DE10206980A1

DE10206980A1 - Mikroskop, Detektor und Verfahren zur Mikroskopie

Info

Publication number: DE10206980A1
Application number: DE10206980A
Authority: DE
Inventors: Kyra Moellmann
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2003-08-21
Also published as: US6952006B2; US20030155482A1

Abstract

Ein Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Lichtpulse zur Beleuchtung einer Probe emittiert, wobei die Lichtpulse Photonen mit einer Photonenenergie beinhalten, ist offenbart. Das Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite der Lichtpulse vorgesehen ist, der einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie ist. Ferner ist ein Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite von Lichtpulsen zur Beleuchtung einer mikroskopischen Probe und ein Verfahren zur Mikroskopie beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Lichtpulse zur Beleuchtung einer Probe emittiert, wobei die Lichtpulse Photonen mit einer Photonenenergie beinhalten.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite von Lichtpulsen zur Beleuchtung einer mikroskopischen Probe.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Mikroskopie.

Zur Untersuchung von biologischen Proben ist es seit langem üblich, die Probe mit optischen Markern, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen zu präparieren. Oft werden, beispielsweise im Bereich der Genuntersuchungen, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in die Probe eingebracht, die sich spezifisch an bestimmten Probenbestandteilen anlagern. Aus den Fluoreszenzeigenschaften der präparierten Probe können beispielsweise Rückschlüsse auf die Beschaffenheit, die Zusammensetzung der Probe oder auf Konzentrationen bestimmter Stoffe innerhalb der Probe gezogen werden.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahles zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt. Kommerzielle Scanmikroskope bestehen meist aus einem Scanmodul, das an das Stativ eines klassischen Lichtmikroskops angeflanscht wird, wobei das Scanmodul alle genannten zur Abrasterung einer Probe zusätzlich nötigen Elemente beinhaltet.

In der konfokalen Scanmikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung (oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte und damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.

Viele Fluoreszenzfarbstoffe sind nur mit ultraviolettem Beleuchtungslicht anregbar. Die Verwendung von ultraviolettem Beleuchtungslicht hat insbesondere für lebende Proben den Nachteil einer sehr viel stärkeren Probenschädigung. Außerdem müssen alle optischen Bauteile für ultraviolettes Licht und für das Fluoreszenzlicht, das auf Grund der Stokesshift eine höhere Wellenlänge aufweist, transparent sein und dürfen durch die Beleuchtung mit ultraviolettem Licht nicht beschädigt werden. Insbesondere bei verkitteten optischen Bauteilen, wie Linsengruppen in einem Mikroskopobjektiv, tritt durch Beleuchtung mit ultraviolettem Licht eine irreversible Schädigung des Kitts und der Linsen auf. Ein weiterer Nachteil der Beleuchtung mit ultraviolettem Licht liegt in der geringeren Eindringtiefe in biologische Proben begründet. Die Nachteile lassen sich durch Zwei- oder Mehrphotonenanregung vermeiden. In der Mehrphotonen-Scanmikroskopie werden die Fluoreszenzphotonen detektiert, die auf einen Zwei- oder Mehrphotonenanregungsprozess zurückzuführen sind. Die Wahrscheinlichkeit eines Zwei-Photonenüberganges ist vom Quadrat der Anregungslichtleistung abhängig. Um hohe Lichtleistungen zu erzielen, ist es daher zweckmäßig, das Beleuchtungslicht zu pulsen, um hohe Pulsspitzenleistungen zu erreichen. Diese Technik ist bekannt und beispielsweise in der amerikanischen Patenschrift US 5,034,613 "Two-photon laser microscopy" und in der deutschen Offenlegungsschrift DE 44 14 940 offenbart. Ein weiterer Vorteil der Mehrphotonenanregung insbesondere in der konfokalen Scanmikroskopie liegt im verbesserten Bleichverhalten; da die Probe nur im Bereich ausreichender Leistungsdichte, also im Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles, ausbleicht. Außerhalb dieses Bereichs findet im Gegensatz zur Ein-Photonen-Anregung nahezu kein Bleichen statt.

