JP2000347229A - 顕微鏡における短パルスレーザーのレーザー出力および／またはパルス幅調整のための配置 - Google Patents

顕微鏡における短パルスレーザーのレーザー出力および／またはパルス幅調整のための配置

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Abstract

(57)【要約】 【課題】顕微鏡における短パルスレーザーのレーザー出
力および／またはパルス幅調整のための配置 【解決手段】短パルスレーザーを介する入射によって試
料を励起し非線形蛍光、特に２光子蛍光を発生させる、
顕微鏡のレーザー出力および／またはパルス幅を調整す
るための配置であって：前記非線形蛍光信号ならびに反
射信号および／またはレーザー出力に相当する参照信号
が検出され、蛍光信号と反射信号および／または参照信
号との比が調整のための標準信号として使用される配
置。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】パルスレーザーによって標本
内に非線形過程（多光子吸収、SHG、OBIC、時間高分解
能蛍光証明等）を励起するには、できるだけ大きいパル
スピーク出力Ｐpe akが必要である。パルスピーク出力
（強度I）は、次のように計算される。 Ｐpeak ＝ ＰＡｖｇ／（τ・ｆ・Ａ） （１）
【０００２】従って、ピーク出力を大きくするには、そ
れだけパルス幅τが標本のところで短くなければならな
い。しかし、短いパルスはパルス幅に応じてある決まっ
たスペクトル幅Δλを持つ。Ａとｆはそれぞれ繰り返し
率と対標本相互作用面積［sic］である。ＰＡｖｇはレ
ーザー放射の平均出力である。波長成分の分散によっ
て、パルスは光学媒質（標本を含む）通過時に広くな
る。加えて、SPMのような非線形効果が現れ、スペクト
ルに、従ってまたパルス幅に作用する。このため、パル
ス幅と平均出力を対試料レーザー相互作用の位置で最適
にする必要がある。
【０００３】
【従来の技術】１ns未満の短パルスは、その短さのため
に直接電気的な方法では測定できない。このため、例え
ば自己相関器を用いてパルスの自己相関関数を決定す
る。続いて、この自己相関関数からパルス幅を推定す
る。しかしこれらの測定器では、一般に、求めるレーザ
ー光が平行光線であることが必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このため、大口径対物
レンズを用いたときに直接パルス幅を決定するのには適
合できない。原則として、標本内へ進入する深さに依存
するパルス幅の決定・最適化には適合していない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】請求項記載の手順を介し
て、対試料レーザー相互作用の位置におけるパルス幅を
測定し、パルスピーク出力を最適化することができる。
このため、非線形相互作用と線形相互作用とを組み合わ
せ、生物標本に適用する。
【０００６】非線形相互作用は一般に次のように書くこ
とができる。 ＳＮＬ ＝ Ｃ・Ｐn peak ＝ Ｃ・Pn Ａｖｇ／（τ・ｆ・Ａ）ｎ （２） ここで、Ｃは比例係数であり、ｎは非線形の次数を示
す。定数Ｃは標本の特性に依存する。非線形の試料相互
作用は、例えば２光子顕微鏡法（ｎ＝２）、第２高調波
の発生（ｎ＝２）、３光子吸収（ｎ＝３）等である。
【０００７】線形の試料相互作用は一般に次式によって
与えられる。 ＳＬ ＝ Ｃ１・ＰＡｖｇ （ ３） ここで、Ｃ１は比例係数であり、ここでも試料特性に依
存する。線形相互作用には、例えば標本からの反射、１
光子蛍光による励起または出力測定装置による平均出力
の測定がある。２つの過程（線形・非線形）で同時に測
定し、両信号の比 Ｒ ＝ ＳＮＬ／ＳＬ ｎ （３ .１） を決定すると、
【０００８】例えば２光子吸収については次の関係とな
る。 式（２）／式（３） Ｒ ＝ ＳＮＬ／ＳＬ ２ ＝ Ｃ／（Ｃ１ ２・ｆ２・Ａ２）・１／τ２ ＝ Co nst・１／τ２ （４） ここで、ｆおよびＡはパルス幅に依存しない。比例係数
（Ｃ，Ｃ１）は通常は同様にパルス幅に依存しない。非
線形・線形信号の比Ｒは、２光子の場合パルス幅に反比
例し、平均出力に依存しない。定数（Const）は使用し
ている標本と検出装置に依存する。
【０００９】
【発明の実態の形態】本発明をここで模範例として２光
