血管障害（「ＣＡＡ」）に罹患した血管における血管生理学的状態の障害を直接示すものである。この影響は軽度に罹患した血管でみられることから、ヒトの進行ＣＡＡでみられる平滑筋細胞の欠損が直接の原因ではないといえる（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌら、「脳出血併発性または非併発性の脳アミロイド血管障害：組織学的比較研究（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ Ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｄ Ｗｉｔｈ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ）」、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、３０：６３７−６４９ （１９９１）、およびＫａｗａｉら、「アルツハイマー病の脳アミロイド血管障害における血管筋細胞の変性（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ６２３：１４２−６（１９９３）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。平滑筋細胞のマーカーとしてファロイジン染色を用いた予備試験では、軽度のアミロイド血管障害を有する血管の平滑筋細胞密度は正常な血管の場合と差がなかった。
【００６０】
さらに、アミロイド血管障害も発症するＴｇ２５７６トランスジェニックマウスを用いた予備実験では、ＣＡＡを有する血管において薬理学的に誘導した拡張による障害が示唆された。ヒトＡＰＰを過剰発現する、ＦＶＢをバックグラウンドにもつ別の系統のマウス（スウェーデン型変異）では、Ａβ沈着は発生しなかったものの、脳血流に内皮細胞依存性の変化の障害が認められた（Ｉａｄｅｃｏｌａら、「アミロイド前駆体タンパク質過剰発現マウスにおける、ＳＯＤ１による脳内内皮細胞機能不全の緩和（ＳＯＤ１ Ｒｅｓｃｕｅｓ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２：１５７−６１（１９９９）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。Ａβペプチドもまた、内皮細胞および平滑筋細胞に対して毒性を示すこと（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、「ヒト培養血液脳関門内皮細胞における種々のアミロイドβペプチド種の毒性：Ｄｕｔｃｈ型突然変異の毒性増強（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｔｃｈ−ｔｙｐｅ Ｍｕｔａｎｔ）」、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ６０：８０４−１０（２０００）；およびＶａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄら、「脳血管平滑筋細胞表面の線維状Ａβ：脳血管壁内のタンパク分解性環境の変化（Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｕｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ Ａ Ｂｅｔａ． Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｖｅｓｓｅｌ Ｗａｌｌ）」、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０３：８９−９６（２０００）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）、ならびに血管作用性を有すること（Ｔｈｏｍａｓら、「βアミロイド媒介性の血管作用および血管内皮細胞障害（Ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄａｍａｇｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１６８−７１（１９９６）；Ｗｉｒｔｈら、「初代培養内皮細胞におけるキニン放出を介した、アミロイドβ−（１−４０）によるサイクリックＧＭＰ産生の亢進（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ−（１−４０） Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｉａ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｋｉｎｉｎｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）」、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３８２：２７−３３（１９９９）；およびＳｕｏら、「インビボにおけるＡβ血管作用（Ａ Ｂｅｔａ Ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ）」、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０３：１５６−６３（２０００）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）が報告されている。これらのデータと前述の結果とを併せて考えると、微小血管内のＡβ沈着がインビボにおける微小血管の反応性の完全性を変化させていることが強く示唆される。
【００６１】
多光子顕微鏡観察により、これまでにない分解能で脳の脈管構造をかなり大きく三次元再構成しかつ評価することも可能になった。ＸＹ平面において、仕様どおりに構成した多光子顕微鏡の分解能は約１μｍである。したがって、脳表面から深い部分におけるインビボの微細な毛管構造を検出することが可能であった。再構成画像の定性的評価から、軽度のアミロイド血管障害では血管の分岐点付近にアミロイドが生じる傾向のあることが示唆された。これは組織学的な切片では検出が困難な興味深い知見であり、かつ、アテローム性動脈硬化の過程をいくぶん想起させる。この関係から、アミロイド沈着の開始には独特の血管要因も重要な役割を果たしていることが示唆される。これには、血管内の微視的乱流、または分岐構造付近の血管形態における微妙な変化などの問題点が含まれている可能性がある。アミロイドが分岐点付近に選択的に生じる傾向はＣＡＡの重篤度が高くなるにつれて弱まり、重度のＣＡＡではこの効果がみられなくなる。長期（数ヵ月間）の観察期間にわたって多光子顕微鏡観察を行うことにより、アミロイド沈着の経時的な進行を追跡すること、および血管リモデリングが生じる可能性を評価することが可能になると予測される。
【００６２】
実施例 ７ トランスジェニックマウス
ハムスタープリオンタンパク質プロモーター下でｈＡＰＰ（Ｓｗ）を発現するＴｇ２５７６マウスを、交配対で始めたコロニーから取得した。これらのマウスは、年齢依存的にアミロイド血管障害を発症し、かつ、アルツハイマー病と考えられるマウスに類似したアミロイド斑を皮質および海馬に生じることが明らかになっている（４）。導入遺伝子を有する８匹および導入遺伝子を有さない同腹仔８匹を用いて、軟膜血管の平滑筋細胞（「ＳＭＣ」）を解剖学的に測定した。各遺伝子型について、６ヵ月齢の若齢群および１４ヵ月齢の高齢群という２群のマウスを使用した（表１）。
【００６３】
【表１】

【００６４】
同じコレラの動物群を用いて血管反応性の実験を行った。さらに、高齢群の遺伝子導入マウス３匹（２４．７±２．３ヵ月齢）について、アミロイド沈着およびＳＭＣを撮像した。
【００６５】
実施例 ８ 平滑筋細胞の撮像
インビボの血管反応性測定に続いて、麻酔薬（ハロタン）の過剰投与によりマウスを安楽死させた。頭蓋を無傷のまま取り出し、パラホルムアルデヒド（４％ＴＢＳ溶液）で数日間固定した。頭蓋および開頭部を無傷のまま残したため、インビボで拡張を測定したものと同じ血管母集団を同定することが可能であった。その後、脳を取り出し、ＴＢＳで洗浄し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ＴＢＳ溶液で２０分間処理し、再度洗浄したうえで、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＴＢＳ溶液中で２０分間インキュベートすることにより非特異的なバックグラウンド染色を最小限に抑えた。１％ ＢＳＡ ＴＢＳ溶液中で、Ａｌｅｘａ−５６８ ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）（５０μｌ保存液／２ ｍｌ）とチオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０．００５％）との組合せにより血管を染色した。染色溶液に浸漬して２０分後、脳をＴＢＳで洗浄し、プラスチック皿に入れ、溶融した骨ロウにより固定した。脳をＴＢＳに浸漬し、この中に顕微鏡の対物レンズを下ろして撮像を行った。