In einem Mikroskop mit Mehrphotonenanregung der Probe wird als Lichtquelle meist ein modengekoppelter Laser verwendet, der einen Pulszug mit ultrakurzen Pulsen emittiert, wobei die Pulse zeitliche Pulsbreiten im Bereich weniger Pikosekunden oder weniger Femtosekunden aufweisen. Die Repetitionsrate der Pulse beträgt typischerweise 80 MHz. Die zeitliche Pulsbreite ist auch mit den schnellsten Photodioden derzeit nicht direkt messbar. Zur Bestimmung der zeitlichen Pulsbreiten werden indirekte Messmethoden und aufwendige Autokorrelatoren, die teuer und meistens nur für einen beschränkten Wellenlängenbereich verwendbar sind, eingesetzt. Lediglich der Pulszug selbst, also die Abfolge der Pulse, ist mit schnellen Detektoren detektierbar.

Eine parasitäre Messung der zeitlichen Pulsbreiten des Anregungslichtes während der mikroskopischen Untersuchung einer Probe ist wichtig; denn es kann sein, dass die Pulsbreiten der Pulse, die von dem Laser emittiert werden, stark schwanken, was sich auf die nichtlinearen Effekte, die ja in der Probe gewollt angeregt werden (2-Photonenabsorption, Erzeugung der 2. Harmonischen usw.), direkt auswirkt und so zu Fehlinformationen im Bild führen kann. Eine solche parasitäre Überwachung mit einem Autokorrelator ist sehr aufwendig und umständlich.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift DE 199 19 091 A1 ist eine Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge in einem Mikroskop bekannt, wobei durch Einstrahlung mittels eines Kurzpulslasers eine Probe zu nichtlinearer Fluoreszenz, vorzugsweise Zweiphotonenfluoreszenz angeregt wird und wobei das nichtlineare Fluoreszenzsignal sowie ein Reflektionssignal und/oder ein der Laserleistung entsprechendes Referenzsignal detektiert werden und das Verhältnis von Fluoreszenzsignal und Reflektionssignal und/oder Referenzsignal als Regelsignal zur Einstellung dient.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Mikroskop anzugeben, das einfach und kostengünstig herstellbar ist und das eine unkomplizierte und zuverlässige Ermittlung der zeitlichen Pulsbreite der eine Probe beleuchtenden Lichtpulse auch während der Untersuchung der Probe erlaubt.

Die Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite der Lichtpulse vorgesehen ist, der einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie des Laserlichtes ist.

Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, einen Detektor anzugeben der einfach und kostengünstig herstellbar ist und der eine unkomplizierte und zuverlässige Ermittlung der zeitlichen Pulsbreite der eine Probe beleuchtenden Lichtpulse auch während der mikroskopischen Untersuchung der Probe erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch einen Detektor gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Detektor einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie des Laserlichtes ist.

Der Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzuschlagen, das eine optimierte Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht.

Obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:

- Erzeugen von Lichtpulsen zur Beleuchtung einer Probe mit einer Lichtquelle, wobei die Lichtpulse Photonen mit einer Photonenenergie beinhalten
- Ermitteln einer zeitlichen Pulsbreite der Lichtpulse mit einem Detektor, der einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie ist.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass auf einfache und zuverlässige Weise eine Ermittlung der zeitlichen Pulsbreite der eine Probe beleuchtenden Lichtpulse ermöglicht ist. Die Ermittlung erfolgt vorzugsweise parasitär während der Untersuchung der Probe, so dass auch ein manuelles oder automatisches Optimieren der Pulsbreite der Lichtpulse des Beleuchtungslichtes einfach realisierbar ist. Hierzu ist vorzugsweise ein Regelkreis vorgesehen, der die Pulsbreite auf maximale Ausbeute an Fluoreszenzlicht optimiert.