子吸収に基づき説明する。実施例として、２基の検出器
Ｄ１およびＤ２（図１）を配置し、反射・平均出力およ
び２光子蛍光を同時に（順次）記録するようにすること
が必要である。続いて計算機で比Ｒを計算し、グラフ表
示する。
【００１０】図１の配置１ａは、検出器Ｄ２における線
形信号として、レーザーＬによって照明されている試料
Ｐの反射が対物レンズＯおよび、主カラースプリッター
HFTおよび副カラースプリッターNFTを通じて検出される
構成を示す。この反射信号から、適合したダイクロイッ
クミラーNFTを用いて蛍光放射が分離され、短波透過フ
ィルターKPを通じてＤ１に到達する。
【００１１】配置１ｂは、検出器として用いたモニター
ダイオードMDのところでレーザー放射の平均出力を検出
する構成を示す。このモニターダイオードは、一定割合
でビーム分割されたレーザー光を供給される。この配置
が望ましいというのは、こうすれば反射信号が標本の反
射特性に依存しないからである。主カラースプリッター
HFTとしては、両配置とも短波透過フィルターを用い
る。これはNIR波長領域の光を反射させ、VIS‐UV領域の
光を透過させる。
【００１２】図２は比Ｒをパルス幅の関数として表す。
パルス幅が最小のとき、すなわち試料の位置でパルスピ
ーク出力が最大のとき、式（４）に従って最大が起き
る。したがって、パルス幅の最適化はプレチャープユニ
ットを調整することによって実現できる。この種の調整
可能なプレチャープユニットはＤＥ特許１９６ ２２ ３
５９．Ａ１に記載されている。
【００１３】特に有利なのは、無次元数・比Ｒの測定値
が第１近似で平均出力（すなわちガラス繊維への結合効
率、レーザーが最適化されたときの平均出力変化等）に
依存しないことである。この無次元数は専らパルス幅の
みに依存する。しかし平均出力がもっと大きくなると、
使用中の光学系（ガラス繊維結合の場合ガラス繊維）内
で非線形過程（自己位相変調など）が励起される可能性
がある。これによって（超）短レーザーパルスのスペク
トル帯域幅が変化し、同時にパルス幅も変化し、これに
よってパルスピーク出力が小さくなる。この効果は避け
るべきで、すなわち平均出力は制限すべきである。平均
出力の閾値を求めるために前記手順が同様に利用され
る。
【００１４】図３は、プレチャープユニットを無変化に
調整した（パルス幅がプレチャープユニットを通ったと
き変化しない）とき、この比が平均出力にどのように依
存するかを示す。使用中の光学系の非線形効果による前
記パルス幅の前記変化は、式（４）によって一定である
ことが期待される。この比が折れ曲がっていることによ
って図中に表されている。
【００１５】図４は、短パルスレーザーKPL、プレチャ
ープユニットPCE、光ファイバーＦおよび顕微鏡ＭＩ特
にレーザー走査型顕微鏡LSMから成る全配置を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 LSMにおける実施例
【図２】比Ｒをパルス幅の関数として表す
【図３】プレチャープユニットを調整したときの比の平
均出力への依存率を示す
【図４】配置
【符号の説明】
Ｄ１,Ｄ２ 検出器 Ｌ レーザー Ｐ 試料 Ｏ 対物レンズ HFT 主カラースプリッター NFT 副カラースプリッター MD モニターダイオード KPL 短パルスレーザー PCE プレチャープユニット Ｆ 光ファイバー ＭＩ 顕微鏡

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 短パルスレーザーによる入射によって試
    料を励起し、非線形蛍光、特に２光子蛍光を発生させ
    る、顕微鏡のレーザー出力および／またはパルス幅を調
    整するための配置であって：前記非線形蛍光信号ならび
    に反射信号および／またはレーザー出力に相当する参照
    信号が検出され、 蛍光信号と反射信号および／または参照信号との比が調
    整のための標準信号として使用される配置。
  2. 【請求項２】 レーザー出力を記録するため、レーザー
    に後置されたレーザー光がモニターダイオードへ偏向さ
    れる、請求項１に記載の配置。
  3. 【請求項３】 レーザー走査型顕微鏡内における、請求
    項１または２に記載の配置。
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