【００６６】
７５０ ｎｍで作動しかつ対物レンズ後部開口部の出力が２５ ｍＷであるＴｉ：サファイアレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）を備えた、ＢｉｏＲａｄ １０２４ＭＰ多光子撮像システムを撮像に使用した。このシステムを長作動距離浸漬対物レンズ（１０×、ＮＡ ０．５； ６０×、ＮＡ ０．８）を備えた直立顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５０に取り付けた。放出光の検出を強化するため外部検出器を使用した。フィルターセットによって、放出光を３６０ ｎｍ〜４３０ ｎｍ、４８５ ｎｍ〜５０５ ｎｍ、および５２５ ｎｍ〜６５０ ｎｍの３つのチャネルに分けた。ＴｈｉｏＳおよびＡｌｅｘａ−５６８の各信号はそれぞれ最初の２番目および３番目のチャネルに明確に分かれる。
【００６７】
実施例 ９ 平滑筋細胞密度の測定
無傷の脳の背側において、前大脳動脈と中大脳動脈との分岐点で２μｍ間隔の６０×連続光学切片を取得した。低速走査速度で、雑音除去のため２つの連続スキャンをＫａｌｍａｎフィルタリングして、各光学切片を取得した。その後、最大輝度値投影法により光学切片スタックから血管構造を再構成した。コンピューターで生成した無作為な長さの指標線を、血管の直径に対して垂直に描画した（Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ）。この線上のＳＭＣ数を線の長さ（ミクロン単位）で除することによってＳＭＣの線密度を計算した。各マウスについて３つの血管を測定した。勾配のある血管によるＳＭＣ密度測定値のひずみを最小限に抑えるため、長軸が撮像面とほぼ一致している血管を選択した。血管上の顕著なアミロイドの存在のため、遺伝子型について盲検的な選択を行うことは不可能であったが、ファロイジン染色したＳＭＣについては、マウスの月齢に関して盲検的に測定を行った。
【００６８】
実施例 １０ 血管反応性測定のための動物の準備
すべての実験は米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）およびマサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の施設指針に準拠して実施した。マウスには餌および水を自由摂取させた。麻酔は２．５％ハロタンで導入し、以後は６７％ Ｎ_２Ｏおよび３３％ Ｏ_２雰囲気下、１．０％ハロタンで維持した。経口挿管し、脳定位固定装置のフレームに固定し、人工的に換気した（ＳＡＲ−８３０／Ｐ、ＣＷＥ、Ａｒｄｍｏｒｅ、ＰＡ）。呼吸終期のＣＯ_２を微量炭酸ガス測定器（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）により連続的に監視した。動脈圧および心拍数の連続モニタリング、ならびに薬剤注入のため、大腿動脈および大腿静脈にポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０、Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を挿入した。麻酔深度を深くするため、α−クロラロース（８０ ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）を注入しかつハロタンを徐々に減少させた。尾のピンチングに対する動脈圧および心拍数の反応から麻酔深度を定期的に検査し、麻酔深度を安定に維持するため必要に応じて補助的な量のα−クロラロースを投与した。薬剤注入前に動脈血のガスおよびｐＨを分析した。温度管理マット（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＦＨＣ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＭＥ）により直腸温を３７℃に維持した。
【００６９】
実施例 １１ 閉鎖頭蓋窓の準備
マウスの血管径の変化の測定に使用した技術は前述のものと同様である。脳定位固定装置のフレームにマウスの頭部を固定し、経線方向の皮膚切開によって頭蓋を露出させた。フローポートを３つ有するステンレス鋼製の頭蓋窓リング（内径７．０ ｍｍ、高さ１．７ ｍｍ）を骨ロウのループ内で頭蓋に接着した。左頭頂骨の窓のリング内に開頭部（２ ｍｍ×１．５ ｍｍ）を作製した。その後、脳表面を人工脳脊髄液（「ＡＣＳＦ」）で管理しながら、硬膜を切開した。カバーガラスをリングの上に載せ、歯科用アクリル樹脂で固定した。ポートに流入ラインおよび流出ラインを接続することにより、露出した脳に直接液体を注入できるようにした。窓の下の容積は約０．１ ｍｌであった。ＡＣＳＦの組成は、Ｎａ^＋ １５６．５、Ｋ^＋ ２．９５、Ｃａ^＋＋ １．２５、Ｍｇ^＋＋ ０．６７、Ｃｌ⁻ １３８．７、ＨＣＯ_３ ⁻ ２４．６、デキストロース３．７、および尿素０．６７（すべて ｍＭｏｌ／Ｌ）とした。６．５％ ＣＯ_２、１０％ Ｏ_２、および８３．５％ Ｎ_２を用いた平衡により、ＡＣＳＦのｐＨを７．３５〜７．４５に維持した。流入ポートに接続したＰＥ−５０チューブを介して、注入ポンプによりＡＣＳＦを循環させた（０．４ ｍｌ／分）。流出チューブを窓より高い適切な高さに調節することにより、頭蓋内圧を５ ｍｍＨｇ〜８ ｍｍＨｇに維持した。窓内のＡＣＳＦの温度は３６．５℃〜３７．０℃に維持した。
【００７０】
実施例 １２ 血管径の測定
生体内顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、独国）、ＣＣＤビデオカメラ（モデル１３００、Ｃｏｈｕ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）、カメラコントローラー（Ｃ２４００、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）、ビデオモニター（Ｓｏｎｙ、日本）、およびビデオレコーダー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、日本）を含むビデオ顕微鏡システムを用いて、軟膜血管を画像化した。画像はビデオテープに連続的に記録した。分析装置付きビデオ（Ｃ３１６１、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）により１回の実験につき単一の軟膜細動脈（２０μｍ〜３０μｍ）の直径を測定し、かつ、ＭａｃＬａｂデータ取得および分析システムを用いて測定結果を記録した。安定なベースライン直径値が得られるまで、２０分間〜３０分間ＡＣＳＦを注入した。その後、ＡＣＳＦに溶解したアセチルコリン（「ＡＣｈ」）（１０および２５μＭ）およびニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、Ｓｉｇｍａ）（０．５μＭ）を添加して血管拡張を評価した。薬剤を１０分間注入し、続いて洗浄のためさらに２０分間ＡＣＳＦを注入してベースラインの血管径に戻した。２つの薬剤の注入順は無作為に決定した。ある亜集団（ｎ＝６）においては、低投与量と高投与量との間にベースラインに戻すことなく、２つの累積濃度のＡＣｈを注入した。薬剤添加ごとにベースラインからの最大の血管径変化を比較した。遺伝子型および動物の月齢を知らない実験者が血管の撮像およびデータ分析を行った。手順中に有意な低血圧（ｎ＝２）または高炭酸ガス症（ｎ＝１）を呈した動物は先験的に（ａ ｐｒｉｏｒｉ）分析から除外した。
【００７１】