In einer bevorzugen Ausgestaltung umfasst der Detektor einen Halbleiterdetektor mit einem Valenzband und einem Leitungsband, wobei der Energieabstand der energetische Abstand von Valenzband und Leitungsband ist. Durch einen Einphotonenübergang kann bei einem solchen Halbleiterdetektor kein Übergang vom Valenzband ins Leitungsband erfolgen.

Ein Übergang kann im Wesentlichen nur durch Mehrphotonenprozesse erfolgen. Da die Leistungsdichte bei ungepulstem Licht und bei in der Mikroskopie üblichen mittleren Beleuchtungs-Lichtleistungen im Bereich von Mikrowatt bis zu einigen Milliwatt sehr klein ist, wechselwirken die meisten Photonen nicht mit dem Detektor, so dass der Detektor für ungepulstes Licht nahezu unempfindlich ist. Je kürzer die Lichtpulse sind, umso höher ist die Leistungsdichte bei gleicher mittlerer Leistung und umso höher ist die Wahrscheinlichkeit eines Zwei- oder Mehrphotonenüberganges vom Valenzband ins Leitungsband, bei dem bekanntlich zwei oder mehr Photonen nahezu zur gleichen Zeit an nahezu demselben Ort eintreffen müssen. Die Amplitude des vom Detektor erzeugten elektrischen Signals ist folglich ein Maß für die zeitliche Pulsbreite.

Der Halbleiterdetektor ist vorzugsweise einen GaAsP-Photodiode (Beispielsweise: Hamamatsu G1117). Diese speziellen Photodioden sind im Bereich von 300-680 nm empfindlich, d. h. sie können nur in dem spektralen Bereich detektieren. In 2-Photonen-Laserscanmikroskopen werden typischerweise Titan:Saphir-Laser (TiSa-Laser) eingesetzt, die im Bereich von ca. 700-1000 nm Laserstrahlung emittieren. Denkbar ist auch der Einsatz von Nd:YAG-Lasern bei 1064 nm, oder andere modengekoppelte Laser. Wichtig ist, dass die Laserstrahlung selbst nicht von den Photodioden über einen Einphotoneneffekt detektiert werden kann. Die kurzen Lichtpulse sind jedoch wie oben beschrieben detektierbar; ein 2-Photonen-Effekt, hervorgerufen von einem TiSa-Laser bei 800 nm erwirkt dasselbe, wie die Einstrahlung einer 400-nm-Strahlung auf den Detektor, und diese Wellenlänge liegt genau im spektral empfindlichen Bereich des Detektors. Da es sich um einen Zweiphotonen-Effekt handelt, also ein nichtlinearer Effekt, ist das Detektionssignal bei gleicher mittlerer Lichtleistung umso größer, je kürzer die Pulse des Lasers sind, bzw. je höher die Pulsspitzenleistung, die von der zeitlichen Pulsbreite abhängt, ist. Die meisten kommerziell erhältlichen Photodioden sind empfindlich genug, um mit einem geringen Teil des Emissionslichtes der Lichtquelle auszukommen. Vorzugsweise kann der spektral empfindliche Bereich der Diode so gewählt werden, dass die Laserstrahlung nur 2-Photonen-Effekte aber keine 3-Photonen-Effekte erzeugt.

Geeignete Halbleiterdetektormaterialen sind beispielsweise: GaAsP, AlGaAs, InGaAs, Ge, Si, GaAs. GaAsP-Photodioden sind ganz besonders zur Detektion bei Lichtpulsen im Wellenlängenbereich von ca. 700-1300 nm einsetzbar. Andere Halbleiterdetektoren, die einen anderen Energieabstand zwischen Valenzband und Leitungsband aufweisen, decken andere Wellenlängenbereiche ab.

In einer anderen bevorzugten Ausführung umfasst der Detektor einen Photomultiplier mit einer photoaktiven Fläche, wobei der Energieabstand die lonisierungsenergie der photoaktiven Fläche ist.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist der Energieabstand kleiner als das Doppelte der Photonenenergie, so dass in dieser Ausgestaltung im Wesentlichen Zweiphotonenübergänge detektierbar sind.

