DE19919091C2 - Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge eines Kurzpulslasers in einem Mikroskop - Google Patents
Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge eines Kurzpulslasers in einem MikroskopInfo
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Description
Für die Anregung nichtlinearer Prozesse (Multiphotonen-Absorption, SHG, OBIC,
Zeitaufgelöster Fluoreszenznachweis, etc.) durch gepulste Laser in Präparaten ist
eine möglichst hohe Puls-Spitzenleistungen PPeak notwendig. Die
Pulsspitzenleistung Peak
(Intensität I) berechnet sich wie folgt:
Somit ist die Spitzenleistung um so höher desto kürzer die Pulslänge τ im Präparat
ist. Kurze Pulse besitzen jedoch je nach Pulslänge eine bestimmte spektrale
Breite Δλ. A und f bezeichnen jeweils die Repetitionsrate und die
Wechselwirkungsfläche mit dem Präparat. Pavg ist die mittlere Leistung der
Laserstrahlung.
Durch die Dispersion in optischen Komponenten werden die Pulse beim
Durchlaufen der optischen Medien (einschließlich Präparat) verbreitert. Zusätzlich
können nichtlineare Effekte wie SPM (Selbstphasenmodulation) auftreten, die sich auf das Spektrum und
damit wiederum auf die Pulslänge auswirken.
Es besteht also die Notwendigkeit die Pulslänge und die mittlere Leistung am Ort
der Laser-Wechselwirkung mit der Probe zu optimieren.
Kurze Pulse unterhalb von 1 ns können aufgrund ihrer Kürze nicht mehr direkt auf
elektronischem Wege vermessen werden. Man verwendet hierzu z. B.
Autokorrelatoren mit denen die Autokorrelationsfunktion der Pulse bestimmt
werden kann. Anschließend wird aus dieser Autokorrelationsfunktion auf die
Pulslänge geschlossen.
Diese Meßgeräte benötigen jedoch generell einen Parallelstrahl des zu
untersuchenden Laserlichtes. Sie sind also ungeeignet zur Bestimmung der
Pulslänge direkt nach einem hochaperturigen Objektiv. Sie sind prinzipiell
ungeeignet zur Bestimmung/Optimierung der Pulslänge in Abhängigkeit von der
Eindringtiefe in ein Präparat.
DE 296 09 850 U1 der Anmelderin beschreibt ein Mikroskop nach dem Oberbegriff
des Hauptanspruchs, mit einem Kurzpulslaser zur Anregung nichtlinearer
Prozesse in einer zu untersuchenden Probe sowie einer
Dispersionskompensationseinheit zwischen dem Laser und einer Lichtleitfaser,
die den Laserpulsen eine einstellbare Dispersion aufprägt und damit die Pulsbreite
am Probenort variiert.
In DE 197 02 753 A1 der Anmelderin wird in einem Laser-Scanning-Mikroskop die
Laserleistung über eine Monitordiode geregelt, um mittels des Verhältnisses aus
Detektorsignal und Diodensignal das Rauschen zu vermindern.
Ein Bezug zu Kurzpulslasern ist nicht beschrieben.
In DE 695 13 517 T2 wird ein Ramanspektrometer mit einer Probe und
Referenzprobe beschrieben, bei dem ein Standardspektrum über eine
Faltungsfunktion gebildet wird, um Systemschwankungen auszugleichen. Ein
Bezug zu Lasermikroskopen ist nicht beschrieben. Außerdem sollen Fuloreszenz-
Emissionsvorgänge im Gegensatz zur vorliegenden Anmeldung minimiert werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Pulsbreite und die mittlere Leistung
am Probenort dahingehend festzulegen, daß eine maximale
Wechselwirkung mit der Probe zustandekommt.
Mit Hilfe des vorgeschlagenen Verfahrens ist es möglich die Pulslänge am Ort der
Laser-Wechselwirkung mit der Probe zu vermessen und die Pulsspitzenleistung
zu optimieren. Hierzu wird die nichtlineare Wechselwirkung in Kombination mit
einer linearen Wechselwirkung in einem biologischen Präparat verwendet.
Die nichtlineare Wechselwirkung kann im Allgemeinen wie folgt beschrieben
werden:
C ist hierbei ein Proportionalitätsfaktor und n gibt die Ordnung der Nichtlinearität
an. Die Konstante C hängt ab von den Präparateigenschaften. Nichtlineare
Probenwechselwirkungen sind z. B. die Zwei-Photonen-Mikroskopie (n = 2), die
Erzeugung der zweiten Harmonischen (n = 2), die Drei-Photonen-Absorption (n = 3),
etc.
Eine lineare Probenwechselwirkung ist i. A. gegeben durch:
SL = C1 . Pavg (3)
C1 ist hierbei wiederum ein Proportionalitätsfaktor, der auch hier von den
Probeneigenschaften abhängt. Eine lineare Wechselwirkung ist z. B. jede
Reflexion am Präparat, die Anregung einer Ein-Photonen-Fluoreszenz oder aber
die Messung der mittleren Leistung mit einem Leistungsmeßgerät.
Wenn man beide Prozesse (linear/nichtlinear) gleichzeitig mißt und das Verhältnis
zwischen beiden Signalen bestimmt, dann ergibt sich beispielsweise für eine Zwei-
Photonenabsorption folgender Zusammenhang:
wobei f und A unabhängig von der Pulslänge sind.