このアミロイド沈着が血管壁の構造に及ぼす影響を評価するため、蛍光標識したファロイジンとチオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）との組合せを用いてアミロイドと同時にＳＭＣを可視化した。ファロイジンは、アクチンフィラメント、特にＦ−アクチンに結合し、種々の条件下でＳＭＣの可視化に利用されている（Ｗｉｌｓｏｎら、「肺動脈の内皮因子による平滑筋細胞の一方向性配列（Ａ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｆａｃｔｏｒ Ｃａｕｓｅｓ Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ）」、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｅｌｌ １９：１７７−８２８（１９８７）；およびＫｏｂａｙａｓｈｉら、「生後ラットの大動脈における内膜平滑筋細胞の出現および分布（Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｉｍａｌ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｓｔｎａｔａｌ Ｒａｔ Ａｏｒｔａ）」、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２８９：４８７−９７（１９９７）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。ファロイジンは固定されたマウス軟膜血管中の血管ＳＭＣを染色し、かつ、Ａｌｅｘａ ５６８と共役させると、ＴｈｉｏＳと別の発光チャネルで撮像することができる。この方法により、ある長さの軟膜細動脈において、周囲のアミロイドに対するＳＭＣの構成および数を調べることが可能である。染色は固定した無傷の脳で行うことができ、かつ、ＭＰＳＬＭにより三次元撮像を行うことができる。
【００７２】
図１４に、１６ヵ月齢のＴｇ２５７６マウスの軟髄膜血管上のアミロイド血管障害パターンを示す。３２枚の画像からなるこのモンタージュにより中大脳動脈の関与が血管の走行に沿ってどう変化するかが説明されているが、これらは試験された全血管の典型例である。血管径が大きい部位は、血管の全周にわたってアミロイドが完全な環を形成しており、最も早期かつ重度に罹患した部位であると考えられる。アミロイドの古典的なセグメント像が明らかであり、かつ、血管が最も重篤に罹患した部位ではアミロイドが数百ミクロンにわたって断続することなく連続的に伸びている。より小さい血管ではアミロイドの量が少なく、沈着もまばらであり、ところどころ血管壁上の孤立した小片として蓄積している。アミロイド沈着は細動脈壁上にのみ認められ、同図のバックグラウンドにシルエットとして画像化されている細静脈はアミロイドに罹患していない。
【００７３】
３つの異なる月齢のマウスについて、アミロイド血管障害におけるＳＭＣの形態を調べた。非トランスジェニックの同腹仔およびアミロイド沈着を生じるには若すぎる（６ヵ月齢）トランスジェニック個体では、ＳＭＣが規則的に配列していた。ＳＭＣは血管周囲に円周性に配列していた。血管の走行方向には密接状態で互いに隣接し、細胞間に明らかな空間は認められなかった（図１５）。
【００７４】
対照的に、１４ヵ月齢および２４ヵ月齢のトランスジェニックマウスでは、ＴｈｉｏＳ陽性アミロイドによりＳＭＣが実質的に破壊されていた（図１６）。アミロイドがまばらな領域は、隣接するＳＭＣ間にＴｈｉｏＳ陽性物質の断片が見えるという特徴があった。より重度に罹患した血管部位では、個々のＳＭＣがアミロイドに包まれ、そのため隣接する細胞からの距離が長くなり最終的には完全に孤立する様子が観察された。１４ヵ月齢群の罹患した血管ではＳＭＣの構成が明らかに異常であったが（図１６Ａ〜図１６Ｂ）、ＳＭＣは横方向に縮小することによってアミロイドの侵害に対応しているように見えた。血管の走行方向では、ＳＭＣの欠損は顕著ではなかった。これらの定性的な観察結果と一致して、定量分析の結果（図１７）もまた、以下を示した：ＴｈｉｏＳ陽性血管部位におけるＳＭＣの線密度を、１４ヵ月齢Ｔｇ２５７６マウスのＴｈｉｏＳ陰性血管部位または対照群である非トランスジェニック同腹仔の測定結果と比較しても、有意差は認められなかった。
【００７５】
しかし、本実験で用いた最高齢（２４ヵ月齢）の群では、アミロイド沈着が特に重度である領域において、血管の走行方向に沿ったＳＭＣも欠損していた（図１６Ｃ〜図１６Ｄ）。アミロイドに罹患した血管部位と罹患していない部位とについて、血管の走行方向に沿ったＳＭＣ密度を計算した。アミロイドを有する血管では、同じ個体のアミロイドのない血管と比較して、２４ヵ月齢までにＳＭＣが半分以上失われていた。アミロイドのない血管または血管部位のＳＭＣ密度は１４ヵ月齢群と２４ヵ月齢群とで有意差がなく（図１７）、かつ、１４ヵ月齢の非トランスジェニックマウス、６ヵ月齢の非トランスジェニックマウス、または６ヵ月齢のトランスジェニックマウスの血管のＳＭＣ密度と比較しても有意差がなかった。続いて、ニッスル染色した病理切片を検証したところ、重度に罹患した血管部位においても内皮細胞が保持されていることが判明した。出血性脳卒中の証拠は観察されなかった。
【００７６】
２４ヵ月齢のマウスに見られるような、血管壁におけるＳＭＣの欠損は、生理的または薬理学的な刺激に対する拡張反応を必然的に変化させる。１４ヵ月齢のマウスで見られるようなＳＭＣの破壊によりもたらされる結果は明らかになっていない。血管壁中のアミロイドの存在により、ＳＭＣ欠損前でさえ血管機能が害されるという仮説が立てられた。したがって、若齢（６ヵ月齢）およびより高齢（１４ヵ月齢）のトランスジェニックマウス、ならびに対照として非トランスジェニックの同腹仔に閉鎖頭蓋窓を作製し、これを用いて軟膜血管の生理を直接調べた。酸化窒素依存性の機構（１０）を介して内皮依存性の血管拡張を引き起こすアセチルコリン（「ＡＣｈ」）、またはＳＭＣに直接作用する酸化窒素供与体であるニトロプルシドナトリウム（「ＳＮＰ」）のいずれかを添加し、これに対する血管径の変化を測定した。ＡＰＰ遺伝子の過剰発現およびＡβペプチドの過剰産生がアミロイド沈着と独立に血管機能に影響するという可能性を検証するため、６ヵ月齢のトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスにおける血管反応も併せて測定した。測定した４群の生理学的パラメーターを表１に示した。４群間で、動脈血のｐＨ、ＣＯ_２、Ｏ_２、またはベースライン血管径に有意差はなかった（ｐ ＞ ０．０５、ＡＮＯＶＡ）。統計有意差となったのは、若齢非トランスジェニック群と他の３群との間の動脈圧であった（ｐ ＜ ０．０５、ＡＮＯＶＡ）；この若齢群の血圧測定値は、血管反応の前後とも実質的に高かった。しかし、いずれの実験群についても、実験前と実験後の平均血圧には差がなかった。
【００７７】
この４群にＡＣｈおよびＳＮＰを投与した際の拡張率を図１８に示す。６ヵ月齢のＴｇ＋群およびＴｇ−群との間には、ＡＣｈおよびＳＮＰのいずれの場合も反応に差はみられなかった。これとは対照的に１４ヵ月齢のマウスでは、トランスジェニックマウス５匹中４匹において、ＡＣｈ両方の投与量およびＳＮＰに対する血管拡張反応が非トランスジェニック群と比較して顕著に低減していた。事実、これらマウスの血管拡張は対照マウスの約２５％にまで低減していた。導入遺伝子陽性群の中の１匹であるアウトライアーは、ＡＣｈおよびＳＮＰのいずれに対しても本質的に正常反応を示し、測定値は同群の他のマウスの平均値から６ ＳＤ解離していた。このマウスの生理学的パラメーターのいずれかにおける差異からは、同群の他のマウスからのこの顕著な解離を説明できなかった。
【００７８】
生理学的実験の後、マウスに対して灌流を行い、前述と同様の準備をしてＭＰＬＳＭ分析に供した。撮像時、１４ヵ月齢の「アウトライアー」の血管の測定セグメントには中度のＴｈｉｏＳ陽性アミロイドが認められ、同群の他のマウスの所見と特に異なっていなかった。ただし、最も重度に罹患した血管にもアミロイドの完全な環は存在していなかった。このアウトライアーをデータから除外すると、トランスジェニックマウスと非トランスジェニックの同腹仔との間でＡＣｈおよびＳＮＰのいずれについても結果に大きな有意差が認められた（ｐ ＜ ０．００５、ＡＮＯＶＡ）。このアウトライアーを含めた場合、１０^−５ＭのＡＣｈ投与については差がより小さくなったものの統計有意性は維持された（ｐ ＜ ０．０５）；より高投与量のＡＣｈ、およびＳＮＰについては統計有意差がなかった。
【００７９】
Ｔｇ２５７６トランスジェニックマウスを用いて、脳血管におけるＡβ沈着の自然歴を調べ、かつ、アミロイド沈着は血管の構造的破壊および機能的破壊の原因となるという仮説を検定した。
【００８０】