Um eine absolute quantitative Messung der zeitlichen Pulsbreite zu erreichen, ist eine Kalibrierung des Detektors erforderlich. Da zeitliche Schwankungen der mittleren Lichtleistung P_ave des von der Lichtquelle ausgehenden Lichtes unvermeidbar sind, ist in einer ganz besonders bevorzugten Ausführung ein weiterer Detektor zur Ermittlung der mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes vorgesehen, der einen weiteren Energieabstand aufweist, der kleiner als die Photonenenergie ist. Der weitere Detektor ist durch Einphotonenübergänge aktivierbar. Vorzugsweise ist das von ihm erzeugte elektrische Signal Save proportional zur mittleren Leistung P_ave des Lichtes. Die Schwankungen können bei Kenntnis von S_ave und S_puls, dem elektrischen Signal des Detektors zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite, rechnerisch berücksichtigt werden. Es gilt:

wobei P_peak die Pulsspitzenleistung, Δτ die zeitliche Pulsbreite und f die Pulsfolgefrequenz ist.

Je kleiner also die zeitliche Pulsbreite Δτ ist, desto größer ist das Verhältnis, wobei Schwankungen in der mittleren Leistung schon berücksichtigt sind.

Es stehen einem mit der Kombination aus zwei Detektoren zwei Kontrollparameter, die sich auf die Bildqualität in einem Mikroskop auswirken können, zur Verfügung, nämlich die Veränderung der mittleren Leistung und die Variation der Pulsbreite. Die Kenntnis über die Veränderung der Parameter während der Bildaufnahme ist wichtig bei der Beurteilung der Bildqualität. Die Anordnung kann in Descan- und in Nondescan-Anordnung eingesetzt werden. In der NDD-Anordnung bietet sich die Möglichkeit, Aussagen über eine relative Pulsverbreiterung, hervorgerufen z. B. durch die Probe, zu machen.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist ein Strahlteiler vorgesehen, der dem Detektor und ggf. dem weiteren Detektor einen Teil des von der Lichtquelle emittierten Lichtes zuführt. Der Strahlteiler ist vorzugsweise unmittelbar nach der Lichtquelle angeordnet.

In einer anderen Ausführungsform ist der Detektor nach der Probe angeordnet. Diese Ausführungsform ist besonders dazu geeignet Aussagen über das Dispersionsverhalten des Mikroskops und der Probe zu machen.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Mikroskop ein Scanmikroskop, insbesondere ein konfokales Scanmikroskop.

Der Detektor ist In einer bevorzugen Ausgestaltung modular ausgeführt und in den Strahlengang eines Mikroskops einbringbar. Diese Ausgestaltung ist insbesondere zur Nachrüstung bereits installierter Systeme geeignet. Vorzugsweise sind zur exakten Positionierung Führungs- und Anschlagelemente vorgesehen. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist ein Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite von Lichtpulsen zusammen mit einem weiteren Detektor zur Ermittlung der mittleren Lichtleistung in einem Modul zusammen gefasst. Zur Verwertung und Auswertung der von den Detektoren erzeugten elektrischen Signalen ist vorzugsweise ein PC vorgesehen.

In einer bevorzugen Ausgestaltung beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt des Ermittelns der mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes mit einem weiterer Detektor, der einen weiteren Energieabstand aufweist, der kleiner als die Photonenenergie ist, und den weiteren Schritt des Korrigierens der ermittelten Pulsbreite der Lichtpulse anhand der ermittelten mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes.