Die Proportionalitätskonstanten (C, C1) sind im Normalfall ebenfalls unabhängig
von der Pulslänge. Das Verhältnis R von nichtlinearem und linearem Signal ist im
Zwei-Photonenfall umgekehrt proportional zur Pulslänge und unabhängig von der
mittleren Leistung. Die Konstante (Const) hängt vom verwendeten Präparat und
von der Detektionseinrichtung ab.
Die technische Umsetzung soll hier beispielhaft anhand der Zweiphotonen-
Absorption erläutert werden.
Fig. 1: Technische Umsetzung in einem LSM
Zur technischen Umsetzung ist es notwendig zwei Detektoren D1 und D2 (Fig. 1)
so anzuordnen, daß die Reflexion/mittlere Leistung und die Zwei-Photonen-
Fluoreszenz simultan (sequentiell) registriert wird. Anschließend wird im Rechner
das Verhältnis R berechnet und grafisch dargestellt.
Anordnung 1a in Fig. 1 zeigt einen Aufbau bei der als lineares Signal in D2 die
Reflexion der von einem Laser L beleuchteten Probe P über ein Objektiv O und
Hauptfarbteiler HFT und Nebenfarbteiler NFT detektiert wird.
Dieses Reflexionssignal wird mit geeigneten Dichroiten NFT von der
Fluoreszenzstrahlung abgetrennt, die über einen Kurzpaßfilter KP auf D1 gelangt.
Anordnung 1b zeigt einen Aufbau bei dem eine Monitordiode MD als D2 die
mittlere Leistung der Laserstrahlung detektiert.
Die Monitordiode wird mit einer festen Ausspiegelung des Laserlichtes gespeist.
Diese Anordnung ist die bevorzugte, da hier das Reflexionssignal unabhängig von
den Reflexionseigenschaften des Präparates ist.
Als Hauptfarbteiler HFT dient in beiden Anordnungen ein Kurzpaßfilter. Er
reflektiert Licht im NIR-Wellenlängenbereich und transmittiert Licht im VIS-UV-
Bereich.
Fig. 2 zeigt das Verhältnis R als Funktion der Pulslänge.
Bei der minimalen Pulslänge, d. h. bei max Pulsspitzenleistung am Ort der Probe
ergibt sich entsprechend Gleichung (4) ein Maximum. Somit kann eine
Optimierung der Pulslänge durch das Einstellen einer Prechirp-Einheit erfolgen.
Eine derartige einstellbare Prechirp-Einheit wird in DE 296 09 850 U1 beschrieben.
Besonders vorteilhaft ist, daß die Messung der Kenngröße/Verhältnis R in erster
Näherung unabhängig von der mittleren Leistung (d. h. Koppeleffizienz in eine
Glasfaser, Änderung der mittleren Ausgangsleistung beim Optimieren des Lasers,
etc.) ist. Die Kenngröße hängt ausschließlich nur von der Pulslänge ab.
Wird jedoch die mittlere Leistung weiter erhöht, so können in den verwendeten
Optiken (in der Faser bei einer Faserkopplung) nichtlineare Prozesse (wie
Selbstphasenmodulation) angeregt werden. Hierdurch ändert sich die spektrale
Bandbreite der (ultra)-kurzen Laserpulse, und damit die Pulslänge, wodurch sich
die Pulsspitzenleistung verringert. Diese Effekte sind zu vermeiden, d. h. die
mittlere Leistung zu begrenzen.
Zum Aufsuchen des Schwellwertes für die mittlere Leistung kann oben
beschriebenes Verfahren ebenfalls eingesetzt werden.
Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von der mittleren Leistung bei
unveränderter Einstellung der Prechirpeinheit (Pulslänge wird nicht über die
Prechirpeinheit variiert). Die oben erwähnte Änderung der Pulslänge aufgrund der
nichtlinearen Effekte in den verwendeten Optiken äußert sich im Diagramm durch
ein Abknicken des laut Gl. 4 als konstant erwarteten Verhältnisses.
Fig. 4 zeigt eine Gesamtanordnung aus Kurzpulslaser KPL, Prechirpeinheit PCE,
Lichtleitfaser F und Mikroskop MI, vorzugsweise Laser-Scanning-Mikroskop
LSM.
Claims (4)
1. Mikroskop,
- - mit einem Kurzpulslaser zur Anregung nichtlinearer Prozesse in einer zu untersuchenden Probe,
- - mit einer Dispersionskompensationseinheit, die den Laserpulsen eine einstellbare Dispersion aufprägt und damit die Pulsbreite am Probenort variiert,
- - dass ein erster Detektor (D1) zur Registrierung des Signals eines der nichtlinearen Prozesse
- - und ein zweiter Detektor (D2) zur Registrierung des Signals eines in der
- - Probe (P) ablaufenden, linearen Prozesses oder der mittleren Laserleistung vorgesehen ist,
- - dass eine das Verhältnis der beiden Detektorsignale bildende Recheneinheit vorgesehen ist
- - und dass die Dispersionskompensationseinheit (CE) die Pulsbreite variiert, bis das Verhältnis maximal ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass die
mittlere Laserleistung veränderbar ist, um
einen Schwellwert für die mittlere Laserleistung zu ermitteln, unterhalb dem
nichtlineare optische Effekte in den der Dispersionskomensationseinheit (CE)
nachgeschalten optischen Komponenten vernachlässigbar sind.
3. Mikroskop nach Anspruch 1,
dadurch gekennnzeichnet, dass die Pulsbreite am Probenort (P) aus dem
Verhältnis der beiden Detektorsignale ermittelbar ist.
4. Mikroskop nach Anspruch 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (MI) als
Laserscanningmikroskop ausgebildet ist.
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