得られたデータは、アミロイド関連性のＳＭＣ破壊により、内皮依存性および内皮非依存性の両方の血管拡張薬に対する反応がこれら血管でＳＭＣ欠損が生じるよりも早い月齢で障害されることを示していた。血管機能に対するこのアミロイドの干渉機構については複数の可能性が存在する。アミロイドは血管拡張を機械的に阻害しこれによって血管壁を比較的硬くさせているという可能性がある。この可能性は、アミロイド血管障害を有する血管は死後組織においてつぶれることがなく、このため古典的な「ストーブ煙突」像を呈するという長期的な観察結果により裏付けられている（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌら、「脳出血併発性または非併発性の脳アミロイド血管障害：組織学的比較研究（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ Ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｄ Ｗｉｔｈ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ）」、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．、３０：６３７−６４９ （１９９１）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。死後に血管径を維持するこの非柔軟性が、インビボにおいて物理的に拡張を制限している可能性が考えられる。もしくは、アミロイドにより隣接ＳＭＣが物理的に分離されることによって、ＳＭＣの協調作用に依存する収縮が障害されるという可能性もある。これら血管周囲のアミロイドの蓄積が最終的に多数のＳＭＣの死をもたらすことを考慮すると、第三の可能性はＳＭＣに対するアミロイドの軽度毒性である。このような毒性によって、おそらくはチャネルタンパク質の発現が変化することにより、ＳＭＣの適切な拡張能力が干渉されるという可能性も考えられる（例：脳血管のＮＯ依存性弛緩（Ｓｏｂｅｙら、「酸化窒素ならびにカリウムチャネルのアゴニストおよびインヒビターが脳底動脈の直径に及ぼす影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ Ｂａｓｉｌａｒ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉａｍｅｔｅｒ）」、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７２：Ｈ２５６−Ｈ２６２（１９９７）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）を媒介する、Ｃａ^＋＋依存性Ｋ^＋チャネル（Ｔａｇｕｃｈｉら、「ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルを媒介とする、低酸素時の脳細動脈の拡張（ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋ＋ Ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｉｏｌｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｐｏｘｉａ）」、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ４：１００５−８（１９９４）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる））。アミロイドは培養中の内皮細胞に対して毒性を示し（Ｔｈｏｍａｓら、「βアミロイド媒介性の血管作用および血管内皮細胞障害（Ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄａｍａｇｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ ８０：６８−７１（１９９６）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）、Ａβペプチドの変異型は培養中のＳＭＣに対して毒性を示す。ただし、Ｔｇ２５７６マウスで最も多い１−４０型はＳＭＣに対して直接の毒性を示さなかった（Ｄａｖｉｓら、「Ｄｕｔｃｈ型変異アミロイドβタンパク質の強力な病理学的特性（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｕｔｃｈ−ｔｙｐｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｍｙｌｏｉｄ ＢｅｔａＰｒｏｔｅｉｎ）」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ３：２９９６−３０００（１９９６）；およびＷａｎｇら、「ヒトの脳微細血管および大動脈平滑筋に対する、Ｄｕｔｃｈ型変異（Ｅ２２Ｑ）およびＦｌｅｍｉｓｈ型変異（Ａ２１Ｇ）のアミロイドβタンパク質の毒性（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｔｃｈ（Ｅ２２Ｑ）ａｎｄ Ｆｌｅｍｉｓｈ（Ａ２１Ｇ）Ｍｕｔａｎｔ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ａｏｒｔｉｃ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ）」、Ｓｔｒｏｋｅ ３１：５３４−５３８（２０００）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。したがって、インビボにおけるＳＭＣ機能の明らかな欠失は、細胞欠損につながるイベントカスケードの予備的段階を反映している可能性もある。アミロイド沈着モデルのＴｇ２５７６マウスでみられるＳＭＣ欠失は、ヒトＡＤ症例の剖検において超微細構造解剖学レベルで報告された既報の結果と類似している（Ｖｉｎｔｅｒｓら、「アルツハイマー病患者の脳生検標本における微細血管構造：免疫組織化学的および超微細構造学的研究（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｂｉｏｐｓｙ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｙ）」、Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ Ｐａｔｈｏｌ １８： ３３３−４８（１９９４）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。興味深いことに、アミロイド誘導性ＳＭＣ機能不全のこのようなモデルは、罹患した血管でＳＭＣ欠失が生じる前にアミロイドを除去できれば、血管機能を回復できる可能性があることを示している。アミロイドを除去するための治療手法を開発することにより（Ｓｃｈｅｎｋら、「アミロイドβ免疫による、ＰＤＡＰＰマウスのアルツハイマー様病変の緩和（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｂｅｔａ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ−ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＤＡＰＰ Ｍｏｕｓｅ）」、Ｎａｔｕｒｅ、００：１７３−１７７（１９９９）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）、これらの動物においてこの仮説を検定できると考えられる。
【００８１】
ＦＶＢをバックグラウンドとしてＡＰＰ（Ｓｗ）を過剰発現するマウスにおいて、脳血管の機能が研究されている（Ｔｇ１１３０Ｈ）。これらのマウスはアミロイド沈着を示さず、かつ、比較的若齢で死亡する。本明細書に記載の結果と対照的に、Ｔｇ１１３０Ｈマウスでは、内皮依存性の脳血流変化は障害されたものの内皮非依存性の脳血流変化は障害されなかった（Ｉａｄｅｃｏｌａら、「アミロイド前駆体タンパク質過剰発現マウスにおける、ＳＯＤ１による脳内内皮細胞機能不全の緩和（ＳＯＤ１ Ｒｅｓｃｕｅｓ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２：５７−６１（１９９９）、これは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。月齢、バックグラウンド系統（Ｔｇ２５７６はＣ５７ Ｂ／Ｊ１ Ｆ１をバックグラウンドとする）、または測定プロトコル自体（血流ｖｓ．血管径）の差が観察結果の差に寄与した可能性もある。しかし、これらのデータを併せて考えると、脳血管反応の機能的完全性が突然変異ＡＰＰの過剰発現およびＡβ沈着によって深く障害されていることが示唆され、かつ、ＣＡＡおよびアルツハイマー病においては機能的な変化も生じる可能性が高いと考えられる。これらインビボの研究結果、および、Ａβが大動脈の環に対してポジティブなイオン誘起型効果を及ぼすというエクスビボ研究の観察結果（Ｐａｒｉｓら、「炎症性経路を介して可溶性βアミロイドペプチドにより媒介される血管作用（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｂｅｔａ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｖｉａ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｔｈｗａｙ）」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２１：１８３−９７（２０００）；およびＣｒａｗｆｏｒｄら、「βアミロイドペプチドのインビトロ血管作用の特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖａｓｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １５０：１５９−６８（１９９８）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）は、血管関連性Ａβが脳血管の構造および機能に生理学的な障害を引き起こすという仮説を支持している。