In einer besonders bevorzugten Ausführung ist der weitere Schritt des Optimierens der zeitlichen Pulsbreite der von der Lichtquelle emittierten Lichtpulse anhand der gemessenen zeitlichen Pulsbreite vorgesehen.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein erfindungsgemäßes Mikroskop und
Fig. 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop.
Fig. 1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Mikroskop, das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Das Mikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1, die als modenverkoppelter Titan-Saphir-Laser 3 ausgeführt ist. Das von dem Titan-Saphir-Laser 3 emittierte Licht 5, das eine Wellenlänge von 780 nm aufweist, beinhaltet Lichtpulse mit einer Repetitionsrate von 80 MHz. Die Dauer der Lichtimpulse beträgt ca. 1 ps. Das Licht 5 wird nach dem Passieren einer Anregungsblende 27 von einem Hauptstrahlteiler 7 einer Strahlablenkeinrichtung 9, die einen kardanisch aufgehängten Spiegel 11 beinhaltet, reflektiert und von der Strahlablenkeinrichtung 9 durch die Scanoptik 13, die Tubusoptik 15 und das Objektiv 17 über bzw. durch die Probe 19 geführt. Das von der Probe 19 ausgehende Detektionslicht 21 gelangt auf demselben Lichtweg über die Strahlablenkeinrichtung 9 zurück zum Hauptstrahlteiler 7, passiert diesen trifft nach Passieren der Detektionsblende 23 auf den Photomultiplier 25. In der Zeichung ist das Licht 5 zur Beleuchtung der Probe 19 mit einer durchgezogenen Linie dargestellt, während das von der Probe 19 ausgehende Detektionslicht 21 gestrichelt dargestellt ist.
Zwischen der Lichtquelle 1 und dem Hauptstrahlteiler 7 ist ein Strahlteiler 29 im Strahlengang des Lichtes 5 angeordnet, der einen Teillichtstrahl 31 von ca. 5% des Lichtes 5 zu einem weiteren Strahlteiler 33 reflektiert. Der weitere Strahlteiler 33 leitet den Teillichtstrahl 31, nochmals zu gleichen Teilen aufgespalten, zum Einen einem Detektor 35 zur Ermittlung der zeitlichen Pulsbreite und zum Anderen einem weiteren Detektor 37 zur Ermittlung der mittleren Lichtleistung zu. Der Detektor 35 ist als Halbleiterdetektor 39, nämlich als GaAsP-Photodiode ausgeführt und laut den Herstellerangaben für Licht im Wellenlängenbereich von 300-680 nm empfindlich. Der Detektor 35 erzeugt elektrische Signale, die zum Quadrat der Spitzenleistung der Lichtpulse proportional sind. Der weitere Detektor 37 ist als Photodiode 41 ausgeführt und erzeugt elektrische Signale die zur mittleren Leistung des Lichtes 5 proportional sind. Die elektrischen Signale werden einer Kontrolleinheit 43 zur Auswertung zugeführt, die als PC 45 ausgestaltet ist. Die ermittelte zeitliche Pulsbreite wird dem Benutzer angezeigt.
Fig. 2 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop mit Non-Descan- Detektion. Bei diesem Mikroskop wird auch das kondensorseitig von der Probe ausgehende weitere Detektionslicht 47, bei dem es sich um Fluoreszenzlicht handelt, detektiert, in dem es mit einem Kondensor 49 zu einem Strahl gebündelt und einem weiteren Photomultiplier 51 zugeführt wird.
Der Detektor 35 zur Ermittlung der zeitlichen Pulsbreite des durch die Probe gelaufenen Lichtes 5 und der weitere Detektor 37 zur Ermittlung der mittleren Lichtleistung sind als Modul 53 ausgeführt. Zwischen dem Kondensor 49 und dem Modul 53 ist ein dichroitischer Strahlteiler 55 angeordnet, der das Fluoreszenzlicht dem weiteren Photomultiplier 51 zuführt und das Licht 5, das als Anregungslicht eine andere Wellenlänge als das Fluoreszenzlicht aufweist zu dem Modul passieren lässt. Innerhalb des Moduls befindet sich eine Kontrolleinheit 43 zur Auswertung der von dem Detektor 35 und dem weiteren Detektor 37 erzeugten Signale.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Bezugszeichenliste 1 Lichtquelle
3 Titan-Saphir-Laser
5 Licht
7 Hauptstrahlteiler
9 Strahlablenkeinrichtung
11 kardanisch aufgehängter Spiegel
13 Scanoptik
15 Tubusoptik
17 Objektiv
19 Probe
21 Detektionslicht
23 Detektionsblende
25 Photomultiplier
27 Anregungsblende
29 Strahlteiler
31 Teillichtstrahl
33 weiterer Strahlteiler
35 Detektor
37 weiterer Detektor
39 Halbleiterdetektor
41 Photodiode
43 Kontrolleinheit
45 PC
47 weiteres Detektionslicht
49 Kondensor
51 Photomultiplier
53 Modul
55 dichroitischer Strahlteiler