【００８２】
実施例 １３ 方法
これらの実験は、ＰＤＡＰＰマウスをアミロイドβで免疫するとアミロイドβに対する抗体が生じ、かつ、続いて新しいアミロイドβ沈着が予防されるという知見に基づくものである（Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−７（１９９９）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。インビボにおける抗アミロイドβ抗体と斑との相互作用により斑の除去がもたらされるという仮説を検定した。したがって、治療的介入の前後にアミロイドβ沈着をインビボ撮像することを試みた。蛍光標識した抗アミロイドβ抗体を皮質に直接添加した。突然変異ＡＰＰを遺伝子導入した２０ヵ月齢のホモ接合ＰＤＡＰＰマウスの皮質を、マウスが生きている状態で撮像した。最初の撮像時には多数のアミロイドβ沈着が観察され、そのうち一部はびまん性アミロイドの特徴を呈し、そのうち一部は不連続な核を有していた。脳表面から１００ミクロン〜１５０ミクロンに深さまで、２ミクロン刻みの薄い光学切片のスタックを取得した（図１９Ａおよび図１９Ｃ）。Ｗｉｎｄｏｗｓ−ＮＴ搭載のワークステーション（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ６１０、Ｄｅｌｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、Ｒｏｕｎｄ Ｒｏｃｋ、ＴＸ）上でこの画像を三次元再構成（Ｖｏｘｂｌａｓｔ、ＶａｙＴｅｋ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＩＡ）したところ脳表面から１００ミクロン以上という深さにおいてもアミロイドβ沈着の非常に細かい詳細が明らかになった。びまん性の沈着は、伸長、不規則な形状、およびクラスターを高頻度に伴う微細形態を有しており、その像は従来のＰＤＡＰＰマウスの組織学的免疫染色による像とまったく同様であった。いくつかの軟膜血管を囲むアミロイド血管障害も同様に撮像した。したがって、蛍光標識した抗アミロイドβ抗体を皮質に直接添加しかつ皮質内に拡散させて、アミロイドβ沈着を特異的に標識した。この標識により、存在する沈着を同定しかつ多光子顕微鏡で撮像することが可能となった。
【００８３】
撮像後、マウスは異変なく回復した。３日後にマウスを再度麻酔し、同じ領域を撮像した。まったく同じ領域が確実に撮像されるよう、テキサスレッド血管造影およびステージ位置により確認を行った。最初の撮像時では、３日前の撮像セッション時の蛍光がほとんどまたはまったく残存していないことが明らかになった。その後、蛍光標識した抗アミロイドβ抗体を皮質に再度直接添加した。皮質表面から、１００ミクロン〜１５０ミクロンの深さまで、２ミクロンごとにｚ軸方向の撮像を繰返し画像を取得した。初回撮像時に存在していたアミロイドβ沈着はほとんどまたはまったく観察されなかったが、アミロイド血管障害は依然として検出された（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。このように、抗アミロイドβ抗体を単回投与した後のこの時点において、アミロイドβ沈着の劇的な解消が観察された。６匹のマウスの各１つ〜２つの部位において、初回撮像時からの間隔を３日間から８日間に延長してこの実験を再現した場合も、ほぼ同様の結果が得られた。２回目の撮像セッションの際単純にアミロイドβが１０Ｄ５にマスキングされていた、という可能性を検証するため、アミロイドβのＮ末端上の特徴的なエピトープに結合する抗体である３Ｄ６を使用して２回目の撮像セッションを行った場合も、同一の結果が得られた。これらの結果は、１回目の撮像セッション時に存在していたアミロイドβが逆転した、すなわち抗体の使用により除去された、ということを示している。
【００８４】
頭蓋および硬膜の除去、モノクローナル抗体の使用、および撮像により、アミロイドβ沈着が非特異的な影響を受けた可能性がある、という別の説明を検証した。この可能性を検討するため、ヒトのタウの細胞内エピトープには結合するがげっ歯類のタウとは交差反応しないモノクローナル抗体１６Ｂ５をフルオレセイン標識したものを最初の撮像セッションで使用するという偽実験をマウス５匹において行った（Ｖｉｇｏｐｅｌｆｒｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５：７８８−７９３（１９９５）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。このモノクローナル抗体１６Ｂ５は老人斑上のエピトープには結合しないため、１６Ｂ５を使用した最初の撮像セッションでは、予測どおりアミロイドβはまったく画像化されなかった。蛍光標識した１０Ｄ５を使用して３日〜５日後に行った再撮像では、最初に１０Ｄ５を用いて撮像した６匹のマウスの初回撮像セッションのものと見分けがつかないような多数のアミロイドβ沈着が画像化された。したがって、外科的準備、不適切なモノクローナル抗体の使用、または撮像などがアミロイドβ沈着の解消をもたらしたのではないと考えられる。
【００８５】
抗アミロイドβ抗体の使用がびまん性および密集性の線維状沈着を変化させたのかという疑問を検証するため、チオフラビンＳを用いた別の撮像戦略を開発した。チオフラビンＳはアミロイドタンパク質沈着に特異的に結合する標準的蛍光色素であり、アルツハイマー病の神経病理学研究に広く用いられている。チオフラビンＳ（青緑域で発光）の希釈溶液（０．００５％ ＡＣＳＦ溶液）を、フルオレセイン標識した１０Ｄ５または１６Ｂ５と同時に皮質表面に投与することにより、密な核を有するチオフラビンＳ陽性斑とすべてのアミロイドβ沈着とを同時に観察できるようにした。９匹のマウスを上述の１０Ｄ５群（ｎ＝４、７部位）と１６Ｂ５群（ｎ＝５、７部位）とに無作為に割り振った。合計２８回の撮像セッションの各々について、２名の読影者が独立にチオフラビンＳ斑の有無をスコア化し、かつ、第１および第２の画像セットを比較することによって、個々のチオフラビンＳ斑が消失したか否かを決定した。１０Ｄ５群では、初回撮像時から３日後に６５個中４５個（７０％）の斑が消失していた。１６Ｂ５群では、３日後に再同定できなかった斑は４５個中９個のみ（２０％）であった（χ^２＝３０．５、ｐ ＜ ０．００１）。この結果は、びまん性および密集性いずれのアミロイドβ沈着も１０Ｄ５の投与によって逆転されることを示している。さらにこの結果は、２回目の撮像セッションにおけるアミロイドβの減少は、抗体媒介性のエピトープの変化によるものではなく沈着の解消によるものであるという技術的な対照をなすものである。
【００８６】
撮像および１０Ｄ５の処理による影響をさらに分析するため、２回目の撮像セッション後にマウスの組織学的検証を行った。マウスの脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１５％グリセロールで凍結保護し、凍結ミクロトームで４０ミクロンの切片を作製した。ビオチン化または蛍光標識した３Ｄ６で免疫染色したところ、頭蓋開口部の表面から約１００ミクロン〜２００ミクロンの深さの領域が染色された。１０Ｄ５処理群ではすべてのマウスで表面付近のアミロイドβ沈着が顕著に消失していたが（図２１）、偽処理群ではいずれのマウスでものそのような消失は観察されなかった。判定は、処理状態を知らない観察者が行った。注意点として、３Ｄ６と１０Ｄ５とは隣接するが重複はしないエピトープを有しており、かつ、使用順に関わらず老人斑を二重染色する可能性がある。これらの結果は、１０Ｄ５の直接投与により最初に皮質を処理するとその後アミロイドβ沈着が解消されるという仮説と一致している。
【００８７】
小グリア細胞を検出するトマトレクチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて組織化学的に染色したところ、１６Ｂ５で処理した動物においてさえ、撮像部位における小グリア細胞の顕著な上方制御が観察された（図２２）。抗グリア線維状酸性タンパク質による免疫染色では、軽度の星状細胞反応が観察されたにとどまった。これらのデータから、１０Ｄ５曝露後のアミロイドβ解消は傷害に対する非特異的反応ではなく抗アミロイドβ抗体に対する特異的反応であるということが示唆される。
【００８８】
アミロイドβによる免疫が小グリア細胞によるアミロイドβの見かけ上の摂取を引き起こすことから、次に、抗体投与部位におけるアミロイドβと小グリア細胞との相互作用を調べた（Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−７（１９９９）；これらは参照として全文が本明細書に組み入れられる）。フルオレセイン標識したトマトレクチンとビオチン標識した３Ｄ６（アビジン−ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈにより検出））とを使用した二重免疫蛍光により、前側／頭頂骨側の皮質の処理部位において、少量の残存アミロイドβを完全に取り囲む顕著な小グリア細胞反応が観察された（図２３Ａ）。この部位から遠い部分（例えば側頭葉）では、斑に伴う小グリア細胞は典型的にはわずか数個であった（図２３Ｂ）。処理群および対照群のいずれのマウスにおいても撮像部位付近で小グリア細胞の活性化が生じていたが、小グリア細胞とアミロイドβ沈着との関連性は劇的に異なっていた。
【００８９】
総括として、上述のデータは、脳内に存在するアミロイドβ沈着が実験的介入により逆転したことを初めて示したものである。チオフラビンＳ染色したアミロイドβ沈着は、びまん性および密集性のいずれの場合も、抗アミロイドβ抗体を皮質に直接投与するという処理から３日以内に顕著に解消された。残存したアミロイドβは小グリア細胞に包囲されているのが観察された。エクスビボ系で同時に行った実験では、小グリア細胞がＦｃ媒介性の食作用を介してアミロイドβを取り込む能力を有することが示された。この食作用により続いてペプチドが分解される。抗体がアミロイドβ^１３の原線維発生を変化させている可能性もある。この実験の処理は抗体の受動的投与であったことから、この実験はまた、アミロイドβ^３による免疫の結果を確認しかつ拡張するものでもある。これらのデータは、アミロイドβによる免疫後にアミロイドβ沈着の軽減を媒介しているのは、必ずしも細胞性免疫反応ではなく体液性の反応であることを示唆している。結果として、これらのデータは、アルツハイマー病におけるアミロイドβ沈着を予防または解消する上で受動的な免疫療法が有効である可能性があるという考えを支持するものである。この手法は、自己限定性であること、最適なエピトープ特性を有するよう設計された試薬を使用できること、および、高齢患者の母集団において高力価の免疫効果を得る必要性を回避できること、という臨床上の利点を有するものと考えられる。
【００９０】
麻酔した生体マウスにおいて、不連続な脳の病変部を約１ミクロンの分解能で画像化できる、強力なインビボ多光子撮像技術を以下に説明する。これにより、他のインビボ技術をはるかに上回る分解能で個々の細胞または病変構造を画像化できる、非常に優れたインビボ画像が得られる。原理的に、直接標識した適切な抗体を用いることによって、任意の細胞外エピトープを可視化することが可能である。皮質内へと抗体を侵入させることは制限要因とはならず、抗体は多光子顕微鏡の検出可能深度と同程度の深さ（脳表面から約１００ミクロン〜１５０ミクロン、またはマウス皮質のＩＩ層もしくはＩＩＩ層）まで侵入した。その他の蛍光マーカー（フルオレセインまたはテキサスレッド）により血管の解剖学的構造が画像化でき、これによりランドマークを提供することができる。これらのマーカーは、血管の病理またはアミロイド血管障害などを対象とした研究にも明らかに有用であると思われる。インビボの代謝活性および生理活性をモニターできる広範な蛍光レポーター分子が利用可能である。同じ部位を数時間または数日後に繰返し撮像することも容易である。予備的実験からは、撮像プロトコルを一部修正すればこの時間ウィンドウを数ヵ月に延長することも可能であることが示唆された。最も優れた撮像剤である蛍光標識１０Ｄ５は、驚くべき治療効果を有していると考えられるが、この手法を改変することにより、他の治療手法をインビボ多光子顕微鏡観察を用いて試験するために使用できる、価値のある撮像剤が得られると予測される。同じ部位を長期的に撮像できるというこの撮像法の能力は多様な治療的介入の研究に理想的である。さらに、この能力により、抗アミロイドβ抗体による治療がアミロイドβ沈着を逆転させると明確に結論付けることも可能であった。
【００９１】
神経原線維錯綜は、アルツハイマー病における細胞内の神経病理学的なもう一つの決定的特徴であり、皮質の第ＩＩ層、ＩＩＩ層、およびＩＶ層のニューロンに発生する。神経原線維錯綜を形成する主たるタンパク質は微小管関連タンパク質タウであり、これがＡβのプリーツシートタンパク質構造中で自己凝集する。このβプリーツシートは老人斑中のアミロイドβタンパク質と同じ種類の構造をもっており、したがって同様の色素がこれに結合する。チオフラビンＳ、コンゴーレッド、および同様にアミロイドに結合する任意の化合物が、神経原線維錯綜に結合する。したがって、これら化合物の蛍光性変異体は神経原線維錯綜のインビボ検出に有用であると考えられる。本明細書では、これらの化合物が実際に錯綜を染色すること、および、多光子顕微鏡観察により検出可能であることを、エクスビボで示した。
【００９２】
さらに、神経原線維錯綜を検出する第二の手法として、このタンパク質構造に独特な自己蛍光特徴を利用する方法がある。
【００９３】
図２４Ａに、死後のヒトの脳の凍結標本における典型的な神経原線維錯綜を示す。長波長光を照射した際の独特の自己蛍光特性を利用して撮像したものである。この同定を確認するために行った抗ホスホタウ抗体による免疫組織化学法で、同じ細胞が画像化された。８００ ｎｍの光を照射した後の、錯綜の独特の発光スペクトルを図２４Ｂに示した。
【００９４】
脳組織の多光子励起を利用して、動物の神経変性疾患を診断用に検出および撮像できることが示された。このことは、ヒトを含むより大型の動物においてこれらの疾患を検出および撮像するという多光子励起の有用性を示唆している。
【００９５】
以上、説明を目的として本発明を詳述したが、これらの詳細は説明だけを目的としたものであることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明は当業者により改変されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａから図１Ｃ】本発明による神経変性疾患撮像に関する種々の態様を示す。図１Ａは患者の頭蓋の撮像様式を示す。図１Ｂにおいては分光システムを用いて撮像が行われる。図１Ｃは単一モード光ファイバーおよび末端レンズとを用いた撮像を示す。
【図２】インビボ撮像のための頭蓋の調製物を示す。図２Ａは、撮像前に解剖顕微鏡を通じて肉眼で観察した頭蓋像である。無傷であるが菲薄化した頭蓋領域を通して軟膜静脈が見られる。画像中で前部および正中線上の縫合も見られる。スケールマークは１ ｍｍ間隔である。図２Ｂは撮像中の顕微鏡対物レンズの略図である。頭蓋の菲薄化領域を、骨ロウ（濃い灰色）の環によって保持した人工脳脊髄液のプール（薄い灰色）中に浸す。チオフラビンＳの注入を可能にするため、菲薄化した領域の側壁に小さい亀裂をつくる。図２Ｃは、１５ヵ月齢のＴｇ２５７６マウス内でチオフラビンＳ陽性（「ＴｈｉｏＳ」）アミロイドをインビボで可視化した図である。頭蓋表面付近の単一の光学切片である。この画像中で、軟膜細動脈を囲むチオフラビンＳ陽性アミロイド血管障害が見られる。右下隅に頭蓋骨のかすかな自己蛍光が見られ、かつ、右下方に硬膜の線維状自己蛍光が帯として見られる。図２Ｄは、図２Ｃと同じＺ軸由来であるが脳の内側方向に５０μｍ深い、別の光学切片を示し、マウス皮質の層１におけるチオフラビンＳ陽性のアミロイド沈着を示している。図２Ｅは、画像スタック全体の垂直ボリュームレンダリングを示し、頂部に頭蓋、そのすぐ下にアミロイドで覆われた軟膜血管、および生きている脳の深部にチオフラビンＳ陽性斑が見られる。硬膜の自己蛍光もまた血管と頭蓋との間のかすかな層として見られる。図２Ｃおよび図２Ｄの光学切片のおよその位置を点線で示した。図２Ｃ〜図２Ｅのスケールバーは２５μｍである。