Claims

1. Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Lichtpulse zur Beleuchtung einer Probe emittiert, wobei die Lichtpulse Photonen mit einer Photonenenergie beinhalten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite der Lichtpulse vorgesehen ist, der einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie ist.

2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Übergang von dem Ruhezustand in den aktiven Zustand einen Mehrphotonenprozess beinhaltet.

3. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Halbleiterdetektor mit einem Valenzband und einem Leitungsband umfasst, wobei der Energieabstand der energetische Abstand von Valenzband und Leitungsband ist.

4. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Photomultiplier mit einer photoaktiven Fläche umfasst, wobei der Energieabstand die lonisierungsenergie der photoaktiven Fläche ist.

5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Energieabstand kleiner als das Doppelte der Photonenenergie ist.

6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Detektor zur Ermittlung der mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes vorgesehen ist, der einen weiteren Energieabstand aufweist, der kleiner als die Photonenenergie ist.

7. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Strahlteiler vorgesehen ist, der dem Detektor einen Teil des von der Lichtquelle emittierten Lichtes zuführt.

8. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor nach der Probe angeordnet ist.

9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Scanmikroskop ist.

10. Detektor zur Ermittlung einer zeitlichen Pulsbreite von Lichtpulsen zur Beleuchtung einer mikroskopischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie ist.

11. Detektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Übergang von dem Ruhezustand in den aktiven Zustand einen Mehrphotonenprozess beinhaltet.

12. Detektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Halbleiterdetektor mit einem Valenzband und einem Leitungsband umfasst, wobei der Energieabstand der energetische Abstand von Valenzband und Leitungsband ist.

13. Detektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Photomultiplier mit einer photoaktiven Fläche umfasst, wobei der Energieabstand die lonisierungsenergie der photoaktiven Fläche ist.

14. Detektor nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Energieabstand kleiner als das Doppelte der Photonenenergie ist.

15. Detektor nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen weiteren Detektor zur Ermittlung der mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes umfasst, der einen weiteren Energieabstand aufweist, der kleiner als die Photonenenergie ist.

16. Verfahren zur Mikroskopie gekennzeichnet durch folgend Schritte:

- Erzeugen von Lichtpulsen zur Beleuchtung einer Probe mit einer Lichtquelle, wobei die Lichtpulse Photonen mit einer Photonenenergie beinhalten,

- Ermitteln einer zeitlichen Pulsbreite der Lichtpulse mit einem Detektor, der einen Energieabstand zwischen einem Ruhezustand und einem aktiven Zustand aufweist, der größer als die Photonenenergie ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Übergang von dem Ruhezustand in den aktiven Zustand einen Mehrphotonenprozess beinhaltet.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Halbleiterdetektor mit einem Valenzband und einem Leitungsband umfasst, wobei der Energieabstand der energetische Abstand von Valenzband und Leitungsband ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Photomultiplier mit einer photoaktiven Fläche umfasst, wobei der Energieabstand die lonisierungsenergie der photoaktiven Fläche ist.

20. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt:

- Ermitteln der mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes mit einem weiteren Detektor, der einen weiteren Energieabstand aufweist, der kleiner als die Photonenenergie ist, und

- Korrigieren der ermittelten Pulsbreite der Lichtpulse anhand der ermittelten mittleren Leistung des von der Lichtquelle emittierten Lichtes.

21. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt:

- Optimieren der zeitlichen Pulsbreite der von der Lichtquelle emittierten Lichtpulse anhand der gemessenen zeitlichen Pulsbreite.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, gekennzeichnet durch die Verwendung mit einem Scanmikroskop.