【図３】チオフラビンＳ陽性の構造が本当に老人斑であることが確認される。これは、チオフラビンＳおよび、抗アミロイドβモノクローナル抗体であるｃｙ３標識１０Ｄ５（Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を、固定された無傷のＴｇ２５７６マウスの脳の表面に添加することによって実施した。図３Ａにおいて、３８０ ｎｍ〜４８０ ｎｍの蛍光発光は、脳の深さ約４０μｍにある斑のアミロイド核を染色したチオフラビンＳを示す。図３Ｂにおいて、５６０ ｎｍ〜６５０ ｎｍの発光はチオフラビンＳ陽性の核を囲む同じＡβを染色したＣｙ３−１０Ｄ５である。スケールバー＝１０μｍ。図３Ｃは、２日前に多光子顕微鏡で撮像した領域内の切片におけるグリア線維酸性タンパク質の免疫活性を示す。散在する免疫活性な星状細胞は隣接する（画像化されない）皮質と実質的に異なることなく、撮像に対する組織の反応が最小限であることを示唆している。スケール＝１００μｍ。
【図４】Ｔｇ２５７６マウスに沈着したチオフラビンＳ陽性アミロイドのインビボ撮像を示す。図４Ａは、最初の撮像日に取得した６０×視野の３×３モンタージュである。光学切片は、頭蓋内側の表面から２００μｍにわたって２μｍごとに取得した。画像をｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸方向に整列化し、次に単一の像として投影したところ、アミロイド血管障害および老人斑が確認された。スケールバー＝１００μｍ。図４Ｂは、頭蓋表面から深さ約４０μｍのチオフラビンＳ陽性斑のインビボ画像を示す。この画像は斑の本体を通る単一の光学切片である。スケールバー＝１０μｍ。図４Ｃは図４Ｂと同じ斑を同一の撮像条件下で２日後に再撮像したものである。図４Ｄは、軟膜細動脈に関連したチオフラビンＳ陽性アミロイド血管障害を示す単一光学切片である。スケールバー＝２０μｍ。図４Ｅは図４Ｄと同じ細動脈を２日後に撮像したものである。
【図５】斑の測定値のばらつきを分析した図である。図５Ａにおいて、０．５ヵ月ごとの群にまとめたすべての斑の測定値の割合の変化（平均±標準偏差）は、測定平均値においても測定値のばらつきにおいてもこの実験期間中何らの傾向を示さなかった。各測定時のＮ値は標準偏差バーの上に示した。図５Ｂは最初の測定値とその後の全間隔の測定値との線形回帰のプロットであり、全ての斑のサイズについて強い相関が認められる。線の傾きは１に近く（０．９８）、相関係数はＲ^２＝０．８９である。
【図６】斑の部分母集団の経時的なサイズ変化を示す。同じマウスを最初の撮像時（左側）と１０４日後（右側）に撮像したもので、チオフラビンＳ斑（赤色）およびフルオレセイン血管造影像（緑色）のスタックを２チャンネルボリュームレンダリングした画像である。これら領域内には４つの斑が鮮明に画像化されている（Ａ〜Ｄで示した）。ボリュームスタックの上端部には硬膜の自己蛍光が観察される。この自己蛍光は図７のものとやや異なって見えるが、これは画像スタックの最初の深さが完全には一致していないためである。下のグラフは各斑の直径の変化率（％）を示したものである。標識斑Ａおよび標識斑Ｂの大きさは約５０％増大し、斑Ｃはほぼ同じ大きさに維持され、斑Ｄは４０％縮小した。スケールバー＝２０μｍ。
【図７】撮像領域における新しい斑の出現を示す。図７Ａは最初の撮像時に撮像した３つの斑のセットをボリュームレンダリングしたものである。図７Ｂは６４日後に撮像した同じ領域をボリュームレンダリングしたものであり、最初の斑に新しいチオフラビンＳ陽性斑が付随していることを示している。左下の線維状の自己蛍光は硬膜である。スケールバー＝５０μｍ。
【図８】実験典型例の簡単な模式図である。麻酔マウスを開頭器にのせ、これを多光子顕微鏡のステージに取り付ける。血管造影剤としてテキサスレッドで標識したデキストランを尾静脈より注射する。開頭し、チオフラビンＳを脳表面に塗布する。チオフラビンＳ洗浄後に撮像すると、微小血管の解剖学的構造およびアミロイド沈着が観察できる。
【図９】アミロイド血管障害および微小血管の解剖学的構造とを共起した例である。この図に示したような、半定量的評価基準（なし、軽度、中度、重度）を使用した。
【図１０】血管径の測定値を示す。開始点を無作為に設定し、以後、一連の全画像について３０μｍごとに血管の直径を測定した。各測定点について血管の直径およびアミロイドの有無を記録した。
【図１１】図１０に関する血管径の測定値を示す。軽度（ｎ＝１１）、中度（ｎ＝１０）、および重度（ｎ＝６）の血管に関して、アミロイド非含有血管とアミロイド含有血管とで有意な差が認められる。^＊＝ｐ ＜ ０．０１。
【図１２】血管の分岐点付近に生じた軽度のアミロイド血管障害の例である。距離を測定する方法が、ランダムな点の重ね合わせを用いて示され、これらの点から最も近い分岐点までの距離が測定される。
【図１３】最も近い分岐点からアミロイド沈着までの距離を示したグラフである。測定は図１２に関して説明した方法で行った。軽度（血管セグメント数ｎ＝７５、ｐ ＜ ０．００５）および中度（血管セグメント数ｎ＝７３、ｐ ＜ ０．００５）の血管両方において有意差がみられ、アミロイドが分岐点付近で生じる傾向が確認された。重度に罹患した血管（ｎ＝５９）では、統計的有意には達しなかったもののある程度の差がみられた。
【図１４】Ｔｇ２５７６マウスにおけるＴｈｉｏＳ陽性アミロイド血管障害を示す。１６ヵ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳を無傷のまま固定し、ＴｈｉｏＳ（０．００５％）で染色したうえで７５０ ｎｍの二光子励起を用いて撮像した。この画像は２０×対物レンズで撮像した４×８のｚ軸画像のモンタージュである。図の頂部が脳の正中線であり、かつ、脳の前極が左側を向いている。脳の側端の大きな湾曲がモンタージュ生成に干渉したため、画像の最下部にはひずみが生じている。中大脳動脈が図中右側の脳の側端後方から正中線に向かって走行している。ＴｈｉｏＳ陽性血管に関連したアミロイド、および表面付近の実質のＴｈｉｏＳ陽性斑が鮮明に画像化されている。表面細静脈は染色陰性のバックグラウンドプロフィールとして観察される。スケールバー（右上）＝６００μｍ。
【図１５】変異アミロイド前駆体タンパク質（「ＡＰＰ」）の過剰発現が、アミロイド沈着非依存的に平滑筋細胞を障害しないことを示す。ファロイジン標識した若齢（６ヵ月齢）Ｔｇ２５７６ラットの平滑筋細胞は血管周囲に整然と配置され、隣接する細胞間に間隙は認められない。図１５ＡはＴｇ−ラットの軟膜血管内の平滑筋細胞をファロイジンで染色したものである。図１５ＢはＴｇ＋ラットの軟膜血管内の平滑筋細胞である。スケールバー＝２０μｍ。
【図１６】１４ヵ月齢および２２ヵ月齢のＴｇ２５６７マウスにおいてアミロイド沈着が平滑筋細胞に及ぼす影響を示す。図１６Ａは１４ヵ月齢のＴｇ２５７６マウスの軟膜細動脈の血管壁の平滑筋細胞をファロイジン標識したものである。図１６Ｂは血管周囲のＴｈｉｏＳ陽性アミロイドを示したものである。アミロイド沈着領域では、同じ血管の非罹患領域と比較して平滑筋細胞が明らかに障害されている。アミロイドに囲まれた平滑筋細胞は、血管に沿った顕著な細胞欠損は呈していないものの、組織崩壊し、分離している。図１６Ｄは２４ヵ月齢のＴｇ２５７６マウスの平滑筋細胞を染色したものである。図１６Ｅは血管周囲のＴｈｉｏＳ陽性アミロイドである。この月齢では血管に沿った平滑筋細胞の欠損が顕著であり、残存細胞の崩壊も認められる。しかし、アミロイドに罹患していない血管領域では正常な平滑筋細胞の配列が維持されている（図１６Ｃおよび図１６Ｆを参照）。重ね合わせたカラー像はファロイジン染色およびＴｈｉｏＳ染色を示している。スケールバー＝２０μｍ。
【図１７】１４ヵ月齢および２４ヵ月齢のＴｇ２５６７マウスにおけるアミロイド沈着血管と非含有血管との平滑筋細胞密度を定量化した図である。平滑筋細胞の線密度を本明細書に記載の方法で測定した。両月齢群由来のアミロイド罹患血管と非罹患血管とにおける細胞密度を測定した。２４ヵ月齢のマウスのアミロイド沈着血管では、同じ動物のアミロイド非沈着血管、ならびに、より若齢のトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスのアミロイド非沈着血管のいずれと比較しても、平滑筋細胞密度が有意に低かった（ｐ ＜ ０．０１、ＡＮＯＶＡ）。
【図１８】ＡＣｈおよびＳＮＰに対する軟膜血管の反応を示す。１４ヵ月齢のＴｇ＋マウス（ｎ＝５匹中４匹、アウトライアー１匹を除外）およびＴｇ−マウス（ｎ＝３匹中３匹）について、ＡＣｈ（１０^−６Ｍ）およびＳＮＰ（０．５×１０^−６Ｍ）に応答した最大拡張率（％）を示した。バーは平均±ＳＤ、^＊はＡＮＯＶＡによるｐ ＜ ０．０５である。
【図１９】２０ヵ月齢のホモ接合ＰＤＡＰＰマウスにおけるアミロイドβ沈着をインビボ画像である。皮質表面直下から深さ約１５０ミクロンまでのＺ軸画像スタックを再構成した像であり、それぞれ、２０×対物レンズを使用して５ミクロン刻みで撮像した画像（図１９Ａ〜図１９Ｂ）、および６０×対物レンズを使用して２ミクロン刻みで撮像した画像（図１９Ｃ〜図１９Ｄ）である。フルオレセイン標識したモノクローナル抗体１０Ｄ５の希釈溶液によりアミロイドβが可視化されている（図１９Ａおよび図１９Ｃ）。最初の撮像セッションにより、代表的な一匹のマウスの神経網および関連する血管に１０Ｄ５免疫反応性のアミロイドβ斑が多数示されている（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。３日後にフルオレセイン１０Ｄ５を用いてまったく同じ部位を再撮像した。驚くべきことに神経網のアミロイドβはほとんど残存しておらず、以前存在していたアミロイドβ沈着の逆転が直接的に示唆された。血管関連性アミロイドβが顕著な変化を示さないことに留意されたい。図１９Ａおよび図１９Ｂでは倍率バー＝５０μｍ、図１９Ｃおよび図１９Ｄでは２５μｍ。
【図２０】最初の撮像セッションにおける１０Ｄ５を１６Ｂ５に変更することにより、アミロイドβの見かけ上の消失が抗アミロイドβ抗体の使用によるのか、または、外科的な調製、撮像、およびその他の非特異的な要因によるのかを確認した。１６Ｂ５はヒトのタウを標的とするがげっ歯類のタウとは交差反応しないモノクローナル抗体である（Ｓｏｂｅｙら、「酸化窒素ならびにカリウムチャネルのアゴニストおよび阻害物質が脳底動脈径に及ぼす影響（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ Ｂａｓｉｌａｒ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉａｍｅｔｅｒ）」、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７２：Ｈ２５６−Ｈ２６２ （１９９７）、参照として本明細書に組み入れられる）。撮像剤としてチオフラビンＳを使用した。図２０Ａおよび図２０Ｂはそれぞれ、最初の撮像時のチオフラビンＳ陽性斑、および１０Ｄ５塗布から３日後の像である。図２０Ｃにより、１６Ｂ５で処理したマウスのチオフラビンＳ陽性斑が３日後も変化しなかったことが示されている。（図２０Ｄ）。倍率バー＝２０μｍ。
【図２１】２０ヵ月齢のホモ接合ＰＤＡＰＰマウスの脳を直接標識抗体３Ｄ６を用いて撮像し、組織学的に分析した画像である。皮質および海馬体形成の間にアミロイドβが極めて高レベルに沈着していることが示されている。１０Ｄ５塗布部位ではアミロイドβ染色が顕著に減少していた。図２１Ａは、１０Ｄ５（ａａ ３−６）と比べて特徴的なエピトープ（ａａ １−５）を有する抗アミロイドβモノクローナル抗体であるビオチン化３Ｄ６を用いた免疫染色を示す。これにより、深さ１００ミクロン〜２００ミクロンの領域ではアミロイドβの拡散が本質的に存在しないことが示され、これは、隣接する切片またはこれより内側もしくは外側の部位に顕著な沈着がみられるのと対照的である。図２１Ｂは、１６Ｂ５塗布により最初に処理した後は、３Ｄ６免疫反応性のアミロイドβ斑に変化がみとめられなかったことを示している。倍率バー＝２００μｍ。
【図２２】小グリア細胞の活性化をビオチン標識トマトレクチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で評価したところ、１０Ｄ５群（図２２Ａ）および１６Ｂ５群（図２２Ｂ）の両方において頭蓋の調製および撮像から３日後に顕著な局所的小グリア細胞活性化が認められたことを示す図である。倍率バー＝２００μｍ。
【図２３】小グリア細胞と１０Ｄ５−フルオレセイン処理から３日後の残存アミロイドβとの間に密接な関係があることを示すために再構成された、薄い共焦点光学切片（０．２ミクロン）を示す。図２３Ａは、フルオレセイン標識トマトレクチン（小グリア細胞を検出）、およびＣｙ３アビジンで検出されたビオチン標識３Ｄ６（アミロイドβを検出）を示している。残存アミロイドβ斑の周囲で顕著な小グリア細胞の反応が観察された。図２３Ｂが示しているように、例えば側頭葉などの遠い部位では、小グリア細胞とアミロイドβとの関係ははるかに薄い。倍率バー＝２０μｍ。
【図２４】図２４Ａは、アルツハイマー病患者の死後脳組織由来の神経原線維錯綜およびリポフスチン小滴の自己蛍光を示す。図２４Ｂは、アルツハイマー病患者の死後脳組織由来の神経原線維錯綜の蛍光をタウタンパク質に対する抗体を用いて撮像したものであり、この図は、図２４Ａの蛍光がタウタンパク質に起因することを示唆している。

Claims (34)

1. 哺乳類において神経変性疾患を検出する方法であり、以下の段階を含む方法：
   脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光特性の放射に有効な条件下で放射線を照射することによって、哺乳類の脳組織を活性化させる段階；
   活性化段階を実行するために用いたのと同じ条件下で哺乳類の健常脳組織を励起することによって放射される標準的蛍光と、蛍光特性を比較する段階；ならびに
   蛍光特性が標準的蛍光と異なる部位の脳組織を、神経変性疾患を潜在的に有する部位として同定する段階。
2. 以下の段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
   活性化段階の前に、少なくとも１つの光活性薬剤を用いて脳組織を処理する段階。
3. 少なくとも１つの光活性薬剤を用いて脳組織を処理する段階の前に、標準的蛍光が決定される、請求項２記載の方法。
4. 光活性薬剤が、神経変性疾患またはその他の神経異常の病変部に結合する際に蛍光を発する、請求項２記載の方法。
5. 放射線がレーザーにより生成される、請求項１記載の方法。
6. 放射線がパルス化される、請求項１記載の方法。
7. 放射線がパルス幅約１０^−９秒から１０^−１５秒の間でパルス化される、請求項６記載の方法。
8. レーザーがモードロックレーザーである、請求項５記載の方法。
9. 脳組織に照射された放射線を収集する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
10. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびルー・ゲーリッグ病からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
11. 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１０記載の方法。
12. 哺乳類の脳内のアミロイド斑が検出される、請求項１１記載の方法。
13. 哺乳類の脳内の神経原線維錯綜が検出される、請求項１１記載の方法。
14. インビボで実施される、請求項１記載の方法。
15. 活性化段階が、哺乳類の頭蓋に放射線を通過させることにより実施される、請求項１記載の方法。
16. 放射線が、哺乳類の頭蓋の菲薄化した部分を通過する、請求項１５記載の方法。
17. 活性化段階が、頭蓋を開けた状態で哺乳類の脳に放射線を通過させることにより実施される、請求項１記載の方法。
18. 蛍光特性が自己蛍光特性である、請求項１記載の方法。
19. 哺乳類由来の脳組織の画像を作製する方法であり、以下の段階を含む方法：
    脳組織の多光子同時励起の促進および蛍光の生成に有効な条件下で放射線を照射することによって哺乳類の脳組織を活性化させる段階；ならびに
    蛍光を収集して脳組織の画像を作製する段階。
20. 以下の段階をさらに含む、請求項１９記載の方法。
    活性化段階の前に、少なくとも１つの光活性薬剤を用いて脳組織を処理する段階。
21. 放射線がレーザーにより生成される、請求項１９記載の方法。
22. 放射線がパルス化される、請求項１９記載の方法。
23. 放射線がパルス幅約１０^−９秒から１０^−１５秒の間でパルス化される、請求項２２記載の方法。
24. レーザーがモードロックレーザーである、請求項２１記載の方法。
25. 撮像される脳組織が神経変性疾患に罹患している、請求項１９記載の方法。
26. 神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、およびルー・ゲーリッグ病からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
27. 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項２６記載の方法。
28. 哺乳類の脳内のアミロイド斑が撮像される、請求項２７記載の方法。
29. 哺乳類の脳内の神経原線維錯綜が検出される、請求項２７記載の方法。
30. インビボで実施される、請求項１９記載の方法。
31. 活性化段階が、哺乳類の頭蓋に放射線を通過させることにより実施される、請求項１９記載の方法。
32. 放射線が、哺乳類の頭蓋の菲薄化した部分を通過する、請求項３１記載の方法。
33. 活性化段階が、頭蓋を開けた状態で哺乳類の脳に放射線を通過させることにより実施される、請求項１９記載の方法。
34. 蛍光が自己蛍光である、請求項１９記載の方法。

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